CN1688192A - 免疫刺激核酸 - Google Patents

免疫刺激核酸 Download PDF

Info

Publication number
CN1688192A
CN1688192A CN03824039.4A CN03824039A CN1688192A CN 1688192 A CN1688192 A CN 1688192A CN 03824039 A CN03824039 A CN 03824039A CN 1688192 A CN1688192 A CN 1688192A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotides
seq
nucleotide
phosphate ester
patient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN03824039.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1688192B (zh
Inventor
阿瑟·M·克里格
尤利里克·塞缪洛特兹
乔格·沃尔默
欧金·尤尔曼
玛丽恩·朱克
格雷森·利甫福德
罗伯特·兰金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Coley Pharmaceutical GmbH
Coley Pharmaceutical Group Inc
Original Assignee
Coley Pharmaceutical GmbH
Coley Pharmaceutical Group Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharmaceutical GmbH, Coley Pharmaceutical Group Inc filed Critical Coley Pharmaceutical GmbH
Priority claimed from PCT/US2003/025935 external-priority patent/WO2004016805A2/en
Publication of CN1688192A publication Critical patent/CN1688192A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1688192B publication Critical patent/CN1688192B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一类可用于刺激免疫反应的柔性或半柔性CpG免疫刺激寡核苷酸。

Description

免疫刺激核酸
发明领域
本发明涉及免疫刺激核酸，以及具有减少的肾炎症反应的免疫刺激寡核苷酸，其组合物以及使用所述免疫刺激核酸的方法。
发明背景
细菌DNA具有免疫刺激效果，可激活B细胞和天然杀伤细胞，但是脊椎动物的DNA没有这种效果(tokunaga，T.，et al.，1988.Jpn.J.Cancer Res.79：682-686；Tokunaga，T.，et al.，1984，JNCI 72：955-962；Messina，J.P.，et al.，1991，J.Immunol.147：1759-1764；以及Krieg，1998，In：Applied Oligonucleotide Technology，C.A.Stein and A.M. Krieg，(Eds)，John Wiley and Sons，Inc.，New York，NY，pp.431-448的综述)。现在认识到细菌DNA的这些免疫刺激效果是由于在细菌DNA中的特定碱基序列(CpG基序)中普遍存在未甲基化的CpG二核苷酸，但是在脊椎动物DNA中是甲基化的并且数量很少(Krieg et al，1995 Nature 374：546-549；Krieg，1999 Biochim.Biophys.Acta 93321：1-10)。含有这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)可以模仿细菌DNA的免疫刺激效果。这种CpG ODN对于人和鼠的白细胞具有高度的免疫刺激效果，诱导B细胞增殖；细胞因子和免疫球蛋白的分泌；天然杀伤(NK)细胞的胞溶活性和IFN-g的分泌；以及激活树突状细胞(DC)和其它抗原呈递细胞以表达共刺激分子和分泌细胞因子，特别是对促进Th1样T细胞反应有重要作用的Th1样细胞因子。天然磷酸二酯骨架的CpG ODN的这种免疫刺激效果是高度CpG特异性地，如果CpG基序被甲基化，变成GpC，或者被除去或被改变，则其效果会剧烈下降(Krieg et al，1995 Nature 374：546-549；Hartmann et al，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10)。
在早期的研究中，认为免疫刺激核酸基序具有通式嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶(Krieg et al，1995 Nature 374：546-549；Pisetsky，1996 J.Immunol.156：421-423；Hacker et al.，1998 EMBO J.17：6230-6240；Lipford et al，1998 Trends in Microbiol.6：496-500)。但是，现在发现鼠淋巴细胞对不具有这种“通式”的磷酸二酯Cpg基序具有很好的反应(Yi et al.，1998 J.Immunol.160：5898-5906)，人B细胞和树突状细胞也是一样(Hartmann et al，1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10；Liang，1996J.Clin.Invest.98：1119-1129)。
现已发现了几种不同类别的CpG核酸。一类能激活B细胞但是在诱导IFN-a和NK细胞的激活方面能力较弱；这一类称为B类。B类CpG核酸通常是完全稳定的，包含位于特定的优选碱基序列中的未甲基化的CpG二核苷酸。参见，例如，美国专利序列号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。另一类CpG核酸可激活B细胞和NK细胞并能诱导IFN-；这一类称为C类。C类CpG核酸，如初次描述的那样，是完全稳定的，包括B类型序列和富含GC的回文结构或类回文结构。在2001年8月17日申请的共同未决的美国临时专利申请60/313,273和2002年8月19日申请的US10/224,523以及相关的PCT专利申请PCT/US02/26468，公开号为国际公开号WO03/015711中已有关于这些类型的描述。
发明简述
本发明令人惊讶地发现可以通过选择性地在特定的核苷酸之间包含一个或多个不稳定连接使得B类和C类CpG核酸和其它稳定的免疫刺激核酸维持其免疫刺激特性甚至使之提高。所述不稳定连接优选是天然连接，即磷酸二酯或磷酸二酯样连接。不稳定连接典型地，但不是必然地，相对容易被核酸酶消化。本发明的免疫刺激核酸包括至少一个位于5’端的嘧啶(Y)和邻近的3’端嘌呤(Z)，优选是鸟嘌呤(G)之间的不稳定连接，其中5’端Y和3’端Z都是内部核苷酸。
和所有稳定的免疫刺激核酸一样，本发明的免疫刺激核酸可用于诱导Th1样免疫反应。相应地，本发明的免疫刺激核酸可用于疫苗的佐剂，它们可用于治疗包括癌症，传染性疾病，变态反应，和哮喘在内的疾病。它们被认为在为任何目的的任何需要延长或重复给予免疫刺激核酸的情况下有特定的用途。
除了可用于为任何目的需要使用完全稳定的免疫刺激核酸的情况中，本发明的免疫刺激核酸在某些实施方案中更优于完全稳定的免疫刺激核酸，例如功效增强并且毒性降低。
本发明部分涉及含有寡核苷酸的免疫刺激CpG。本发明的一个方面是具有下述通式的寡核苷酸：5’T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2 *T*T3’(SEQ ID NO：296)。寡核苷酸N1是0-6个核苷酸，N2是0-7个核苷酸。符号*表示存在稳定的核苷酸间连接。当所述寡核苷酸包括至少2个磷酸二酯键核苷酸间连接的时候，不用*标记的核苷酸间连接可能是不稳定的或是稳定的。稳定的核苷酸间连接可能是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中N1是0-2个核苷酸。优选所述寡核苷酸是16-24个核苷酸长。
在一些实施方案中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*T*C*G*TTTTGAN1C*G*N2 *T*T3’(SEQ ID NO：296)，5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GAN1C*G*N2 *T*T3’(SEQ ID NO：296)或5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_N1C*G*N2 *T*T3’(SEQ ID NO：296)。符号_表示存在磷酸二酯核苷酸间连接。
优选所述寡核苷酸是5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T3’(SEQ ID NO：297)，5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：298)，5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：299)，或5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：300)。
本发明的其它方面涉及含有下式的寡核苷酸：5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4CGN5 *T*T3’(SEQ ID NO：301)。N3是0-4个核苷酸。N4是1-5个核苷酸。N5是0-7个核苷酸。符号*表示存在稳定的核苷酸间连接。当所述寡核苷酸包括至少2个磷酸二酯键核苷酸间连接的时候，不用*标记的核苷酸间连接可能是不稳定的或是稳定的。稳定的核苷酸间连接可能是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中N4是1-2个核苷酸。优选所述寡核苷酸是16-24个核苷酸长。
在一些实施方案中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4C*GN5 *T*T3’(SEQ ID NO：301)，5’T*C*G*A*T*N3C*G*TTTTN4C_G_*N5 *T*T3’(SEQ ID NO：302)或者 5’T*C*G*T*T*N3C_G_TTTTN4CGN5 *T*T3’(SEQ ID NO：303)。
优选所述寡核苷酸是5’T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：304)或者5’T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：305)。
根据本发明的其它方面，提供了含有下式的寡核苷酸：5’T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：306)。N是任意核苷酸。符号*表示存在稳定的核苷酸间连接。当所述寡核苷酸包括至少3个磷酸二酯键核苷酸间连接的时候，不用*标记的核苷酸间连接可能是不稳定的或是稳定的。稳定的核苷酸间连接可能是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中所述寡核苷酸包括5个磷酸二酯核苷酸间连接。优选地所述寡核苷酸是16-24个核苷酸长。
在一些实施方案中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：307)，5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：308)，或者5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：309)。在一个实施方案中所述寡核苷酸是5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：310)。符号_表示存在磷酸二酯核苷酸间连接。
在其它实施方案中所述寡核苷酸包括至少一个具有磷酸二酯核苷酸间连接的C_G基序。在其它实施方案中，所述寡核苷酸不包括任何具有磷酸二酯核苷酸间连接的C_G基序。
在其它方面提供了具有结构5’T*C_G(N6C_GN7)2-3T*C_G*T*T*T3’(SEQ ID NO：311-312)。N6和N7独立地是1到5个核苷酸长，所述寡核苷酸是16-40个核苷酸长。
在一些实施方案中N6是一个核苷酸，例如N6可以是T或A。在一些实施方案中N7是5个核苷酸，例如，N7可以是5个嘧啶或TTTTG。
在一些实施方案中寡核苷酸具有下述结构：5’T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3’(SEQ ID NO：313)或者5’T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3’(SEQ ID NO：314)。
根据本发明的其它方面提供了具有结构5’T*CGCGN8CGCGC*GN93’(SEQ ID NO：315)。N8的长度在4到10个核苷酸之间，包括至少1个C_G基序。N9的长度在0到3个核苷酸之间。所述寡核苷酸为15-40个核苷酸长。
在一些实施方案中，N8包括至少2个或3个CG基序。在其它实施方案中，N8是PuCGPyPyCG或PuCGPyPyCGCG。任选的N8是ACGTTCG。N9可以包括至少一个CG基序，例如CCG。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸具有如下结构：5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO：316)或者5’T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G3’(SEQ ID NO：317)。
在另一个方面提供了具有如下通式的寡核苷酸5’T*T*GX1X2TGX3X4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T3(SEQ IDNO：318)。N10的长度在4到8个核苷酸之间，包括至少1个C_G基序。X1，X2，X3和X4独立地是C或G。所述寡核苷酸长度为24-40个核苷酸。
在一些实施方案中N10包括至少2个或3个CG基序。在其它实施方案中所述寡核苷酸具有下述结构中的一种：5’T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：319)或者5’T*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3(SEQ ID NO：320)。
在其它实施方案中，所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO：321)。
在一些方面，所述ODN是具有选自下组的序列的寡核苷酸：CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：333)，GTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：334)，TCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：335)，CGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：336)，GTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：337)，TTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：338)，TTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：339)，TTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：340)，TGACGTTTTGTCGTT(SEQ IDNO：341)，GACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：342)，ACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：343)，GTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：344)，GTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：345)，TTTTGTCGTT(SEQ ID NO：346)，TTTGTCGTT，TTGTCGTT，TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT(SEQID NO：347)，TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCG(SEQID NO：348)，TCGTCGTTTTGACGTTTTGTC(SEQ IDNO：349)，TCGTCGTTTTGACGTTTTGT(SEQ ID NO：350)，TCGTCGTTTTGACGTTTTG(SEQ ID NO：351)，TCGTCGTTTTGACGTTTT(SEQ ID NO：352)，TCGTCGTTTTGACGTTT(SEQ ID NO：353)，TCGTCGTTTTGACGTT(SEQ ID NO：354)，TCGTCGTTTTGACGT(SEQ ID NO：355)，TCGTCGTTTTGACG(SEQ ID NO：356)，TCGTCGTTTTGAC(SEQ ID NO：357)，TCGTCGTTTTGA(SEQ ID NO：358)，TCGTCGTTTTG(SEQID NO：359)，TCGTCGTTTT(SEQ ID NO：360)，TCGTCGTTT，TCGTCGTT，CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT(SEQ ID NO：361)，GTCGTTTTGACGTTTTGTCG(SEQ ID NO：362)，TCGTTTTGACGTTTTGTC(SEQ IDNO：363)，CGTTTTGACGTTTTGT(SEQ ID NO：364)，GTTTTGACGTTTTG(SEQ ID NO：365)，TTTTGACGTTTT(SEQ ID NO：366)，TTTGACGTTT(SEQ ID NO：367)，和TTGACGTT。
本发明的另一个方面是含有八聚体序列的寡核苷酸，该八聚体序列含有至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的YZ二核苷酸，至少4个T核苷酸，其中Y是嘧啶或修饰的嘧啶，其中Z是鸟嘌呤核苷或修饰的鸟嘌呤核苷，其中所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接。
Y可以是未甲基化的C。Z可以是鸟嘌呤核苷。在一些实施方案中，Y是胞嘧啶或选自下组的修饰的胞嘧啶碱基：5-甲基胞嘧啶，5-甲基-异胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-卤代胞嘧啶，鸟嘧啶，N4-乙基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，和氢。在其它实施方案中，Z是鸟嘌呤或选自下组的修饰的鸟嘌呤碱基：7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂-7-取代的鸟嘌呤(例如7-去氮杂-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)，7-去氮杂-8-取代的鸟嘌呤，次黄嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，8-取代的鸟嘌呤例如8-羟基鸟嘌呤，和6-硫鸟嘌呤，2-氨基嘌呤和氢。
在一些实施方案中，所述八聚体序列包括TTTT基序。在其它实施方案中所述八聚体序列包括两个YZ二核苷酸。任选的YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。
在一些实施方案中所述八聚体序列选自下组：T*C-G*T*C-G*T*T，C-G*T*C-G*T*T*T，G*T*C-G*T*T*T*T，T*C-G*T*T*T*T*G，C-G*T*T*T*T*G*A，T*T*T*T*G*A*C-G，T*T*T*G*A*C-G*T，T*T*G*A*C-G*T*T，T*G*A*C-G*T*T*T，G*A*C-G*T*T*T*T，A*C-G*T*T*T*T*G，C-G*T*T*T*T*G*T，T*T*T*T*G*T*C-G，T*T*T*G*T*C-G*T，G*T*T*T*T*G*T*C，和T*T*G*T*C-G*T*T，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中表示存在磷酸二酯核苷酸间连接。
在其它实施方案中，所述寡核苷酸长度为8-40个核苷酸。
磷酸二酯样连接可以是硼烷基磷酸酯或非对映的纯的Rp硫代磷酸酯。任选的所述稳定的核苷酸间连接是硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，甲基硫代磷酸酯，或其任意组合。
所述寡核苷酸可以具有3’-3’连接，并具有一个或两个可及的5’端。在一些优选的实施方案中所述寡核苷酸具有两个可及的5’端，每个都是5’TCG。
本发明的另一个方面提供了含有下式的寡核苷酸：5’TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3’(SEQ ID NO：368)。至少一个CG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接。
本发明的其它方面是含有5’GNC3’的寡核苷酸，其中N是4-10个核苷酸长的核酸序列，至少有50％的T，不包括CG二核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接。在一个实施方案中，N包括TTTT基序。在其它实施方案中所述寡核苷酸选自下组：G*T*T*T*T*G*T*C和G*T*T*T*T*G*A*C，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接。
本发明的另一个方面提供了免疫刺激核酸分子，所述分子具有至少一个内部嘧啶-嘌呤(YZ)二核苷酸，任选的嘧啶-鸟嘌呤核苷(YG)二核苷酸和一个嵌合骨架，其中至少一个内部YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中任选地每个另外的内部YZ二核苷酸具有磷酸二酯，磷酸二酯样，或稳定的核苷酸间连接，其中所有其它核苷酸间连接都是稳定的。在一个实施方案中所述免疫刺激核酸包括多个内部YZ二核苷酸，每个都具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。在一个实施方案中，每个内部YZ二核苷酸都具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。
在一个实施方案中，所述免疫刺激核酸分子选自下组：*A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：1)，
G*C_G*T*C_G*A*C_C*T*C_G*A*C_G*C(SEQ IDNO：2)，
G*C_G*T*C_G*TT*T*T*C_G*T*C_G*C(SEQ ID NO：3)，
T*C*C*A*T_G*A*C_G*T*T*C*C*T_G*A*TG*C(SEQ ID NO：4)，
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*TC_G*T*T(SEQ IDNO：5)，
T*C*G*T*C*G*T*T*t*T*C_G*G*C_G*G*C*C*_G*C*C*G(SEQ ID NO：6)，
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：7)，
T*C*G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：8)，
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T(SEQ IDNO：9)，
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：10)，
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T(SEQ IDNO：11)，
T*C_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：12)，
T*C_7*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_7*T*T(SEQ ID NO：13)，
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：14)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*T*C*G*C*G(SEQ ID NO：15)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*T*C*G*T*G(SEQ ID NO：16)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：17)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：21)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T(SEQ IDNO：22)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：23)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T(SEQ IDNO：24)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*G*C*G*A*C*G*T*C*G*C*G(SEQ ID NO：25)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G(SEQ ID NO：26)，
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A*C*G*T*C*G*C*G(SEQ ID NO：27)，
T*C_G*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：28)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T(SEQ IDNO：29)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：30)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C*G(SEQ ID NO：31)，T*C G*T*C G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T(SEQ ID NO：32)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T*T(SEQ IDNO：33)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T(SEQ ID NO：34)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：35)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：36)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：37)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C*G*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：38)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：39)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：40)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T(SE IDNO：41)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*C_G*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：42)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：43)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T(SEQ ID NO：44)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：45)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T(SEQ IDNO：46)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：47)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：48)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：49)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T(SEQ IDNO：50)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：51)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T(SEQ IDNO：52)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T(SEQID NO：53)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：54)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：55)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：56)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：241)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T(SEQ ID NO：58)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：59)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T(SEQ IDNO：60)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：61)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T(SEQ IDNO：62)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：63)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T(SEQ ID NO：64)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：65)，
T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：66)，
T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：67)，
T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T(SEQ ID NO：68)，
T*C_G*T*T**T*T*T*T*T*T*C_G*T*T**T*T(SEQ ID NO：69)，
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：70)，
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T(SEQ IDNO：71)，
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：72)，
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T(SEQ IDNO：73)，
T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T(SEQ ID NO：74)，
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：75)，
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：76)，
T*G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：77)，
T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：78)，
T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T*C*T*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：79)，
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：80)，
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T(SEQID NO：81)，
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：82)，
T*T*C_G*T*T*C*T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T(SEQ ID NO：83)，
T*T*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T(SEQ ID NO：84)，
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*_C_G*T(SEQ ID NO：85)，
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：86)，
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T(SEQ ID NO：87)，
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：88)，
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：89)，
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T(SEQ ID NO：90)，
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T(SEQ ID NO：91)，
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T(SEQ ID NO：92)，
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：93)，
T*T*T*T*C_G_T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T(SEQID NO：94)，
T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T(SEQ ID NO：95)，
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：96)，
T*T G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T G*T*T(SEQ ID NO：97)，
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：98)，和
T*T G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T(SEQ ID NO：99)，其中*代表硫代磷酸酯，代表磷酸二酯，U代表2′-脱氧尿嘧啶，7代表7-去氮杂鸟嘌呤。
在一个实施方案中，所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C_G*T*C_G*T*T*T*～G*T*C_G*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：100)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：101)，
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ IDNO：102)，T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：103)，
和T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：104)，其中*代表硫代磷酸酯，_代表磷酸二酯。
本发明的另一个方面提供了一种含有嵌合骨架和至少一个序列N1YGN2的免疫刺激核酸分子，其中独立地对每一个N1YGN2来说YG都是内部嘧啶-鸟嘌呤核苷(YG)二核苷酸，N1和N2彼此独立地可以是任何核苷酸，其中对于至少一个序列N1YGN2来说，以及任选的对于每一个另外的序列N1YGN2来说：YG二核苷酸都具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，或者当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，并且当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，其中所有其它核苷酸间连接都是稳定的。
在一个实施方案中所述免疫刺激核酸含有多个序列N1YGN2，其中对于每个序列N1YGN2来说：YG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，或者当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，并且当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连。
在一个实施方案中，所述免疫刺激核酸选自下组：
