CN1681927A

CN1681927A - 改进的转运蛋白及其用途

Info

Publication number: CN1681927A
Application number: CNA038216078A
Authority: CN
Inventors: H·史; E·布鲁沃尔德
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2005-10-12
Also published as: CA2492099A1; WO2004007668A2; ES2400807T3; AU2003248923A1; US7595190B2; WO2004007668A3; EP1539961A2; US20060168697A1; CA2492099C; EP1539961B1; EP1539961A4; AU2003248923B2

Abstract

本发明一般涉及植物遗传工程。更具体的，本发明涉及赋予植物或其它生物耐盐性的核酸和方法。

Description

改进的转运蛋白及其用途

相关申请的相互参照

无

有关在联邦资助研究或开发下作出的本发明的权利声明

本发明是在政府支持下做出的，其资助号为No.IBN 0110622，由国家科学基金会(National Science Foundation)授予。政府对本发明享有一定权利。

发明领域

本发明一般涉及植物遗传工程。更具体的，本发明涉及使植物或其它生物具有耐盐性的核酸和方法。

发明背景

由于盐浓度造成的环境应力是限制对土壤中高盐浓度特别敏感的农作物产量的最重要因素之一。世界上大量陆地面积都受到对植物生长有害的盐水平的影响。估计27900万平方公顷的灌溉土地中有35-45％目前受到盐浓度的影响。这已将划分为旱地和沙漠地的区域排除在外(这些土地占地球总陆地面积的25％)。盐浓度曾经是人类历史和农业系统寿命中的重要因素。进入耕种土壤中的盐具有不稳定性且经常破坏远古和近代耕种社会。远古世界中作为权利的苏美尔文明的消逝是由于盐聚集在幼发拉底河和底格里斯河流域。由于盐的聚集和落后的灌溉方式，大面积的印度次大陆已经变成了不毛之地。本世纪中，包括澳洲、欧洲、美国西南部、加拿大草原的广阔区域和其它区域的农作物产量也有相当大的降低。

尽管可采用工业技术来抵御这一问题，如通过排水和供应高品质的水，但这些措施都非常昂贵。在大多数情况下，由于对大规模农业的需求增加，提高灌溉效率或安装排水系统都不可行。此外，在世界上的干燥和半干燥地区，水蒸发超过了降水。这些土壤固有的盐分高，因此需要大量灌溉才能用于生产。由于灌溉水含有溶解的盐分和矿物质，用水的同时也用盐，这也构成了盐浓度的问题。

越来越强调的是对植物进行修饰以适应盐浓度造成的限制生长的条件。如果可对重要的经济作物进行操作赋予耐盐性，则这种土地又可以耕种，从而增加种子的销售并提高有用农作物的产量。长期以来人们已尝试耐盐性作物的常规培育。这些培育方法主要基于以下策略：a)在作物和它们更耐盐的野生亲属之间进行广泛的杂交(Rush和Epstein，J.Amer.Hort.Sci.，106：699-704(1981))，b)筛选并选择特定表型的变体(Norlyn，见Genetic Engineering of Osmoregulation第293-309页(1980))，c)通过轮回选择设计新的表型(Tal，Plant & Soil，89：199-226(1985))。未能成功地产生耐受变体(得到很少变体且其耐盐性有限)(Flowers和Yeo，Aust.J，Plant.Physiol.，22：875-884(1995))说明常规的培育方法是不够的，为了培育种方法获得成功应该包括设计转基因作物(Bonhert和Jensen，Aust.J，Plant.Physiol.，23：661-667(1996))。