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：105)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：106)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：107)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：108)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：109)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：110)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：111)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：112)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：113)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：114)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：115)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：116)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：117)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：118)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：119)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：120)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：121)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：122)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：123)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：124)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：125)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：126)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：127)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：128)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：129)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：130)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：131)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：132)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：133)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：134)，T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：135)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*_C_G*T*T(SEQ ID NO：136)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：137)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：138)，T*C G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：139)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：140)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：141)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*_T_C_G*T*T(SEQ ID NO：142)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：143)，T*C G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：144)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：145)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：146)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：147)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：148)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：149)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：150)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：151)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：152)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：153)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：154)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：155)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：156)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：157)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：158)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：159)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：160)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：161)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：162)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：163)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：164)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：165)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：166)，T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：167)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：168)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：169)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：170)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：171)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：172)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：173)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：174)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：175)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：176)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：177)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：178)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：179)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：180)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：181)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：182)，T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：183)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：184)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：185)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：186)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：187)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：188)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：189)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：190)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：191)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：192)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：193)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：194)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_GT*T(SEQ ID NO：195)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：196)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：197)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：198)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：199)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：200)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：201)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：202)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：203)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：204)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：205)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：206)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：207)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：208)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：209)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：210)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：211)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：212)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：213)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：214)，T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：215)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：216)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：217)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：218)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：219)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：220)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：221)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：222)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T(SEQ ID NO：223)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：224)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：225)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：226)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：227)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：228)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：229)，T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：230)，和T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：231)，其中*代表硫代磷酸酯，代表磷酸二酯。
在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：232)，T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：233)，和T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：234)，其中*代表硫代磷酸酯，代表磷酸二酯。
在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：235)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T(SEQ ID NO：236)，和T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T*T_T_GT*C*G*T*T(SEQ ID NO：237)，其中*代表硫代磷酸酯，代表磷酸二酯。
在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：238)，T*C_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T(SEQ ID NO：239)，和T*C_G_T_C_G_T*T*T_T_G_T_C_G_T*T*T_T_G_T_C_G_T*T(SEQ ID NO：240)，其中*代表硫代磷酸酯，代表磷酸二酯。
在一个实施方案中，至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的内部YG二核苷酸是CG。在一个实施方案中，至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的内部YG二核苷酸是TG。
在一个实施方案中所述磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接是磷酸二酯。在一个实施方案中所述磷酸二酯样连接是硼烷基磷酸酯或非对映的纯的Rp硫代磷酸酯。
在一个实施方案中所述稳定的核苷酸间连接选自下组：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，硫逐磷酸甲酯，及其任意组合。在一个实施方案中所述稳定的核苷酸间连接是硫代磷酸酯。
在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子是B类免疫刺激核酸分子。在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子是C类免疫刺激核酸分子。
在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子是4-100个核苷酸长。在一个实施方案中所述免疫刺激核酸分子是6-40个核苷酸长。在一个实施方案中，所述免疫刺激核酸分子是6-19个核苷酸长。
在一个实施方案中，所述免疫刺激核酸分子不是反义寡核苷酸，三螺旋形式的寡核苷酸，或核糖酶。
本发明的另一个方面提供了一种寡核苷酸，其含有
N1-C_G-N2-C_G-N3
其中N1和N3每个独立地是长度为1-20个核苷酸的核酸序列，其中表示内部磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中N2独立地是长度为0-20个核苷酸的核酸序列，其中G-N2-C包括1个或2个稳定连接。
本发明的另一个方面提供了一种寡核苷酸，其含有
N1-C_G-N2-C_G-N3
其中N1和N3每个独立地是长度为1-20个核苷酸的核酸序列，其中_表示内部磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中N2独立地是长度为4-20个核苷酸的核酸序列，其中G-N2-C包括至少5个稳定连接。
本发明的另一个方面提供了一种寡核苷酸，其含有
N1-C_G-N2-C_G-N3
其中N1，N2和N3每个独立地是长度为0-20个核苷酸的核酸序列，其中表示内部磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸不是反义寡核苷酸，三螺旋形式的寡核苷酸，或核糖酶。
本发明的另一个方面提供了一种寡核苷酸，其含有
X1-N1-(GTCGTT)n-N2-X2(SEQ ID NO：18-20和57)
其中N1和N2每个独立地是长度为0-20个核苷酸的核酸序列，其中n＝2或n＝4-6，其中X1和X2每个独立地是3-10个核苷酸长的具有硫代磷酸酯核苷酸间连接的核酸序列，其中N1-(GTCGTT)n-N2包括至少一个磷酸二酯核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸的3’和5’核苷酸不包括poly-G，poly-A，poly-T，或poly-C序列。
在一个实施方案中所述核酸具有含有脱氧核糖或核糖的骨架。
在一个实施方案中所述寡核苷酸具有含有脱氧核糖或核糖的骨架。
在一个实施方案中所述寡核苷酸组成药物组合物，其中任选地含有药学可接收的载体。
在一个实施方案中所述寡核苷酸进一步包括佐剂或细胞因子。
在一个实施方案中所述寡核苷酸进一步包括抗原，其中所述寡核苷酸是疫苗佐剂。
在一个实施方案中所述抗原选自下组：病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，寄生虫抗原，和肿瘤抗原。在一个实施方案中所述抗原由核酸载体编码。在一个实施方案中，所述抗原是肽抗原。在一个实施方案中所述抗原与所述寡核苷酸或免疫刺激核酸分子共价连接。在另一个实施方案中所述抗原不与所述寡核苷酸或免疫刺激核酸分子共价连接。
本发明的另一个方面提供了一种识别检测免疫刺激核酸分子的相对功效或毒性的方法。所述方法包括选择一种具有参考序列，稳定骨架，和参考免疫刺激功效或毒性的参考免疫刺激核酸；选择一种具有参考序列，并且用磷酸二酯或磷酸二酯样连接代替了参考序列中至少一个内部YN二核苷酸的Y和N之间的稳定连接，并具有检测免疫刺激功效或毒性的检测免疫刺激核酸，其中Y是嘧啶，N是任意核苷酸；将检测免疫刺激功能或毒性与参考免疫刺激功能或活性相比较，识别检测免疫刺激核酸分子的相对功效或毒性。
在一个实施方案中，所述检测免疫刺激核酸作为TLR9信号传导活性诱导子的能力比参考免疫刺激核酸更强。
在一个实施方案中，所述检测免疫刺激核酸作为1型干扰素的诱导子的能力比参考免疫刺激核酸更强。
在一个实施方案中，所述检测免疫刺激核酸作为IP-10的诱导子的能力比参考免疫刺激核酸更强。
在一个实施方案中YN是YG。在一个实施方案中，至少一个内部YG二核苷酸是CG。在一个实施方案中，至少一个内部YG二核苷酸是TG。
在一个实施方案中，所述检测免疫刺激核酸含有多个内部YG二核苷酸，每个都具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。在一个实施方案中，至少一个内部YG二核苷酸是每个的内部YG二核苷酸。
在一个实施方案中所述磷酸二酯或磷酸二酯样连接是磷酸二酯。在一个实施方案中，所述磷酸二酯样连接是硼烷基磷酸酯或非对映的纯的Rp硫代磷酸酯。
在一个实施方案中，所述稳定的骨架包括多个选自下组的核苷酸间连接：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，硫逐磷酸甲酯，及其任意组合。在一个实施方案中所述稳定的骨架包含多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
在一个实施方案中所述参考免疫刺激核酸分子是B类免疫刺激核酸分子。在一个实施方案中所述参考免疫刺激核酸分子是C类免疫刺激核酸分子。
在一个实施方案中所述参考免疫刺激核酸分子是4-100个核苷酸长。在一个实施方案中所述参考免疫刺激核酸分子是6-40个核苷酸长。在一个实施方案中，所述参考免疫刺激核酸分子是6-19个核苷酸长。
本发明的另一方面提供了一种设计少于20个核苷酸长的稳定免疫刺激核酸分子的方法。所述方法包括选择一个长度为6-19个核苷酸的序列，其中所述序列包括至少一个内部CG二核苷酸；在至少一个内部CG二核苷酸的C和G之间选择磷酸二酯或磷酸二酯样连接；独立地在每个另外的内部CG二核苷酸的C和G之间选择磷酸二酯，磷酸二酯样，或稳定连接；在所有其它核苷酸间连接选择稳定连接。
本发明的另一方面是治疗或预防变态反应或哮喘的方法。所述方法的实施是通过给患者施用有效量的本文所述的免疫刺激CpG寡核苷酸以治疗或预防变态反应或哮喘。在一个实施方案中所述寡核苷酸给药至粘膜表面。在其它实施方案中所述寡核苷酸以喷雾剂形式给药。任选地，所述寡核苷酸进行鼻内给药。
根据本发明的另一个方面提供了一种诱导细胞因子产生的方法。所述方法的实施是通过给患者施用有效量的本文所述的免疫刺激CpG寡核苷酸以诱导选自下组的细胞因子：IL-6，IL-8，IL-12，IL-18，TNF，IFN-α，趋化因子，和IFN-γ。
本发明的另一个方面是本文所述的CpG免疫刺激寡核苷酸与抗原或其它治疗化合物，例如抗微生物试剂组合的组合物。所述抗微生物制剂可以是，例如，抗病毒试剂，抗寄生虫试剂，抗细菌试剂或抗真菌试剂。
根据本发明的另一个方面提供了一种由包括本文所述的CpG免疫刺激寡核苷酸的持续释放装置组成的组合物。
所述组合物任选地包括一种药学载体和/或配制成递送装置。在一些实施方案中，所述递送装置选自阳离子脂，细胞渗透蛋白，和持续释放装置。在一个实施方案中所述持续释放装置是生物可降解的聚合物或微粒。
根据本发明的另一个方面提供了一种刺激免疫反应的方法。所述方法包括给患者施用有效量的CpG免疫刺激寡核苷酸以在患者中诱导免疫反应。优选所述CpG免疫刺激寡核苷酸通过口服，局部，通过持续释放装置，粘膜，系统，肠胃外或肌肉内给药。当所述CpG免疫刺激寡核苷酸给药至粘膜表面的时候，可以以有效量递送以诱导粘膜免疫反应或系统免疫反应。在优选的实施方案中所述粘膜表面选自口腔、鼻、直肠、阴道、和眼睛表面。
在一些实施方案中所述方法包括使患者暴露于抗原中，其中所述免疫反应是抗原特异性免疫反应。在一些实施方案中所述抗原选自肿瘤抗原，病毒抗原，细菌抗原，寄生虫抗原和肽抗原。
CpG免疫刺激寡核苷酸可引起广谱的免疫反应。例如这些CpG免疫刺激寡核苷酸可以用于使Th2转变为Th1免疫反应。CpG免疫刺激寡核苷酸还可以用于激活免疫细胞，例如淋巴细胞(例如B和T细胞)，树突状细胞，和NK细胞。所述激活可以发生在体内，体外或离体，即，通过从患者中分离免疫细胞，使免疫细胞和有效量的能激活所述免疫细胞的CpG免疫刺激寡核苷酸接触，将激活的免疫细胞重新给予患者。在一些实施方案中所述树突状细胞呈递癌抗原。所述树突状细胞可以在离体条件下暴露于癌抗原中。
由CpG免疫刺激寡核苷酸产生的免疫反应还可以诱导细胞因子的产生，例如产生IL-6，IL-8，IL-12，IL-18，TNF，IFN-α，趋化因子和IFN-γ。
在另一个实施方案中，所述CpG免疫刺激寡核苷酸可用于治疗癌症。根据本发明的其他方面所述CpG免疫刺激寡核苷酸也可以用于在具有发生癌症危险的患者中预防癌症(例如减少发生癌症的危险性)。所述癌症可以选自胆道癌，乳腺癌，子宫颈癌，绒毛膜癌，结肠癌，子宫内膜癌，胃癌，上皮内瘤，淋巴腺癌，肝癌，肺癌(例如小细胞和非小细胞)，黑色素瘤，成神经细胞瘤，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，肉瘤，甲状腺癌，和肾癌，以及其它癌和肉瘤。在一些重要的实施方案中，所述癌症选自骨癌，脑和CNS癌，结缔组织癌，食道癌，眼癌，何杰金氏淋巴瘤，喉癌，口腔牙槽癌，皮肤癌和睾丸癌。
可选择地当CpG免疫刺激寡核苷酸与抗癌治疗联合使用的时候，CpG免疫刺激寡核苷酸还可以用于增加癌细胞对于癌症治疗(例如抗癌治疗)的反应性。所述抗癌治疗可以是化学疗法，疫苗(例如体外引发的树突状细胞疫苗或癌症抗原疫苗)或者基于抗体的治疗。后者还可以包括施用例如癌细胞表面抗原特异的抗体，其中所述免疫反应导致抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，所述抗体选自Ributaxin，Herceptin，Quadramet，Panorex，IDEC-Y2B8，BEC2，C225，Onco1ym，SMART M195，ATRAGEN，Ovarex，Bexxar，LDP-03，ior t6，MDX-210，MDX-11，MDX-22，OV103，3622W94，anti-VEGF，Zenapax，MDX-220，MDX-447，MELIMMUNE-2，MELIMMUNE-1，CEACIDE，Pretarget，NovoMAb-G2，TNT，Gliomab-H，GNI-250，EMD-72000，LymphoCide，CMA676，Monopharm-C，4B5，ior egf.r3，ior c5，BABS，anti-FLK-2，Mix-260，ANA Ab，SMART 1D10 Ab，SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA。
因此，根据本发明的一些方面，患有癌症或具有患癌症危险的患者被给予CpG免疫刺激寡核苷酸和抗癌治疗。在一些实施方案中，所述抗癌治疗选自化学治疗剂，免疫治疗剂和癌疫苗。
在另一个关于预防或治疗癌症的方法的实施方案中，所述患者进一步被给予干扰素-α。
本发明的其它方面涉及在患者中预防疾病的方法。所述方法包括给患者定期施用CpG免疫刺激寡核苷酸以提高免疫系统的反应性，以在患者中预防疾病。要用本发明的预防性方法预防的疾病或状况的实例包括微生物感染(例如性传播的疾病)以及由于食物过敏造成的过敏性休克。
本发明的其它方面是通过给患者施用有效量的能激活自然免疫反应的CpG免疫刺激寡核苷酸诱导天然免疫的方法。
根据本发明的另一个方面提供了一种治疗或预防病毒或逆转录病毒感染的方法。所述方法包括给患有病毒或逆转录病毒感染或具有其患病危险的患者施用有效量的能治疗或预防所述病毒或逆转录病毒感染的任何本发明的组合物。在一些实施方案中所述病毒是由肝炎病毒例如乙型肝炎，丙型肝炎，HIV，疱疹病毒或乳头瘤病毒引起的。
根据本发明的另一个方面提供了一种治疗或预防细菌感染的方法。所述方法包括给患有细菌感染或具有其患病危险的患者施用有效量的能预防或治疗所述细菌感染的任何本发明的组合物。在一个实施方案中所述细菌感染是由细胞内细菌引起的。
本发明的另一个方面是治疗或预防寄生虫感染的方法，通过给患有寄生虫感染或具有其患病危险的患者施用有效量的能治疗或预防所述寄生虫感染的任何本发明的组合物。在一个实施方案中所述寄生虫感染是由细胞内寄生虫引起的。在另一个实施方案中所述寄生虫感染是由肠道寄生虫引起的。
在一些实施方案中所述患者是人，在其它实施方案中所述患者是非人的脊椎动物，选自狗，猫，马，牛，猪，火鸡，山羊，鱼，猴，鸡，大鼠，小鼠和绵羊。
本发明的另一个方面涉及诱导TH1免疫反应的方法，通过给患者施用有效量的能产生TH1免疫反应的任何本发明的组合物。
本发明的另一个方面涉及一种诱导免疫反应的方法，通过给需要的患者施用有效量的免疫寡核苷酸5’T*C*G*T*X1 *T*T3；其中X1为3-30个核苷酸，其中*指存在稳定的核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸包括至少2个磷酸二酯核苷酸间连接。
本发明的另一个方面涉及一种治疗自体免疫疾病的方法，通过给患有自体免疫疾病或具有其患病危险的患者施用有效量的能治疗或预防所述自体免疫疾病的任何本发明的组合物。
在其它实施方案中，所述寡核苷酸以能诱导细胞因子表达的有效量递送到患者中。可选择地，所述细胞因子选自IL-6，TNFα，IFNα，IFNγ和IP-10。在其它实施方案中所述寡核苷酸以能使免疫反应从偏向Th2的反应转变为偏向Th1的反应的有效量递送给患者。
本发明的某些方面是治疗呼吸道重塑的方法，包括：给患者施用有效量的能治疗患者的呼吸道重塑的含有CG二核苷酸的寡核苷酸。在一个实施方案中所述患者患有哮喘，慢性阻塞性肺病，或者是吸烟者。在其它实施方案中所述患者没有哮喘的症状。
本发明的一个方面还提供了使用本发明的寡核苷酸刺激免疫反应的方法。
还提供了一种制造能刺激免疫反应的本发明的寡核苷酸的药物的方法。
本发明的另一个方面涉及一种刺激免疫反应的方法，通过给患者施用有效量的能刺激免疫反应的长度为至少5个核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个免疫刺激二核苷酸基序，其中所述二核苷酸的核苷酸之间的核苷酸间连接具有R手性，其中所述寡核苷酸中至少70％的其它核苷酸间连接具有S手性。
本发明的每个限定都包括本发明的各种实施方案。因此本发明的每个方面都包括涉及任何一个要素或要素组合的本发明的每个限定。
附图简述
图1显示了将这些细胞暴露于由图顶部沿X轴所示的数字所示的寡核苷酸中后，人PBMC分泌的干扰素α(pg/m1)的水平，用▲表示，正对照寡核苷酸用■表示。图1A所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：322，SEQ IDNO：323，和SEQ ID NO：324，正对照寡核苷酸是SEQID NO：242。图1B所示的检测寡核苷酸包括SEQ IDNO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328，正对照寡核苷酸是5’TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT 3’(SEQ ID NO：329)。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。所显示的数据表示六个供体的平均值。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)处理的细胞分泌的干扰素α(pg/ml)的水平。
图2显示了将这些细胞暴露于由图顶部沿X轴所示的数字所示的寡核苷酸中后，人PBMC分泌的IL-10(pg/ml)的水平，用▲表示，正对照寡核苷酸用■表示。图2A所示的检测寡核苷酸包括(SEQ ID NO：322)，SEQ IDNO：323，和SEQ ID NO：324，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：242。图2B所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。所显示的数据表示六个供体的平均值。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)处理的细胞分泌的IL-10(pg/ml)的水平。
图3显示了将这些细胞暴露于由图顶部沿X轴所示的数字所示的寡核苷酸中后，人PBMC分泌的TNT-α(pg/ml)的水平，用▲表示，正对照寡核苷酸用■表示。图3A所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：322，SEQ IDNO：323，和SEQ ID NO：324，正对照寡核苷酸是SEQID NO：329。图1B所示的检测寡核苷酸包括SEQ IDNO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。所显示的数据表示三个供体的平均值。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)和LPS处理的细胞分泌的TNT-α(pg/ml)的水平。
图4显示了将这些细胞暴露于由图顶部沿X轴所示的数字所示的寡核苷酸中后，人PBMC分泌的IL-6(pg/ml)的水平，用▲表示，正对照寡核苷酸用■表示。图4A所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：322，SEQ ID NO：323，和SEQ ID NO：324，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329(具有完全硫代磷酸酯修饰的骨架)。图4B所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。所显示的数据表示三个供体的平均值。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)和LPS处理的细胞分泌的IL-10(pg/ml)的水平。
图5显示了将这些细胞暴露于由图顶部沿X轴所示的数字所示的寡核苷酸中后，人PBMC分泌的干扰素γ(pg/ml)的水平，用▲表示，正对照寡核苷酸用■表示。图5A所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：322，SEQ IDNO：323，和SEQ ID NO：324，正对照寡核苷酸是SEQID NO：329。图5B所示的检测寡核苷酸包括SEQ IDNO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。所显示的数据表示三个供体的平均值。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)和LPS处理的细胞分泌的干扰素α(pg/ml)的水平。
图6显示了将这些细胞暴露于由图顶部沿X轴所示的数字所示的寡核苷酸中后，作为NK细胞活化标志的NK细胞上CD69表达(MFI)的水平，用▲表示，正对照寡核苷酸用■表示。图6A所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：322，SEQ ID NO：323，和SEQ ID NO：324，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。图6B所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和S EQ ID NO：328，正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。所显示的数据表示三个供体的平均值。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)和LPS处理的NK细胞上CD69表达的水平。
图7显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：313中后，人PBMC分泌的干扰素α(IFN-α)(7A)和IL-10(7B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图8显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：314中后，人PBMC分泌的干扰素α(IFN-α)(8A)和IL-10(8B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242用●表示。负对照ODN是SEQ ID NO：330：tccaggacttctctcaggtt。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)
图9显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：319中后，人PBMC分泌的干扰素α(IFN-α)(9A)和IL-10(9B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图10显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸∑EΘIΔNO：316中后，人PBMC分泌的干扰素α(IFN-α)(10A)和IL-10(10B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQIDNO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图11显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：317中后，人PBMC分泌的干扰素α(IFN-α)(11A)和IL-10(11B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQID NO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图12显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸∑EΘIΔNO：320中后，人PBMC分泌的干扰素α(IFN-α)(12A)和IL-10(12B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQID NO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图13显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：313中后，B细胞上CD86表达(13A)和单核细胞上CD80表达(13B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQ ID NO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图14显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：314中后，B细胞上CD86表达(14A)和单核细胞上CD80表达(14B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQ ID NO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图15显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：319中后，B细胞上CD86表达(15A)和单核细胞上CD80表达(15B)的水平，用■表示，正对照寡核苷酸SEQ ID NO：242用●表示。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图16显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：316中后，B细胞上CD86表达(16A)和单核细胞上CD80表达(16B)的水平，并与正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242和寡核苷酸5’TCC AGG ACT TCT CTC AGGTT 3’)SEQ ID NO：330比较。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图17显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：321中后，人PBM C分泌的干扰素α(IFN-α)(17A)和IL-10(17B)的水平，并与对照寡核苷酸SEQ ID NO：242和寡核苷酸SEQ ID NO：330比较。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图18显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：321中后，B细胞上CD86表达(18A)和单核细胞上CD80表达(18B)的水平，并与正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242和寡核苷酸SEQ ID NO：330比较。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图19显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：317中后，B细胞上CD86表达(19A)和单核细胞上CD80表达(19B)的水平，并与正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242和寡核苷酸SEQ ID NO：330比较。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图20显示了将这些细胞暴露于寡核苷酸SEQ ID NO：320中后，B细胞上CD86表达(20A)和单核细胞上CD80表达(20B)的水平，并与正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242和寡核苷酸SEQ ID NO：330比较。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
图21显示了核酸分子的一部分，显示了包括碱基(B)，糖和在5’胞嘧啶核苷和3’鸟嘌呤核苷之间具有磷酸二酯连接(用圆圈表示)以及具有邻近的硫代磷酸酯连接的骨架在内的结构特征。
图22是在对小鼠进行皮下注射后48小时肾，脾，和肝中硫代磷酸酯(SEQ ID NO：242)，柔性(SEQ ID NO：294)，和半柔性(SEQ ID NO：241)寡核苷酸的相关组织数量的条形图。寡核苷酸SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：241具有相同的碱基序列，其骨架组成不同。
图23显示了在体外通过诱导细胞因子IL-6，IL-10，IFNα和IP-10对人免疫细胞的刺激。
图24显示了在体外作为TLR9相关的细胞因子IL-6，IL-10，IL-12p40，IFNα，TNFα和IP-10的诱导子通过增加其功效和/或能力刺激鼠脾细胞，并且不分泌可检测到的IL-1，IL-2，IL-4，IL-5或GM-CSF。
图25显示了本发明的ODN(SEQ ID NO：313)在肺中诱导TLR9相关基因(IL-6，TNFα，IFNα，IFN和IP-10)的表达。
图26显示了在小鼠体内CpG ODN对抗原诱导的淋巴结发育的效果。
图27证明了CpG ODN抑制了对抗原致敏的Th2反应。
图28显示了在小鼠体内对抗原诱导的IgE产生的作用。
图29证明了抗原激发在呼吸道内腔引起白细胞，主要是嗜伊红细胞的总数的增加。
图30和32显示了抗原激发在呼吸道内腔引起白细胞，主要是嗜伊红细胞的总数的增加，并且这种情况被本发明的ODN(SEQ ID NO：313)以剂量相关的方式抑制。
图31和32显示了抗原激发引起呼吸道反应过度，并且这种情况被本发明的ODN(SEQ ID NO：313)以剂量相关的方式抑制。
图33显示了在进行了5mg/kg的IV&IT给药后鼠血浆中的ODN浓度。所述血浆数据显示了在进行了IV&IT给药后，与SEQ ID NO：329相比，SEQ ID NO：313在血浆中更快地被清除。
图34显示了在进行了5mg/kg的IV&IT给药后鼠肺中的ODN浓度。在同样剂量水平的IV给药之后，肺中SEQ ID NO：313的浓度低于SEQ ID NO：329的浓度。IT给药后差异较不显著。SEQ ID NO：329的肺数据只记录到给药后48小时。
图35显示了在进行了5mg/kg的IV&IT给药后鼠肾中的ODN浓度。肾的数据表明在IV和IT给药后，肾中SEQ ID NO：313的绝对数量都低于相应的SEQ ID NO：329浓度。
特别是在IT给药后肾对于SEQ ID NO：313的暴露，与对于同样剂量水平的SEQ ID NO：329的暴露相比有显著的降低。
图36显示了在以5mg/kg进行IV给药后鼠肾中的ODN浓度。
图37显示了在以5mg/kg进行IT给药后鼠肾中的ODN浓度。
图38显示了在以5mg/kg进行SEQ ID NO：313的IV给药后鼠肾中SEQ ID NO：313和其八聚体的浓度。
图39显示了在以5mg/kg进行SEQ ID NO：313的IT给药后鼠肾中SEQ ID NO：313和其八聚体的浓度。
图40是一组半柔性ODN与具有相同序列的完全硫代磷酸酯ODN相比的刺激指数图。
图41是一组对柔性(SEQ ID NO：294)，半柔性(SEQ ID NO：241)，和完全硫代磷酸酯ODN(SEQ ID NO：242)给药发生反应的细胞因子诱导的条形图A&B(IP-10)，C(IFN)，和D&E(TNF)。
图42是一组对柔性(SEQ ID NO：294)，半柔性(SEQ ID NO：241)，和完全硫代磷酸酯ODN(SEQ ID NO：242)的给药发生反应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞活性图。
图43是一组在小鼠中用半柔性(SEQ ID NO：241)或完全硫代磷酸酯ODN(SEQ ID NO：242)进行抗肿瘤治疗的图。图43A和B显示了在肾细胞癌模型中的结果。图43C和D显示了在鼠成神经细胞瘤模型中的结果。图43E和F显示了在鼠非小细胞肺癌模型中的结果。
发明详述
根据本发明提供了柔性和半柔性的免疫刺激核酸。在某些实施方案中，本发明所述的免疫刺激寡核苷酸具有改善的性质，包括类似的或增高的功效，对肾，肝和脾具有减少的全身暴露，并且在注射部位可能具有降低的反应原性。虽然申请人并不受到某一机制的限制，但是相信这些改善的性质与策略性地在所述免疫刺激寡核苷酸内放置磷酸二酯或磷酸二酯样“核苷酸间连接”有关。这里所说的术语“核苷酸间连接”是指在一个核酸分子中连接两个相邻核苷酸的共价骨架连接。所述共价骨架连接典型地是修饰的或未修饰的磷酸酯连接，但是其它变体也可以。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有n-1个核苷酸间连接。根据本发明的教导所述免疫刺激寡核苷酸中的这些共价骨架连接可以是修饰的或未修饰的。
特别是，磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接包括“内部二核苷酸”。通常内部二核苷酸是指任意一对通过核苷酸间连接相连的相邻核苷酸，其中该对核苷酸中的任何一个都不是末端核苷酸，即，该对核苷酸中没有一个核苷酸是所述寡核苷酸的5’或3’末端。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个二核苷酸，只有n-3个内部二核苷酸。内部二核苷酸的每个内部核苷酸间连接都是内部核苷酸间连接。因此n个核苷酸长的线性寡核苷酸具有总共n-1个二核苷酸，只有n-3个内部二核苷酸。因此，策略性放置的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接指位于核酸序列中任意一对核苷酸之间的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。在一些实施方案中所述磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接不位于靠近5’或3’端的任何一对核苷酸之间。
本发明至少在某些方面是基于惊人地发现了本文所述的柔性和半柔性核酸在许多情况下与相应的具有相同的核苷酸序列的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比，至少具有相同的，或者在许多情况下具有更强的免疫刺激活性。这种现象是无法预料的，因为一般认为硫代磷酸酯寡核苷酸通常比不稳定的寡核苷酸更具有免疫刺激效果。此结果是令人惊讶的，这是因为一般预期如果在关键的免疫刺激基序，即CG之间放置“柔性化”的键，那么所述核酸可能会具有降低的活性，因为所述核酸在体内很容易断裂成不含CG的片段。与此预期结果相反，许多这些核酸实际上在体外和体内都具有同等的或是更强的活性。柔性和半柔性寡核苷酸比它们的完全稳定的对应物即使不是更有效，至少也具有相同的功效；柔性和半柔性寡核苷酸的净免疫刺激效果代表着活性和稳定性之间的平衡。在高浓度下，这种平衡倾向于活性，也就是功效占优势。在低浓度下，这种平衡倾向于稳定性，也就是与核酸酶易感性相关的相对不稳定性占优势。
本发明一方面涉及柔性寡核苷酸。柔性寡核苷酸是一种具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中只在至少一个内部嘧啶-嘌呤二核苷酸(YZ)的内部或其紧邻部位具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。优选YZ是YG，嘧啶-鸟嘌呤核苷(YG)二核苷酸。所述至少一个内部YZ二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。所述至少一个内部YZ二核苷酸紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接可以是在所述至少一个内部YZ二核苷酸的5’，3’或同时在5’和3’。优选所述至少一个内部YZ二核苷酸紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接本身是内部核苷酸间连接。因此对于序列N1YZ N2，其中N1和N2每一个独立于另一个是任意单个核苷酸，所述YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样连接，此外(a)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，(b)当N2是内部核苷酸的时候，Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样连接相连，或者(c)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，并且当N2是内部核苷酸的时候，Z和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样连接相连。
柔性寡核苷酸的非限制性实施例包括SEQ ID NO 105-231，SEQ ID NO 232-234，SEQ ID NO 235-237，和SEQ ID NO 238-240所述的那些。
根据本发明的柔性寡核苷酸与完全稳定的寡核苷酸相比相对比较容易受到核酸酶的切割。相信本发明的柔性寡核苷酸相对于全长柔性寡核苷酸可被切割为具有降低的或没有免疫刺激活性的片段，但这并不意味着受到特定理论或机制的限制。引入至少一个核酸酶敏感的核苷酸间连接，特别是在所述寡核苷酸中部附近，可以提供一个“关闭开关”，它可以改变所述寡核苷酸的药物动力学以至于可以减少所述寡核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时间。这在组织和临床应用中可能具有特殊的价值，因为它可以避免慢性局部炎症或免疫刺激相关的伤害，例如肾。
本发明的另一个方面涉及半柔性寡核苷酸。半柔性寡核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中仅仅在至少一个内部嘧啶-嘌呤(YZ)二核苷酸的内部具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。半柔性寡核苷酸与相应的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比，通常具有增强的免疫刺激效果。例如，半柔性SEQ ID NO：241的免疫刺激能力是完全硫代磷酸酯的SEQ ID NO：242的2-5倍，其中这两个寡核苷酸具有相同的核苷酸序列，只有内部YZ核苷酸间连接不同，如下所示，其中*表示硫代磷酸酯，_表示磷酸二酯：
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：241)
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：242)
SEQ ID NO：241含有内部磷酸二酯核苷酸间连接，同时包括CG和TG(都是YZ)二核苷酸。由于半柔性寡核苷酸具有更强的能力，半柔性寡核苷酸与传统的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸相比，为达到所希望的生物效果，可以用于较低的有效浓度，并且具有较低的有效剂量。
但是完全稳定的免疫刺激寡核苷酸具有剂量反应的最大值，本发明的半柔性寡核苷酸显示出单调增加的剂量反应曲线(通过TLR9刺激测定)，在超出了相应的完全稳定的免疫刺激寡核苷酸的最佳浓度以后仍然可以达到更高浓度。因此相信本发明的半柔性寡核苷酸比完全稳定的免疫刺激寡核苷酸能够诱导更强的免疫刺激。
根据本发明，弱免疫刺激完全稳定的寡核苷酸的免疫刺激活性可以通过引入至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的内部YZ二核苷酸而得到提高。因此可以从具有完全稳定骨架的弱免疫刺激寡核苷酸开始，通过用磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接替换至少一个内部YG二核苷酸的稳定核苷酸间连接从而改善其免疫刺激活性。例如，发现SEQ ID NO：243比它的完全稳定的对应物SEQ ID NO：244具有更强的免疫刺激活性，其中SEQ ID NO：244与SEQ ID NO：242相比是相对弱的免疫刺激寡核苷酸：
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：243)
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：244)
但是少于20个核苷酸长的完全稳定的免疫刺激核酸与较长(例如24个核苷酸长)的完全稳定寡核苷酸相比具有更适当的免疫刺激活性，发现16个核苷酸长的半柔性寡核苷酸至少具有与超过20个核苷酸长的完全稳定的寡核苷酸的免疫刺激活性相同的免疫刺激活性。例如SEQ ID NO：245和5602(都是部分序列与SEQ ID NO：242类似的16聚体)具有与SEQ ID NO：242(24聚体)相当的免疫刺激活性。
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：245)
5602 T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQID NO：56)
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：242)
在一些实例中，六聚体硫代磷酸酯寡核苷酸看来似乎没有免疫刺激活性，甚至是用一个磷酸二酯内部YZ核苷酸间连接代替硫代磷酸酯连接也会产生相应的具有免疫刺激活性的六聚体。
还认为半柔性寡核苷酸的上述性质通常随着内部YZ二核苷酸中的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的“剂量”的增加而增加。因此认为，例如，通常对给定的具有五个内部YZ二核苷酸的寡核苷酸序列来说，具有五个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸比具有四个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YG核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果，后者依次也比具有三个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果，后者依次也比具有两个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果，后者依次也比具有一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的寡核苷酸更具免疫刺激效果。重要的是，甚至只是含有一个内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接也认为优于没有内部磷酸二酯或磷酸二酯样YZ核苷酸间连接的。除了磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的数目，沿着核酸长度上的位置分布也影响其功效。
半柔性寡核苷酸的非限制性实施例包括如SEQ ID NO 1-99和241和SEQ ID NO 100-104所述的那些。
本发明的免疫刺激寡核苷酸通常受到保护以免其在血清中被快速降解。本发明的免疫刺激寡核苷酸通常也受到保护以免其在大部分组织中被快速降解，除了特定的具有特异的或过量的核酸酶活性能够降解所述免疫刺激寡核苷酸的组织。这导致在那些特定的组织中免疫刺激寡核苷酸减少，否则在用可抵抗降解的寡核苷酸进行的长期治疗中这些免疫刺激寡核苷酸的积累会导致不希望的效果。本发明的寡核苷酸通常包括，除了在优选的内部位置上的磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接之外，还包括能抵抗降解的5’和3’端。这种抵抗降解的末端可以包括任何能使得对核酸外切酶切割的抗性比相应的未修饰末端增强的适当的修饰。例如，所述5’和3’末端可以通过在骨架上的至少包含一个磷酸盐修饰实现稳定。在优选的实施方案中，在所述骨架的每个末端的至少一个磷酸盐修饰独立地是硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，或甲基硫代磷酸酯核苷酸间连接，在另一个实施方案中，所述可抵抗降解的末端包括一个或多个通过肽或3’末端的酰胺键连接起来的核苷酸单位。但是本发明也包括其它稳定的末端，包括但不限于下面将要描述的。
如上所述，本发明的寡核苷酸包括在内部YG二核苷酸内部的或其紧邻部位的磷酸二酯或磷酸二酯样连接。这种YG二核苷酸通常是免疫刺激基序的一部分。但是寡核苷酸不需要在每个免疫刺激基序内都含有磷酸二酯或磷酸二酯样连接。例如，寡核苷酸例如T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：242)具有四个CpG二核苷酸，可以在第二，第三或第四个CpG二核苷酸的C和G之间，具有磷酸二酯连接，或者可以是其任意组合。甚至在肾脏对这些“稳定寡核苷酸”更快消化的情况下另外的磷酸二酯或磷酸二酯样连接也能保留下来。例如SEQ ID NO：242进一步含有两个内部TG二核苷酸，其中一个或两个，单独或与任何一个内部CG二核苷酸或其组合结合，都可以具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。
磷酸二酯核苷酸间连接是天然的核酸连接特征类型。如图20所示，所述磷酸二酯核苷酸间连接包括磷原子，其侧翼是两个桥接的氧原子，另外还与两个氧原子相连，一个带电荷，一个不带电荷。当所述寡核苷酸的组织半衰期的减少是非常重要的时候，磷酸二酯核苷酸间连接是特别优选的。
磷酸二酯样核苷酸间连接是含有磷的桥接基团，在化学性质上和/或非对映性质上与磷酸二酯类似。对其与磷酸二酯相似性的检测包括对核酸酶消化的易感性以及激活RNAse H的能力。因此例如磷酸二酯寡核苷酸，而不是硫代磷酸酯寡核苷酸易被核酸酶消化，但是磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都能够激活RNAse H。在优选的实施方案中所述磷酸二酯样核苷酸间连接是boranophosphate(或等同的硼烷基磷酸酯)连接。美国专利序列号5,177,198；美国专利序列号5,859,231；美国专利序列号6,160,109；美国专利序列号6,207,819；Sergueev et al.，(1998)J Am Chem Soc 120：9417-27。在另一个优选的实施方案中所述磷酸二酯样核苷酸间连接是非对映的纯的Rp硫代磷酸酯。认为非对映的纯的Rp硫代磷酸酯比混和的或非对映的纯的Sp硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化，激活RNAse H的能力也更强。CpG寡核苷酸的立体异构体是1999年7月27日申请的共同未决的美国专利申请09/361,575，公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO00/06588)请求保护的主题。应当注意，为本发明的目的，术语“磷酸二酯样核苷酸间连接”特别地不包括二硫代磷酸酯和膦酸甲酯核苷酸间连接。
本发明的免疫刺激核酸分子具有嵌合骨架。为本发明的目的，嵌合骨架指部分稳定的骨架，其中至少一个核苷酸间连接是磷酸二酯或磷酸二酯样连接，其中至少一个其它核苷酸间连接是稳定核苷酸间连接，其中至少一个磷酸二酯或磷酸二酯样连接和至少一个稳定连接是不同的。由于已有报道认为硼烷基磷酸酯连接相对于磷酸二酯连接是稳定的，为使骨架达到嵌合状态，可将硼烷基磷酸酯连接分类为磷酸二酯样的或是稳定的，这取决于其所处环境。例如，根据本发明，在一个实施方案中，嵌合骨架包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)连接和至少一个硼烷基磷酸酯(稳定)连接。根据本发明，在另一个实施方案中嵌合骨架可以包括硼烷基磷酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯样)和硫代磷酸酯(稳定的)连接。“稳定的核苷酸间连接”是指与磷酸二酯核苷酸间连接相比，在体内降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)中相对具有抵抗力的核苷酸间连接。优选的稳定核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯和甲基硫代磷酸酯。其它稳定的核苷酸间连接包括但不限于：肽，烷基，去磷酸和上述其它物质。
修饰的骨架例如硫代磷酸酯可以用氨基磷酸酯或H-膦酸盐化学方法用自动技术合成。可以用例如美国专利序列号4,469,863中描述的方法制备芳基和烷基膦酸盐；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧用美国专利序列号5,023,243和欧洲专利序列号092,574中的方法烷基化)可以使用商业可获得的试剂用自动固相合成方法制备。现有技术中对于制备其它DNA骨架修饰和取代的方法已有描述。Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90：544；GoodchildJ(1990)Bioconjugate Chem 1：165。制备嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如Uhlmann等的专利中描述了这些技术。
混和骨架修饰的ODN可以使用商业可获得的DNA合成仪和标准亚磷酰胺化学合成。(F.E.Eckstein，“Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach” IRL Press，Oxford，UK，199 1，and M.D.Matteucci andM.H.Caruthers， Tetrahedron Lett. 21，719(1980))。偶合以后，用Beaucage试剂(R.P.Iyer，W.Egan，J.B.Regan and S.L.B eaucage， J.Am.Chem.Soc. 11 2，1253(1990))(在乙腈中浓度为0.075M)或苯乙酰二硫化物(PADS)通过硫化反应，然后用乙酸酐，2，6-卢剔啶的四氢呋喃溶液(1∶1∶8；v∶v∶v)和N-甲基咪唑(在四氢呋喃中浓度为16％)加帽，引入PS连接。该加帽步骤在硫化反应之后进行以最大程度地减少在应是硫代磷酸酯的部位上形成不希望的磷酸二酯(PO)连接。在磷酸二酯连接的引入过程中，例如在CpG二核苷酸上，中间的硫-III通过碘的水/吡啶溶液处理被氧化。从固体支持物上切割下来以后，通过浓缩氨的处理进行最后的去保护(15小时，50℃)，用NaCl梯度(例如缓冲液A∶乙腈/水＝1∶4/v∶v中NaH2PO4浓度为10mM，pH6.8；缓冲液B∶乙腈/水＝1∶4/v∶v中NaH2PO4浓度为10mM，NaCl浓度为1.5M；在30分钟内5到60％B，速度为1ml/min)在Gen-Pak Fax柱(Millipore-Waters)上进行HPLC或者用毛细管电泳分析ODN。可以用HPLC或在Source High Performance柱(Amersham Pharmacia)上用FPLC纯化。将HPLC-单一级分混和并通过C18柱或超滤进行脱盐。用MALDI-TOF质谱对ODN进行分析以确定计算质量。
本发明的核酸还可以包括其它修饰。包括非离子的DNA类似物，例如烷基和芳基磷酸盐(其中带电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧被烷基化。含有二醇的核酸，例如四乙二醇或六乙二醇，其每个末端或所有末端都能抵抗核酸酶的降解。
所述免疫刺激寡核苷酸的大小(即沿着核酸长度方向上的核苷酸残基的数目)可能也影响所述寡核苷酸的刺激活性。为了便于细胞吸收，免疫刺激寡核苷酸优选最小长度为6个核苷酸残基。根据本发明，如果存在足够的免疫刺激基序，任何大于6个核苷酸(甚至数个kb长)的核酸都能诱导免疫反应，较大的核酸在细胞内部被降解。本发明认为如果可以递送到细胞内部，短至4个核苷酸长的半柔性寡核苷酸也可以具有免疫刺激效果。根据本发明，在特定的优选实施方案中，所述免疫刺激寡核苷酸在4到100个核苷酸之间。在典型的实施方案中所述免疫刺激寡核苷酸在6到40个核苷酸之间。根据本发明，在特定的优选实施方案中，所述免疫刺激寡核苷酸在6到19个核苷酸之间。
本发明的寡核苷酸是含有能引起免疫反应的特异序列的核酸。这些能引起免疫反应的特异序列被称为“免疫刺激基序”，含有免疫刺激基序的寡核苷酸被称为“免疫刺激核酸分子”以及，等同的，“免疫刺激核酸”或“免疫刺激寡核苷酸”。本发明的免疫刺激寡核苷酸因此包括至少一个免疫刺激基序。在一个优选的实施方案中，所述免疫刺激基序是“内部免疫刺激基序”。术语“内部免疫刺激基序”指所述基序序列的位置在较长的核酸序列内部，所述核酸序列在长度上比所述基序序列长，其中在所述免疫刺激基序序列的5’和3’端都至少连接着一个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫刺激寡核苷酸包括免疫刺激基序“CpG二核苷酸”。CpG二核苷酸可以是甲基化的或未甲基化的。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激核酸是含有未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化的5’胞嘧啶核苷以及3’鸟嘌呤核苷，并通过磷酸键相连)并能激活免疫系统的核酸；这种免疫刺激核酸就是CpG核酸。CpG核酸在许多公告专利，公开专利申请，和其它出版物，包括美国专利序列号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068中都有描述。含有至少一个甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激核酸是含有甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即甲基化的5’胞嘧啶核苷以及3’鸟嘌呤核苷，并通过磷酸键相连)并能激活免疫系统的核酸。在其它实施方案中所述免疫刺激寡核苷酸不含CpG二核苷酸。这些不含CpG二核苷酸的寡核苷酸称为非CpG寡核苷酸，它们具有非CpG寡核苷酸基序，其可以是甲基化的或未甲基化的。本发明的免疫刺激寡核苷酸进一步可以包括甲基化和未甲基化CpG和非CpG免疫刺激基序的任意组合。
对于CpG核酸，最近发现具有不同类型的CpG核酸。一类能够激活B细胞但是诱导IFN-α和NK细胞激活的能力相对较弱；这一类型称为B类。B类CpG核酸典型地是完全稳定的，在特定优选的碱基中包括一个未甲基化CpG二核苷酸。参见，例如美国专利序列号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。另一类能够诱导IFN-α和NK细胞激活但是刺激B细胞的能力相对较弱；这一类型称为A类。A类CpG核酸典型地在5’和3’端具有稳定poly-G序列，以及至少6个核苷酸的含有磷酸二酯CpG二核苷酸的回文序列。参见，例如公开的专利申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)。还有一类CpG核酸可激活B细胞和NK细胞并能诱导IFN-α；这一类被称为C类。C类CpG核酸，如同最初所描述的，典型地是完全稳定的，包括B类型序列和富含GC的回文结构或类回文结构。这一类在2001年8月17日申请的共同未决的美国临时专利申请60/313,273，和2002年8月19日申请的US10/224,523中有描述，在此引入其全文作为参考。C类核酸的一些非限制性实例包括：
SEQIDNO                   序列
275 T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
369 T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
370 T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
371 T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
372 T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
373 T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
374 T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
375 T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G
316 T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
因此，本发明的一个方面发现了具有嵌合骨架的CpG免疫刺激寡核苷酸的特定的亚类能够非常有效地调节免疫刺激效果。这些CpG核酸可在治疗或预防中用于刺激免疫系统以治疗癌症，传染性疾病，变态反应，哮喘，自体免疫性疾病，以及其它失调，并可在癌症化疗之后帮助保护不受到机会感染。这种CpG刺激所引起的强烈但是平衡的，细胞和体液的免疫反应反应了机体自身对于病原体和癌细胞入侵的天然防御系统。
本发明在一方面发现了CpG免疫刺激寡核苷酸具有改善的免疫刺激性质并且具有降低的肾脏炎症效果。在一些实例中，在给予了完全硫代磷酸酯寡核苷酸的患者中观察到肾脏炎症。相信本文所描述的嵌合核酸比完全硫代磷酸酯的寡核苷酸产生的肾脏炎症更少。此外这些寡核苷酸在刺激免疫反应方面非常有效。因此分子的磷酸二酯区域并不降低其功效。
优选的CpG免疫刺激寡核苷酸如下述6个通式中任一个所述：
5’T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2 *T*T 3’(SEQ IDNO：296)，
5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4CGN5 *T*T 3(’SEQID NO：301)，
5’T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：307)，
5’T*C_G(N6C_GN7)2-3T*C_G*T*T*T 3’(SEQ ID NO：311-312)
5’T*T*GX1X2TGX3X4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：331)和
5’T*CGCGN8CGCGC*GN9 3’(SEQ ID NO：332)
在这些通式中N是任何核苷酸，N1是0-6个核苷酸，N2是0-7个核苷酸，N3是0-4个核苷酸，N4是1-5个核苷酸，N5是0-7个核苷酸，N6和N7独立地长度在1到5个核苷酸之间，N8长度在4到10个核苷酸之间，N9长度在0到3个核苷酸之间，其中N1O的长度在4到8个核苷酸之间。X1，X2，X3和X4独立地是C或G。上述通式定义了CpG寡核苷酸类的亚集，这些寡核苷酸被证明具有非常好的免疫刺激性质，在体内比含有完全硫代磷酸酯的寡核苷酸更易受到降解。在通式中5’指所述寡核苷酸的自由5’末端，3’指所述寡核苷酸的自由3’末端。
通式中所用的符号*指存在稳定的核苷酸间连接。在所述寡核苷酸包括至少2-3个磷酸二酯核苷酸间连接的时候，不用*标记的核苷酸间连接可以是稳定的或不稳定的。在一些实施方案中优选所述寡核苷酸包括3-6个磷酸二酯连接。在一些情况下CG基序之间的连接是磷酸二酯，在另一些情况下是硫代磷酸酯或其它稳定的连接。
其它通式包括5’TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3’(SEQ ID NO：368)，其中至少一个CG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接和5’GNC 3；其中N是长度为4-10个核苷酸的核酸序列，至少具有50％T，不包括CG二核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一个稳定核苷酸间连接。
在一些实施方案中所述寡核苷酸具有下述结构之一：
5’T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2 *T*T3’(SEQ IDNO：296)，
5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GAN1C*G*N2 *T*T 3’(SEQ ID NO：296)
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G A_N1C*G*N2 *T*T3’(SEQ ID NO：296)，
5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4C*G*N5 *T*T 3’(SEQ ID NO：301)，
5’T*C*G*A*T*N3C*G*TTTTN4C_G_*N5 *T*T 3’(SEQ ID NO：302)，
5’T*C*G*T*T*N3C_G_TTTTN4CGN5 *T*T 3’(SEQ ID NO：303)，
5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：307)，5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T3’(SEQ IDNO：308)，或者5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：309)。
这些结构中的符号指存在磷酸二酯核苷酸间连接。
所述结构的一些优选的实施例包括下述各式：
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T 3’(SEQ ID NO：327)
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO：328)
5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO：324)
5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T 3(SEQID NO：325)
5’T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO：323)
5’T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO：326)
5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T 3’(SEQ ID NO：322)
5’T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3’(SEQ ID NO：313)
5’T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3’(SEQ ID NO：314)
5’T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO：319)
5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO：316)
5’T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G 3’(SEQ ID NO：317)
5’T*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T 3’(SEQ ID NO：320)
5’T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’(SEQ ID NO：321)，T*C-G*T*C-G*T*T，C-G*T*C-G*T*T*T，G*T*C-G*T*T*T*T，T*C-G*T*T*T*T*G，C-G*T*T*T*T*G*A，T*T*T*T*G*A*C-G，T*T*T*G*A*C-G*T，T*T*G*A*C-G*T*T，T*G*A*C-G*T*T*T，G*A*C-G*T*T*T*T，A*C-G*T*T*T*T*G，C-G*T*T*T*T*G*T，T*T*T*T*G*T*C-G，T*T*T*G*T*C-G*T，G*T*T*T*T*G*T*C，或T*T*T*G*T*C-G*T*T。
所述免疫刺激寡核苷酸通常长度在4到100个之间，在一些实施方案中在10到40个之间。所述长度也可以在16到24个核苷酸之间。
术语“核酸”和“寡核苷酸”还包括具有取代或修饰的核酸或寡核苷酸，例如在碱基和/或糖上。例如，包括具有在2’部位与除羟基以外的，并且在5’部位与除磷酸盐基团或羟基以外的低分子量的有机基团共价结合的骨架糖的核酸。因此修饰的核酸可以包括2’-O-烷基化核糖基团。此外，修饰的核酸可以包括用糖例如阿拉伯糖或2’-氟代阿拉伯糖取代核糖。因此所述核酸在骨架组分上可以是异质的，因而可以含有任何可能的例如肽-核酸相连的聚合物单元(具有氨基酸骨架和核酸碱基)的组合。
核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶例如C-5丙炔嘧啶和7-去氮杂-7-取代的嘌呤修饰的碱基。Wagner R W et al.(1996)Nat Biotechnol 14：840-4.嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-氟代胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，次黄嘌呤和其它天然和非天然的核碱基，取代的和未取代的芳香部分。其它这种修饰是本领域技术人员所公知的。
本发明的免疫刺激寡核苷酸与天然RNA和DNA相比，可以包括各种化学修饰和取代，包括磷酸二酯核苷酸间桥接，β-D-核糖单位和/或天然核苷酸碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶)。化学修饰的实例是技术人员所公知的，在例如Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90：543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36：107-129；和Hunziker J etal.(1995)Mod Synth Methods 7：331-417中有描述。根据本发明的寡核苷酸可以具有一个或多个修饰，与具有同样序列的由天然DNA或RNA组成的寡核苷酸相比，其中每个修饰都位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥接和/或特定的β-D-核糖单位和/或特定的天然核苷酸碱基部位。
例如，本发明涉及的寡核苷酸可能含有一个或多个修饰，其中每个修饰独立地选自：
a)用修饰的核苷酸间桥接代替位于核苷酸3’和/或5’端的磷酸二酯核苷酸间桥接，
b)用去磷酸桥接代替位于核苷酸3’和/或5’端的磷酸二酯桥接，
c)用另一个单元代替糖磷酸盐骨架的糖磷酸盐，
d)用修饰的糖单元代替-D-核糖，以及
e)用修饰的核苷酸碱基代替天然核苷酸碱基。
寡核苷酸的化学修饰的更详细的实施例如下所述。
位于核苷酸3’端和/或5’端的磷酸二酯核苷酸间桥接可以被修饰的核苷酸间桥接取代，其中所述修饰的核苷酸间桥接例如可以选自硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，NR1R2-氨基磷酸酯，硼烷基磷酸酯，α-羟苄基膦酸酯，磷酸盐-(C1-C21)-O-烷基酯，磷酸盐-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯，(C1-C8)膦酸烷基酯和/或(C6-C12)磷酸芳基酯桥接，(C7-C12)-α -羟甲基-芳基(例如WO95/01363中公开的)，其中(C6-C12)芳基，(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基可选择地被卤素，烷基，烷氧基，硝基，氰基，其中R1和R2独立地是氢，(C1-C18)-烷基，(C6-C20)-芳基，(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基，优选的是氢，(C1-C8)-烷基，优选的是(C1-C4)-烷基和/或甲氧乙基，或者R1和R2与携带它们的氮原子一起形成5-6-元杂环，所述杂环还可以进一步含有选自O，S和N的杂原子。
位于核苷酸3’端和/或5’端的磷酸二酯桥接被去磷酸桥接取代(去磷酸桥接在例如Uhlmann E and PeymanA in “Methods in Molecular Biology”，Vol.20，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，Chapter 16，pp.355ff有描述)，其中去磷酸桥接例如可以选自去磷酸桥接formacetal，3’-thioformacetal，甲基羟胺，肟，亚甲基二甲基肼撑，二亚甲基砜和/或甲硅烷基团。
糖磷酸盐骨架(即糖磷酸盐骨架由糖磷酸盐单元组成)上的糖磷酸盐单元(即-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥接一起形成糖磷酸盐单元)可以用另一个单元取代，其中另一个单元例如适合于构建“吗啉代衍生物”寡聚物(如例如Stirchak EP et al.(1989)Nucleic Acids Res 17：6129-41中所述)，也就是，例如用吗啉代衍生物单元取代；或者构建聚酰胺核酸(“PNA”；如例如Nielsen PE et al.(1994)Bioconjug Chem 5：3-7中所述)，也就是用PNA骨架单元，例如用2-氨乙基甘氨酸取代。
β-核糖单元或β-D-2’-脱氧核糖单元可以被修饰的糖单元取代，其中修饰的糖单元例如选自β-D-核糖，α-D-2’-脱氧核糖，L-2’-脱氧核糖，2’-F’-2’-脱氧核糖，2’-F-阿拉伯糖，2’-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选的2’-O-(C1-C6)烷基-核糖是2’-O-甲基核糖，2’-O-(C2-C6)烯基-核糖，2’-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖，2’-NH2-2’-脱氧核糖，β-D-木-呋喃糖，α-阿拉伯呋喃糖，2，4-二脱氧-β-D-赤-6-吡喃糖，和碳环(如例如Froehler J(1992)Am ChemSoc 114：8320中所述)和/或开环糖类似物(如例如Vandendriessche et al.  (1993)Tetrahedron 49：7223 中所述)和/或二环糖类似物(如例如Tarkov M et al.(1993)Helv Chim Acta 76：481中所述)。
在一些优选的实施方案中所述糖是2’-O-甲基核糖，特别是其中一个或全部核苷酸通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连。
核酸还包括取代的嘌呤和嘧啶例如C-5丙炔嘧啶和7-去氮杂-7-取代的嘌呤修饰的碱基。Wagner RW et al.(1996)Nat Biotechnol 14：840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，和胸腺嘧啶，以及其它天然或非天然存在的核碱基，取代的和未取代的芳香部分。
修饰的碱基可以是与天然存在于DNA和RNA中的碱基例如T，C，G，A和U在化学性质上不同，但是与这些天然碱基在基本化学结构上相同的任何碱基。修饰的核苷酸碱基可以是，例如选自次黄嘌呤，尿嘧啶，二氢尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-氨基尿嘧啶，5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶，5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶，5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶，5-(羟甲基)尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟基胞嘧啶，5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶，5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶，5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，N2-二甲基鸟嘌呤，2，4-二氨基-嘌呤，8-氮杂嘌呤，取代的7-去氮杂嘌呤，优选7-去氮杂-7-取代的和/或7-去氮杂-8-取代的嘌呤，5-羟甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，例如N4-乙基胞嘧啶，5-羟基脱氧胞苷，5-羟甲基脱氧胞苷，N4-烷基脱氧胞苷，例如N4-乙基脱氧胞苷，6-硫代脱氧鸟苷，和硝基吡咯的脱氧核苷酸，C5-丙炔嘧啶，和二氨基嘌呤，例如2，6-二氨基嘌呤，次黄嘌呤核苷，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤或其它对天然核苷酸碱基的修饰。这些列表只是举例说明而并非限制。