已在不同植物中表征了一些与应力耐受性有关的生化途径，一些参与这些过程的基因已被鉴定，且在有些情况下，在转基因/过表达试验中已经研究了蛋白质可能的作用。曾经提到一些相容的溶质在应力下的渗透调节中发挥作用。这些相容的溶质，包括碳水化合物(Tarcynshi等，Science，259：508-510(1995))，氨基酸(Kishor等，Plant Physiol.，108：1387-1394(1995))和季氮化合物(Ishtani等，Plant Mol.Biol.，27：307-317(1995))已显示可增加应力下的渗透调节。同时，通常在种子成熟阶段表达的蛋白质(LEA，胚胎起源晚期高丰度蛋白(Late Embriogenesis Abundantproteins))已显示在水分滞留和在应力过程中保护其它蛋白质中发挥作用。LEA在稻米中过表达在水应力器件对植物提供缓和的益处(Xu等，Plant Physiol，110：249-257(1996)，以及Wu和Ho，WO 97/13843)。

已知编码Na⁺/H⁺反向转运的一个基因(sod2)可使裂殖酵母具有钠耐受性(Jia等，EMBO J.，11：1631-1640(1992)以及Young和Zheng，WO 91/06651)，尽管这种质膜结合蛋白的作用似乎仅限于酵母。使用这种基因来转化植物的一个主要缺点与异源基因表达中碰到的典型问题有关，即基因产物错误折叠，使蛋白质靶向靶膜以及蛋白质功能的调节。

具有液泡反向转运活性的Na⁺/H⁺反向转运蛋白已在红甜菜的贮藏组织和多种盐生植物和耐盐的产糖(glycophtic)植物种类中被鉴定(Barkla和Pantoja，Ann.Rev.Plant.Physiol.47：159(1996)，以及Blumwald和Gelli，Adv.Bot.Res.25：401(1997))。近来，称为AtNHX1的来自拟南芥(Arabadopsis thaliana)的编码液泡Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因已被分离(Blumwald等，WO 99/47679)。该基因在拟南芥、番茄和芸苔中的过表达可增强转基因植物的耐盐性(Apse等，Science，285：1256-1258(1999)，Zhang和Blumwald，Nat.Biotechnol.，19：765-768(2001)，和Zhang等，PNAS USA，98：12832-12836(2001))。

发明简述

本发明提供了通过引入编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸来增强植物耐盐性的方法，该多核苷酸的表达可增强植物的耐盐性。这些多核苷酸中的每一个都具有与SEQ ID NO：有至少80％同一性的氨基酸序列，且少于530个氨基酸。

在本发明的一些方面，所述方法包括引入具有由SEQ ID NO：5、7、9、11、13或15构成的序列的多核苷酸以使植物具有耐盐性。

在本发明的一些方面，所述方法包括引入编码多肽的多核苷酸以使植物具有耐盐性，所述多肽具有由SEQ ID NO：6、8、10、12或14构成的序列。

在本发明的一些方面，所述方法包括引入长度小于500、或小于475个氨基酸的多肽的编码多核苷酸以使植物具有耐盐性。

在另一个实施方案中，所述增强植物耐盐性的方法包括在植物中引入编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸，它具有与SEQ ID NO：有至少80％同一性的氨基酸序列，其中，与SEQ ID NO：2中第508位的丝氨酸相对应的残基被Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的赋予增强的耐盐性的氨基酸替代。

在一些实施方案中，一个中性或极性氨基酸替代了SEQ ID NO：2中第508位的丝氨酸。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2中第508位的丝氨酸相对应的中性或极性氨基酸是苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。

在一些实施方案中，赋予耐盐性的编码Na⁺/H⁺转运蛋白的纯化的多核苷酸序列是SEQ ID NOS：3。

在一些实施方案中，所述由纯化的多核苷酸编码的Na⁺/H⁺转运蛋白多肽序列是SEQID NO：4。

本发明还提供了包含编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸的转基因植物，当其表达时可赋予植物增强的耐盐性；且其中所述转运蛋白多肽包含与SEQ ID NO：有至少80％同一性的氨基酸序列且小于530个氨基酸。