在本文所述的特定通式中定义了一组修饰的碱基。例如字母Y用于表示含有胞嘧啶或修饰的胞嘧啶的核苷酸。这里所说的修饰的胞嘧啶是天然存在的或非天然存在的胞嘧啶的嘧啶碱基类似物，它可以取代该碱基而不会破坏所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的胞嘧啶包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-氯代-胞嘧啶，5-溴代-胞嘧啶，5-碘代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)，6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)，5-氮杂-胞嘧啶，2-巯基-胞嘧啶，异胞嘧啶，假-异胞嘧啶，具有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N，N’-丙烯胞嘧啶或吩恶嗪)，和尿嘧啶和它的衍生物(例如5-氟代-尿嘧啶，5-溴代-尿嘧啶，5-溴乙烯基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，5-羟基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶)。一些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-羟甲基-胞嘧啶，和N4-乙基-胞嘧啶。在本发明的另一个实施方案中，所述胞嘧啶碱基被一般的碱基(例如3-硝基吡咯，P-碱基)，芳香环系统(例如氟苯或二氟苯)或氢原子(dSpacer)。
字母Z用于表示鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤碱基。这里所述的修饰的鸟嘌呤是天然存在的或非天然存在的鸟嘌呤的嘌呤碱基类似物，它可以取代该碱基而不会破坏所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修饰的鸟嘌呤包括但不限于7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂-7-取代的鸟嘌呤(例如7-去氮杂-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)，7-去氮杂-8-取代的鸟嘌呤，次黄嘌呤，N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)，5-氨基-3-甲基-3H，6H-thiazolo[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲哚，腺嘌呤，取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤，8-氧代-腺嘌呤)8-取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)，和6-硫代鸟嘌呤。在本发明的另一个实施方案中，所述鸟嘌呤碱基被一般的碱基(例如4-甲基-吲哚，5-硝基-吲哚，和K-碱基)，芳香环系统(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑，1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸酰胺)或者氢原子(dSpacer)。
所述寡核苷酸可以具有一个或多个可及的5’末端。能够制备具有两个这样的5’末端的修饰的寡核苷酸。这可以通过将两个寡核苷酸通过3’-3’连接相连起来产生具有一个或两个可及的5’末端的寡核苷酸。3’-3’连接可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或任意其它修饰的核苷酸间桥接。获得这种连接的方法是本领域已知的。例如，这种连接在Seliger，H.；et al.，Oligonucleotide analogs with terminal3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression，Nucleotides & Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77 and Jiang，et al.，Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro and in vivo properties，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)，7(12)，2727-2735中有描述。
此外，其中3’末端核苷酸之间的连接并非磷酸二酯，硫代磷酸酯或其它修饰的桥接的3’-3’连接的核酸可以用另外的间隔基团制备，例如三或四乙二醇磷酸盐部分(Durand，M.et al，Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains，Biochemistry(1992)，31(38)，9197-204，US Patent No.5658738，和美国专利序列号5668265)。另外，非核苷酸的连接子可以用标准的亚磷酰胺化学从乙二醇，丙二醇，或得自脱碱基脱氧核糖(dSpacer)单元(Fontanel，MarieLaurence et al.，Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5′-attached tooligonucleotides；Nucleic Acids Research(1994)，22(11)，2022-7)获得。非核苷酸连接子可以一次引入或多次引入，或者彼此组合以使要被连接的两个ODN的3’末端之间具有任意希望的距离。
最近已有报道认为CpG寡核苷酸通过和Toll样受体9(TLR9)之间的相互作用行使其免疫刺激效果。HemmiH et al.(2000)Nature 408：740-5.因此对CpG寡核苷酸或其它免疫刺激核酸相应的TLR9信号传导活性可以通过测量NF-κB，NF-κB相关的信号，以及NF-κB上游的合适事件和中间产物来进行测量。
为在本发明中使用，本发明的寡核苷酸可以用本领域熟知的多种方法中的任何一种进行合成。例如，b-氰乙基亚磷酰胺方法(Beaucage，S.L.，and Caruthers，M.H.，Tet.Let. 22：1859，1981)；核苷酸H-膦酸盐方法(Garegget al.，Tet. Let. 27：4051-4054，1986；Froehler et al.，Nucl.Acid.Res. 14：5399-5407，1986，；Garegg et al.，Tet.Let. 27：4055-4058，1986，Gaffney et al.，Tet.Let.29：2619-2622，1988)。这些化学方法可以使用各种市场上可获得的自动核酸合成仪进行操作。这些寡核苷酸被称为合成寡核苷酸。分离的寡核苷酸通常是指从天然状态下与之结合的组分中分离出来的寡核苷酸。作为一个例子，分离的寡核苷酸可以是从细胞，从核，从线粒体或从染色质中分离出来。
所述寡核苷酸对降解具有部分抗性(例如是稳定的)。“稳定的寡核苷酸分子”指对于体内降解(例如通过外切或内切核酸酶)相对具有抗性的寡核苷酸。核酸稳定性可以通过骨架修饰获得。具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸具有最大的活性，保护所述寡核苷酸不被细胞内外切或内切核酸酶降解。其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯修饰的核酸，磷酸二酯核硫代磷酸酯核酸的组合，膦酸甲酯，甲基硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，对乙氧基，及其组合。
修饰的骨架例如硫代磷酸酯可以用自动方法用氨基磷酸酯或H-膦酸盐化学合成。芳基和烷基膦酸盐可以用例如美国专利序列号4,469,863所述的方法制备；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧用美国专利序列号5,023,243和欧洲专利序列号092,574中所述的方法进行烷基化)可以用商业可获得的试剂用自动固相合成制备。制备其它DNA骨架修饰和取代的方法已有描述(例如Uhlmann，E.andPeyman，A.，Chem.Rev. 90：544,1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem. 1：165，1990)。
其它稳定的寡核苷酸包括：非离子的DNA类似物，例如烷基和芳基磷酸盐(其中带电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基基团取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧被烷基化。含有二醇的核酸，例如四乙二醇或六乙二醇，其每个或全部末端都可以抵抗核酸酶降解。
虽然在小鼠中CpG的作用已经非常清楚，但是对人系统中的信息还所知甚少。在鼠系统中具有强烈免疫刺激活性的CpG硫代磷酸酯寡核苷酸在人和其它啮齿类免疫细胞中的活性较低。在实施例中描述了可能的人CpG基序的发育以及其对于人PBMC，例如B细胞和NK细胞的作用和机制的特性。含有这些CpG基序和部分修饰的骨架的DNA强烈的刺激人外周血细胞产生IL-6，IL-10，IP-10，TNF-α，IFN-α，和IFN-γ。IFN-γ增加至高于对照水平。NK细胞和T细胞也被诱导表达升高水平的CD69。
根据本发明已发现CpG免疫刺激寡核苷酸的子集对于人细胞例如NK细胞具有强烈的免疫刺激效果，表明这些CpG免疫刺激寡核苷酸是有效的治疗剂，可用于人疫苗，癌症免疫疗法，哮喘免疫疗法，一般性地增强免疫功能，增强放射性或化学疗法之后的造血功能的恢复，自体免疫性疾病和其它免疫调节应用。
因此在本发明的某些方面，所述CpG免疫刺激寡核苷酸可用作疫苗治疗具有患变态反应或哮喘，被传染性生物体感染或已识别了特异癌抗原的癌症的患病危险的患者。所述CpG免疫刺激寡核苷酸还可以在没有抗原或变态反应原的条件下用以防止感染，变态反应或癌症，在这种情况下重复给药可以获得更长时间的保护。这里所说的具有患病危险的患者是具有任何暴露于引起感染的病原体或癌症或变态反应原中的危险或者具有患癌症危险的患者。例如，具有患病危险的患者可以是计划去发现有特定类型的传染剂存在的地区旅行的患者，或者可以是其生活方式或者医疗方法是暴露于含有传染性生物体的的体液中或者直接暴露于该生物体中的患者，或者甚至是居住在具有传染性微生物或变态反应原的地区的任何患者。具有患传染性危险的患者还包括医疗机构推荐其进行特定的传染性生物体抗原接种的一般人群。如果所述抗原是变态反应原，所述患者发生针对该特定抗原的变态反应，患者可能是暴露于该抗原中，即在花粉季节中，患者就具有暴露于抗原中的危险。具有患变态反应或哮喘危险的患者包括那些具有变态反应或哮喘，但是在CpG免疫刺激寡核苷酸治疗过程中没有发病的患者，以及那些由于遗传或环境因素被视为具有患这些疾病危险的患者。
具有患癌症危险的患者是那些具有高度可能性发生癌症的患者。这些患者包括，例如具有遗传异常的患者，遗传异常的存在已被证明与发生癌症的较高可能性存在相关关系，以及暴露于能引发癌症的试剂，例如烟草，石棉，或其它化学毒素中的患者，或者曾经进行过癌症治疗并且明显缓解的患者。当具有患癌症危险的患者用对患者具有患病危险的这种类型的癌症特异的抗原和CpG免疫刺激寡核苷酸进行治疗的时候，患者可能能在癌症发展的时候杀死癌细胞。如果患者中开始形成肿瘤，患者会对肿瘤抗原产生特异的免疫反应。
除了将CpG免疫刺激寡核苷酸用于预防性治疗之外，本发明还包括将CpG免疫刺激寡核苷酸用于治疗具有感染，变态反应，哮喘，或癌症的患者。
具有感染的患者是暴露于感染性病原体中并在身体中具有急性或慢性的可检测水平的病原体的患者。所述CpG免疫刺激寡核苷酸可以与抗原一起使用或者不与它一起使用，以达到抗原特异性的能减少感染性病原体的水平或消除感染性病原体的系统或粘膜免疫反应。这里所说的感染性疾病，是由于身体中存在外源微生物所引发的疾病。开发有效的保护身体粘膜表面的疫苗策略和治疗是特别重要的，粘膜表面是病原体进入身体的第一个部位。
具有变态反应的患者是具有针对变态反应原的变态反应或者具有其患病危险的患者。变态反应是指对于某种物质(变态反应原)的获得性超敏反应。变态反应情况包括但不限于湿疹，过敏性鼻炎或伤风，花粉热，结膜炎，支气管哮喘，风疹(麻疹)和食物过敏，以及其它过敏性情况。
变态反应通常是由于对无害的变态反应原产生IgE抗体而引起的。CpG免疫刺激寡核苷酸的系统或粘膜给药诱导的细胞因子主要是一类称为Th1的细胞因子(例如IL-12，IP-10，IFN-α和IFN-γ)，它诱导了体液和细胞免疫反应。其它主要类型的免疫反应，与IL-4和IL-5细胞因子的产生有关，称为Th2类型免疫反应。基于CpG免疫刺激寡核苷酸能将患者中免疫反应从主要是Th2(与IgE抗体的产生和变态反应相关)的反应转变为平衡的Th2/Th1反应(可进行保护不发生变态反应)，可以给患者施用诱导免疫反应的有效剂量的CpG免疫刺激寡核苷酸以治疗或预防哮喘和变态反应。
因此，所述CpG免疫刺激寡核苷酸具有显著的治疗用途，用于治疗变态反应性或非变态反应性情况例如哮喘。Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5在哮喘患者的呼吸道中含量升高。这些细胞因子促进了哮喘炎性反应的重要方面，包括IgE同位素转换，嗜伊红趋药性和活化以及肥大细胞的生长。Th1细胞因子，特别是IFN-和IL-12，可以抑制Th2克隆的形成和Th2细胞因子的产生。哮喘指呼吸系统的疾病，由炎症，呼吸道狭窄以及呼吸道对于吸入物的增加的反应性来表征。哮喘经常，但不是完全与过敏性或变态反应性症状相关。
患有癌症的患者是指具有可检测到的癌细胞的患者。癌症可以是恶性的或是非恶性的癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳腺癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；黑色素瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌，以及其它癌和肿瘤。在一个实施方案中所述癌症是毛细胞白血病，慢性骨髓性白血病，皮肤T细胞白血病，多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，恶性黑色素瘤，鳞状细胞癌，肾细胞癌，前列腺癌，膀胱细胞癌，或结肠癌。
患者可以指人或脊椎动物，包括但不限于狗，猫，马，牛，猪，绵羊，山羊，火鸡，鸡，灵长类动物，例如猴，以及鱼(水产养殖种类)，例如鲑鱼。因此本发明还可用于治疗非人患者的癌症和肿瘤，感染和变态反应/哮喘。在共生动物(例如猫和狗)中癌症是一种最主要的死亡原因。
这里所述的术语治疗当用于失调例如感染性疾病，癌症，变态反应或哮喘的时候指能够增加患者对于这些疾病(例如受到病原体感染)的抵抗力，或者，换句话说，可减少患者发生这种疾病(例如被病原体感染)的可能性的预防性治疗，以及在患者患有所述疾病以后的治疗，以战胜这些疾病(例如减少患消除感染)或防止这些疾病变的更糟。
在实例中，当CpG寡核苷酸与抗原一起给药的时候，患者可能暴露于抗原中。这里所说的术语暴露于指使患者与抗原接触的主动步骤，或者患者对于体内抗原的被动暴露。将患者主动暴露于抗原的方法是本领域公知的。通常，抗原可通过任何方法例如静脉内，肌肉内，口腔，经皮，粘膜，鼻内，气管内或皮下给药直接给予患者。抗原可进行系统性或局部给药。抗原和CpG免疫刺激寡核苷酸给药的方法在下面将更加详细的介绍。如果抗原在身体内处于可以暴露于免疫细胞的状态，则患者被动地暴露于抗原。患者可以被动地暴露于抗原，例如通过外源病原体进入身体内，或者通过能在其表面表达外源抗原的肿瘤细胞的发育。
其中患者被动地暴露于抗原的方法可特别依赖于所述CpG免疫刺激寡核苷酸给药的时间选择。例如，在具有患癌症或感染性疾病或变态反应或哮喘反应的危险的患者中，当危险为最大的时候，也就是在变态反应季节或者在暴露于能引起癌症的试剂中之后，可以给患者施用所述CpG免疫刺激寡核苷酸。此外所述CpG免疫刺激寡核苷酸可以在旅行者旅行到他们有暴露于感染性试剂的危险的外地之前给他们施用。同样地，所述CpG免疫刺激寡核苷酸可以在患者暴露于可诱导对抗原的系统或粘膜免疫反应的生物战中的时候给予具有这种危险的士兵或平民施用。
这里所用的抗原是能激发免疫反应的分子。抗原包括但不限于细胞，细胞提取物，蛋白质，多肽，肽，多糖，多糖结合物，多糖的肽和非肽类似物以及其它分子，小分子，脂类，糖脂，碳水化合物，病毒和病毒提取物和多细胞生物体例如寄生虫和变态反应原。术语抗原广泛的包括被宿主免疫系统识别为外源的任何类型的分子。抗原包括但不限于癌抗原，微生物抗原，和变态反应原。
这里所说的癌抗原是化合物，例如肽或蛋白质，与肿瘤或癌细胞表面结合，并且在MHC分子中的抗原呈递细胞的表面表达的时候能够激发免疫反应。可以通过制备癌细胞的粗提物，例如Cohen，et al.，1994，Cancer Research，54：1055中所述的，通过部分纯化抗原，通过重组技术，或者用已知的抗原合成，从癌细胞中制备癌抗原。癌抗原包括但不限于重组表达的抗原，完整肿瘤或癌症，或其免疫原性部分。这种抗原可以用本领域已知的任何其它方法分离或者重组制备。
这里所说的微生物抗原是微生物的抗原，包括但不限于病毒，细菌，寄生虫，和真菌。这种抗原包括完整的微生物及其天然分离物和片段或其衍生物，还包括与天然微生物抗原相同或类似的合成化合物，能够诱导对该微生物特异的免疫反应。如果一种化合物能够诱导针对天然微生物抗原的免疫反应(体液和/或细胞的)，那么认为它与天然微生物抗原类似。这种抗原在本领域中是经常使用的并且是本领域普通技术人员公知的。
在人中发现的病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HDTV-III，LAVE或HTLV-III/LAV，或HIV-III；以及其它分离物，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，人肠道孤病毒)；Calciviridae(例如能引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒，风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒)；；冠状病毒科(例如冠状病毒)；棒状病毒科(例如疱疹性口炎病毒，狂犬病毒)；)；线状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒，布尼亚病毒，phleboviruses和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒)；双股RNA病毒科；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如丁型肝炎(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷型微卫星)，非甲非乙型肝炎(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即丙型肝炎)；诺沃克和相关病毒，以及星状病毒)。
革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌在脊椎动物中可作为抗原。这种革兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德菌，葡萄球菌，和链球菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌，假单胞菌，和沙门氏菌。感染性细菌的特定实例包括但不限于幽门螺旋杆菌，伯氏疏螺旋体菌，嗜肺军团杆菌，分枝杆菌(例如结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，戈登分枝杆菌)，金黄色葡萄球菌，奈瑟双球菌，脑膜炎奈瑟氏菌，单核细胞增多性李斯特菌，化脓性链球菌(A群链球菌)，无乳链球菌(B群链球菌)，链球菌(草绿色群)，粪链球菌，牛链球菌，链球菌(厌氧株)，肺炎链球菌，致病性弯曲菌，肠球菌，流感嗜血杆菌，炭疽杆菌，白喉杆菌，棒状杆菌，猪丹毒杆菌，产气荚膜梭状芽孢杆菌，破伤风杆菌，产气肠杆菌，克雷白氏肺炎杆菌，多杀性巴氏杆菌，拟杆菌，具核梭杆菌，念珠状链杆菌，梅毒密螺旋体，纤细密螺旋体，钩端螺旋体，立克次体，和以色列放线菌。
真菌的实例包括新生隐球菌，荚膜组织胞浆菌，厌酷球孢子菌，皮炎芽生菌，沙眼衣原体，白色念珠菌。
其它感染性生物体(即原生生物)包括疟原虫，例如恶性疟原虫，三日疟原虫，卵形疟原虫，和间日疟原虫和刚地弓形虫。血液和/或组织寄生虫包括疟原虫，巴贝斯虫，分歧巴贝斯虫，热带利什曼原虫，利什曼原虫，巴西利什曼原虫，杜氏利什曼原虫，冈比亚锥虫和罗得西亚锥虫(非洲昏睡病)，枯氏锥虫(查格斯病)，和刚地弓形虫。
其它医学相关的微生物在文献中已有详尽的描述，例如参见C.G.A Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，在此引入其全文作为参考。
变态反应原指能在易感的患者中诱发变态反应或哮喘的物质(抗原)。变态反应原的种类非常多，包括花粉，昆虫毒液，动物皮屑灰尘，真菌孢子和药物(例如青霉素)。天然的，动物和植物变态反应原的实例包括但不限于对下述种属特异的蛋白质：犬(家犬)；尘螨(例如粉尘螨)；猫(家猫)；Ambrosia(Ambrosia artemiisfolia；黑麦草(例如多年生黑麦草或一年生黑麦草)；柳杉(日本柳杉)；交链孢(互格交链孢菌)；杨木；赤杨(Alnus gultinoasa)；桦属(白桦)；栎属(白橡)；橄榄(橄榄树)；艾属(艾草)；车前草属(例如长叶车前)；墙草属(例如Parietaria officinalis或Parietaria judaica)；小蠊(例如德国小蠊)；蜜蜂属(例如Apis multiflorum)；柏属(例如丝柏，亚利桑那柏木和大果柏木)；桧属(例如Juniperus sabinoides，弗吉尼亚雪松，杜松和德州雪松)；金钟柏(例如侧柏)；扁柏(例如日本扁柏)；大蠊(例如美洲大蠊)；冰草属(例如匍匐冰草)；黑麦属(例如黑麦)；小麦属(例如小麦)；鸭茅(例如鸭茅)；羊茅属(例如草地羊茅)；早熟禾属(例如草地早熟禾或加拿大早熟禾)；燕麦属(例如燕麦)；绒毛草属(例如绒毛草)；黄花茅属(例如香黄花茅)；燕麦草属(例如条纹燕麦草)；翦股颖属(例如小糠草)；梯牧草属(例如梯牧草)；虉草属(例如草芦)；雀稗属(例如百喜草)；高梁属(例如阿列波高梁)；和雀麦属(例如无芒雀麦)。
这里所用的术语基本上纯化指基本上不含其它蛋白质脂类，碳氢化合物或其它与其天然结合的物质的多肽。本领域普通技术人员可以用标准的蛋白质纯化技术纯化病毒或细菌多肽。基本上纯的多肽通常在非还原性聚丙酰胺凝胶上呈现单一主要条带。对于部分糖基化的多肽以及那些具有几个启动子密码的多肽，在非还原性聚丙酰胺凝胶上可能具有几个条带，但是它们只是该多肽的几个不同形式。病毒或细菌多肽的纯度可以通过氨基末端氨基酸序列分析确定。不由核酸载体编码的其它形式的抗原例如多糖，小分子，类似物等等也包括在本发明之中。
本发明的寡核苷酸可以与抗微生物剂一起给患者施用。这里所说的抗微生物剂指天然存在的或合成的化合物，能够杀死或抑制传染性微生物。根据本发明可用的抗微生物剂的类型取决于患者感染的或具有感染危险的微生物的类型。抗微生物剂包括但不限于抗细菌剂，抗病毒剂，抗真菌剂和抗寄生虫剂。短语如“抗感染剂”，“抗细菌剂”，“抗病毒剂”，“抗真菌剂”，“抗寄生虫剂”和“杀寄生虫剂”的含义是本领域普通技术人员所熟知的，是用标准医用语言定义的。简短来说，抗细菌剂杀死或抑制细菌，包括抗生素和其它具有类似功能的合成的或天然的化合物。抗生素是低分子量的分子，是由细胞，例如微生物产生的二级代谢物。通常，抗生素可干扰一种或多种对该微生物特异的但在宿主细胞中不存在的细菌功能或结构。抗病毒剂可以从天然来源中分离或合成，可用于杀死或抑制病毒。抗真菌剂可用于治疗表面真菌感染以及条件性和初级系统性真菌感染。抗寄生虫剂可杀死或抑制寄生虫。
可给人施用的抗寄生虫剂，也称为杀寄生虫剂的实例包括但不限于阿苯达唑，两性霉素B，苄硝唑，硫氯酚，盐酸氯喹，磷酸氯喹，氯林肯霉素，去氢依米丁，乙胺嗪，二氯酰胺酚，依氟鸟氨酸，呋喃唑酮，糖皮质激素，卤泛曲林，双碘喹啉，伊维菌素，甲苯达唑，甲氟喹，甲葡胺锑酸盐，米拉索普，美曲膦脂，甲硝哒唑，氯硝柳胺，硝呋莫司，奥沙尼喹，巴龙霉素，依西酸喷他脒，哌嗪，吡喹酮，磷酸伯氨喹，氯胍，噻吩嘧啶，磺胺乙嘧啶，周效磺胺乙嘧啶，盐酸奎吖因，硫酸奎宁，葡糖酸奎尼定，螺旋霉素，葡萄糖酸锑钠(葡萄糖酸锑钠)，苏拉明，四环素，强力霉素，噻苯达唑，替硝唑，甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲恶唑，和锥虫胂胺，其中一些可单独使用或与其它药物一起使用。
抗细菌剂可杀死或抑制细菌的生长或功能。抗细菌剂的一个大类是抗生素。可有效杀死或抑制大范围的细菌的抗生素被称为广谱抗生素。其它类型的抗生素主要有效针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。这些类型的抗生素被称为窄谱抗生素。其它可有效抵抗单个生物体或疾病而不能抵抗其它类型的细菌的抗生素被称为限谱抗生素。抗细菌剂有时也根据它们的主要作用方式分类。通常抗细菌剂是细胞壁合成抑制剂，细胞膜抑制剂，蛋白质合成抑制剂，核酸合成或功能抑制剂，和竞争性抑制剂。
抗病毒剂是可预防细胞被病毒感染或病毒在细胞内复制的化合物。抗病毒药物比抗细菌药物少的多，因为病毒复制的过程与宿主细胞内DNA的复制非常地接近，以至于非特异性的抗病毒剂通常对宿主都有毒性。病毒感染过程中有几个阶段可被抗病毒剂阻断或抑制。这些阶段包括，病毒与宿主细胞接触(免疫球蛋白或结合肽)，病毒的脱壳(例如金刚胺)，病毒mRNA的合成或翻译(例如干扰素)，病毒RNA或DNA的复制(例如核苷酸类似物)，新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制剂)，以及病毒的出芽和释放。
核苷酸类似物是与核苷酸类似，但是具有不完整的或异常的脱氧核糖或核糖基团的合成化合物。一旦细胞中存在核苷酸类似物，它们会被磷酸化，产生三磷酸形式，与正常的核苷酸竞争加入病毒DNA或RNA。一旦核苷酸类似物的三磷酸形式加入到生长的核酸链中，它就会与病毒聚合酶不可逆地结合，使链终止。核苷酸类似物包括但不限于无环鸟苷(用于治疗单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒)，丙氧鸟苷(用于治疗巨细胞病毒)，碘苷，三氮唑核苷(用于治疗呼吸道合胞病毒)，双脱氧肌苷，双脱氧胞苷，齐多夫定(叠氮胸苷)，咪喹莫特和resimiquimod。
干扰素是由病毒感染的细胞或免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过与被感染细胞邻近细胞的特异性受体结合，引起细胞中的变化，保护细胞不被病毒感染。和干扰素也可以诱导被感染细胞表面的I类和II类MHC分子，导致向宿主免疫细胞识别的抗原呈递增加。可获得和  干扰素的重组形式，用于治疗慢性乙型和丙型肝炎感染。当使用能有效进行抗病毒治疗的剂量的时候，干扰素具有严重的副作用例如发烧，身体不适以及体重降低。
本发明中可使用的抗病毒剂包括但不限于免疫球蛋白，金刚胺，干扰素，核苷酸类似物，和蛋白酶抑制剂。抗病毒的特定实例包括但不限于醋孟南；无环鸟苷；无环鸟苷钠；阿的福韦；阿洛夫定；阿韦舒托；盐酸金刚胺；阿拉诺丁；阿立酮；甲磺酸阿替韦啶；阿夫立定；西多福韦；西潘茶碱；盐酸阿糖胞苷；甲磺酸地拉维定；地昔洛韦；去羟肌苷；二噁沙利；依度尿苷；恩韦拉登；恩韦肟；泛昔洛韦；盐酸法莫汀；非西他滨；非阿尿苷；磷利酯；膦甲酸钠；膦乙酸钠；更昔洛韦；更昔洛韦钠；碘苷；乙氧二羟丁酮；拉米夫定；洛布卡韦；盐酸美金刚；甲吲噻腙；内维拉平；喷昔洛韦；吡罗达韦；利巴韦林；盐酸金刚乙胺；甲磺酸沙奎那韦；盐酸索金刚胺；索立夫定；维司托隆；司他夫定；盐酸替洛隆；三氟尿苷；盐酸伐昔洛韦；阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸盐；阿糖腺苷磷酸钠；韦罗肟；扎西他滨；齐多夫定；和净韦肟。
抗真菌剂可用于治疗和预防感染性真菌。抗真菌剂有时根据其作用机制分类。一些抗真菌剂是细胞壁抑制剂，抑制葡萄糖合酶。包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌剂可破坏膜的完整性。包括但不限于咪唑，例如克霉唑，sertaconzole，氟康唑，伊曲康唑，酮康唑，咪康唑，和voriconacole，以及FK 463，两性霉素B，BAY 38-9502，MK 991，帕地霉素，UK 292，布替萘芬，和特比萘芬。其它抗真菌剂可以破坏几丁质(例如几丁质酶)或免疫抑制作用(501 cream)。
所述CpG免疫刺激寡核苷酸可与其它治疗剂例如用于增强免疫反应的佐剂一起使用。所述CpG免疫刺激寡核苷酸和其它治疗剂可以同时给药或顺序给药。当其它治疗剂同时给药的时候，它们可配成同一个配方或用单独的配方，但在同一时间给药。当其它治疗剂和所述CpG免疫刺激寡核苷酸的给药在时间上分开的时候，其它治疗剂彼此之间以及与所述CpG治疗剂是顺序给药。这些化合物给药在时间上的间隔可以是数分钟或更长时间。其它治疗剂包括但不限于佐剂，细胞因子，抗体，抗原等。
本发明的化合物还可以和非核酸佐剂一同给药。非核酸佐剂可以是除了本发明的CpG免疫刺激寡核苷酸之外的任何分子或化合物，它们可以刺激体液和/或细胞免疫反应。非核酸佐剂包括，例如具有depo作用能刺激免疫系统的佐剂。
所述CpG免疫刺激寡核苷酸还可以作用粘膜佐剂使用。现已发现系统和粘膜免疫都可被CpG核酸的粘膜递送诱导。因此所述寡核苷酸可与其它粘膜佐剂一起给药。
还可通过使所述CpG免疫刺激寡核苷酸与细胞因子(Bueler & Mulligan，1996；Chow et al.，1997；Geissler et al.，1997；Iwasaki et al.，1997；Kim et al.，1997)或B-7共刺激因子(Iwasaki et al.，1997；Tsuji et al.，1997)共给药或共线性表达诱导免疫反应。术语细胞因子是以纳摩尔和皮摩尔浓度作为体液调节剂，并且在正常的或病理状态下可调节个体细胞和组织的功能活性的各种不同的可溶性蛋白和多肽的总称。这些蛋白质也可以直接调节细胞间的相互作用，调节发生在胞外环境发生的事件。细胞因子的实例包括但不限于IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，干扰素γ(γ-IFN)，IFN-α，肿瘤坏死因子(TNF)，TGF-β，FLT-3配体和CD40配体。
所述寡核苷酸还可以用于使免疫反应从Th2免疫反应转变为Th1免疫反应。这使得可以产生相对平衡的Th1/Th2环境。免疫反应从Th2向Th1免疫反应的转变可以通过测量在对核酸的反应中产生的细胞因子的水平(例如通过诱导单核细胞和其它细胞产生Th1细胞因子，包括IL-12，IFN-γ和GM-CSF)来评价。免疫反应从Th2向Th1反应的转变或再平衡在治疗和预防哮喘中特别有用。例如，治疗哮喘的有效量可以是可使与哮喘相关的Th2类型的免疫反应转变为Th1类型的反应或平衡的Th1/Th2环境的量。Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5在哮喘患者的呼吸道中有所升高。本发明的CpG免疫刺激寡核苷酸可引起Th1细胞因子的升高，有助于帮助再平衡免疫系统，预防或减少主要是Th2的免疫反应具有的副作用。
本发明的寡核苷酸还可以用于治疗呼吸道重塑。呼吸道重塑是由于呼吸道内平滑肌细胞增殖和/或粘膜下层增厚造成的，最终可造成呼吸道狭窄，导致呼吸受限。本发明的寡核苷酸可预防进一步的重塑，可以减少重塑过程造成的组织增生。
所述寡核苷酸还可用于提高树突状细胞的存活，分化，激活和成熟。所述CpG免疫刺激寡核苷酸具有独特的能力可提高树突状细胞的细胞存活，分化，激活和成熟。
CpG免疫刺激寡核苷酸还可以增加天然杀伤细胞的溶解活性和依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。用CpG免疫刺激寡核苷酸与对细胞靶，例如癌细胞特异的抗体一同使用可获得ADCC。当所述的CpG免疫刺激寡核苷酸与抗体一同给患者施用的时候，患者的免疫系统可被诱导杀死肿瘤细胞。可用于ADCC过程的抗体包括可与身体中细胞相互作用的抗体。本领域已有许多关于细胞靶特异的这种抗体的描述，许多都是商业可获得的。
所述CpG免疫刺激寡核苷酸还可以和抗癌治疗一起使用。抗癌治疗包括癌症药物，放射治疗和外科手术。这里所用的“癌症药物”指能给患者施用以治疗癌症的药剂。这里所说的“治疗癌症”包括预防癌症的发生，减轻癌症的症状，和/或抑制已经出现的癌症的生长。在其它方面，癌症药物可给予具有发生癌症危险的患者，目的是减少癌症发生的危险性。本文描述了治疗癌症的各种类型的药物。为此目的癌症药物可分类为化学治疗剂，免疫治疗剂，癌症疫苗，激素疗法，以及生物反应调节剂。
此外，本发明的方法还包括多于一种的癌症药物与所述CpG免疫刺激寡核苷酸一起使用的应用。作为一个实例，在适当的时候，所述CpG免疫刺激寡核苷酸可与化学治疗剂和免疫治疗剂一起使用。另外，癌症药物可以包括免疫治疗剂和癌疫苗，或者化学治疗剂和癌疫苗，或者化学治疗剂，免疫治疗剂和癌疫苗一起施用给一个患者，以治疗患有癌症或者具有患癌症危险的患者。
化学治疗剂可选自甲氨蝶呤，长春新碱，阿霉素，顺氯氨铂，不含糖的氯乙基亚硝基尿素，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素C，博来霉素，链霉素，氮烯唑胺，紫杉酚，fragyline，泛影葡胺GLA，valrubicin，carmustaine和poliferposan，MMI270，BAY 12-9566，RAS famesyl转移酶抑制剂，famesyl转移酶抑制剂，MMP，MTA/LY231514，LY264618/Lometexol，Glamolec，CI-994，TNP-470，美新/托普替康，PKC412，Valspodar/PSC833，诺消灵/米托蒽醌，Metaret/苏拉明，巴马司他，E7070，BCH-4556，CS-682，9-AC，AG3340，AG3433，Incel/VX-710，VX-853，ZD0101，ISI641，ODN698，TA 2516/Marmistat，BB2516/Marmistat，CDP 845，D2163，PD183805，DX8951t，Lemonal DP 2202，FK317，Picibanil/OK-432，AD 32/Valrubicin，美他特龙/锶衍生物，Temodal/替莫唑胺，Evacet/脂质体链霉素，Yewtaxan/紫杉醇，Taxol/紫杉醇，Xeload/卡培他滨，氟铁龙/脱氧氟尿苷，Cyclopax/口服紫杉醇，口服Taxoid，SPU-077/顺铂，HMR 1275/Flavopirido1，CP-358(774)/EGFR，CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂，BMS-182751/口服铂，UFT(替加氟/尿嘧啶)，Ergamisol/左旋咪唑，Eniluracil/776C85/5FU增强剂，Campto/左旋咪唑，Camptosar/依立替康，Tumodex/Ralitrexed，Leustatin/克拉屈滨，Paxex/紫杉醇，Doxil/脂质体链霉素，Caelyx/脂质体链霉素，福达华/氟达拉滨，Pharmarubicin/表阿霉素，DepoCyt，ZD 1839，LU 79553/Bis-Naphtalimide，LU 103793/Dolastain，Caetyx/脂质体链霉素，Gemzar/吉西他滨，ZD 0473/Anormed，YM 116，碘结晶，CDK4和CDK2抑制剂，PARP抑制剂，D4809/Dexifosamide，Ifes/Mesnex/异环磷酰胺，Vumon/替尼泊甙，伯尔定/卡铂，Plantinol/顺铂，Vepeside/依托泊苷，ZD 9331，泰索帝/多烯紫杉醇，鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药物，Taxane类似物，亚硝基脲，烷基化试剂例如melphelan和环磷酰胺，氨鲁米特，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，苯丁酸氮芥，盐酸阿糖胞苷，放线菌素，盐酸道诺霉素，雌莫司汀磷酸钠，依托泊苷(VP 16-213)，氟脱氧尿苷，氟尿嘧啶(5-FU)，氟他米特，羟基脲(羟基尿素)，异环磷酰胺，干扰素 -2α，-2β，醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)，洛莫司汀(CCNU)，盐酸二氯甲基二乙胺(氮芥)，巯基嘌呤，巯乙磺酸钠，米托坦(o.p′-DDD)，盐酸米托蒽醌，奥曲肽，普卡霉素，盐酸甲基苄肼，链脲霉素，柠檬酸他莫西芬，硫鸟嘌呤，硫替派，硫酸长春碱，安吖啶(m-AMSA)，阿扎胞苷，红细胞生成素，六甲密胺(HMM)，白介素2，丙脒腙(甲基-GAG；甲基乙二醛双脒腙；MGBG)，戊糖苷(2′脱氧柯福霉素)，司莫司汀(甲基-CCNU)，替尼泊甙(VM-26)和硫酸去乙酰长春酰胺，但不受这些物质的限制。
所述免疫治疗剂可以选自Ributaxin，贺赛汀，Quadramet，Panorex，IDEC-Y2B8，BEC2，C225，Oncolym，SMART M195，ATRAGEN，Ovarex，托莫西单抗，DP-03，iort6，MDX-210，MDX-11，MDX-22，OV103，3622W94，抗-VEGF，赛尼哌，MDX-220，MDX-447，MELIMMUNE-2，MELIMMUNE-1，CEACIDE，Pretarget，NovoMAb-G2，TNT，Gliomab-H，GNI-250，EMD-72000，LymphoCide，CMA 676，Monopharm-C，4B5，ior egf.r3，ior c5，BABS，抗-FLK-2，MDX-260，ANAAb，SMART 1D10 Ab，SMART ABL 364 Ab和ImmuRAIT-CEA，但不受这些物质的限制。
癌症疫苗可选自EGF，抗独特型癌症疫苗，Gp75抗原，GMK黑色素瘤疫苗，MGV神经节苷脂结合疫苗，Her2/neu，Ovarex，M-Vax，O-Vax，L-Vax，STn-KHL theratope，BLP25(MUC-1)，脂质体独特型疫苗，Melacine，肽抗原疫苗，毒素/抗原疫苗，基于MVA的疫苗，PACIS，BCG疫苗，TA-HPV，TA-CIN，DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，但不受这些物质的限制。
CpG免疫刺激寡核苷酸和免疫治疗剂例如单克隆抗体一起使用可以通过各种机制，包括显著增强ADCC(如前所述)，天然杀伤(NK)细胞的激活和增加IFNα水平从而提高长期存活率。当与单克隆抗体一起使用的时候所述核酸可以用以减少达到其生物学效果所需要的抗体的剂量。
这里所说的术语“癌症抗原”和“肿瘤抗原”可互换使用，指在癌细胞差异表达的抗原，因而可以用于靶定癌细胞。癌症抗原可以明显刺激肿瘤特异的免疫反应。一些这种抗原由正常细胞编码，虽然不一定表达。这些抗原的特征是它们在正常细胞中是沉默的(即不表达)，只在分化的特定阶段表达，以及暂时性的表达例如胚胎和胎儿抗原。其它癌症抗原由突变的细胞基因编码，例如癌基因(例如激活的ras癌基因)，抑制基因(例如突变的p53)，由于内部缺失或染色体移动造成的融合蛋白。还有其它癌症抗原由病毒基因，例如那些RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因编码。
所述CpG免疫刺激寡核苷酸也可用于治疗和预防自体免疫性疾病。自体免疫性疾病是一类患者自身抗体与宿主组织反应，或者免疫效应T细胞与内源肽发生自身反应的疾病，引起组织的破坏。因此免疫反应是针对患者自身的抗原，被称为自体抗原。自体免疫性疾病包括但不限于风湿性关节炎，克罗恩氏病，多发性硬化，系统性红斑狼疮(SLE)，自体免疫性脑脊髓炎，重症肌无力(MG)，桥本氏甲状腺炎，古德巴斯德综合症，天疱疮(例如，寻常性天疱疮)，格雷氏疾病，自体免疫性溶血性贫血，自体免疫性血小板减少性紫癜，具有抗胶原抗体的硬皮病，混和性结缔组织疾病，多发性肌炎，恶性贫血，先天性艾迪森氏病，自体免疫相关的不孕，肾小球肾炎(例如，新月体性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎)，大水疱性类天疱疮，修格连氏综合症，胰岛素抵抗，和自体免疫性糖尿病。
这里所说的“自体抗原”是指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因此在自体免疫性疾病中对于自体抗原的免疫反应是不希望的免疫反应，会导致正常组织的破坏和损伤，而对癌抗原的免疫反应是希望的免疫反应，会使得肿瘤或癌症被破坏。因此，本发明的某些方面是为了治疗自体免疫性疾病，并不推荐将CpG免疫刺激核酸与自体抗原，特别是那些作为自体免疫疾病的靶的抗原一起使用。
在其它例子中，所述CpG免疫刺激核酸可以与低剂量的自体抗原一起递送。大量动物研究证明低剂量抗原的粘膜给药会导致免疫低反应或“耐受”。激活机制可能是由细胞因子调节的从Th1向Th2和Th3优势(即TGF-α优势)的反应转变。低剂量抗原递送的主动抑制也可抑制不相关的免疫反应(旁路抑制)，这在自体免疫疾病，例如风湿性关节炎和SLE的治疗上很重要。旁路抑制涉及在局部环境中分泌Th1反调节的抑制剂细胞因子，其中促炎性和Th1细胞因子以抗原特异性或抗原非特异性的方式释放。这里所说的“耐受”是指这种现象。实际上口服耐受在对大量动物的自体免疫性疾病的治疗中都是有效的，所说的疾病包括：实验自体免疫脑脊髓炎(EAE)，实验自体免疫重症肌无力，胶原诱导的关节炎(CIA)，依赖于胰岛素的糖尿病。在这些模型中，自体免疫性疾病的预防和抑制与抗原特异性的体液和细胞反应从Th1向Th2/Th3反应的转变有关。
本发明还包括用所述CpG免疫刺激寡核苷酸诱导抗原非特异性先天免疫激活和对传染性刺激的广谱抗性的方法。这里所说的术语抗原非特异性先天免疫激活是指除B细胞以外的其它免疫细胞的激活，例如可以包括NK细胞，T细胞或其它可以以不依赖于抗原的方式应答的免疫细胞或这些细胞的组合的激活。对传染性刺激的广谱抗性的诱导是由于免疫细胞处于活性形式，并且受到引发对任何侵入的化合物或微生物发生反应。这些细胞不需要特别针对某个特定的抗原。这在生物战争以及上述的其它环境例如旅行中特别有用。
本发明还涉及具有手性核苷酸间连接的寡核苷酸。如上所述本发明的柔性和半柔性寡核苷酸在C和G之间具有磷酸二酯样连接。磷酸二酯样连接的一个例子是Rp构象的硫代磷酸酯连接。