在本发明的一些实施方案中，所述转基因植物包括使植物具有增强的耐盐性的Na⁺/H⁺转运蛋白多肽，它具有与SEQ ID NO：有至少80％同一性的氨基酸序列，且与SEQID NO：2中的第508位的丝氨酸相对应的残基被赋予增强的耐盐性的氨基酸所替代。在本发明的一些方面，所述替换氨基酸是极性或中性氨基酸，如半胱氨酸。

定义

术语″植物″包括整个植株、芽营养器官和/或结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花的器官(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵细胞和中央细胞)、种子(包括合子、胚、胚乳和种皮)、果实(例如成熟的子房)、幼苗、植物组织(例如维管组织、基本组织等)、细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)，以及它们的后代。可用于本发明方法的植物的种类通常包括可以进行转化技术的高等和低等植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。它包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。

术语″核酸序列″是指从5’到3’末端阅读的脱氧核糖核酸和核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA、自复制质粒、DNA或RNA的传染性聚合物以及起主要结构作用的DNA或RNA。

术语″异源序列″是指来自外源物种的序列，或者，如果来自相同物种则是来自其原始形式的修饰。例如，操作性连接于异源编码序列的启动子是指来自与该启动子不同来源的种类的编码序列，或如果来自相同种类，则是与该启动子非天然相关的编码序列(例如，遗传工程构建的编码序列或来自不同生态型或变体的等位基因)。

个体植物的“外源”多核苷酸是指通过有性杂交以外的任何方法被引入植物的多核苷酸。可实现此目的的方法的例子如下所述，且包括农杆菌介导的转化、生物射弹法、电穿孔等。含有外源核酸的植物在这里被称为T1(例如，在拟南芥植物(Arabidopsis)中通过真空渗入)或RO(指由体外转化细胞产生的植物)代转基因植物。有性杂交或自交所得的转基因植物是这种植物的后代。

本发明所述的″NHX1核酸″或″NHX1多核苷酸序列″是亚序列或全长的多核苷酸，它编码NHX1多肽及其补体，例如SEQ ID NOS：1，3，5、7、9、11、13或15。来自拟南芥(Arabadopsis)的NH1基因的一个例子是AtNHX1。本发明的NHX1基因产物(例如mRNA或多肽)的特征在于能够提供增强的耐盐性。本发明的NHX1多核苷酸通常包括至少约250个核苷酸的编码序列，其长度约为2000个核苷酸。通常，本发明的NHX1核酸含有约400-1600个核苷酸。

当提到转基因时，精通此领域的技术人员应该知道，插入的多核苷酸序列不需要与得到其的基因序列相同或“基本相同”。如下面的实施例所述，该术语还特别地包括这些变体。

当插入的多核苷酸序列被转录和翻译以产生功能性NHX1多肽时，精通此领域的技术人员认识到，由于密码子简并性，许多多核苷酸序列将编码相同的多肽。这些变体特别地包括在术语″NHX1多核苷酸序列″或″NHX1多核苷酸序列″之内。此外，这些术语还特别地包括那些与NHX1基因序列和保留被编码的蛋白质的功能的编码蛋白基本相同(用以下方法鉴定)的全长序列。因此，当提到拟南芥(Arabadopsis)AtNHX1基因时，上述术语包括与这里所述序列基本相同的变体多核苷酸序列以及能够赋予包含该序列的转基因植物耐盐性的编码蛋白。

当如下所述对最大一致性(maximum correspondence)进行比对时，如果两个序列中的核苷酸序列或氨基酸残基分别相同，则两个多核苷酸或多肽被称为“相同”。术语“与……互补”在这里是指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分相同。

两个(或多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过比较两个序列在一个区段上的序列来进行，或通过“比较窗口”来识别并比较序列相似性的局部区域。用区段是为了比较至少约20个，通常约50-200个，更通常是约100-150个毗邻位置，其中，可在两个序列最佳比对后将一个序列与相同数量的毗邻位置的参考序列进行比较。