至少已经有一项研究检测了p手性对于CpG寡核苷酸的免疫刺激效果的影响。Yu等比较了富含立体的(不是纯立体的)硫代磷酸酯(PS)-寡核苷酸诱导脾细胞增殖的能力(Yu et al.，2000)。在这项研究中，发现了如果所述寡核苷酸的合成具有随机的p手性或富含Sp核苷酸间连接，含有单个CpG基序的19聚体序列可以诱导高水平的鼠脾细胞增殖，但是如果所述寡核苷酸富含Rp核苷酸间连接，这种增殖则显著减少(Yu et al.，2000)。但是，这项研究并没有检测p手性在CpG二核苷酸中的特殊作用，也没有测定Rp CpG寡核苷酸在短期的刺激检测中是否具有活性。
根据本发明发现所述寡核苷酸p手性对于CpG寡核苷酸的免疫活性具有明显相反的影响，这取决于活性测量的时间点。在40分钟的早期时间点，硫代磷酸酯CpG寡核苷酸的Rp而不是Sp立体异构体可在鼠脾细胞中诱导JNK磷酸化(在实施例中讨论)。相反，在44小时的晚期时间点，Sp而不是Rp立体异构体具有活性可刺激脾细胞增殖。我们证明了这种Rp和Sp立体异构体的动力学和生物活性上的差异并不是由于细胞吸收上的任何差异造成的，更可能是由于p手性的两种相反的生物学作用导致的。首先Rp立体异构体与Sp相比在早期时间点具有增强的刺激免疫细胞的活性表明Rp可能更有效地与CpG受体，TLR9相互作用，或诱导下游信号传导途径。另一方面，Rp PS-寡核苷酸与Sp相比其更快的降解导致信号传导的持续时间更短，  因此Sp PS-寡核苷酸在晚期时间点检测的时候表现出更强的生物活性。
本发明的某些方面是基于如下的新发现：先前报道的Rp PS-寡核苷酸缺乏免疫刺激作用仅仅是由于它们的核酸酶不稳定性，而不是由于其本身不能刺激CpG受体和下游途径。在检验其刺激JNK磷酸化的能力的时候，其中JNK磷酸化代表这种促有丝分裂剂激活的蛋白激酶途径的活化，Rp寡核苷酸是最具有活性的，立体随机的寡核苷酸其次，而Sp寡核苷酸没有可检测到的活性。但是，当通过测量抑制蛋白IκB-α的降解比较这些寡核苷酸激活NF-κB途径的能力的时候，虽然非CpG对照不能诱导IκB-α降解，但所有的CpG寡核苷酸都具有活性。因此Sp寡核苷酸仍然具有生物学活性。它不能诱导JNK途径可能与JNK和NF-B途径激活动力学的不同有关，但是由于检测所用的立体特异的寡核苷酸的量有限，我们没能证实这个猜想。
实施例中的实验揭示了CpG二核苷酸本身的p手性具有令人惊讶的强烈效果。与立体随机的CpG寡核苷酸相比，其中单个CpG二核苷酸与Rp相连的同源物活性稍强，但是含有Sp连接的同源物在诱导脾细胞增殖上几乎没有活性。Sp同源物的活性的丧失支持了我们的猜想，TLR9受体和与其相互作用的DNA中的CpG二核苷酸的手性有关，但可能被Rp立体异构体更好地刺激。因此立体随机的寡核苷酸的免疫刺激效果可能不仅仅是由于存在50％的延迟降解的Sp连接，而且也因为有一半的寡核苷酸分子的CpG二核苷酸具有Rp手性，使其增强了免疫刺激效果。
Rp PS连接的核酸酶敏感性对于解释PS-寡聚体在人或动物中的药物动力学(PK)和代谢具有重要的意义。这种突出的血清核酸酶活性已知是3’核酸外切酶。在典型的立体随机的PS-寡聚体溶液中，预期有一半的分子的最后一个3’核苷酸间连接是Rp手性。因此在这些50％的PS-寡聚体分子中，末端3’碱基在IV输注后很快被切割。在一半的这种分子中从末端3’核苷酸间连接起的第二个是Rp手性，因此初始的PS-寡聚体分子中有25％的3’末端预期会很快减少2个碱基。这种涉及3’RP核苷酸间连接的体内碱基剪切过程可能会持续下去，直到3’核苷酸间连接具有Sp构象。因此如果PS-寡聚体被合成为具有Sp 3’末端连接，它们的降解就会较慢，与立体随机的PS-寡聚体相比就会有不同的PK模式。这使得可以使用一些较短的寡核苷酸用于体内。在设计反义应用中的最佳寡聚物的时候，Rp立体异构体的增强的RNA结合是由于具有尽可能多的Rp构象的寡核苷酸内核。另一方面，免疫刺激应用上的最佳CpG寡核苷酸可以是其中除了CpG外所有核苷酸间连接都是Sp手性的寡核苷酸。
所述CpG免疫刺激寡核苷酸可以直接给患者施用或者可以与核酸递送复合体一起施用。核酸递送复合体指核酸分子与靶定工具(例如能导致与靶细胞有更高亲和力的分子)相结合(例如离子或共价结合；或制成胶囊)。核酸递送复合体的实例包括核酸与甾醇(例如胆固醇)，脂类(例如阳离子脂，病毒颗粒或脂质体)，或靶细胞特异的结合试剂(例如能被靶细胞特异的受体识别的配体)相结合。优选的复合体在体内应足够稳定，以防止在被靶细胞内在化以前就显著地解离。但是，复合体在细胞内适当的条件下应当是能切割的，使得所述寡核苷酸能释放出其功能形式。
将抗原和寡核苷酸递送到表面的递送载体或者说递送装置已有描述。所述CpG免疫刺激寡核苷酸和/或抗原和/或其它治疗剂可以单独给药(例如在盐水或缓冲液中)或者用本领域已知的任何递送载体给药。例如已有关于下述递送载体的描述：螺旋体(Gould-Fogerite et al.，1994，1996)；乳化剂(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1997)；ISCOMs (Mowat et al.，1993，Carlsson et al.，1991，Hu et.，1998，Morein et al.，1999)；脂质体(Childers et al.，1999，Michalek et al.，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；活细菌载体(例如沙门氏菌，大肠杆菌，Bacildzs calfnatte-guerin，志贺氏菌，乳酸菌)(Hone et al.，1996，Pouwels et al.，1998，Chatfieldet al.，1993，Stover et al.，1991，Nugent et al.，1998)；活病毒载体(例如牛痘，腺病毒，单纯疱疹)(Gallichan et al.，1993，1995，Moss et al.，1996，Nugentet al.，1998，Flexner et al.，1988，Morrow et al.，1999)；微球(Gupta et al.，1998，Jones et al.，1996，Maloy et al.，1994，Moore et al.，1995，O′Hagan etal.，1994，Eldridge et al.，1989)；核酸疫苗(Fynanet al.，1993，Kuklin et al.，1997，Sasaki et al.，1998，Okada et al.，1997，Ishii et al.，1997)；聚合物(例如羧甲基纤维素，甲克素)(Hamajima et al.，1998，Jabbal-Gill et al.，1998)；聚合物环(Wyatt et al.，1998)；蛋白体(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1988，1996，1997)；氟化钠(Hashi et al.，1998)；转基因植物(Tacket et al.，1998，Mason et al.，1998，Haq et al.，1995)；病毒颗粒(Gluck et al.，1992，Mengiardi et al.，1995，Cryz et al.，1998)；病毒样粒子(Jiang et al.，1999，Leibl et al.，1998)。其它递送载体是本领域已知的，在下面关于载体的讨论中将给出更多的实例。
术语CpG免疫刺激寡核苷酸的有效量指足以实现所希望的生物效果或所必需的量。例如，CpG免疫刺激寡核苷酸与抗原一同给药诱导粘膜免疫的有效量是使得暴露于抗原的时候对抗原发生反应产生IgA所必需的量，而诱导系统性免疫所必需的量是使得暴露于抗原的时候对抗原发生反应产生IgG所必需的量。根据本文所提供的教导，通过选择各种活性化合物，结合加权系数例如功效，相关生物可获得性，患者体重，副作用的严重程度和优选的给药方式，可以选择一种有效的预防性或治疗性治疗方案，不致引起严重的毒性并且还能完全有效地治疗特定的患者。任何特定应用的有效量随各种因子的不同而不同，这些因子如要治疗的疾病或状况，待给药的特定的CpG免疫刺激寡核苷酸，患者的体格大小，或者所述疾病或状况的严重程度。本领域普通技术人员无需过度的实验就能够根据经验确定特定CpG免疫刺激寡核苷酸和/或抗原和/或其它治疗剂的有效量。
本文所说的粘膜或局部递送的化合物的患者剂量典型地是每次给药大约在0.1μg到10mg之间，这取决于是每天，每周，或者每月还是以其它任何时间间隔给药。更典型地粘膜或局部剂量是每次给药大约10μg到5mg之间，最典型地是大约100μg到1mg之间，隔天或隔周2-4次给药。更典型地，免疫刺激剂量是每次给药1μg到10mg，最典型地是10μg到1mg，每天或每周给药。这里所说的进行肠胃外递送的化合物的患者剂量典型地比疫苗佐剂或免疫刺激物应用的有效粘膜剂量高5到10,000倍，更典型地高10到1,000倍，最典型地高20到100倍。其中目的是诱导抗原特异的免疫反应，其中所述化合物与抗原而不是另一种治疗剂一起递送。这里所说的CpG免疫刺激寡核苷酸与其它治疗剂一起或者以特殊的递送载体为诱导先天免疫反应的目的进行的肠胃外递送的化合物剂量典型地是每次给药从0.1μg到10mg，这取决于是每天，每周，或者每月还是以任何其它的时间间隔给药。更典型地，为这些目的的肠胃外剂量是每次给药从10μg到5mg，更典型地是从大约100μg到1mg，隔天或隔周给药2-4次。但是在一些实施方案中，为这些目的的肠胃外剂量可以使用比上述的典型剂量高5到10,000倍的量。
对于任何上述的化合物，治疗有效量最初都可以通过动物模型确定。治疗有效量也可以通过已经在人中检验过的CpG寡核苷酸的人数据(已进行过人的临床试验)以及已知的具有相似的药理学活性的化合物，例如其它佐剂，例如LT和其它为疫苗目的的抗原来确定。肠胃外给药需要更高的剂量。应用剂量可以根据相关的生物可获得性和给药化合物的功效来调整。根据上述方法和其它本领域熟知的方法调整剂量达到最大功效完全在普通技术人员的能力之内。
本发明的配方可用药学可接收的溶液进行给药，其中按常规含有药学可接收浓度的盐，缓冲试剂，防腐剂，相容载体，佐剂，和可选择的其它治疗成分。
为在治疗中使用，所述CpG免疫刺激寡核苷酸的有效量可以以任何能将所述寡核苷酸递送到所希望的表面，例如粘膜，系统的方式给予患者。本发明的药物组合物的给药可以使用任何技术人员所公知的方法。给药的优选方法包括但不限于口服，肠胃外，肌肉内，鼻内，舌下，气管内，吸入，眼内，  阴道内，和直肠内。
口服给药的时候，所述化合物(即CpG免疫刺激寡核苷酸，抗原和其它治疗剂)可以容易地将活性化合物与本领域熟知的药学可接收的载体混合起来配制。这种载体使本发明的化合物可配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，淤浆，悬液等等，可使受到治疗的患者口服吸收。口服使用的药物制剂可以用固体赋形剂，可选择地研磨成最终的混合物，处理各个微粒的混合物，加入合适的助剂，如果希望的话，可以获得片剂或糖衣丸。合适的赋形剂特别可以是填充剂例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纤维素制剂例如玉米淀粉，小麦淀粉，稻淀粉，马铃薯淀粉，白明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果希望的话，还可以加入分解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，例如褐藻酸钠。可选择地，口服配方还可以配制在盐水或缓冲液，即EDTA中以中和内部的酸性条件，或者也可以不用任何载体给药。
还包括上述组分的口服剂型。所述组分可以进行化学修饰使得该衍生物的口服递送更有效。通常，化学修饰可以是将至少一个部分与组分分子本身连接起来，所述部分使得可以(a)抑制蛋白酶水解；以及(b)从胃或肠中吸收到血管中。还希望能增加所述组分整体的稳定性以及增加在身体中的循环时间。这种部分的实例包括：聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski andDavis，1981，″Soluble Polymer-Enzyme Adducts″In：Enzyznes as Drugs，Hocenberg and Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.367-383；Newmark，etal.，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189.其它可用的聚合物是聚-1，3-二氧环戊烷和聚-1，3，6-tioxocane。优选用于药学应用的，如上所述，是聚乙二醇。
对于所述组分(或衍生物)，释放的部位可以是胃，小肠(十二指肠，空肠，或回肠)，或大肠。本领域技术人员可以配制成不会在胃中溶解，而在肠的十二指肠或其它地方释放的配方。优选地，可以通过保护所述寡核苷酸(或衍生物)或者在胃环境以外的地方释放生物活性物质，例如在肠内释放，使得释放避免胃环境的有害作用。
要保证对胃有完全的抗性，必需使得包覆层在至少pH 5.0时不会渗透。用于肠溶衣的更普通的惰性成分的实例是偏苯三酸醋酸纤维素(CAT)，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)，HPMCP 50，HPMCP 55，邻苯二甲酸聚乙烯醋酸酯(PVAP)，Eudragit L30D，Aquateric，邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)，Eudragit L，Eudragit S，和Shellac。这些包覆层可制成混和膜。
包覆层或包覆层的混合物可用于片剂，而这在胃中并不能起到保护作用。还可包括糖包覆层，或者使片剂易于吞咽的包覆层。胶囊可以由坚硬的外壳(例如明胶)组成，以递送干燥的治疗剂，即粉末；对于液体形式，可以使用软明胶外壳。扁囊剂的外壳材料可以是厚的淀粉或其它可食用的纸。对于丸剂，锭剂，制型片剂或片剂研制剂，可使用湿润块化技术。
配方中包含的所述治疗剂可以是细小的多微粒，以尺寸大约为1mm的微粒或小球或颗粒存在。胶囊给药中可将物质配制成粉末，轻微压缩的栓剂或者甚至药片。治疗剂可通过压缩制备。
还可以包括染色剂和调味剂。例如可以配制(例如用脂质体或微球胶囊)所述寡核苷酸(或衍生物)，然后进一步将其制成可食用的产品，例如含有染色剂和调味剂的冷冻饮料。
可以用惰性物质稀释治疗剂或增加其体积。稀释剂可以包括碳水化合物，特别是甘露醇，a-乳糖，无水乳糖，纤维素，蔗糖，修饰的右旋糖苷和淀粉。还可用特定的无机盐作为填充剂，包括三磷酸钙，碳酸镁和氯化钠。一些商业可获得的稀释剂是Fast-Flo，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
治疗剂的配方中可包含分解剂，制成固体剂型。用作分解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业出售的分解剂，Explotab。羟基乙酸淀粉钠，安伯来特，羧甲基纤维素钠，超支链淀粉，藻酸钠，明胶，桔皮，酸性羧甲基纤维素，天然海绵和膨润土都可以使用。分解剂的另一种形式是不溶的阳离子交换树脂。粉末状的树脂可以用于分解剂和粘合剂，可以包括粉末状的树脂例如琼脂，刺梧桐或黄蓍胶。褐藻酸及其钠盐也可用于分解剂。
可使用粘合剂将治疗剂聚集在一起形成坚硬的片剂，包括来自天然产物的材料例如阿拉伯树胶，黄蓍胶，淀粉和明胶。还包括甲基纤维素(MC)，乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以在醇溶液中使用，使治疗剂成为粒状。
治疗剂的配方中可含有抗摩擦剂，以防止在配制过程中形成粘结。可在治疗剂和膜壁之间具有润滑剂层，这包括但不限于：硬脂酸并包括其镁和钙盐，聚四氟乙烯(PTFE)，液体石蜡，植物油和蜡。还可以使用可溶性润滑剂例如硫酸月桂酸钠，硫酸月桂酸镁，各种分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可以加入助流剂，它可在配制药物的时候提高药物的流动特性，有助于在压缩的时候进行重排。助流剂可以包括淀粉，滑石，煅制二氧化硅和水合硅铝酸盐。
为了有助于治疗剂溶解到含水环境中，可加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子去垢剂例如硫酸月桂酸钠，辛丁酯磺酸钠和二辛基磺酸钠。可使用阳离子去垢剂，包括苯扎氯铵或benzethomium chloride。配方中可含有非离子去垢剂作为表面活性剂，包括聚桂醇400，硬脂酸聚烃氧40酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10，50和60，硬脂酸甘油酯，聚山梨醇酯40，60，65和80，脂肪酸蔗糖酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂在所述寡核苷酸或衍生物的配方中可以是单独存在，或者以不同比率作为混合物存在。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合的胶囊，以及由明胶制成的软的密封的胶囊和增塑剂，例如甘油或山梨醇。推入配合的胶囊包括混合物中的活性成分以及填充物例如乳糖，粘合剂例如淀粉，和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁和，可选择的，稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以在合适的液体，例如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇中溶解或悬浮。此外，可以加入稳定剂。口服给药可以配制成微球。本领域中已知这种微球。口服给药的所有配方的剂量应当适用于这种给药方式。
对于颊给药，所述组合物可用传统方法配制成片剂或锭剂。
对于吸入式给药，根据本发明可使用的化合物可以便利地以压力罐或喷雾器中产生的喷雾剂的形式递送，其中使用适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。使用压力喷雾剂的时候，剂量单位的确定可以用泵递送计量好的量。吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物的粉末混合物和适当的粉末基底例如乳糖或淀粉。
本文还包括所述寡核苷酸(或其衍生物)的肺部递送。所述寡核苷酸(或衍生物)在吸入的时候被递送到哺乳动物的肺部，穿过血管周围的肺上皮细胞。其它关于吸入分子的报道包括Adjei et al.，1990，Pharmaceutical Research，7：565-569；Adjei et al.，1990，International Journal of Pharmaceutics，63：135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet et al.，1989，Journal of Cardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)：143-146(endotlielin-1)；Hubbard etal.，1989，Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212(al-抗胰蛋白酶)；Smith et al.，1989，J.Clin.Invest.84：1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein et al.，1990，″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重组人生长激素)；Debs et al.，1988，J.Immunol.140：3482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子α)和Platz et al.，U.S.Patent No.5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。具有系统效果的药物肺部递送的方法和组合物在1995年9月申请的Wong et al发明的美国专利序列号5,451,569中有描述。
本发明还包括广泛的用于治疗产品的肺部递送的机械装置，包括但不限于喷雾器，定量吸入器，和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟知的。
适于本发明使用的商业可获得的装置的一些特异的例子是Ultravent喷雾器，由Mallinclcrodt，Inc.，St.Louis，Missouri制造；Acorn II喷雾器，由Marquest Medica1 Products，Englewood，Colorado制造；Ventolin定量吸入器，由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina制造；和Spinhaler粉末吸入器，由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造。
所有这些装置都需要使用适合于分送寡核苷酸(或衍生物)的配方。典型地，每种配方对于所使用装置的类型都是特异的，包括使用合适的推进剂，除了常用的稀释剂之外，治疗中也可使用佐剂和/或载体。而且还可以使用脂质体，微胶囊或微球，包合复合物或其它类型的载体。化学修饰的寡核苷酸还可以制备成不同的配方，这取决于化学修饰的类型或所使用装置的类型。
适于喷射或超声喷雾器使用的配方典型地是将寡核苷酸(或衍生物)溶解在水中，浓度为大约每ml溶液中0.1到25mg的生物活性寡核苷酸。配方还可包含缓冲液和简单糖(例如有利于寡核苷酸的稳定和渗透压的调节)。喷雾器配方还可以含有表面活性剂，以减少或预防在形成喷雾剂的过程中由于溶液的雾化引起的寡核苷酸表面诱导的聚集。
用于定量吸入装置的配方通常包括含有所述寡核苷酸(或衍生物)的极细粉末，通过表面活性剂悬浮在推进剂中。推进剂可以是任何为此目的使用的传统物质，例如含氯氟烃，氢氯氟碳化合物，氟碳化合物，或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或其组合。适当的表面活性剂包括三油酸山梨聚糖和大豆卵磷脂。
用于从粉末吸入器中发药的配方含有极细的含有寡核苷酸(或衍生物)的干粉末，也可以含有疏松剂，例如乳糖，山梨醇，蔗糖，或甘露醇，其量有助于装置中粉末的分散，例如占配方重量的50到90％。所述寡核苷酸(或衍生物)最方便地是制备成颗粒形式，其平均颗粒大小是小于10mm(或微米)，最优选是0.5到5mm，这样可最有效地递送到肺末梢。
本发明的药物组合物的鼻递送也包括在内。鼻递送使得本发明的药物组合物在将治疗产物给药到鼻中之后可以直接通到血管中，而该产物不需要在肺中沉积。鼻递送的配方包括右旋糖苷或环状糊精。
对于鼻给药，可以使用的装置是小而坚硬的瓶子，上面连接着一个定量喷雾器。在一个实施方案中，定量递送是通过将本发明的药物组合物溶液吸取到定容积的腔室中，该腔室具有小孔，其尺寸使得喷雾剂配方可以雾化，当该腔室中的液体受到压缩的时候可以形成喷雾。压缩该腔室以实现本发明的药物组合物的给药。在一个特定的实施方式中，所述腔室为活塞排布。这种装置是商业可获得的。
可选择地，可以使用带有孔或开口的塑料挤瓶，孔或开口的尺寸使得可以雾化喷雾剂配方，当受到挤压的时候能形成喷雾。开口通常在瓶子的顶部，顶部通常变细以部分适合于鼻通道，以有效地给予喷雾剂配方。优选地，鼻吸入器应提供定量的气溶胶配方，以给予定量的药物。
当希望系统递送的时候，所述化合物可以配制成通过注射，例如通过快速浓注或连续输注进行肠胃外给药。注射的配方可以制成单位剂型，例如安瓿瓶或多剂量容器，并加入防腐剂。所述组合物可以将这种剂型制成油质载体或水质载体中的悬液，溶液或乳液，可以含有配方剂例如悬浮，稳定和/或分散试剂。
肠胃外给药的药物配方包括水溶形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬液可以制成适当的油质注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂质体。水质注射悬液可以含有能增加悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或右旋糖苷。可选择地，所述悬液还可以含有合适的稳定剂或能增强所述化合物的溶解性以制备高浓度溶液的试剂。
可选择地，所述活性化合物可以是粉末形式，在使用前与合适的载体，例如无菌的不含热源的水组合。
所述化合物还可以制成直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠，例如含有传统的栓剂基剂例如可可油或其它甘油酯。
除了上述的配方，所述化合物还可以制成长效制剂。这种长期作用的配方可以用合适的聚合物或疏水物质(例如在可接收的油中作为乳化剂)或离子交换树脂配制，或制成微溶的衍生物，例如微溶的盐。
所述药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶相的载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种糖，淀粉，纤维素衍生物，明胶，和聚合物例如聚乙二醇。合适的液体或固体药物制剂形式是，例如吸入用的水或盐溶液，微胶囊，螺旋体，被微金颗粒包裹，包含在脂质体中，喷雾剂，气溶胶，植入皮肤的小球，或在尖锐物体上干燥以擦入皮肤。所述药物组合物还可以包括微粒，粉末，片剂，包衣片剂，(微)胶囊，栓剂，糖浆，乳液，悬液，霜剂，液滴或延长活性化合物释放的制剂，在这些制剂中照例使用赋形剂和添加剂和/或助剂例如分解剂，粘合剂，包覆剂，溶胀剂，润滑剂，调味剂，甜味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于各种药物递送系统。药物递送的方法综述，参见Langer，Science249：1527-1533，1990，在此引入其全文作为参考。
所述CpG免疫刺激寡核苷酸和可选择的其它治疗剂和/或抗原可以用其本身(纯的)或以药学可接收的盐的形式给药。当用于药物的时候，盐应当是药学可接收的，但是非药学可接收的盐也可以用于制备药学可接收的盐。这种盐包括但不限于那些用下述酸制备的盐：盐酸，氢溴酸，磺酸，硝酸，磷酸，马来酸，乙酸，水杨酸，对甲苯硫酸，酒石酸，柠檬酸甲烷磺酸，甲酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸，和苯磺酸。而且，这些盐可以制成碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠，钾或钙盐。
合适的缓冲剂包括：乙酸及其盐(1-2％w/v)；柠檬酸及其盐(1-3％w/v)；硼酸及其盐(0.5-2.5％w/v)；和磷酸及其盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯代丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯类(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
本发明的药物组合物含有有效量的CpG免疫刺激寡核苷酸以及任选的抗原和/或其它治疗剂，并且可选择地包括在药学可接收的载体中。术语药学可接收的载体是指一种或多种适用于给人和其它脊椎动物施用的相容的固体或液体填充剂，稀释剂或封装物质。术语载体指有机或无机成分，天然的或是合成的，它们与活性成分组合在一起有利于使用。所述药物组合物的组分还可以与本发明的化合物互相混和，它们之间没有能破坏所需的药物功效的相互作用。
本发明进一步通过下述实施例说明，但不应曲解为对其的限制。在此引入本申请所引用的所有参考文献(包括参考文献，已公告的专利，公开的专利申请，以及共同未决的专利申请)的全部内容作为参考。
实施例
材料与方法：
寡聚脱氧核苷酸(ODN)
所有的ODN都购自biospring(Frankfurt，Germany)或Sigma-Ark(Darmstadt，Germany)，由Coley Pharmaceutical GmbH(Langenfeld，Germany)控制同一性和纯度。ODN用磷酸盐缓冲液(S igma，Germany)稀释，储存于-20℃。所有的稀释液都使用不含热源的试剂。
细胞纯化
来自健康男性和女性的外周血棕黄层制备物得自Blood Bank of the University of Dsseldorf(Germany)，用此制备物在Ficoll-Hypaque(Sigma)上离心纯化得PBMC。纯化的PBMC立即使用(在大部分检测中)或悬于冷冻培养基中储存于-70℃。在需要的时候将这些细胞的等分试样溶解，洗涤并重悬于加入了5％(v/v)热灭活的人AB血清(BioWhittaker，Belgium)或10％(v/v)热灭活的FCS，2mML-谷氨酰胺(Bio Whittaker)，100U/ml青霉素和100g/ml链霉素(Invitrogen(Karlsruhe，Germany))的RPMI 1640培养基(BioWhittaker，Belgium)中。
细胞因子检测
将溶解的或新鲜的PBMC接种在48孔平底板，或96孔圆底板中，与标示浓度的ODN一起在37℃在湿润的培育箱中培育。培养物上清如果没有立即使用即收集起来，冷冻于-20℃直至需要。上清中细胞因子的数量用商业可获得的ELISA试剂盒(Diaclone，USA)或用商业可获得的抗体(得自Becton Dickinson/Pharmingen或PBL)在小鼠中进行ELISA检测。
NK细胞激活的流式细胞分析的培养
CD3(T细胞标记)，CD56(NK细胞标记)和CD69(NK细胞和T细胞早期激活标记)的结合荧光染料的单克隆抗体购自Becton Dickinson。在96孔圆底板中将PBMC在加入或不加各种浓度的ODN的条件下培育24小时。用流式细胞仪通过CD56阳性和CD3阴性细胞识别NK细胞。流式细胞仪数据从FACSCalibur(Becton Dickinson)获得。用计算机程序CellQuest(Becton Dickinson)分析数据。
细胞表面激活标记的流式细胞分析
为了测量作为B细胞的激活标记的共刺激分子CD86的表达，将PBMC与标示浓度的ODN一起培育48小时，用mAb对细胞中的CD19和CD86染色(Pharmingen，Germany)。用流式细胞仪检测CD19阳性的B细胞上CD86的表达。
为了测量作为单核细胞的激活标记的共刺激分子CD80的表达，将PBMC与标示浓度的ODN一起培育48小时，用mAb对细胞中的CD14，CD19和CD80染色(Pharmingen，Germany)。用流式细胞仪检测CD14阳性CD19阴性的单核细胞上CD80的表达。两项测量结果都用平均荧光密度(MFI)表示。
实施例1
人PBMC暴露于本文所述的CpG寡核苷酸之后这些细胞分泌的干扰素-α(IFN-α)，IFN-γ，IL-10，IL-6，和TNF-α的水平显示于附图1-5。图中检测寡核苷酸用▲表示。作为正对照寡核苷酸的寡核苷酸用■表示。图1A，2A，3A，4A，和5A所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：322，SEQ ID NO：323，和SEQ ID NO：324。图1B，2B，3B，4B，和5B所示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。图下方列出了用负对照(培养基)处理的细胞分泌的细胞因子的水平，在一些例子中，每个实验中还使用了LPS。
如图1-5所证明的，试验中所检测的寡核苷酸能够引起细胞因子的分泌，其水平与具有完全硫代磷酸酯骨架的正对照寡核苷酸相当或更高。负对照导致产生的细胞因子显著减少。
实施例2
检测了NK细胞在用检测寡核苷酸处理后发生反应时相对于对照寡核苷酸CD69表达(MFI)的水平。CD69的表达是T细胞和NK细胞激活的标志。在图6中暴露于检测寡核苷酸的细胞用▲表示。作为正对照寡核苷酸的寡核苷酸用■表示。图6A中显示的检测寡核苷酸包括SEQID NO：322，SEQ ID NO：323，和SEQ ID NO：324。图6B中显示的检测寡核苷酸包括SEQ ID NO：325，SEQ ID NO：326，SEQ ID NO：327，和SEQ ID NO：328。这些研究中用的正对照寡核苷酸是SEQ ID NO：329。图下方列出了每个实验中用负对照(培养基)和LPS处理的T细胞和NK细胞的CD69表达的水平。
如图6中所证实的，试验中检测的寡核苷酸能够诱导CD69的表达，其水平与具有完全硫代磷酸酯骨架的正对照寡核苷酸相当或更高。负对照导致产生的CD69显著减少。
实施例3
人PBMC暴露于本文所述的CpG寡核苷酸之后这些细胞分泌的干扰素-α(IFN-α)和IL-10的水平显示于附图7-12和17。图中检测核苷酸用■表示。作为正对照寡核苷酸SEQ ID NO：242的寡核苷酸用●表示。作为负对照寡核苷酸SEQ ID NO：330的寡核苷酸用◆表示。图7A和7B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：313。图8A和图8B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：314。图9A和9B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：319。图10A和图10B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：316。图11A和11B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：317。图12A和12B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：320。图17A和17B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：321。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
如图7-12和17所证实的，试验中检测的每一个寡核苷酸能够引起不同水平和类型的细胞因子的分泌。例如，大部分检测ODN在大约相等或更低浓度下比具有完整硫代磷酸酯骨架的正对照寡核苷酸更好地诱导一种或多种细胞因子。负对照导致产生细胞因子的量显著减少。
PBMC和SEQ ID NO：313一起培育后分泌干扰素α(IFN-α)和白介素-10(IL-10)的水平与和SEQ IDNO：242一起培育后相似。SEQ ID NO：314对于人PBMC分泌IL-10的量的作用与SEQ ID NO：242类似，但IFNα的分泌显著增加。与SEQ ID NO：242相反，SEQID NO：319只诱导人PBMC分泌低水平的IFNα，但是这两个寡核苷酸分泌的IL-10的量相当。SEQ ID NO：316诱导人PBMC分泌IFNα的水平比SEQ ID NO：242高几倍。还观察到IL-10分泌总量的增加。SEQ ID NO：317被证明与SEQ ID NO：316的性质类似，与SEQ ID NO：242相比诱导人PBMC分泌IFN α的量显著增加。IL-10分泌水平略微升高。虽然SEQ ID NO：320可诱导人PBMC分泌IFNα和IL-10，但分泌量小于SEQID NO：242。SEQ ID NO：321诱导人PBMC分泌IFNα的水平比SEQ ID NO：242高多于十倍(图17A)。与SEQ ID NO：242相比，SEQ ID NO：321诱导的人PBMC的IL-10分泌在该寡核苷酸浓度较高的条件下略有增加(图17B)。
实施例 4
B细胞和单核细胞在暴露于本文所述的CpG寡核苷酸之后这些细胞激活的水平如附图13-15，16和18-20所示。图中检测核苷酸用■表示。作为正对照寡核苷酸SEQ IDNO：242的寡核苷酸用●表示。作为负对照寡核苷酸SEQID NO：330的寡核苷酸用◆表示。图13A和13B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：313。图14A和图14B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：314。图15A和15B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：319。图16A和图16B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：316。图18A和18B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：321。图19A和19B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：317。图20A和20B显示的检测寡核苷酸是SEQ ID NO：320。用于生成各个数据点的寡核苷酸的浓度沿X轴表示(μM)。
如图13-15，16和18-20所证实的，试验中检测的每一个寡核苷酸能够引起不同水平和类型的细胞表面标记的表达。例如，大部分检测ODN在大约相等或更低浓度下比具有完整硫代磷酸酯骨架的正对照寡核苷酸更好地诱导细胞表面标记。
SEQ ID NO：313诱导B细胞上的CD86表达水平和单核细胞上的CD80表达水平与SEQ ID NO：242相当。与SEQ ID NO：242相反，  SEQ ID NO：313与SEQ ID NO：242相比在较低浓度就能刺激细胞，表明其具有增强的功效。SEQ ID NO：314诱导B细胞上的CD86表达水平和单核细胞的CD80表达水平相当。与SEQ ID NO：242相比，用较低浓度的SEQ ID NO：314就能观察到SEQ ID NO：314的效果，证明了SEQ ID NO：314具有增强的功效。在B细胞表面上，CD86的表达受到SEQ ID NO：319的强烈上调，信号强度与SEQ ID NO：242相当。在单核细胞上，用SEQ ID NO：319只能检测到略有升高的CD80表达水平。SEQ ID NO：319诱导B细胞上CD86上调的能力与SEQ ID NO：242相比略有降低。与SEQ ID NO：242相比，SEQ ID NO：316诱导B细胞上的激活标记CD86(图16A)和单核细胞上的激活标记CD80(图16B)水平更高。将人PBMC与SEQ IDNO：321一起培育B细胞被强烈激活，用CD86表达表示(图18A)。CD86的水平比SEQ ID NO：242诱导的高。SEQ ID NO：321对单核细胞的激活比SEQ ID NO：242强，通过CD80的表达测定(图18B)。SEQ ID NO：317诱导B细胞上CD86的表达水平与SEQ ID NO：242相当(图19A)，但是与SEQ ID NO：242相比单核细胞上激活标记CD80的表达增加(图19B)。SEQ ID NO：320诱导B细胞上CD86的表达与SEQ ID NO：242程度相似(图20A)。
实施例5.半柔性寡核苷酸在体外对人PBMC具有免疫
                   刺激效果
在此实施例中，检测了半柔性寡核苷酸在体外诱导细胞因子和趋化因子的能力。外周血单核细胞(PBMC)得自三个健康人提供者，在存在各种浓度(0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，和5.0μM)的完全稳定的CpG SEQ ID NO：242或半柔性SEQ ID NO：241的条件下培养。在6，16和48小时之后，收集培养物上清，用ELISA检测上清中的各种细胞因子(IFN-＜，TNF-α，IL-10)和趋化因子IP-10。在低浓度的条件下，半柔性和完全稳定的寡核苷酸在培养16或48小时后诱导INF-α的程度类似。但是ODN 5476对IFN-α的最大诱导浓度是SEQ ID NO：242所需寡核苷酸浓度的大约一半。在中间浓度，SEQ ID NO：242比SEQ ID NO：241诱导更多的IFN-α，在高浓度，SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：241诱导IFN-α都较少。半柔性和完全稳定的寡核苷酸刺激趋化因子IP-10的程度类似，其浓度依赖性也类似。在两种情况下，较低浓度的寡核苷酸都观察到大约700pg/ml的IP-10，较高浓度的寡核苷酸则诱导较少的IP-10。细胞因子IL-10也观察到与IP-10类似的模式，除了半柔性寡核苷酸在0.05μM浓度诱导显著量的IL-10，而完全稳定的寡核苷酸在0.05μM浓度几乎不诱导或根本不诱导IL-10。半柔性和完全稳定的寡核苷酸诱导TNF-α的能力类似，即两种类型的寡核苷酸都能强烈诱导TNF-α，特别是在高浓度的条件下。
                         表1寡核苷酸(μM)诱导的细胞因子和
                                趋化因子(pg/mL)1
 ODN  0.05 0.1  0.2 0.5  1.0  5.0
 IFN  SEQ IDNO：241  534.8(3.5) 466.0(7.5)  251.6(22.9) 25.4(21.4)  22.9(26.3)  26.7(22.1)
 SEQ IDNO：242  444.0(23.9) 573.6(41.7)  892.4(58.0) 583.6(51.5)  115.6(2.5)  51.5(12.8)
 IP-10  SEQ IDNO：241  5677.8(18.9) 6221.5(22.4)  4936.6(11.8) 1493.6(5.5)  121.9(0.4)  0.0(0.0)
 SEQ IDNO：242  7287.4(5.5) 6685.8(12.8)  6967.4(15.9) 4422.7(11.0)  361.7(2.6)  0.0(0.0)
 IL-10  SEQ IDNO：241  447.6(3.7) 385.3.(4.9)  257.3(3.1) 92.9(1.6)  46.5(0.2)  17.3(1.5)
 SEQ IDNO：242  73.4(1.0) 399.8(3.0)  367.7(9.8) 237.8(2.6)  52.3(1.3)  10.5(0.3)
 TNF- SEQ IDNO：241 179.0(18.3) 186.4(15.9) 229.9(23.4) 178.8(9.0) 368.2(22.3) 886.3(31.7)
 SEQ IDNO：242  196.8(25.9) 211.5(8.7)  242.7(5.5) 262.1(6.3)  479.8(33.5)  939.6(69.7)
1其值为平均值(标准偏差)。
实施例6.体外半柔性SEO ID NO：241和完全稳定的
           ODN对鼠巨噬细胞的刺激。
鼠巨噬细胞系(RAW264)与半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241，完全稳定的寡核苷酸SEQ ID NO：242，完全稳定的ODN 1826，脂多糖(LPS)或PBS一起培育16小时。半柔性和完全稳定的ODN的检测浓度为0.02，0.05，和0.1μM。收集上清并用ELISA检测IL-12的p40亚基(IL-12p40，pg/ml)。结果如表2所示。半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241诱导巨噬细胞分泌IL-12p40的能力比任一个完全稳定的ODN都显著地强。
      表2半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241刺激鼠巨噬细胞分
                         泌IL-12p40
ODN  ODN浓度(μM)     IL-12p40，pg/mL平均值(S.D.)