序列的最佳比对可通过以下方法进行：Smith和Waterman的局部同源算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman和Wunsch的同源比对算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)；Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)；这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wis.)；或检查。″序列同一性百分比″是通过在一个比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定的，其中，比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(不包括添加或缺失)相比可包括添加或缺失(即缺口)用于两个序列的最佳比对。为计算这一比例需要确定在两个序列中都出现的相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置的数目，将此匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。

术语多核苷酸序列″基本相同″是指，采用上述程序(优选BESTFIT)，采用标准常数，一个多核苷酸包含与参考序列有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性的序列。精通此领域的技术人员将知道，可对这些数值进行适当调整以确定由这两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性，这需要考虑密码子简并性、氨基酸类似性、阅读框定位等。出于这些目的，氨基酸序列基本类似通常是指序列同一性至少为40％，优选至少60％，更优选至少90％，最优选至少95％。“基本类似”的多肽共有上述序列，但不相同的残基位置可通过保守性氨基酸变化而不同。保守性氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的互换。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含有酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

另一种迹象表面核苷酸序列基本相同，如果两个分子在严格条件下相互杂交。严格条件是序列依赖的，且将在不同环境中不同。通常，严格条件是在确定的离子强度和pH下比特定序列热解链温度(Tm)低约5℃-约20℃。Tm是(在确定的离子强度和pH下)有50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。通常，严格条件是：盐浓度约为0.02摩尔，pH为7，温度至少约60℃。然而，如果它们编码的多肽基本相同，则核酸在严格条件下不相互杂交仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并产生核酸的拷贝时便会发生这种情况。

特定NHX1基因(例如这里所述的拟南芥(Arabadopsis)AtNHX1基因)的同系物是第二基因(在相同种类或不同种类中)，它具有至少50个毗邻核苷酸的多核苷酸序列，它与第一基因的序列基本相同(用上述方法确定)。通常认为同系物具有相同的进化途径。

附图简述

图1显示，酵母转化测定结果证实，修饰的AtNHX1增强了耐盐性。

图2显示，酵母转化测定结果显示，AtNHX1 C-末端缺失控制转运蛋白的Na⁺/K⁺选择性。

图3显示，酵母转化测定结果证实，修饰的AtNHX1增加Li⁺耐性。

图4显示，酵母转化测定结果证实，修饰的AtNHX1增加对渗透应力的耐性。

图5显示了用来表征AtNHX1 N-末端和跨膜结构域活性的酵母转化测定的结果。

图6显示了赋予耐盐性的AtNHX1的定点诱变和截短的位置。

发明详述

本发明提供了新的经过修饰的分离的核酸分子，它编码转运钠离子通过细胞膜的蛋白质，例如从细胞胞质溶胶到液泡，以提供具有耐盐性的细胞。

NHX1基因编码膜结合Na⁺/H⁺反向转运转运蛋白，该蛋白利用质子电化学梯度引导Na⁺通过膜，所述梯度是由例如液泡H⁺-腺苷三磷酸酶(ATP酶)和H⁺-无机焦磷酸酶(PPi酶)产生的。在本发明中创建了具有增加的转运活性的突变和截短形式的NHX1。与完整的蛋白质相比，这种修饰的基因产物(蛋白质)能使钠离子从胞质溶胶更聚集到胞外区室，例如液泡。通过转化过表达这种基因的盐敏感型作物，这些基因可用于耐盐植物的工程。

本发明还包括经过修饰的Na⁺/H⁺反向转运蛋白，它具有改变的离子选择性或离子渗透性，这可增加对盐或干旱或渗透的耐性。

本发明还涉及对NHX1基因的修饰，它通过使用基于PCR扩增的定点诱变和缺失以筛选具有增强的转运活性或改变的离子选择性的经过修饰的蛋白质形式。

本发明核酸的分离

通常，下面描述的重组DNA技术中的术语和试验方法都是在此领域被熟知且通常使用的方法。标准技术被用于克隆、DNA和RNA的分离、扩增和纯化。通常，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应是按照制造商的说明书进行的。这些技术和各种其它技术通常是按照Sambrook等， Molecular Cloning-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)或 Current Protocols in Molecular Biology.1-3卷，John Wiley & Sons，Inc.(1994-1998)的描述进行的。