SEQ ID NO：241  0.02     148.8(37.5)
 0.05     149.8(28.7)
 0.1     162.3(8.4)
SEQ ID NO：242  0.02     41.4(18.6)
 0.05     42.0(26.2)
 0.1     23.0(10.7)
SEQ ID NO：386  0.02     43.5(23.0)
 0.05     38.3(19.2)
 0.1     54.4(4.1)
LPS  __     346.5(20.5)
PBS  __     32.0(12.1)
实施例7.可刺激人免疫细胞的具有最优序列的半柔性
B类寡核苷酸是潜在的鼠免疫细胞的免疫刺激剂。
已有报道人和鼠免疫细胞可对不同的CpG ODN发生发应。完全稳定的CpG SEQ ID NO：242被视为在刺激人免疫细胞方面是最优的，但是在刺激鼠免疫细胞方面不能视为是“最优的”。相反的，完全稳定的CpG ODN 5890(5′T*C*A*A*C*G*T*T 3′)在刺激鼠免疫细胞方面被视为是“最优的”，但是在刺激人免疫细胞方面不能被视为是“最优的”。人和鼠B细胞都能表达TLR9。表达TLR9的HEK293鼠脾细胞在存在不同浓度的完全稳定的CpG SEQ ID NO：242，完全稳定的CpG ODN 5890，或半柔性SEQ ID NO：241的条件下进行培养，然后检测TLR9的激活。用于该检测的细胞表达鼠TLR9并含有报道子基因构建体。细胞与ODN一起在湿润的培养箱中在37℃培养16h。每个数据点都重复三次。溶解细胞并检测报道子基因活性。参照不添加ODN的培养基中的报道子基因活性计算刺激指数。半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241和完全稳定的寡核苷酸SEQ ID NO：242具有相同的碱基序列。结果如表3所示。在最低浓度，SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：242具有最小的免疫刺激效果。但是当浓度增加到 14 nM及更高的时候，SEQ ID NO：241明显的比SEQ ID NO：242的免疫刺激效果更强。在本实验中，在最高浓度，SEQ ID NO：241至少与鼠最优化的完全稳定的寡核苷酸ODN 5890具有同样的免疫刺激效果。
         表3具有人细胞最优化的序列的半柔性ODN对鼠的表达
                   TLR9的HEK293细胞的刺激指数。
    ODN
  浓度     5890  SEQ ID NO：241  SEQ ID NO：242
  0.9nM     1.4  0.7  0.9
  3.5nM     2.4  1.1  1.2
  14nM     12.5  1.9  1.1
  58nM     21.4  4.3  2.0
  0.23μM     25.2  12.0  6.2
  0.94μM     28.6  18.3  8.0
  3.75μM     29.3  32.1  10.3
实施例8-9.半柔性寡核苷酸诱导NK细胞激活
还比较了半柔性和完全稳定的寡核苷酸刺激NK细胞激活的能力。使用标准的铬释放检测，在加入10％的FBS(在65℃加热失活30分钟)，50μM2-巯基乙醇，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酸，加入或不加入半柔性SEQ ID NO：241或完全稳定的SEQIDNO：242的2mL RPMI中培养10×106 BALB/c脾细胞48小时，每个ODN加入的终浓度为1，3，或10μg/mL。细胞经过洗涤，然后在用YAC-1和2C11，两个NK敏感的靶细胞系进行的短期51Cr释放检测中作为效应子细胞(Ball as ZK et al. (1993)J Immunol 150：17-30)。向V底微量滴定板中的体积为2mL的104个51Cr标记的靶细胞中加入不同浓度的效应子细胞，在5％ CO2中在37℃培育4小时。所研究的效应子细胞：靶细胞(E∶T)比率为6.25∶1，25∶1，50∶1，和100∶1。然后将板离心，对上清的等分试样计数其放射活性。由存在效应子细胞时的51Cr释放减去靶细胞单独培养时的51Cr释放的比率确定特异溶解百分率，其是基于细胞在2％乙酸中溶解(100％溶解)后的释放减去细胞单独培养时的51Cr cpm释放的总数计算的。结果如表5所示。总的来说，半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241和完全稳定的SEQ ID NO：242在所有ODN浓度下和E∶T比率下诱导NK细胞激活的水平基本相当。
                        表5 NK细胞调节的特异性溶解
ODN μg/mL                      E∶T比率
6.25∶1  25∶1   50∶1  100∶1
 SEQ ID NO：241     1 8  17   17.5  27.5
    3 2.5  5   8  15
    10 4  12.5   20  28
 SEQ ID NO：242     1 7  8   12.5  22
    3 3.5  4   11  18
    10 5  12.5   23  32.5
实施例10.半柔性寡核苷酸通常比具有相同或相似序列 的完全硫代磷酸酯的寡核苷酸更具有免疫刺激效果。
所有检测的半柔性寡核苷酸在人TLR9的检测中都比相应的均一硫代磷酸酯分子更具有活性(表6)。平均刺激指数是根据四个浓度(0.1μM，0.5μM，2μM，和8μM)的数据点计算的。在该表中，U代表2’-脱氧尿嘧啶。
  表6半柔性寡核苷酸相对于具有相同或相似序列的
  完全硫代磷酸酯寡核苷酸的相对平均刺激指数。
                序列 相对平均刺激指数
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：247) 1.00
T*C*G*C*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：248) 0.74
T*C*G*C*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：249) 0.72
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：250) 1.37
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：251) 1.25
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：252) 2.99
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*_CG*C*C*G(SEQ ID NO：253) 2.22
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：254) 3.46
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：255) 4.08
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：256) 5.69
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：257) 4.49
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T* 1.00
T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：244)
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：258) 4.23
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：243) 4.74
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：259) 1.00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：260) 1.80
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：261) 1.00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：262) 2.71
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：263) 3.01
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：264) 3.06
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T(SEQ ID NO：265) 2.06
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T(SEQID NO：266) 1.43
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T(SEQID NO：267) 0.91
G*T*T*C*T*C*G*C*T*G*G*T*G*A*G*T*T*T*C*A(SEQ ID NO：26 8) 1.00
G*T*T*C*T*C_G*C*T_G*G*T_G*A*G*T*T*T*C*A(SEQ ID NO：269) 3.45
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：270) 1.00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：271) 2.49
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：272) 2.51
T*C*G*T*C*G*T*T*T*U*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：273) 1.00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：274) 2.62
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：242) 1.00
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：276) 1.95
T*C*G*U*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*U*G*U*C*G*T*T(SEQ ID NO：277) 1.00
T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*UG*U*C_G*T*T(SEQ ID NO：278) 1.39
T*C*G*T*C*G*U*U*U*T*G*T*C*G*U*U*U*U*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：279) 1.00
T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：280) 2.05
A*A*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：281) 1.00
A*A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：282) 1.58
实施例11.在体外弱免疫刺激的完全稳定的寡核苷酸 的半柔性形式具有提高的能力
(T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T，SEQ ID NO：244)是完全稳定的，完全硫代磷酸酯的CpG寡核苷酸，与SEQ ID NO：242相比免疫刺激能力较低。相关的半柔性寡核苷酸(T*G*T*CG*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T，SEQ ID NO：258)和(T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T，SEQ ID NO：243)的能力是SEQ ID NO：244的数倍，甚至比SEQ ID NO：242能力还强。
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：258)
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：243)
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：244)
                 表7完全稳定的但是免疫刺激效果较弱的寡核苷酸
                        的半柔性变体具有提高的免疫刺激效果
ODN                       ODN浓度，μM
    0.1     0.5     2     8
 SEQ ID NO：244     16.0     47.5     71.4     68.5
 SEQ ID NO：243     19.3     40.5     78.2     77.9
 SEQ ID NO：241     2.6     9.5     12.9     14.0
 SEQ ID NO：242     10.6     34.2     38.3     40.8
实施例12.长度减少的半柔性寡核苷酸在体外具有免
                   疫刺激效果
比较半柔性16聚体，SEQ ID NO：283，16聚体，SEQ ID NO：245，17聚体，SEQ ID NO：284，和24聚体，SEQ ID NO：241和完全稳定的ODN 24聚体，SEQ ID NO：242和18聚体，SEQ ID NO：285刺激TLR9信号传导的能力。将每种寡核苷酸加入到浓度分别为1，6，12，或24μg/mL的人TLR9和报道子基因构建体转染的HEK293细胞中，如上所述检测TLR9的激活。
(16聚体)T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T(SEQ ID NO：283)
(16聚体)T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：245)
(17聚体)T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：284)
(18聚体)A*A*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：285)
(24聚体)T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：241)
(24聚体)T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：242)
在所有检测浓度下，18聚体完全稳定的寡核苷酸ODN SEQ ID NO：285比24聚体完全稳定的寡核苷酸SEQID NO：242的免疫刺激效果更弱，在6μg/mL或更高浓度下，16聚体和17聚体半柔性寡核苷酸至少与24聚体SEQ ID NO：242免疫刺激效果相同。此外，16聚体和17聚体半柔性寡核苷酸几乎与24聚体半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241的免疫刺激效果相同。
                 表8短的半柔性寡核苷酸与短的和长的完全稳定的
                     和半柔性寡核苷酸相比的免疫刺激活性
ODN                         ODN浓度，μg/mL
    1     6     12     24
 SEQ ID NO：283     1.2     17.1     29.0     39.5
 SEQ ID NO：245     1.1     8.4     31.3     48.9
 SEQ ID NO：284     3.4     23.9     35.9     45.6
 SEQ ID NO：285     4.6     12.9     15.9     18.0
 SEQ ID NO：241     6.4     33.0     50.8     58.6
 SEQ ID NO：242     11.0     24.6     26.2     21.9
实施例13.半柔性寡核苷酸在体内具有免疫刺激效果
将B ALB/c小鼠分组，皮下给予400μg半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241，完全稳定的免疫刺激寡核苷酸SEQ ID NO：242，完全稳定的负对照寡核苷酸(TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT，SEQ ID NO：286)，或等量体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。注射后3小时对动物抽血，用合适的细胞因子特异的ELI SA测定血清中IP-10，IFN-γ，和TNF-α的水平。接受半柔性SEQ ID NO：241(8,000-12,000pg/mL)的动物中的血清IP-10比SEQ ID NO：242(3,500-8,000pg/mL)高大约两倍。接受对照SEQ ID NO：286的动物中的血清IP-10与接受PBS的动物中的IP-10水平同样低。半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241和完全稳定的免疫刺激寡核苷酸SEQ ID NO：242诱导IFN-γ的量相似，大约为150pg/mL。半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241诱导TNF-α的量比完全稳定的免疫刺激寡核苷酸SEQ ID NO：242高30-45％(在一个实验中是大约1,550pg/mL和大约1,175pg/mL，在另一个实验中是大约710pg/mL和490pg/mL)。
在另一组体内实验中，检测了半柔性和完全稳定的寡核苷酸在BALB/c小鼠中治疗肿瘤的能力。三组BALB/c小鼠注射自然发生的鼠肾腺癌细胞(Renca)，用已有的肿瘤模型。Salup RR et al.(1985)J Immunopharmacol 7：417-36.每组小鼠还接受了100mg半柔性寡核苷酸SEQID NO：241，100mg完全稳定的免疫刺激寡核苷酸SEQID NO：242，或等量体积的PBS。然后检测小鼠的存活和死亡时的肿瘤尺寸。接受PBS假处理的小鼠平均存活为44天，50天的存活率为20％。相反，接受半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241的小鼠在50天的时候具有80％的存活率，接受完全稳定的免疫刺激寡核苷酸SEQ ID NO：242的小鼠在50天时具有70％的存活率。在肿瘤尺寸(立方毫米)方面，52天后接受PBS的小鼠的肿瘤体积为大约1200mm3，而接受半柔性寡核苷酸SEQ ID NO：241或完全稳定的免疫刺激寡核苷酸SEQ ID NO：242的肿瘤分别为大约250mm3和180mm3。因此半柔性寡核苷酸和完全稳定的寡核苷酸在此模型中在减轻肿瘤负荷和延长存活方面都很有效。
实施例14.柔性或半柔性寡核苷酸具有减小的中毒性肾 损害
已经观察到给猴子施用完全稳定的免疫刺激寡核苷酸与肾小球肾炎，即肾的炎症的发展有关。肾小球肾炎可以通过尿中红血球和蛋白的存在进行诊断和监控，通常伴随着肾小球滤过率的降低(即氮血率)，水和盐滞留，高血压，和水肿。通常尿基本不含血细胞和血浆蛋白。还可以通过肾组织的组织检查诊断。据报道肾组织富含核酸酶，它对于柔性寡核苷酸比完全稳定的免疫刺激寡核苷酸更具有活性。
将猴子分为两组，一组给予柔性寡核苷酸，另一组给予完全稳定的免疫刺激寡核苷酸。柔性寡核苷酸和完全稳定的免疫刺激寡核苷酸在序列上相同，仅是其核苷酸间连接不同。两组猴子都接受相同剂量的免疫刺激寡核苷酸。预治疗(基准)和定期治疗都要检测至少一个参数，以评估肾小球肾炎的存在，包括，例如，用试纸验尿确定是否存在蛋白尿和/或血尿，用显微镜进行尿液分析确定是否存在红细胞和/红细胞圆柱，尿蛋白浓度，血尿氮(BUN)，血清肌氨酸酐，血压，体重，和用光学和/或电子显微镜组织分析进行肾活组织检查。将临床发现与给予每个猴子的免疫刺激寡核苷酸的类型联系起来，比较各组之间的结果的统计显著性。
可选择地，用另外两组猴子，如上所述给予柔性或半柔性寡核苷酸或完全稳定的免疫刺激寡核苷酸，但是使用更高或更低的寡核苷酸剂量，来进一步评价结果与寡核苷酸剂量之间的关系。
接受柔性寡核苷酸的猴子比接受完全稳定的免疫刺激寡核苷酸的猴子更不倾向于患肾小球肾炎。
实施例15.柔性寡核苷酸在高浓度具有增强的免疫刺激 能力
比较柔性寡核苷酸和SEQ ID NO：242诱导TLR9活性的能力。在四种浓度，1μg/ml，6μg/ml，12μg/ml，和24μg/ml的每一种下都比较柔性ODN和对照SEQ IDNO：242。在每个浓度下每个柔性寡核苷酸激活与SEQ ID NO：242激活的比率如下述表9所示。这些结果表明柔性寡核苷酸在较高浓度下比SEQ ID NO：242更具免疫刺激性。
T*G*T*C_G_T*T*G*T*C_G_T*T*G*T*C_G_T*T*G_T*C_ G*T*T    SEQ ID NO：287
T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C_GT*T*T    SEQ ID NO：288
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*C_G_G*T*C_G_T*T*T*T    SEQ ID NO：289
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*C_G_T*G*C_G_T*T*T*T*T    SEQ ID NO：290
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T    SEQ ID NO：291
T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C_G*A    SEQ ID NO：292
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T*T_G*T_C_G*T*T    SEQ ID NO：293
                     表9在每个浓度柔性寡核苷酸与SEQ ID NO：242相比的
                                          相对能力
ID                   ODN浓度，μg/mL
    1     6     12     24
 SEQ ID NO：287     0.11     0.12     1.00     1.68
 SEQ ID NO：288     0.30     0.62     1.67     1.81
 SEQ ID NO：289     0.13     0.52     1.67     1.97
 SEQ ID NO：290     0.18     0.41     1.69     2.27
 SEQ ID NO：291     0.16     0.35     1.56     1.81
 SEQ ID NO：292     0.25     0.48     1.38     1.84
 SEQ ID NO：293     0.10     0.11     1.20     2.05
实施例16.血清和组织中寡核苷酸的稳定性。
小鼠被皮下注射25mg/kg半柔性寡核苷酸SEQ IDNO：241，柔性寡核苷酸(T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T；SEQ ID NO：294)，或完全稳定的寡核苷酸SEQ ID NO：242。在选定的时间之后采集组织和血清样品并就完整寡核苷酸和其片段对其进行分析。
组织或血清样品用穿刺注入已知数量的内标ODN(1.25μg polyT)，通过下述的自动固相萃取(SPE)方法从组织和血浆样品中分离ODN。所得到的含有分析物，代谢物，和内标的溶液通过下述的毛细管电泳(CGE)和MALDI-TOF方法进行分析。测定从CGE分析的肾，肝，脾和血清样品中回收的ODN总量(即分析物加上代谢物)。计算标准偏差。用占总峰面积的百分比表示每个代谢物的相对数量。
SPE.要从血清中分离ODN，将100μg的样品进行穿刺注入1.25μg内标ODN，搅拌并溶解于5ml SAX-缓冲液中。将溶液通过阴离子交换柱(SAX，Agilent)，并进行洗脱，用离子强度增加的缓冲液洗脱ODN。将得到的洗脱液用反相(RP)柱(Glen Research)或可比柱(HLB，Waters)脱盐。将只含有水或乙腈的RP柱的洗脱液干燥并在同一个管子中溶解于60μl去离子水中。进行膜透析以进一步使样品脱盐。直接用毛细管电泳分析样品。进行MALDI-TOF MS的时候，样品不稀释或者浓缩，就是将50μl的ODN样品真空干燥，在去离子水中溶解并如下述进行检测。
按照相似的SPE操作方法分离组织中的ODN。用FastPrep装置对100mg组织进行匀浆。加入蛋白酶K，使蛋白水解2h。在用上述的SPE方法中的水溶组分继续操作之前进行苯酚提取。
CGE.将含有分析物，其代谢物，以及确定数量的内标ODN的脱盐样品用电动方法注射到预注了水的充满凝胶的毛细管(中性，30cm，eCAP DNA毛细管，Beckman#477477)的样品侧，使用300V/cm的电压，在260nm进行检测。在25℃在含有7M脲的Tris/硼酸/EDTA缓冲液中进行分离。通过与标定物比较相对迁移时间(MT寡核苷酸/MT内标)分辨各分析物，同样地制备并分析标定物。记录相对迁移时间和任何＞3x信号∶噪声(S∶N)的电泳峰的相对面积百分比。峰高在3x和10x信号∶噪声之间的记录不进行计量。
％寡聚物＝(峰面积/总峰面积＞3xS∶N)x100％
MALDI-TOF.含有分析物和其代谢物的脱盐样品用Applied Biosystems MALDI-TOF质谱仪进行分析，使用延迟引出源，337nm波长的氮激光，1.2米的飞行管。仪器设置如下：电压为25kV；栅极电压95.4％；导引线0.1％；延迟时间1200ns。使用含有柠檬酸二铵的3-羟基吡啶甲酸作为基质。ODN样品的光谱在外部在同一个样品板中在相同的条件下用一组已知分子量的标准ODN进行校准。
48小时得到的结果如图20所示。图20显示了在肾中半柔性SEQ ID NO：241和柔性ODN SEQ ID NO：294与完全硫代磷酸酯的SEQ ID NO：242相比显著减少(分别减少了93％和87％)
实施例17.C寡核苷酸在体外具有免疫刺激效果。
半柔性C类寡核苷酸在5’非回文部分(ODN SEQ ID NO：255)，3’回文部分(ODN SEQ ID NO：251)，以及同时在5’非回文部分和3’回文部分(ODN SEQ IDNO：295)中具有磷酸二酯连接。此外，ODN SEQ IDNO：252中的连接与ODN SEQ ID NO：295相似，但是由核苷酸中的2’-O-Me核糖组成3’回文部分(如下述下划线所示)。然后用上述的TLR9检测评价这些寡核苷酸。
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：255)
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：251)
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G(SEQ ID NO：295)
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T* C_G * G * C_G * G * C * C_G * C * C * G(SEQ ID NO：252)
具有完全稳定骨架的C-类寡核苷酸与B类寡核苷酸相比通常显示出相对低的TLR9活性。如下述表10所述，仅在5’非回文部分引入半柔性序列(ODN SEQ ID NO：255)与仅在3’回文部分引入半柔性序列(ODN SEQ IDNO：251)相比显著增强了TLR9的活性。同时在5’非回文部分和3’回文部分引入半柔性序列(ODN SEQ ID NO：295)与仅在3’回文部分引入半柔性序列(ODN SEQID NO：251)相比增强了TLR9的活性。
                                   表10半柔性C类寡核苷酸对TLR9的刺激
ODN                          ODN浓度，μg/mL
  0.1     0.5     2.0     8.0
    SEQ ID NO：255   2.3     16.9     36.4     35.7
    SEQ ID NO：251   1.2     2.5     8.4     16.8
    SEQ ID NO：295   2.0     11.6     29.8     37.3
    SEQ ID NO：252   1.1     3.9     22.1     47.0
半柔性C类寡核苷酸不仅保留了诱导人PBMC分泌IFN-α的能力，而且它们在低浓度也具有较强的能力。在那些在5’非回文部分包括半柔性序列(ODN SEQ IDNO：255和ODN SEQ ID NO：295)的C类寡核苷酸中能力的增强最明显。ODN SEQ ID NO：255，SEQ IDNO：251，和SEQ ID NO：295用ELISA评价，并与SEQ ID NO：242，这三个半柔性寡核苷酸的完全稳定形式和有效的IFN-α的C-类寡核苷酸诱导子进行比较。结果如表11所示。
                        表11 C-类寡核苷酸的半柔性形式对IFN-α的诱导
                                         (pg/mL)。
ODN                         ODN浓度，μM
  0.1     0.2   0.5    1.0     2.0
    SEQ ID NO：255   3202     7429   937    64     3
    SEQ ID NO：251     688   3033    3083
    SEQ ID NO：295   2560     3363   3246    930     41
  50     504   3247    2114     1789
实施例18：SEQ ID NO：313的物理化学性质
方法：
SEQ ID NO：313的粉末X-射线衍射模式显示出非晶相特征的衍射花纹。水蒸气吸附分析显示出SEQ ID NO：313具有高的吸湿性。药物交换水分会导致水分量随环境湿度的变化而变化。所述化合物显示出高的水溶性(＞100mg/mL)，因此在可用的pH范围内具有足够的溶解性。对升高温度的药物水溶液的分析表明它在微酸到酸性环境中很快的降解，但是缓冲值在pH6以上的溶液显现出具有足够的溶液稳定性。
结果：
SEQ ID NO：313的天然状态是非晶体的并且是高度吸湿的。所述化合物显示出高的水溶性(＞100mg/mL)，因此在可用的pH范围内具有足够的溶解性。所述ODN在微酸到酸性环境中很快的降解。缓冲值在pH6以上的溶液显现出具有足够的溶液稳定性。
实施例19：在体外对TLR9-转染的细胞的刺激
方法：
人TLR9转染的HEK 293细胞与SEQ ID NO：313或SEQ ID NO：329一起培育16小时。通过荧光素酶读数测定信号。
结果
与SEQ ID NO：329相比，SEQ.ID NO：313对靶受体TLR9的刺激能力更强。
实施例20：在体外对人免疫细胞的刺激
方法：
来自6个供体的人外周血单核细胞与SEQ.ID NO：313或SEQ ID NO：329一起培育24或48小时。检测细胞因子的分泌。
结果
结果如图23所示。与SEQ ID NO：329相比，SEQID NO：313作为TLR9相关的细胞因子IL-6，IL-10，IFNα和IP-10的诱导子显示出增加的或至少是相似的功效和/或能力。
实施例21：在体外对鼠脾细胞的刺激
方法：
鼠(BALB/c)脾细胞与SEQ ID NO：313或SEQ ID NO：329一起培育48小时。检测细胞因子和IP-10的分泌。
结果
与SEQ ID NO：329相比，SEQ ID NO：313作为细胞因子IL-6，IL-10，IL-12p40，IFNα，TNFα和IP-10的诱导子显示出增加的或至少是相似的功效和/或能力。数据如图24所示。这些数据证明SEQ ID NO：313对鼠免疫细胞的活性与对人细胞(上述)的活性相当，与TLR9激活的结果类似。
实施例22：小鼠体内细胞因子基因的诱导
方法：
这项研究评估了将SEQ ID NO：313对呼吸道施用后鼠肺中细胞因子的表达。为了研究肾的情况，还评估了此器官中同样细胞因子(如实施例10和21中所述)的表达。小鼠(雄性，BALB/c)通过鼻腔内滴注或丸药静脉注射给予SEQ ID NO：313或S EQ ID NO：329(每种1mg/kg)。给药8或15小时后摘除肺和肾。提取RNA并转录为cDNA。放大cDNA的靶片段并用real-time PC R(Roche LightCycler用SYBR Green检测方法)进行检测。用Roche的LC PROBE DE SIGN软件(1.0版本，Roche目录No 3139 174)设计GAPDH，IFNγ，IL-6，IP-10，和TNF-的引物。用PRIMER 3软件设计IFN的引物。所产生的α产物均一化为对照基因(GAPDH)表达的比率。
结果
施用于呼吸道的时候，SEQ ID NO：313诱导肺中TLR9相关基因(IL-6，TNFα，IFNα，IFNγ和IP-10)的表达。结果如图25所示。但是，除了IP-10，这些基因在以这种方式给药的小鼠的肾中不表达。由于IP-10通常被干扰素诱导，该趋化因子的表达可能是从肺分泌到系统循环中的干扰素的间接结果。当SEQ ID NO：313进行静脉内给药的时候，除了IFNγ的每一个基因在肾中都被诱导。因此，在SEQ ID NO：313对呼吸道施用后对肾没有效果可能是由于较低的系统性暴露。
CpG ODN可能通过很多方式引起对肾的作用。在对一些CpG ODN系统性暴露之后观察到由依赖于TLR9的方式引起的急性肾肉芽肿性炎症。我们的结果表明对给入到呼吸道的SEQ ID NO：313的系统性暴露对于在肾中直接诱导TLR9-相关基因是不够的。
实施例23：对于小鼠体内抗原诱导的淋巴结发育的效果
方法：
这项研究研究了SEQ ID NO：313在小鼠的引流淋巴结中诱导免疫反应偏移Th2-类型反应的能力。通过向小鼠(雄性，BAAB/x)的右后脚垫注射抗原(卵清蛋白，100μg)和完全弗氏佐剂使其致敏。同时向同一个脚垫注射SEQ ID NO：313或SEQ ID NO：329(1.5mg/kg)或载体(盐水)。脚垫注射后6天，摘除膝后弯的的引流淋巴结。用流式细胞术计数T细胞(CD3+)和B细胞(B220+)。如下所述进行离体抗原唤起检测，将1×106个细胞(来自膝后弯的的引流淋巴结)在2201介质含有卵清蛋白(100μg/ml)或稀释剂的RPMI 1640+10％胎牛血清中培育。培养36个小时以后除去介质，用LINCO research，Inc.14 research Park Drive，st charles，Missouri 63304的试剂盒检测IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12p70，GM-CSF，IFNγ，和TNFα的浓度，用Luminex多元系统(Luminex Corporation，12212 Technology Boulevard，Austin，Texas 78727-6115)进行分析。
结果
引流淋巴结的细胞数目致敏化引起T细胞和B细胞在引流淋巴结中的聚集。这些抗原诱导的聚集在还接受了CpG ODN的小鼠中没有显著增加。但是，每个单独注射到未致敏小鼠中的CpG ODN不引起T细胞和B细胞的聚集。数据如图26所示。
抗原唤起检测取自抗原致敏的小鼠的引流淋巴结细胞在离体被抗原再刺激的时候分泌IL-4，IL-5，IL-10和IFNγ。在还接受了CpG ODN的致敏小鼠中，Th2-类型的细胞因子IL-4，IL-5和IL-10的分泌减少了，但是Th1-类型的细胞因子IFNγ的分泌增加。我们的数据，如图27所示，支持了这个猜想，即SEQ ID NO：313象SEQID NO：329一样，可抑制对于抗原致敏的Th2反应。结果是平均值±s.e.m.(n＝9-10)。与致敏的，用载体处理组相比*P＜0.05(Kruskal-Wallis多重比较检验)。
实施例24：对小鼠体内抗原诱导的IgE产生的效果
方法：
在进行研究的第0和第7天用抗原(卵清蛋白，100g，i.p.)和氢氧化铝佐剂对小鼠(雄性，BALB/c)进行致敏。在每次致敏前两天和每次致敏当天使小鼠接受SEQ ID NO：313(0.15或1.5mg/kg，i.p.)或SEQ ID NO：17(1.5mg/kg，i.p.)。在研究的第18天收集血清。用ELISA测量抗原(卵清蛋白)特异的IgE和IgG2a的滴度。操作方法总结于表12中。
                         表12操作方法总结
     致敏       致敏
↓ ↓
O DN O DN  O DN  O DN
↓ ↓ ↓ ↓
天数： -2  0  5 7 18
    ↓
结束
结果
在用SEQ ID NO：313或SEQ ID NO：329处理的小鼠中，完全阻止了抗原特异性的IgE的产生。相反，IgG2a的产生增加了。由于IgE和IgG2a的产生分别是Th2类型和Th1类型反应的特征，这种效果进一步证明了SEQ ID NO：313可以抑制对于抗原致敏的Th2类型的反应。另外CpG ODN还可以直接诱导B细胞中T-β表达和IgE的类别转换。数据如图28所示。结果是平均值±s.e.m.(n＝10-12，除了SEQ ID NO：329组是5)。与致敏的，用载体处理组相比*P＜0.05(Kruskal-Wallis多重比较检验)。
实施例25：对于小鼠体内抗原诱导的呼吸道炎症的效果
方法：
在进行研究的第0和第7天用抗原(卵清蛋白，100μg，i.p.)和氢氧化铝佐剂对小鼠(雄性，BALB/c)进行致敏。小鼠通过暴露于吸入的卵清蛋白喷雾剂中被抗原激发，每周两次，连续两周。第一次激发是在研究的第21天。通过鼻腔内滴注给呼吸道施用SEQ ID NO：313(0.1-1000μg/kg)，SEQ ID NO：329(1-1000μg/kg)或载体(盐水，20μl)，每周一次，在该周第一次抗原激发之前两天施用。用肺泡冲洗液回收呼吸道中的细胞，制备不同的细胞计数。用组织病理学评估测定肺组织中嗜伊红细胞的数目(嗜伊红细胞体积密度)和粘液分泌(PAS染色)。操作方法列于表13中。
                                    表13操作方法总结
致敏 激发 激发
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
ODN ODN
↓ ↓
天数： 0 7 19 21 24 26 28 31 33
↓
结束
结果
抗原激发引起呼吸道内腔中白细胞，主要是嗜伊红细胞的总数的增加。数据如图29所示。SEQ ID NO：313和SEQ ID NO：329以剂量依赖的方式显著抑制了嗜伊红细胞。嗜伊红细胞的ED50值为：SEQ ID NO：313：23μg/kg；SEQ ID NO：329：47μg/kg。激发还可以引起CD4+T(CD3+CD4+细胞)细胞的聚集，该细胞受到SEQID NO：313的显著抑制。SEQ ID NO：313还显著抑制肺组织中抗原诱导的嗜伊红细胞的聚集以及上皮粘膜的分泌。图29的结果是结果是平均值±s.e.m.(n＝15)。与抗原激发的载体处理组相比*P＜0.05(Kruskal-Wallis多重比较检验)。图30的结果是结果是平均值±s.e.m.(n＝6)。与抗原激发的载体处理组相比*P＜0.05，**P＜0.001(Kruskal-Wallis多重比较检验)。
实施例26：对于小鼠体内抗原诱导的呼吸道反应过度的效果
方法：
在进行研究的第0和第7天用抗原(卵清蛋白，100μg，i.p.)和氢氧化铝佐剂对小鼠(雄性，BALB/c)进行致敏。小鼠通过暴露于吸入的卵清蛋白喷雾剂中被抗原激发，每周两次，连续两周。第一次激发是在研究的第19天。通过鼻腔内滴注给呼吸道施用SEQ ID NO：313(10-1000μg/kg)或载体(盐水，20μl)，每周一次，在该周第一次抗原激发之前两天施用。在最后一次抗原激发后24小时通过测量对于静脉内乙酰胆碱的支气管收缩(呼吸道阻力增加)。对于每一个动物，绘制其对于乙酰胆碱的剂量反应曲线，用曲线下的面积量化呼吸道反应性。操作方法如表14所示。
                                      表14操作方法总结
  致敏   激发   激发
  ↓   ↓   ↓   ↓   ↓   ↓ 30
  ODN   ODN
  ↓   ↓
天数：    0   7   17   19   22   24   26   29
  ↓
  结束
结果
抗原激发引起呼吸道反应过度。SEQ ID NO：313以剂量依赖的方式抑制抗原诱导的呼吸道反应过度的发生。数据如图31和32所示，样品对于乙酰胆碱的剂量反应曲线显示了SEQ ID NO：313(1000μg/kg)的效果。将对乙酰胆碱的剂量反应曲线量化为其曲线下的面积。结果是平均值±s.e.m.(n＝6-8)。与抗原激发的载体处理组相比*P＜0.05(Kruskal-Wallis多重比较检验)。
用重复测量的MANOVA对抗原激发并用载体处理的小鼠与每一个用抗原激发并用SEQ ID NO：313处理的小鼠之间的完全剂量反应(RL)进行分析。在100和1000μg/kg SEQ ID NO：313处理组的剂量反应曲线之间具有显著性差异，在抗原激发并用载体处理的小鼠和用10μg/kg SEQ ID NO：313进行类似处理的小鼠之间没有显著性差异。
实施例27：大鼠的体内药物动力学(PK)研究
在大鼠中进行PK研究以确定SEQ ID NO：313，一种“半柔性”ODN在血浆和组织，特别是肾中的清除是否比SEQ ID NO：329，一种具有与SEQ ID NO：313相同的碱基序列的完全硫代磷酸酯的ODN更快。
方法
通过静脉内(IV)和气管内(IT)方式给予56只大鼠5mg/kg(对于IV和IT)的SEQ ID NO：313和SEQ IDNO：329。收集血浆，肺，肾。该研究持续5天，每个剂量组14个时间点。IV组每个时间点3只大鼠(总数为42只大鼠)，IT组每个时间点4只大鼠。
结果
图33显示了5mg/kg的IV和IT给药后大鼠血浆中ODN的浓度。血浆数据显示出在IV和IT给药后SEQ IDNO：313比SEQ ID NO：329更快地从血浆中清除。图34显示了5mg/kg的IV和IT给药后大鼠肺中ODN的浓度。在同样剂量水平的IV给药后，肺中SEQ ID NO：313的浓度比SEQ ID NO：329的浓度低。在IT给药方式中，这种差异比较不明显。SEQ ID NO：329的肺数据只记录到给药后48小时。
图35显示了5mg/kg的IV和IT给药后大鼠肾中ODN的浓度。肾数据显示出在IV和IT给药后肾中SEQ ID NO：313的绝对水平都低于相应的SEQ ID NO：329浓度。特别是在IT给药后肾对于SEQ ID NO：313的暴露显著的低于对相同剂量水平的SEQ ID NO：329的暴露。这可以由图36和37中更明显地看出。
图36显示了5mg/kg的IV给药后大鼠肾中ODN的浓度。图37显示了5mg/kg的IT给药后大鼠肾中ODN的浓度。在IT给药后直至1小时SEQ ID NO：313和SEQ ID NO：329都低于肾中的测量下限(0.4-0.6μg/g)。1小时后，所有的在研究阶段(48小时)中收集到的肾样品中都能检测到SEQ ID NO：329。另一方面，SEQ IDNO：313直至给药后7小时还只是可检测到的水平。
              表15：在对大鼠以5mg/kg的剂量水平进行IV和IT给药
              后，SEQ ID NO：313和SEQ ID NO：329的平均PK参数
                                 的总结
剂量组 组织 ODN  CmaX(μg/ml) Tmax(小时)   T1/2(小时) AUC0-1NF～(hrμg/ml) AUC0-48h*～(hrμg/ml)
IV(5mg/kg) 血浆   10   na     na   0.20     9.5     9.3
  17   na     na   0.62     62.8     62.2
肺   10   1.4     0.25   0.17     0.47     0.35
  17   14.4     0.083   2.5     23.7     20.8
肾   10   6.6     0.083   24.9     184     123
  17   11.4     0.083   nc     nc     346
 IT(5mg/kg) 血浆   10   1.9     0.75   1.20     2.68     2.35
  17   2.1     2   2.3     9.01     7.46
肺   10   632     0.25   28.1     5540     5350
17 692 1   (31)**     (7908)** 6505
肾   10   0.49     2   7.8     5.81     2.34
  17   3.8     7   nc     nc     134
na-不使用
nc-不可计算。由于在研究期间没有达到末期或末期清除期，数据点不够不能精确估计。
*-48小时前最后的可测量浓度的AUC0-48h或AUC0- LAST
**-非常近似的估计(仅仅是基于末期中的2个数据点)
10-SEQ ID NO：313
17-SEQ ID NO：329
表16(a)-(c)：在对大鼠以5mg/kg的剂量水平进行IV和IT给药后，系统和组织对SEQ ID NO：313和SEQ ID NO：
              329的暴露
              (a)- 血浆数据
ODN 给药方式 AUC0-48hr(hr.μg/ml) SEQ ID NO：313：SEQID NO：329的比率
SEQ IDNO：313 IT  2.35 0.32(IT)
IV  9.30 0.15(IV)
IT：IV比率 0.25
SEQ IDNO：329 IT  7.46
IV  62.2
IT∶IV比率 0.12
                            (b)- 肺数据
ODN 给药方式 AUC0-48hr(hr.μg/ml) SEQ ID NO：313：SEQ ID NO：329的比率
SEQ IDNO：313  IT 5350 0.82(IT)
 IV 0.35 0.017(IV)
 IT∶IV比率 15286
SEQ IDNO：329  IT 6505
 IV 21
 IT∶IV比率 313
                         (c)- 肾数据
ODN 给药方式 AUC0-48hr(hr.μg/ml)  SEQ ID NO：313：SEQ ID NO：329的比率
SEQ IDNO：313  IT 2.34  0.017(IT)
 IV 123  0.36(IV)
 IT∶IV比率 0.019
SEQ IDNO：329  IT 134
 IV 346
 IT∶IV比率 0.39
在通过静脉内(IV)或气管内(IT)方式给予这两种ODN之后，发现对于SEQ ID NO：313的系统性和肾暴露显著低于对SEQ ID NO：329的暴露。
以5mg/kg进行IT给药后SEQ ID NO：313的血浆AUC是2.7 hr.μg/ml。SEQ ID NO：329的相应值是9.0hr.μg/ml。因此对于SEQ ID NO：313的系统性暴露是SEQ ID NO：329的三分之一。
以5mg/kg进行IT给药后SEQ ID NO：313的肾AUC是2.35 hr.μg/ml。SEQ ID NO：329的相应值是134hr.μg/ml。因此在同样剂量水平，对于SEQ ID NO：313的系统性暴露仅是SEQ ID NO：329的2％。
与血浆和肾的情况不同，IT给药后肺对于SEQ ID NO：313的暴露与对于SEQ ID NO：329的暴露相比并没有降低到这种程度。SEQ ID NO：313的肺AUC是相同水平的SEQ ID NO：329的肺AUC的几乎70-80％。由于肺是目标组织，肺中ODN的清除没有增加到与血浆和肾相同的程度是非常有利的。
图38显示了SEQ ID NO：313以5mg/kg进行IV给药后大鼠肾中SEQ ID NO：313和它的8聚体代谢物的浓度。
图39显示了SEQ ID NO：313以5mg/kg进行IT给药后大鼠肾中SEQ ID NO：313和它的8聚体代谢物的浓度。由于方法学的问题，血浆和组织中SEQ ID NO：313的8聚体代谢物的数据不完全。但是，在一些IV和所有的IT肾样品中可以获得8聚体的数据。这项数据显示出在大部分成功测量8聚体浓度的肾样品中，代谢物的水平超过了SEQ ID NO：313的水平，表明核酸内切酶活性是SEQ ID NO：313代谢的重要方式。
在完全硫代磷酸酯骨架(SEQ ID NO：329)中引入多个磷酸二酯连接(SEQ ID NO：313)增加了所述ODN的降解率，导致更快的清除，特别是从肾中。
实施例28：与完全硫代磷酸酯ODN相比用半柔性 ODN对TLR9的激活
方法
表达人TLR9的稳定转染的HEK293细胞以前有过描述[Bauer et al.；PNAS；2001]。简短来说，用表达人TLR9和6xNFκB-荧光素酶报道质粒的载体通过电穿孔转染HEK293细胞。稳定的转染子(3×104细胞/孔)与ODN在湿润的培养箱中在37℃一起培育16h。每个实验点都重复三次。溶解细胞并检测其荧光素酶基因活性(用Perkin-Elmer，Ueberlingen，Germany的B rightlite试剂盒)。参照不加入ODN的培养基的报道子基因活性计算刺激指数。
结果
TLR9，容易地被含有最优免疫刺激CpG序列的ODN激活。我们将稳定表达人TLR9的细胞系与一组半柔性ODN和一组与半柔性ODN具有相同ODN序列的完全硫代磷酸酯ODN一起培育。结果如图40所示。
这个结果证明了下表中的每一个半柔性ODN，SEQ ID NO：376，378，380，382，384，241分别比具有完全硫代磷酸酯骨架的相同序列的ODN，SEQ ID NO：377，379，381，383，385，和242能激活更高水平的TLR9。
SEQ IDNO：376  T*G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
SEQ IDNO：377  T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
SEQ IDNO：378  U*G*T*C_G*T*T*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U
SEQ IDNO：379  U*G*T*C*G*T*T*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U
SEQ IDNO：380  D*G*T*C_G*T*T*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*T
SEQ IDNO：381  D*G*T*C*G*T*T*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*T
SEQ IDNO：382  U*G*T*C_G*T*T*U*U*U*U*U_G_G_G_A_GG*G*G
SEQ IDNO：383  U*G*T*C*G*T*T*U*U*U*U*U*G*G*G*A*G*G*G*G
SEQ IDNO：384  U*G*T*C_G*T*T*C*C*U*U*U_G_G_G_A_GG*G*G
SEQ ID  U*G*T*C*G*T*T*C*C*U*U*U*G*G*G*A*G*
 NO：385  G*G*G
 SEQ IDNO：241  T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T
 SEQ IDNO：242  T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
实施例29：在半柔性寡核苷酸中用Rp核苷酸间连接 作为磷酸二酯样连接
方法
细胞培养条件和试剂
对于B细胞增殖检测，BALB/c小鼠(4-18周龄)以2-5×105-106个细胞/ml的密度在96孔微量滴定板中在RPMI中培养44小时，然后加入1μCi的3H胸腺嘧啶核苷4-6个小时，然后收集细胞，用文献的方法(Krieg et al.，1995)测定其闪烁计数。要进行Western blots，在37℃在湿润的5％CO2培养箱中，用加入10％热失活的FCS(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，1.5mM L-谷氨酰胺，50μM 2-ME，100U/ml青霉素，和100μg/ml链霉素的RPMI 1640(Life Technologies，Gaithersburg，MD)培养WEHI-231细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)。
寡核苷酸
寡脱氧核苷酸(PO-寡聚物)和立体随机的寡聚物(脱氧核苷硫代磷酸酯)[Mix-PS]-寡聚物购自Operon Technologies(Alameda，CA)或用标准亚磷酰胺方法(Caruthers，1985)(Stec et al.，1984)制备。寡核苷酸[Mix-PS]-d(TCCATGACGTTCCTGACGTT)([Mix-PS]-SEQ ID NO：386)用作正对照，因为以前发现它对鼠细胞具有强烈的免疫刺激效果(Yi et al.，1996)。对于具有最小的免疫刺激性基序的CpG PS-寡聚物，在本研究中选用序列PS-d(TCAACGTT)-2066作为具有广泛免疫刺激效果的典型CpG基序，代表CpG DNA的家族。这个序列当具有立体随机骨架的时候称为[Mix-PS]-2066。当此八聚物序列具有完全或部分立体确定的骨架的时候，当所有骨架都是立体确定的时候该PS-寡聚物称为[All-Rp-PS]2066或[All-Sp-PS]-2066，当只有CpG二核苷酸是立体特异的时候称为[CG-Rp-PS]-2066或[CG-Sp-PS]-2066。使用的其它PS-寡聚物包括CpG PS-d(TCAACGTTGA)([Mix-PS]-SEQ ID NO：387)及其All-Rp-和All-Sp-立体确定的对应物，以及对照非CpG PS-d(TCAAGCTTGA)[Mix-PS]-SEQ ID NO∶388。
用已知的oxathiaphospholane方法(Stec et al.，1995)(Stec et al.，1998)制备立体确定的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。人工进行合成。3’端的第一个核苷单位通过DBU-抗性的肌氨酰连接子锚定在固相支持物上(Brown etal.，1989)。合成适当保护的具有3′-O-(2-硫代-“螺旋”-4，4-环戊烷-1，3，2-oxathiaphospholane)部分，用层析将其分离为纯的P-非对映异构体。要合成[CG-Rp-PS]-2066和[CG-Sp-PS]-2066，将P-非对映异构体(Rp：Sp的比率大约为1∶1)(Stec et al.，1998)的未溶解的混合物用于生成P原子随机构型的核苷酸间连接。所有合成的寡聚物都用两个步骤的RP-HPLC：DMT-on(保留时间为23-24分钟)和DMT-off(保留时间为1 4-16分钟)纯化；层析系统：ODS Hypersil柱，5μm，240×4.6mm，0.1M重碳酸三乙铵中CH3CN浓度为0-40％，pH7.5，梯度为1％/分钟。它们的纯度用聚丙酰胺凝胶电泳评价。
要研究PS-寡聚物的吸收，用人工合成的立体确定的PS-寡聚物的固相延长制备结合荧光素的有规立构的PS-寡聚物。在进行了脱三苯甲基步骤之后，按常规加入荧光素亚磷酰胺(ChemGenes Corporation，Ashland，MA；工作浓度为125mg/mL)和1-H-四唑(耦合时间120s)，然后用S-Tetra试剂进行硫化反应(Stec et al.，1993)。用浓缩的氢氧化铵从支持物上的切割和去保护，分别是在室温进行1h和在55℃进行4h。将得到的寡聚物用一步RP-HPLC(见上)纯化。由于荧光素部分具有显著的疏水性，Rp-和Sp-寡聚物分别在保留时间14.5，14.8和14.7，15.0分钟被洗脱，也就是在失败序列的末端。在所有情况下，由于荧光素单聚体延长的亚磷酰胺/硫化作用的非立体特异性，两个P-非对映异构体都被洗脱。
Western Blot分析
收集细胞并重悬于新鲜培养基中，浓度为2×106个细胞/ml。在进行40分钟的刺激之前让细胞休息四个小时。收集细胞，用冷的PBS洗涤三次。用0.05M Tris(pH 7.4)，0.14M NaCl，1％ NP-40，0.001M Na3VO4，0.01MNaF，4.3mg/ml B-磷酸甘油，0.002M DTT，50μg/mlPMSF，12.5μg/ml抗痛素，12.5μg/ml抑肽酶，12.5μg/ml亮肽素，1.25g/ml抑肽素，19μg/ml贝他定，10μg/ml膦酰二肽，12.5μg/ml胰蛋白酶抑制剂溶解细胞，将细胞冻溶然后在冰上培育30分钟。然后将样品于4℃ 10，000xg离心10分钟。收集上清的全细胞溶解物做进一步分析。将等量的全细胞溶解物(20μg)在SDS样品缓冲液中煮沸5分钟，然后在11％变形聚丙酰胺凝胶上进行电泳。电泳后，用半干式转渍器(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)将蛋白转至硝酸纤维素膜上。先用5％脱脂奶进行封闭，然后用磷酸-SAPK/JNK(Cell SignalingTechnology，Beverly，MA)，I B-和JNK 1(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)进行杂交。用增强的化学发光试剂(ECL，Amersham International)即可观察到杂交，根据制造商的操作手册进行。
结果
CpG PS-寡聚物的Sp立体异构体诱导脾细胞的3H胸腺嘧啶核苷标示。为了确定CpG DNA的免疫刺激效果的立体特异性，将BALB/c脾细胞与立体确定的八核苷酸PS-d(TCAACGTT)-2066一起培育，其中所有的核苷酸间连接都是Rp或Sp构型，浓度如表17所示。将细胞培养48小时，使得有足够的时间使CpG基序诱导B细胞增殖(Krieg et al.，1995)。具有CpG基序的立体随机的[Mix-PS]2066强烈诱导依赖于剂量的脾细胞增殖(表17)。Sp异构体也诱导增殖，并且能力略微强于[Mix-PS]-2066。相反，Rp立体异构体没有诱导任何可检测到的增殖，这与Yu et al.(Yu et al.，2000)的研究结果一致。
                表17CpG八聚体诱导脾细胞的增殖
寡聚物无(培养基)2066(立体随机的CpG)““Rp(2066)““Sp(2066)““Rp(2066)+20661““   浓度0.4μM2.4μM4.8μM0.4μM2.4μM4.8μM0.4μM2.4μM4.8μM0.4μM2.4μM4.8μM     cpm2170315416,52530,8111207985640956735,37243,5911,59710,25515,841     SI11.57.614.20.60.50.34.416.320.10.74.77.3
SI＝与培养基对照相比的刺激指数
1在培养开始将两个PS-寡聚物的每一个都加到指定浓度
我们先前的研究证明十聚体CpG PS-寡聚物与第一个实验中使用的八聚物相比具有增强的免疫刺激效果。因此，用构建体PS-SEQ ID NO：387重复这些实验，其中构建体合成为立体随机的[Mix-PS]-SEQ ID NO：387，或All-Rp-或All-Sp-形式。而且，[Mix-PS]-SEQ ID NO：387和[All-Sp-PS]-SEQ ID NO：387都能以剂量依赖的方式强烈诱导3H胸腺嘧啶标示。然而，在这个例子中，[All-Rp-PS]-SEQ ID NO：387在最高浓度也能诱导细胞增殖增加，表面它保留了至少部分刺激活性。
在八聚体PS-寡聚物中CpG二核苷酸优选Rp手性。还不清楚最初实验中对Sp立体特异性的明显偏向是由于CG二核苷酸本身内部的作用导致的，还是CG之外的作用。为了确定这一点，合成了两个八聚体PS-2066，其中骨架是立体随机的，除了中间CG之间的连接是Sp或Rp。令人惊讶的是，这个实验的结果与用PS-寡聚物进行实验的结果相反，PS-寡聚物中全部骨架都是有规立构的，因为[CG-Rp-PS]-2066与对照立体随机的PS-寡聚物同样引起脾细胞中3H胸腺嘧啶核苷标示的强烈增加。相反，PS-寡聚物[CG-Sp-PS]-2066基本失活。
CpG PS-寡聚物的R立体异构体抑制脾细胞的3H胸腺嘧啶核苷标示。用Rp立体异构体处理的孔中3H胸腺嘧啶核苷标示的水平低于对照孔，表明可能存在抑制活性，虽然对细胞进行显微镜检查没有发现细胞毒性。事实上，当细胞与等摩尔的[Mix-PS]-2066和All-Rp立体异构体的混合物一起培养的时候，与仅与[Mix-PS]-2066一起培养的细胞相比，3H胸腺嘧啶核苷标示的水平减少了近50％(表17)。
在早期时间点[Rp-PS]-寡聚物的免疫刺激优先。在前述实验中进行的3H胸腺嘧啶核苷标示检测容易受到PS-寡聚物的影响而得到人工的结果，PS-寡聚物降解释放出冷的胸腺嘧啶核苷与标记物质竞争，人工抑制了其标示(Matson et al.，1992)。先前的研究证明[Rp-PS]-寡聚物比Sp对应物更容易被核酸酶降解。因此，在我们的3H胸腺嘧啶核苷标示检测中明显缺乏[Rp-PS]-寡聚物的刺激效果可能是由于误导的人工结果造成的，没有反应出[Rp-PS]-寡聚物的真实效果。为了检测早期时间点的[Rp-PS]-寡聚物的刺激效果，在PS-寡聚物被降解之前，并且是作为对CpG诱导的刺激的独立的生物检测，我们检测了这些PS-寡聚物诱导调节有丝分裂原活化的蛋白激酶，JNK的快速磷酸化的活性。令人惊讶的是，我们发现用CpG序列PS-SEQ ID NO：386和PS-SEQ ID NO：387进行治疗的时候，在四十分钟内不是由[Sp-PS]-异构体而只是由立体随机的[Mix-PS]-和[Rp-PS]-异构体诱导JNK磷酸化。作为对照的非CpG[Mix-PS]-SEQ ID NO：388并不诱导可检测到的JNK磷酸化。所有的样品都含有可比数量的总JNK蛋白。
虽然在JNK磷酸化检测中没有检测到CpG[Sp-PS]-寡聚物的作用，但是在此实验中所述寡聚物具有生物活性，因为在不考虑立体异构体的情况下，所有的CpG PS-寡聚物都减少了抑制蛋白IκB-α的水平，而作为对照的非CpG PS-SEQ ID NO：388并没有有这种效果。
PS-寡聚物细胞的表面结合和吸收不依赖于立体性。对于观察到的PS-寡聚物立体异构体的生物活性之间的差异，一种可能的解释是PS-寡聚物的细胞结合或吸收可能是依赖于立体性的。为了检测这种可能性，合成具有荧光标记的P-立体确定的PS-寡聚物并与细胞一起培育。与过去研究的结果相反，PS-寡聚物的细胞吸收表现出浓度依赖性和温度依赖性。值得注意的是，在Rp或Sp PS-寡聚物的结合或吸收上没有可检测到的差异。
实施例30：半柔性C类寡核苷酸ODN 316和半柔性B类 寡核苷酸ODN 313在体内减少了抗原诱导的呼吸道炎症
这项研究得到了ODN 316在抗原诱导的呼吸道炎症的鼠模型中的体内效果。这项研究中还包含了B类ODN313作为对比。
方法.在进行研究的第0和第7天用抗原(卵清蛋白，10μg，i.p.)和氢氧化铝佐剂(Pierce Alum)对小鼠(雄性，BALB/c)进行致敏。
小鼠通过暴露于吸入的卵清蛋白喷雾剂中被抗原激发，每周两次，连续两周。第一次激发是在研究的第21天。用卵清蛋白在PBS中的1％溶液通过DeVilbiss Ultraneb雾化器经1小时产生喷雾剂。用单独的小鼠作为未激发的对照。
进行ODN 316或ODN 313(1-100，μg/kg)或载体(盐水，20μl)的鼻内给药，每周一次，在该周第一次抗原激发之前两天给药。
研究在第33天(也就是在最后一次抗原激发的48小时)结束。用肺泡冲洗液收集呼吸道中的细胞。用通过Wright-Giemsa染色的细胞离心器制备物上的可见计数细胞检测的随机样品通过Advia自动细胞计数器制备差异细胞计数。CD4+T细胞(CD3+CD4+细胞)的数目通过流式细胞术计数。每组的结果用平均值±SEM表示。用KruskaH-WaMis多重比较检验检测显著性。
结果。抗原激发引起呼吸道内腔中白细胞总数的增加。这种增加主要是由于嗜伊红细胞的聚集(例如在抗原激发的，载体处理的小鼠中为3×105个嗜伊红细胞/ml，在未激发的小鼠中为＜1×104个嗜伊红细胞/ml)。嗜伊红细胞被ODN 316或ODN 313显著抑制(例如在抗原激发的，用100μg/ml的每种ODN处理的小鼠中为大约5×104嗜伊红细包/ml(P＜0.05))。
抗原激发还可以引起CD4+T细胞的聚集，这显著地被每种ODN抑制(例如在抗原激发的，用100μg/ml的每种ODN处理的小鼠中为大约2×104个CD4+T细胞/ml，在抗原激发的，载体处理的小鼠中为大约1.3×104个CD4+T细胞/ml(P＜0.05))。
结论。半柔性C类ODN 316和半柔性B类寡核苷酸ODN 313均能抑制抗原诱导的呼吸道嗜伊红细胞和体内CD4+T细胞的聚集。
实施例31：半柔性B，C和T类ODN的对比：在体 外诱导鼠脾细胞分泌细胞因子
这项研究研究了半柔性B，C和T类ODN在体外诱导鼠脾细胞分泌细胞因子。
方法.收集BALB/c小鼠的脾细胞并混和。将脾细胞在48孔的培养板中在含有单个ODN(0，0.001，0.01，0.1，1或10μg/ml)的RPMI 1640+10％胎牛血清中培育，浓度为1×107个细胞/1ml。检测ODN包含半柔性B类ODN 20674，半柔性C类ODN 316和ODN 317，和半柔性T类ODN 319和ODN 320。
培育(37℃，5％CO2)48小时以后，除去培养基，用Luminex细胞因子多路系统检测IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，GM-CSF，IFN-γ和TNF-α。用ELISA检测IL-12p40，IFN-α和IP-10。精确检测的下限是3.2-10pg/ml。通过用流式细胞术检测CD40，CD69和CD86在CD3+和B220+细胞上的表达评测细胞的激活状态。
所述ODN诱导IL-6，IL-10，IL-12p40，IFN-α，TNF-α和IP-10的分泌。所测定的其它细胞因子的滴度没有增加。例如，在ODN浓度为1μg/ml时，细胞因子的分泌如下所示(所有的都表达为pg/ml)：
               表18在体外对半柔性B，C和T类ODN发生反应时细
                               胞因子的分泌
  ODN   IL-6   IL-10   IL-12p40     IFN-α   TNF-α     IP-10
  313   4000   410   300     12   150     400
  316   3600   820   820     90   400     780
  317   2200   410   790     140   340     760
  319   1200   200   300     nd   50     30
  320   150   nd   160     nd   15     25
nd--未检出
与半柔性B类ODN 313相比，这两种半柔性C类ODN包括更高滴度的IL-10，IL-12p40，IFN-α，TNF-α和IP-10，但不引起更显著的B细胞激活。这两种半柔性T类ODN作为细胞因子诱导子比半柔性B和C类ODN效果更差。
结论.每种B类和C类ODN都能诱导一组细胞因子，这与TLR9的激活一致，每种都能引起B细胞的激活。T类ODN作为细胞因子诱导子效果较差。
与半柔性B类ODN 313相比，半柔性C类ODN 316和317每种都能诱导更高浓度的免疫修饰的细胞因子，但是不诱导更多的B细胞激活。这些数据表明了C类ODN的治疗效果。
实施例32：在体内对CPG ODN发生反应时诱导细胞 因子，抗体，和CTL
细胞因子的检测：BALB/c小鼠通过SC注射给予400mg ODN(SEQ ID NO：294(柔性)，241(半柔性)，242和286)。注射后3小时抽取动物血，用ELISA检测血浆中的IP-10，IFN-γ和TNF-α水平。结果如图41A和B(IP-10)，C(IFN)，和D和E(TNF)中所述。
抗体反应：BALB/c小鼠用单独的1mg HBsAg或和CpG ODN一起通过IM注射进行免疫。初次免疫后4周对动物进行增强。用终点ELISA测量抗体滴度。在增强后2周用终点ELISA测量IgG同型滴度。结果如图42A和B所示。
细胞毒性T淋巴细胞反应：BALB/c小鼠用单独的1mg HBsAg或和CpG ODN一起通过IM注射进行免疫。初次免疫后4周对动物进行增强。在增强后4周用51Cr释放检测测定CTL活性。结果如图42C所示。
因此，如在体外和体内研究中所看到的那样，柔性和半柔性ODN具有相似的或更强的激活鼠免疫系统的能力，能够增加抗原特异的免疫反应。
实施例33：在体内抗癌治疗中使用CpG ODN
本发明的ODN用三种单方疗法的癌症模型检测其功效。最初将所述ODN给予具有肾细胞癌(renca)的小鼠。方法如下所述：在第0天向小鼠的侧腹中注射2×105个renca细胞SC诱导肿瘤。随后的处理是在肿瘤细胞注射后10天开始每周SC注射PBS，CpG ODN 241或242，共注射5周。结果如图43A和B所示。
第二个检测模型是鼠非小细胞肺癌(Lewis肺癌)。在第0天向小鼠的侧腹中注射2×106个Lewis肺癌细胞SC诱导肿瘤。随后的处理是在第1，3，7天以及每周SC注射PBS，100mg CpG ODN 241或242，注射2个月。结果如图43E和F所示。
第三个检测模型是鼠成神经细胞瘤。在第0天向侧腹中SC注射1×106个成神经细胞瘤细胞。从第10天到第15天每天SC注射PBS，100mg CpG ODN 241或242。结果如图43C和D所示。
因此，半柔性ODN可以控制癌(鼠renca，LLC，成神经细胞瘤)的生长，并增加患这些癌症的小鼠的存活率。
实施例34：在BALB/c小鼠和TLR-9敲除小鼠中柔性， 半柔性和硬性ODN的给药导致的肾周炎症
评价了BALB/c小鼠和TLR-9敲除的小鼠的肾周炎症。结果分别如表19和20所示。半柔性ODN(241)在注射部位诱导较少的炎症，不诱导(100mg剂量)或诱导很少的(250mg剂量)肾周炎症。在进行ODN多次给药后有更好的耐受性。
                       表19
    组 肾软组织炎症 肾小囊肉芽肿炎症 脂肪组织肉芽肿炎症
    PBS     正常5/5     正常5/5     正常5/5
    242100mg     轻度2/5     轻度到中度5/5     轻度到中度4/5
    242250mg     轻度1/4     轻度到中度4/4     显著的4/4
    241100mg     正常5/5     正常5/5     正常5/5
    241250mg     轻度2/5     轻度2/5     轻度到中度3/5
                         表20
组 肾软组织炎症 肾小囊肉芽肿炎症 脂肪组织肉芽肿炎症
PBS 正常5/5 正常5/5 正常5/5
242100mg 正常5/5 正常5/5 正常5/5
242250mg 正常5/5 正常5/5 正常5/5
241100mg 正常5/5 正常5/5 正常5/5
241250mg 正常5/5 正常5/5 正常5/5
上述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明的范围不受实施例的限制，实施例是本发明的一个方面的举例说明，其它功能上等同的实施方案也在本发明的范围之内。根据前述的描述，除了本文中所述的之外，各种对本发明的修改对于本领域技术人员都是显而易见的，也在权利要求的保护范围之内。本发明的优点和目的不是必然包括在本发明的每一个实施方案中。
序列表
<110>科勒制药集团有限公司
     科勒制药股份公司
<120>免疫刺激核酸
<130>C01037.70048.US
<140>US 60/404,820
<141>2003-08-06
<150>US 60/404,479
<151>2002-08-19
<150>US 60/447,377
<151>2003-02-14
<150>US 60/404,820
<151>2002-08-19
<160>388
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>1
acgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>2
gcgtcgacgtcgacgc                                                       16
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>3
gcgtcgtttt cgtcgc                                                      16
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>4
tccatgacgt tcctgatgc                                                   19
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>5
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                     17
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>6
tcgtcgtttt cggcggccgccg                                                  22
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>7
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                       17
<210>8
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>8
tcgtcgtttc gtcgtt                                                        16
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>9
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>10
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>11
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>dezaguanine
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>dezaguanine
<400>12
tcntcntttt gtcgttttgt cgtt                                              24
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>dezaguanine
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>dezaguanine
<400>13
tcntcgtttt gtcgttttgt cntt                                              24
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>14
tcgccgtttt cggcggccgc cg                                                22
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>15
tcgtcgtttt acgacgtcgc g                                                 21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>16
tcgtcgtttt acgacgtcgt g                                                 21
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>17
tcgtcgttttacggcgccgc gccg                                               24