用这里提供的序列可用多种技术来实现NHX1核酸的分离。例如，可用基于这里所述序列的寡核苷酸探针来鉴定cDNA或基因组DNA文库中所需的基因。为构建基因组文库，通过随机断裂(例如用限制性内切酶)产生了基因组DMA的大区段，并将区段与载体DNA连接以形成可被包装入适当载体的多联体。为制备cDNA文库，从所需器官如花分离mRNA，并从mRNA制备含有NHX1基因转录物的cDNA文库。或者，可从提取自其它表达AtNHX1基因或同系物的组织的mRNA制备cDNA。

然后可用基于这里所述的克隆的NHX1基因或其片段的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可用来与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物种类中的同源基因。或者，可用抗NHX1多肽或其片段的抗体来筛选mRNA表达文库。

或者，可用扩增技术从核酸样品扩增感兴趣的核酸。例如，可用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库直接扩增NHX1基因的序列。PCR和其它体外扩增方法也可用于，例如，克隆对被表达的蛋白质进行编码的核酸序列，使核酸被用作探针以检测样品中所需mRNA的存在情况，用于核酸测序，或用于其它目的。为对PCR有大概了解可参见PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications.(Innis，M，Gleaned，D.，Sninsky，J.和White，T.编)，Academic Press，San Diego(1990)。

也可用技术文献中描述的已知技术来合成多核苷酸。参见例如，Carruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，47：411-418(1982)和ADAMS等，J.Am.Chem.Soc.，105：661(1983)。然后可通过合成互补链并在合适的条件下将链一起退火，或使用DNA聚合物与合适的引物序列加入互补链来获得双链DNA片段。

感兴趣的NHX1核酸也可通过检索核酸数据库如EST数据库并识别与已知NHX1核酸序列有高类似性的序列来鉴定。一旦本发明的候选NHX1核酸或多核苷酸序列被鉴定，就可用标准方法来确定推定的核酸是否是本发明的NHX1核酸。测定NHX1活性的方法是此领域已知的，例如可参见实施例1和Apse等，Science.285，1256-1258。

重组载体的制备

为将分离的序列用于转化和其它分子生物学技术，制备了适合转化植物细胞的重组DNA载体。转化多种高等植物品种的技术是熟知的，并描述在技术和科学文献中。参见，例如。Weising等，Ann.Rev.Genet.，22：421-477(1988)。编码所需多肽的DNA序列，例如编码全长蛋白质的cDNA序列，优选与转录和翻译起始调节序列结合，这将引导序列从转化植物的预定组织的基因中转录。

例如，为了过表达，可采用植物启动子片段，它将引导基因在再生植物的所有组织中表达。这种启动子在这里被称为“组成型”启动子，它在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumafaciens)T-DNA的1’-或2’-启动子，以及来自此领域的熟练技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。例如，这种基因包括拟南芥(Arabadopsis)的ACT11(Huang等，Plant Mol.Biol.，33：125-139(1996))，拟南芥(Arabadopsis)的Cat3(GenBank NO.U43147，Zhong等，Mol.Gen.Genet.，251：196-203(1996))，来自芸苔属植物(Brassica napus)的编码硬脂酰基-酰基载体蛋白脱氢酶的基因(Genbank No.X74782，Solocombe等，PlantPhysiol.，104：1167-1176(1994))，来自玉米的GPc1(GenBank NO.X15596，Martinez等，J.Mol.Biol，208：551-565(1989))，以及来自玉米的Gpc2(GenBank NO.U45855，Manjunath等，Plant Mol.Biol.，33：97-112(1997))。

或者，所述植物启动子可在特定组织、器官或细胞类型中直接表达NHX1核酸(即组织特异性启动子、器官特异性启动子)，或者在更精确的环境控制或发育控制下表达(即诱导型启动子)。会影响诱导型启动子转录的环境条件的例子包括无氧条件、温度升高、光照或喷洒化学物质/激素。此领域的熟练技术人员将知道，器官特异性启动子可驱动操作性连接序列在靶器官以外的器官中表达。因此，在这里使用的器官特异性启动子是指优选驱动在靶器官中表达，但也可在其它器官中导致一些表达。

许多组织特异性启动子也可用于本发明。例如，指导根组织核酸表达的根启动子对于本发明特别重要。

如果需要合适的多肽表达，应该包括编码区3’-末端的聚腺苷化区域。所聚腺苷化区域可衍生自天然基因、许多其它植物基因或T-DNA。

包含本发明基因序列(例如启动子或编码区)的载体通常含有赋予植物细胞可选择的表型的标记基因。例如，所述标记可编码抗微生物剂抗性，尤其是抗生素抗性，如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，或除草剂抗性，如对氯磺隆或草铵膦的抗性。

转基因植物的制备

可以用各种常规技术将本发明的DNA构建物引入所需植物宿主的基因组。例如，可采用植物细胞原生质体的电穿孔和微注射技术将所述DNA构建物直接引入植物细胞的基因组DNA，或者可采用生物射弹技术，例如DNA颗粒轰击，将所述DNA构建物直接引入植物组织。

微注射技术是此领域已知的并详细描述在科学和专利文献中。用聚乙二醇沉淀引入DNA构建物的方法描述在Paszkowski等，Embo J.，3：27 17-2722(1984)。电穿孔技术描述在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：5824(1985)。生物射弹转化技术描述在Klein等，Nature，327：70-73(1987)。

或者，所述DNA构建物可与合适的T-DNA侧翼区结合并被引入常规的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumafaciens)宿主载体。当细胞被细菌感染时，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumafaciens)宿主的毒性功能将指导构建物的插入并使标记毗邻植物细胞DNA。根瘤农杆菌(Agrobacterium tumafaciens)介导的转化技术，包括使用或不使用二元载体，详细描述在科学文献中。参见，例如，Horsch等，Science，233：496-498(1984)，以及Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803(1983)和《植物的基因转移》(Gene Transfer to Plants)，Potrykus编，(Springer-Verlag，Berlin 1995)。

可培养用任何上述转化技术得到的转化的植物细胞以再生完整植株，所得植株具有转化的表型，因此具有如减低的法尼基转移酶活性所需的表型。这种再生技术取决于组织培养物生长培养基中某些植物激素的操作，典型的是取决于和所需核苷酸序列一起引入的抗微生物剂和/或除草剂标记。植物从培养的原生质体的再生描述在Evans等，《原生质体分离和培养》(Protoplasts Isolation and Culture)，《植物细胞培养手册》(Handbook of Plant Cell Culture)，124-176页，MacMillilanPublishing Company，New York，1983；以及Binding，《植物、植物原生质体的再生》(Regeneration of Plants，Plant Protoplasts)，21-73页，CRC Press，BocaRaton，1985。也可从植物的愈伤组织、外植体、器官或其一部分获得再生。这种再生技术通常描述在Klee等，Ann.Rev，of Plant Phys.，38：467-486(1987)。

本发明的核酸可被用于在几乎任何植物上提供所需特性。因此，本发明可被用于许多植物，包括以下种属的物种：腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、衣藻属目(Chlamydomonas)、小球藻属(Chlorella)、柑属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、贯众属(Cyrtomium)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoseyamus)、莴苣属(Lactuca)、海带属(Laminaria)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、巨藻属(Macrocystis)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、墨角纶属(Majorana)、苜蓿属(Medicago)、海囊藻属(Nereocystis)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、紫萁属(Osmunda)、黍属(Panieum)、Pannesetum、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、多足蕨属(Polypodium)、李属(Prunus)、