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is a，c，g，or t with a phosphorothioate link，3-10 nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>N is a，c，g，or t，0-20 nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>N is a，c，g，or t，0-20nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>N is a，c，g，or t with a phosphorothioate link，3-10 nucleotides
<400>18
nngtcgttgt cgttnn                                                      16
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is a，c，g，or t，with a phosphorothioate link，3-10
     nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>N is a，c，g，or t，0-20 nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222> (27)..(27)
<223>N is a，c，g，or t，0-20 nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>N is a，c，g，ort，with a phosphorothioate link，3-10
     nucleotides
<400>19
nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttnn                                         28
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is a，c，g，or t，with a phosphorothioate link，3-10
     nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>N is a，c，g，or t，0-20 nucleotides
<220>
<221>misc feature
<222>(33)..(33)
<223>N is a，c，g，or t，0-20 nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>N is a，c，g，ort，with a phosphorothioate link，3-10
     nucleotides
<400>20
nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttgtcg ttnn                                 34
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>21
tcgtcgttttcggcgcgcgc cg                                               22
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>22
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>23
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>24
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>25
tcgtcgtttt gcgacgtcgc g                                               21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>26
tcgtcgtttt tcgacgtcga g                                                 21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>27
tcgtcgtttt tcgacgtcgc g                                                 21
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>dezaguanine
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>dezaguanine
<400>28
tcgtcntttt gtcgttttnt cgtt                                              24
<210>29
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>29
tcgtcgtttc gacgtt                                                       16
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>30
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt                                              24
<210>31
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>31
tcgtcgtttc gtcgacgtcg tttcgtcg                                          28
<210>32
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>32
tcgtcgtttc gtcgat                                                     16
<210>33
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>33
tcgtcgtttc gtcgatt                                                    17
<210>34
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>34
tcgtcgtttc gtcgt                                                      15
<210>35
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>35
tcgtcgtttc gtcgtt                                                     16
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>36
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt                                            24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>37
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>38
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>38
tcgtcgtttg tcgtcggcgg ccgccg                                          26
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>39
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg                                              22
<210>40
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>40
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>41
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>41
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>42
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg                                              22
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>43
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>44
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>44
tcgtcgtttt cgtcgt                                                     16
<210>45
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>45
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>46
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>46
tcgtcgtttt cgttgtt                                                    17
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>47
tcgtcgtttt gtcgtcgttt t                                               21
<210>48
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>48
tcgtcgtttt ttttcgtcgt ttt                                             23
<210>49
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>49
tcgtcgtttt tgtcgtt                                                    17
<210>50
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>50
tcgtcgtttt tgttgtt                                                    17
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>dezaguanine
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>dezaguanine
<400>51
tcgtcgtttt ntcnttttgt cgtt                                            24
<210>52
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>52
tcgtcgtttt gacgtt                                                     16
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>53
tcgtcgtttt gacgtttt                                                   18
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>54
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>55
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>56
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>56
tcgtcgtttt gtcgtt                                                     16
<210>57
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is a，c，g，or t，with a phosphorothioate link，3-10
     nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>N is a，c，g，ort，0-20nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(39)..(39)
<223>N is a，c，g，or t，0-20 nucleotides
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>N is a，c，g，or t，with a phosphorothioate link，3-10
     nucleotides
<400>57
nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttgtcg ttgtcgttnn                           40
<210>58
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>dezaguanine
<220>
<221>misc feature
<222>(22)..(22)
<223>dezaguanine
<400>58
tcgtcgtttt gtcgttttnt cntt                                            24
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>59
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>60
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>2′-deoxyuracil
<400>60
tcgtcgtttn gtcgttt                                                    17
<210>61
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>2′-deoxyuracil
<400>61
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>62
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>62
tcgtcgtttg cgtcgt                                                     16
<210>63
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>63
tcgtcgtttg cgtcgtt                                                    17
<210>64
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>64
tcgtcgtttg tcgt                                                       14
<210>65
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>65
tcgtcgtttg tcgtt                                                      15
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(18)
<223>2′-deoxyuracil
<400>66
tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt                                            24
<210>67
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>67
tcgttttgtc gtttt                                                      15
<210>68
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>68
tcgttttgtc gtttttttt                                                  19
<210>69
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>69
tcgttttttt tcgtttt                                                    17
<210>70
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>70
tcgttgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>71
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>71
tcgttgtttt cgttgtt                                                    17
<210>72
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>72
tcgttgtttt tgtcgtt                                                    17
<210>73
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>73
tcgttgtttt tgttgtt                                                    17
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>2′-deoxyuracil
<400>74
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt                                            24
<210>75
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>75
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                           25
<210>76
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>76
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                           25
<210>77
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>77
tgtcgtttcg tcgtt                                                      15
<210>78
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>78
tgtcgttttg tcgtt                                                      15
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>79
ttagttcgta gttcttcgtt                                                 20
<210>80
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>80
ttcgtcgttt cgtcgtt                                                    17
<210>81
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>81
ttcgtcgttt cgtcgttt                                                   18
<210>82
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>82
ttcgtcgttt tgtcgtt                                                    17
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>83
ttcgttctta gttcgtagtt                                                 20
<210>84
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>84
tttcgacgtc gttt                                                       14
<210>85
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>85
ttttcgtcgt tttgtcgtcg t                                               21
<210>86
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>86
ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt                                            24
<210>87
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>87
ttttcgtcgt tttttttcgt cgt                                             23
<210>88
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>88
ttttcgtcgt tttttttcgt cgtttt                                          26
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>89
ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt                                            24
<210>90
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>90
ttttcgtttt gtcgt                                                      15
<210>91
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>91
ttttcgtttt gtcgtttt                                                   18
<210>92
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>92
ttttcgtttt ttttcgt                                                    17
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>93
ttttcgttttttttcgtttt                                                  20
<210>94
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>94
ttttcgtttt gtcgtttt                                                   18
<210>95
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>95
ttttttttcg ttttgtcgt                                                  19
<210>96
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>96
ttgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>97
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>97
ttgtcgtttt cgttgtt                                                    17
<210>98
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>98
ttgtcgtttt tgtcgtt                                                    17
<210>99
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>99
ttgtcgtttt tgttgtt                                                    17
<210>100
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>100
tcgtcgtttt gtcgtttgtc gtt                                             23
<210>101
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>101
tcgtcgtttt gtcgtt                                                     16
<210>102
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>102
tcgtcgtttc gtcgtt                                                     16
<210>103
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>103
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                           25
<210>104
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>104
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>105
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>105
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>106
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>106
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>107
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>107
tcgtcgtttt gtcgtttt cgtt                                              24
<210>108
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>108
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>109
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>109
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>110
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>110
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>111
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>111
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>112
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>112
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>113
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>113
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>114
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>114
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>115
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>115
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>116
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>116
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>117
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>117
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>118
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>118
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>119
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>119
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>120
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>120
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>121
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>121
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>122
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>122
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>123
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>123
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>124
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>124
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>125
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>125
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>126
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>126
tcgtcgttttgtcgttttgt cgtt                                             24
<210>127
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>127
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>128
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>128
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>129
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>129
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>130
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>130
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>131
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>131
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>132
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>132
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>133
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>133
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>134
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>134
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>135
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>135
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>136
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>137
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>137
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>138
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>138
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>139
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>139
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>140
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>140
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>141
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>141
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>142
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>142
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>143
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>143
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>144
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>144
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>145
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>145
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>146
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>146
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>147
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>147
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>148
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>148
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>149
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>149
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>150
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>150
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>151
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>151
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>152
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>152
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>153
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>153
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>154
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>154
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>155
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>155
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>156
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>156
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>157
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>157
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>158
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>158
tcgtcgtttt gtcgttttgtcgtt                                             24
<210>159
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>159
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>160
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>160
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>161
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>161
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>162
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>162
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>163
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>163
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>164
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>164
tcgtcgttttgtcgttttgt cgtt                                             24
<210>165
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>165
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>166
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>166
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>167
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>167
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>168
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>168
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>169
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>169
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>170
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>170
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>171
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>171
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>172
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>172
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>173
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>173
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>174
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>174
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>175
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>175
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>176
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>176
tcgtcgtttt gtcgttttgtcgtt                                             24
<210>177
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>177
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>178
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>178
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>179
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>179
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>180
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>180
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>181
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>181
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>182
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>182
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>183
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>183
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>184
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>184
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>185
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>185
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>186
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>186
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>187
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>187
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>188
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>188
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>189
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>189
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>190
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>190
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>191
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>191
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>192
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>192
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>193
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>193
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>194
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>194
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>195
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>195
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>196
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>196
tcgtcgtttt gtcgttttgtcgtt                                             24
<210>197
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>197
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>198
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>198
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>199
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>199
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>200
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>200
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>201
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>201
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>202
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>202
tcgtcgtttt gtcgttttgtcgtt                                             24
<210>203
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>203
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>204
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>204
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>205
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>205
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>206
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>206
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>207
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>207
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>208
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>208
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>209
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>209
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>210
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>210
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>211
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>211
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>212
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>212
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>213
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>213
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>214
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>214
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>215
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>215
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>216
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>216
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>217
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>217
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>218
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>218
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>219
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>219
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>220
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>220
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>221
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>221
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>222
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>222
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>223
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>223
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>224
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>224
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>225
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>225
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>226
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>226
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>227
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>227
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>228
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>228
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>229
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>229
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>230
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>230
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>231
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>231
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>232
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>232
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>233
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>233
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>234
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>234
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>235
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>235
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>236
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>236
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>237
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>237
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>238
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>238
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                           24
<210>239
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>239
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>240
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>240
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>241
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>241
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>242
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>242
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt                                            23
<210>243
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>243
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                            25
<210>244
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>244
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                           25
<210>245
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>245
tcgtcgtttc gtcgtt                                                     16
<210>246
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>246
tcgtcgtttt gtcgtt                                                     16
<210>247
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>247
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>248
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>248
tcgccgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>249
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>249
tcgccgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>250
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>250
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>251
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>251
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>252
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>252
tcgccgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>253
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>253
tcgccgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>254
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>254
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>255
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>255
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>256
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>256
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>257
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>257
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>258
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>258
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                           25
<210>259
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>259
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>260
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>260
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>261
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>261
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>262
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>262
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt                                            24
<210>263
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>263
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>264
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>264
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>265
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>265
tcgtcgtttt gacgtttt                                                   18
<210>266
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>266
tcgtcgtttt gacgtt                                                     16
<210>267
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>267
tcgtcgtttc gacgtt                                                     16
<210>268
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>268
gttctcgctg gtgagtttca                                                 20
<210>269
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>269
gttctcgctg gtgagtttca                                                 20
<210>270
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>270
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt                                            24
<210>271
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>271
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt                                            24
<210>272
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>2′-deoxyuracil
<400>272
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>273
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>2′-deoxyuracil
<400>273
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>274
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>2′-deoxyuracil
<400>274
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>275
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>275
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg                                              22
<210>276
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>276
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>277
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>2′-deoxyuracil
<400>277
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt                                            24
<210>278
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>2′-deoxyuracil
<400>278
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt                                            24
<210>279
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(18)
<223>2′-deoxyuracil
<400>279
tcgtcgnnnt gtcgnnnngt cgtt                                            24
<210>280
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(18)
<223>2′-deoxyuracil
<400>280
tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt                                            24
<210>281
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>281
aacgtcgttt tcgtcgtt                                                   18
<210>282
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>282
aacgtcgttt tcgtcgtt                                                   18
<210>283
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>283
tcgtcgtttt cgtcgt                                                     16
<210>284
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>284
tcgtcgtttt cgtcgtt                                                    17
<210>285
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>285
aacgtcgttt tcgtcgtt                                                   18
<210>286
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>286
tgctgctttt gtgcttttgt gctt                                            24
<210>287
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>287
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt                                           25
<210>288
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>288
tcgttttttt cgtttttttc gttt                                            24
<210>289
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>289
tcgtcgtttt tcggtcgttt t                                               21
<210>290
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>290
tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt                                              22
<210>291
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>291
tcgtcgtttt cgtttttttc gttt                                            24
<210>292
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>292
tcgttttgtc gtttttttcg a                                               21
<210>293
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>293
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>294
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>294
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>295
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>295
tcgtcgtttt cggcggccgc cg                                              22
<210>296
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n is a，c，g，or t
<400>296
tcgtcgtttt gancgntt                                                   18
<210>297
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>297
tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt                                            24
<210>298
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>298
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>299
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>299
tcgtcgtttt gacgtttt                                                   18
<210>300
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>300
tcgtcgtttt gacgtt                                                     16
<210>301
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n is a，c，g，or t
<400>301
tcgtatncgt tttncgntt                                                  19
<210>302
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n is a，c，g，or t
<400>302
tcgatncgtt ttncgntt                                                   18
<210>303
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n is a，c，g，or t
<400>303
tcgttncgtt ttncgntt                                                   18
<210>304
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>304
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt                                             23
<210>305
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>305
tcgttttgac gttttgtcgt t                                               21
<210>306
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(17)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n is a，c，g，or t
<400>306
tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt                                            24
<210>307
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(17)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n is a，c，g，or t
<400>307
tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt                                            24
<210>308
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n is a，c，g，or t
<400>308
tcgtcgttac gncgttacgn cgtt                                            24
<210>309
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(9)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(17)
<223>n is a，c，g，or t
<400>309
tcgtcgnnnc gtcgnnncgt cgtt                                            24
<210>310
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>310
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt                                            24
<210>311
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>n is a，c，g，or t
<400>311
tcgncgnncg ntcgtt                                                     16
<210>312
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(12)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>n is a，c，g，or t
<400>312
tcgncgnncg nncgntcgtt                                                 20
<210>313
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>313
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>314
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>314
tcgacgtttt gtcgttttgt cgtt                                            24
<210>315
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n is a，c，g，or t
<400>315
tcgcgncgcg cgn                                                        13
<210>316
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>316
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg                                              22
<210>317
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>317
tcgcgacgtt cgcgcgcgcg                                                 20
<210>318
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(9)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n is a，c，g，or t
<400>318
ttgnntgnnt tttntttttt t                                               21
<210>319
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>319
ttgcgtgcgt tttgacgttt tttt                                            24
<210>320
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>320
ttggctggct tttgacgttt tttt                                            24
<210>321
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>321
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg                                              22
<210>322
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>322
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt                                            24
<210>323
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>323
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt                                             23
<210>324
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>324
tcgtcgtttt gacgtttt                                                   18
<210>325
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>325
tcgtcgtttt gacgtt                                                     16
<210>326
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>326
tcgttttgac gttttgtcgt t                                               21
<210>327
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>327
tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt                                            24
<210>328
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>328
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>329
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>329
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>330
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>330
tccaggactt ctctcaggtt                                                 20
<210>331
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(9)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>n is a，c，g，or t
<400>331
ttgnntgnnt tttntttttt t                                               21
<210>332
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n is a，c，g，or t
<400>332
tcgcgncgcg cgn                                                        13
<210>333
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>333
cgtcgttttg acgttttgtc gtt                                             23
<210>334
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>334
gtcgttttga cgttttgtcg tt                                              22
<210>335
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>335
tcgttttgac gttttgtcgt t                                               21
<210>336
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>336
cgttttgacg ttttgtcgtt                                                 20
<210>337
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>337
gttttgacgt tttgtcgtt                                                  19
<210>338
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>338
ttttgacgtt ttgtcgtt                                                   18
<210>339
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>339
tttgacgttt tgtcgtt                                                    17
<210>340
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>340
ttgacgtttt gtcgtt                                                     16
<210>341
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>341
tgacgttttg tcgtt                                                      15
<210>342
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>342
gacgttttgt cgtt                                                       14
<210>343
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>343
acgttttgtc gtt                                                        13
<210>344
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>344
gttttgtcgt t                                                          11
<210>345
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>345
gttttgtcgt t                                                          11
<210>346
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>346
ttttgtcgtt                                                            10
<210>347
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>347
tcgtcgtttt gacgttttgt cgt                                             23
<210>348
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>348
tcgtcgtttt gacgttttgt cg                                              22
<210>349
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>349
tcgtcgtttt gacgttttgt c                                               21
<210>350
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>350
tcgtcgtttt gacgttttgt                                                 20
<210>351
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>351
tcgtcgtttt gacgttttg                                                  19
<210>352
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>352
tcgtcgtttt gacgtttt                                                   18
<210>353
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>353
tcgtcgtttt gacgttt                                                    17
<210>354
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>354
tcgtcgtttt gacgtt                                                     16
<210>355
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>355
tcgtcgtttt gacgt                                                      15
<210>356
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>356
tcgtcgtttt gacg                                                       14
<210>357
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>357
tcgtcgtttt gac                                                        13
<210>358
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>358
tcgtcgtttt ga                                                         12
<210>359
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>359
tcgtcgtttt g                                                          11
<210>360
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>360
tcgtcgtttt                                                            10
<210>361
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>361
cgtcgttttg acgttttgtc gt                                              22
<210>362
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>362
gtcgttttga cgttttgtcg                                                 20
<210>363
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>363
tcgttttgac gttttgtc                                                   18
<210>364
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>364
cgttttgacg ttttgt                                                     16
<210>365
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>365
gttttgacgt tttg                                                       14
<210>366
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>366
ttttgacgtt tt                                                         12
<210>367
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>367
tttgacgttt                                                            10
<210>368
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>368
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt                                            24
<210>369
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>369
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg                                             23
<210>370
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>370
tcggacgttc ggcgcgcgcc g                                               21
<210>371
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>371
tcggacgttc ggcgcgccg                                                  19
<210>372
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>372
tcgcgtcgtt cggcgcgccg                                                 20
<210>373
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>373
tcgacgttcg gcgcgcgccg                                                 20
<210>374
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>374
tcgacgttcg gcgcgccg                                                   18
<210>375
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>375
tcgcgtcgtt cggcgccg                                                   18
<210>376
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>376
tgtcgttttt tttttttttt                                                 20
<210>377
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>377
tgtcgttttt tttttttttt                                                 20
<210>378
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N＝uracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(20)
<223>N＝uracil
<400>378
ngtcgttnnn nnnnnnnnnn                                                 20
<210>379
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N＝uracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(20)
<223>N＝uracil
<400>379
ngtcgttnnn nnnnnnnnnn                                                 20
<210>380
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is 2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(20)
<223>N is 2′-deoxyuracil
<400>380
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt                                                 20
<210>381
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is 2′-deoxyuracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(19)
<223>N is 2′-deoxyuracil
<400>381
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt                                                 20
<210>382
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is uracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(12)
<223>N is uracil
<400>382
ngtcgttnnn nngggagggg                                                 20
<210>383
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is uracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(12)
<223>N is uracil
<400>383
ngtcgttnnn nngggagggg                                                 20
<210>384
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is uracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(12)
<223>N is uracil
<400>384
ngtcgttccn nngggagggg                                                 20
<210>385
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>N is uracil
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(12)
<223>N is uracil
<400>385
ngtcgttccn nngggagggg                                                 20
<210>386
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>386
tccatgacgt tcctgacgtt                                                 20
<210>387
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>387
tcaacgttga                                                            10
<210>388
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡脱氧核苷酸
<400>388
tcaagcttga                                                            10

Claims (120)

1.一种具有至少一个内部嘧啶-嘌呤(YZ)二核苷酸和嵌合骨架的免疫刺激核酸，其中至少一个内部YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中任选的，每个另外的内部YZ二核苷酸具有磷酸二酯，磷酸二酯样，或稳定的核苷酸间连接，其中所有其它核苷酸间连接都是稳定的。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸包含多个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的内部YG二核苷酸。
3.权利要求2的寡核苷酸，其中每个内部YG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样连接。
4.权利要求1的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子是SEQ ID NO：1-54，SEQ ID NO：55-99和SEQ ID NO：241中的任何一个，其中说明书中的序列中所示的*代表硫代磷酸酯，代表磷酸二酯，U代表2’-脱氧尿嘧啶，7代表7-去氮杂鸟嘌呤。
5.权利要求1的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C_G*T*C_G*T*T*T*～G*T*C_G*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：100)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：101)，T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：102)，T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO：103)，和T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G(SEQ ID NO：104)，其中*代表硫代磷酸酯，_代表磷酸二酯。
6.一种寡核苷酸，包括：含有嵌合骨架和至少一个序列N1YGN2的免疫刺激核酸分子，其中独立地对每一个N1YGN2来说YG都是内部嘧啶-鸟嘌呤核苷(YG)二核苷酸，N1和N2彼此独立地是任何核苷酸，其中对于至少一个序列N1YGN2来说，任选地对于每一个另外的序列N1YGN2来说：
YG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，以及
(a)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，
(b)当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，或者
(c)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，以及当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，其中所有其它核苷酸间连接都是稳定的。
7.权利要求6的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸含有多个序列N1YGN2，其中对于每个序列N1YGN2来说：
YG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，以及
(a)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，
(b)当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，或者
(c)当N1是内部核苷酸的时候，N1和Y通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连，以及当N2是内部核苷酸的时候，G和N2通过磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接相连。
8.权利要求6的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子是SEQ ID NO：105-231中的任一个，其中说明书中的序列中所示的*代表硫代磷酸酯，_代表磷酸二酯。
9.权利要求6的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO：232)，
T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：233)，和
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO：234)，其中*代表硫代磷酸酯，_代表磷酸二酯。
10.权利要求6的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T(SEQ ID NO：235)，
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T(SEQ ID NO：236)，和
T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T(SEQ ID NO：237)，其中*代表硫代磷酸酯，_代表磷酸二酯。
11.权利要求6的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子选自下组：
T*C_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T(SEQ ID NO：238)，
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T(SEQ ID NO：239)，和
T*C_G_T_C_G_T*T*T_T_G_T_C_G_T*T*T_T_G_T_C_G_T*T(SEQ ID NO：240)，其中*代表硫代磷酸酯，_代表磷酸二酯。
12.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的内部YG二核苷酸是CG。
13.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的内部YG二核苷酸是TG。
14.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子是B类免疫刺激核酸分子。
15.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子是C类免疫刺激核酸分子。
16.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子是4-100个核苷酸长。
17.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中所述免疫刺激核酸分子不是反义寡核苷酸，三螺旋形式的寡核苷酸，或核糖酶。
18.一种寡核苷酸，含有
N1-C_G-N2-C_G-N3
其中N1和N3每个独立地是长度为1-20个核苷酸的核酸序列，其中表示内部磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中N2独立地是长度为0-20个核苷酸的核酸序列，其中G-N2-C包括1个或2个稳定连接。
19.一种寡核苷酸，含有
N1-C_G-N2-C_G-N3
其中N1和N3每个独立地是长度为1-20个核苷酸的核酸序列，其中表示内部磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中N2独立地是长度为4-20个核苷酸的核酸序列，其中G-N2-C包括至少5个稳定连接。
20.一种寡核苷酸，含有
N1-C_G-N2-C_G-N3
其中N1，N2和N3每个独立地是长度为0-20个核苷酸的核酸序列，其中表示内部磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸不是反义寡核苷酸，三螺旋形式的寡核苷酸，或核糖酶。
21.一种寡核苷酸，含有
X1-N1-(GTCGTT)n-N2-X2
其中N1和N2每个独立地是长度为0-20个核苷酸的核酸序列，其中n＝2或n＝4-6，其中X1和X2每个独立地是具有3-10个核苷酸的硫代磷酸酯核苷酸间连接的核酸序列，其中N1-(GTCGTT)n-N2包括至少一个磷酸二酯核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸的3’和5’核苷酸不包括poly-G，poly-A，poly-T，或poly-C序列。
22.权利要求1-21任一项的寡核苷酸，其中所述核酸具有含有脱氧核糖或核糖的骨架。
23.权利要求1-21任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸进一步含有佐剂或细胞因子，或抗原。
24.权利要求1-21任一项的寡核苷酸，其中所述磷酸二酯或磷酸二酯样连接是磷酸二酯。
25.权利要求1-21任一项的寡核苷酸，其中所述磷酸二酯样连接是硼烷基磷酸酯或非对映的纯的Rp硫代磷酸酯。
26.权利要求1-21任一项的寡核苷酸，其中所述稳定的核苷酸间连接选自下组：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，硫逐磷酸甲酯，及其任意组合。
27.权利要求1-21任一项的寡核苷酸，其中所述稳定的核苷酸间连接是硫代磷酸酯。
28.一种寡核苷酸，包括
5’T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2*T*T3’(SEQ IDNO：296)，
其中N1是0-6个核苷酸，任选的是0-2个核苷酸，其中N2是0-7个核苷酸其中*表示存在一个稳定的核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸包括至少2个磷酸二酯键核苷酸间连接，任选的所述寡核苷酸是16-24个核苷酸长。
29.权利要求28的寡核苷酸，其中所述稳定的核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接。
30.权利要求28的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*T*C*G*TTTTGAN1C*G*N2*T*T3’(SEQ ID NO：296)，5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GAN1C*G*N2*T*T3’(SEQ ID NO：296)，5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T3’(SEQ ID NO：297)，5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：298)，5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：299)，5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：300)，或5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_N1C*G*N2*T*T3’(SEQ ID NO：296)。
31.权利要求28的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个具有磷酸二酯核苷酸间连接的C_G基序。
32.一种寡核苷酸，包括：
5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4CGN5*T*T3’(SEQ ID NO：301)
其中N3是0-4个核苷酸，其中N4是1-5个核苷酸，任选的是1-2个核苷酸，其中N5是0-7个核苷酸，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸包括至少3个磷酸二酯键核苷酸间连接，任选的所述寡核苷酸是16-24个核苷酸长。
33.权利要求32的寡核苷酸，其中所述稳定的核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接。
34.权利要求32的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4C*GN5*T*T3’(SEQ ID NO：301)，5’T*C*G*A*T*N3C*G*TTTTN4C_G_*N5*T*T3’(SEQ ID NO：302)，5’T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：304)，5’T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：305)，或5’T*C*G*T*T*N3C_G_TTTTN4CGN5*T*T3’(SEQ ID NO：303)。
35.权利要求32的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个具有磷酸二酯核苷酸间连接的C_G基序。
36.一种寡核苷酸，包括：
5’T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：306)
其中N是任意核苷酸，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸包括至少3个磷酸二酯键核苷酸间连接，任选的包括5个磷酸二酯核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸任选的是16-24个核苷酸长。
37.权利要求36的寡核苷酸，其中所述稳定的核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接。
38.权利要求36的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：307)，5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：308)，5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：309)，或5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO：310)。
39.一种寡核苷酸，包括：
5’T*CGCGN8CGCGC*GN93’(SEQ ID NO：315)
其中N8的长度在4到10个核苷酸之间，包括至少1个C_G基序，任选的包括至少2或3个CG基序，其中N9的长度在0到3个核苷酸之间，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中表示存在磷酸二酯核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸为15-40个核苷酸长。
40.权利要求39的寡核苷酸，其中N8是PuCGPyPyCG，PuCGPyPyCGCG，或ACGTTCG。
41.权利要求39的寡核苷酸，其中N9包括至少一个CG基序。
42.权利要求39的寡核苷酸，其中N9是CCG。
43.权利要求39的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有如下结构：5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO：316)或5’T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G3’(SEQ IDNO：317)。
44.一种寡核苷酸，包括：
5’T*C_G(N6C_GN7)2-3T*C_G*T*T*T3’(SEQ IDNO：311-312)
其中N6和N7独立地长度在1到5个核苷酸之间，任选的N6是一个核苷酸，优选是T或A，任选的N7是5个核苷酸，优选5个嘧啶是TTTTG，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中_表示存在磷酸二酯核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸为16-40个核苷酸长。
45.权利要求44的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有下述结构：5’T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3’(SEQ ID NO：313)或5’T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3’(SEQ ID NO：314)。
46.一种寡核苷酸，包括：
5’T*T*GX1X2TGX3X4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：318)
其中N10的长度在4到8个核苷酸之间，包括至少1个C_G基序，任选的包括至少2或3个CG基序，其中X1，X2，X3和X4独立地是C或G，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中_表示存在磷酸二酯核苷酸间连接，其中所述寡核苷酸长度为24-40个核苷酸。
47.权利要求46的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有如下结构：5’T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：319)或5’T*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：320)。
48.一种寡核苷酸，包括：
5’T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’(SEQ ID NO：321)
其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中_表示存在磷酸二酯核苷酸间连接，任选的其中所述寡核苷酸长度为21-40个核苷酸。
49.一种寡核苷酸，包括：
含有至少一个具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接的YZ二核苷酸的八聚体序列，至少具有4个T核苷酸，其中Y是嘧啶或修饰的嘧啶，其中Z是鸟嘌呤核苷或修饰的鸟嘌呤核苷，其中所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接。
50.权利要求49的寡核苷酸，其中所述八聚体序列包括TTTT基序。
51.权利要求49的寡核苷酸，其中所述八聚体序列包括两个YZ二核苷酸。
52.权利要求52的寡核苷酸，其中两个YZ二核苷酸均具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接。
53.权利要求49的寡核苷酸，其中所述Y是未甲基化的C。
54.权利要求49的寡核苷酸，其中Z是鸟嘌呤核苷。
55.权利要求49的寡核苷酸，其中所述八聚体序列选自下组：T*C-G*T*C-G*T*T，C-G*T*C-G*T*T*T，G*T*C-G*T*T*T*T，T*C-G*T*T*T*T*G，C-G*T*T*T*T*G*A，T*T*T*T*G*A*C-G，T*T*T*G*A*C-G*T，T*T*G*A*C-G*T*T，T*G*A*C-G*T*T*T，G*A*C-G*T*T*T*T，A*C-G*T*T*T*T*G，C-G*T*T*T*T*G*T，T*T*T*T*G*T*C-G，T*T*T*G*T*C-G*T，G*T*T*T*T*G*T*C，和T*T*G*T*C-G*T*T，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接，其中_表示存在磷酸二酯核苷酸间连接。
56.权利要求49的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为8-40个核苷酸。
57.权利要求49的寡核苷酸，其中所述磷酸二酯样连接是硼烷基磷酸酯或非对映的纯的Rp硫代磷酸酯。
58.权利要求49的寡核苷酸，其中所述稳定的核苷酸间连接选自下组：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，甲基硫代磷酸酯，或其任意组合。
59.权利要求49的寡核苷酸，其中所述Y是胞嘧啶或选自下组的修饰的胞嘧啶碱基：5-甲基胞嘧啶，5-甲基-异胞嘧啶，5-羟基-胞嘧啶，5-卤代胞嘧啶，鸟嘧啶，N4-乙基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，和氢。
60.权利要求49的寡核苷酸，其中所述Z是鸟嘌呤或选自下组的修饰的鸟嘌呤碱基：7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂-7-取代的鸟嘌呤(例如7-去氮杂-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)，7-去氮杂-8-取代的鸟嘌呤，次黄嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，8-取代的鸟嘌呤例如8-羟基鸟嘌呤，和6-硫鸟嘌呤，2-氨基嘌呤和氢。
61.权利要求49的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有3’-3’连接，并且具有一个或两个可及的5’端。
62.权利要求49的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有两个可及5’端，每个都是5’TCG。
63.权利要求49的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列选自下组：CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：333)，GTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ IDNO：334)，TCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ IDNO：335)，CGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ IDNO：336)，GTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：337)，TTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：338)，TTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：339)，TTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：340)，TGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：341)，GACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：342)，ACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：343)，GTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：344)，GTTTTGTCGTT(SEQ ID NO：345)，TTTTGTCGTT(SEQ ID NO：346)，TTTGTCGTT，和TTGTCGTT。
64.权利要求49的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列选自下组：TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT(SEQ ID NO：347)，TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCG(SEQ IDNO：348)，TCGTCGTTTTGACGTTTTGTC(SEQ IDNO：349)，TCGTCGTTTTGACGTTTTGT(SEQ IDNO：350)，TCGTCGTTTTGACGTTTTG(SEQ ID NO：351)，TCGTCGTTTTGACGTTTT(SEQ ID NO：352)，TCGTCGTTTTGACGTTT(SEQ ID NO：353)，TCGTCGTTTTGACGTT(SEQ ID NO：354)，TCGTCGTTTTGACGT(SEQ ID NO：355)，TCGTCGTTTTGACG(SEQ ID NO：356)，TCGTCGTTTTGAC(SEQ ID NO：357)，TCGTCGTTTTGA(SEQ ID NO：358)，TCGTCGTTTTG(SEQ ID NO：359)，TCGTCGTTTT(SEQ ID NO：360)，TCGTCGTTT，和TCGTCGTT。
65.权利要求49的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列选自下组：CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT(SEQ ID NO：361)，GTCGTTTTGACGTTTTGTCG(SEQ ID NO：362)，TCGTTTTGACGTTTTGTC(SEQ ID NO：363)，CGTTTTGACGTTTTGT(SEQ ID NO：364)，GTTTTGACGTTTTG(SEQ ID NO：365)，TTTTGACGTTTT(SEQ ID NO：366)，TTTGACGTTT(SEQID NO：367)，和TTGACGTT。
66.一种寡核苷酸，包括：
5’TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3’(SEQ IDNO：368)
其中至少一个CG二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯样核苷酸间连接，所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接。
67.一种寡核苷酸，包括：
5’GNC3’，其中N是4-10个核苷酸长的核酸序列，至少有50％的T，不包括CG二核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一个稳定的核苷酸间连接。
68.权利要求67的寡核苷酸，其中N包括一个TTTT基序。
69.权利要求68的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自下组：G*T*T*T*T*G*T*C和G*T*T*T*T*G*A*C，其中*表示存在稳定的核苷酸间连接。
70.一种调节免疫反应的方法，包括给患者施用有效量的能调节免疫反应的权利要求1-69任一项的寡核苷酸。
71.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸给予患者以治疗患者的哮喘。
72.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸给予患者以治疗患者的变态反应。
73.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸给予患者以治疗患者的癌症。
74.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸给予患者以治疗患者的感染性疾病。
75.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸给予患者以治疗患者的自体免疫性疾病。
76.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸给予患者以治疗患者的呼吸道重塑。
77.权利要求70的方法，进一步包括与抗原一起或者不与抗原一起给予患者。
78.权利要求70的方法，进一步包括给患者施用治疗方案。
79.权利要求78的方法，其中所述治疗方案是外科手术。
80.权利要求78的方法，其中所述治疗方案是放射疗法。
81.权利要求78的方法，其中所述治疗方案是药物。
82.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸按配方制造。
83.权利要求82的方法，其中所述寡核苷酸与靶分子相关。
84.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸用选自下组的方式给药：口腔，鼻，舌下，静脉内，皮下，粘膜，呼吸，直接注射，和真皮。
85.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸以有效量给予患者以诱导细胞因子的表达。
86.权利要求85的方法，其中所述细胞因子选自IL-6，TNFα，IFNα，IFNγ和IP-10。
87.权利要求70的方法，其中所述寡核苷酸以有效量给予患者以使免疫反应从偏向Th2的反应转变为偏向Th1的反应。
88.一种治疗呼吸道重塑的方法，包括：
给患者施用有效量的能治疗患者的呼吸道重塑的含有CG二核苷酸的寡核苷酸。
89.权利要求88的方法，其中所述患者患有哮喘。
90.权利要求88的方法，其中所述患者患有慢性阻塞性肺病。
91.权利要求88的方法，其中所述患者是吸烟者。
92.权利要求88的方法，其中所述患者没有哮喘的症状。
93.权利要求88的方法，其中所述寡核苷酸是权利要求1-66任一项的寡核苷酸。
94.权利要求1-69任一项的寡核苷酸在刺激免疫反应中的应用。
95.一种制备用于刺激免疫反应的权利要求1-69任一项的寡核苷酸的药物的方法。
96.权利要求1-69任一项的寡核苷酸在制备用于调节患者的免疫反应的药物中的用途。
97.权利要求96的用途，其中所述患者患有哮喘。
98.权利要求96的用途，其中所述患者患有变态反应。
99.权利要求96的用途，其中所述患者患有癌症。
100.权利要求96的用途，其中所述患者患有感染性疾病。
101.权利要求96的用途，其中所述患者患有自体免疫性疾病。
102.权利要求96的用途，其中所述患者患有呼吸道重塑。
103.权利要求96的用途，其中所述药物包括或不包括抗原。
104.权利要求96的用途，其中所述药物按治疗方案施用。
105.权利要求104的用途，其中所述治疗方案是外科手术。
106.权利要求104的用途，其中所述治疗方案是放射疗法。
107.权利要求104的用途，其中所述治疗方案是药物。
108.权利要求96的用途，其中所述寡核苷酸按配方制造。
109.权利要求108的用途，其中所述寡核苷酸与靶分子相关。
110.权利要求96的用途，其中所述药物的给药方式选自下组：口腔，鼻，舌下，静脉内，皮下，粘膜，呼吸，直接注射，和真皮。
111.权利要求96的用途，其中所述药物诱导细胞因子的表达。
112.权利要求111的用途，其中所述细胞因子选自IL-6，TNFα，IFNα，IFNγ和IP-10。
113.权利要求96的用途，其中所述药物使免疫反应从偏向Th2的反应转变为偏向Th1的反应。
114.含有CG二核苷酸的寡核苷酸在制备用于治疗患者的呼吸道重塑的药物中的用途。
115.权利要求114的用途，其中所述患者患有哮喘。
116.权利要求114的用途，其中所述患者患有慢性阻塞性肺病。
117.权利要求114的用途，其中所述患者是吸烟者。
118.权利要求114的用途，其中所述患者没有哮喘的症状。
119.权利要求114的用途，其中所述寡核苷酸是权利要求1-66任一项的寡核苷酸。
120.一种刺激免疫反应的方法，包括：
给患者施用有效量的能刺激免疫反应的长度为至少5个核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个免疫刺激二核苷酸基序，其中所述二核苷酸的核苷酸之间的核苷酸间连接具有R手性，其中所述寡核苷酸中至少70％的其它核苷酸间连接具有S手性。
CN03824039.4A 2002-08-19 2003-08-19 免疫刺激核酸 Expired - Fee Related CN1688192B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40482002P 2002-08-19 2002-08-19
US40447902P 2002-08-19 2002-08-19
US60/404,479 2002-08-19
US60/404,820 2002-08-19
US42970102P 2002-11-27 2002-11-27
US60/429,701 2002-11-27
US44737703P 2003-02-14 2003-02-14
US60/447,377 2003-02-14
PCT/US2003/025935 WO2004016805A2 (en) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostimulatory nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1688192A true CN1688192A (zh) 2005-10-26
CN1688192B CN1688192B (zh) 2012-07-18

Family

ID=35306229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN03824039.4A Expired - Fee Related CN1688192B (zh) 2002-08-19 2003-08-19 免疫刺激核酸

Country Status (5)

Country Link
CN (1) CN1688192B (zh)
GT (1) GT200300176A (zh)
TN (1) TNSN05052A1 (zh)
UA (1) UA88255C2 (zh)
ZA (1) ZA200500963B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101517082B (zh) * 2006-09-27 2014-01-22 科勒制药有限责任公司 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
CN104684923A (zh) * 2012-07-13 2015-06-03 株式会社新日本科学 手性核酸佐剂
CN102864152B (zh) * 2005-11-07 2015-11-18 艾德拉药物股份有限公司 包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性
CN105228450A (zh) * 2013-05-18 2016-01-06 艾杜罗生物科技公司 用于活化“干扰素基因刺激因子”-依赖性信号传导的组合物和方法
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1271733A (zh) * 2000-04-04 2000-11-01 中国预防医学科学院病毒学研究所 对人免疫细胞有特异免疫刺激活性的CpG寡核酸

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864152B (zh) * 2005-11-07 2015-11-18 艾德拉药物股份有限公司 包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性
CN101517082B (zh) * 2006-09-27 2014-01-22 科勒制药有限责任公司 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
CN104684923A (zh) * 2012-07-13 2015-06-03 株式会社新日本科学 手性核酸佐剂
CN105228450A (zh) * 2013-05-18 2016-01-06 艾杜罗生物科技公司 用于活化“干扰素基因刺激因子”-依赖性信号传导的组合物和方法
CN105228450B (zh) * 2013-05-18 2019-01-18 艾杜罗生物科技公司 用于活化“干扰素基因刺激因子”-依赖性信号传导的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
TNSN05052A1 (en) 2007-05-14
CN1688192B (zh) 2012-07-18
ZA200500963B (en) 2006-10-25
UA88255C2 (en) 2009-10-12
GT200300176A (es) 2004-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100969727B1 (ko) 면역자극 핵산
CN101517082B (zh) 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
CN1939541A (zh) 免疫刺激性核酸
US20090306177A1 (en) Modulation of Immunostimulatory Properties of Short Interfering Ribonucleic Acid (Sirna) by Nucleotide Modification
US20090214578A1 (en) Immunostimulatory Single-Stranded Ribonucleic Acid with Phosphodiester Backbone
CN1753687A (zh) Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
CN101160401A (zh) 免疫刺激寡核苷酸
US20110098456A1 (en) Immune stimulatory oligonucleotide analogs containing modified sugar moieties
JP2009517048A (ja) 免疫刺激性オリゴリボヌクレオチド
TWI468166B (zh) 具有增強之免疫刺激活性之經磷酸鹽修飾之寡核苷酸類似物
CN1688192A (zh) 免疫刺激核酸
RU2338750C2 (ru) ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ФОСФОРТИОАТНЫЕ CpG-ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ФОСФОДИЭФИРНЫЕ СВЯЗИ, СПОСОБ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ, СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА
CN1852917A (zh) 使用免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子化合物结合细胞因子和/或化疗剂或放射治疗对免疫系统的协同刺激作用
MX2008003835A (en) Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120718

Termination date: 20210819

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee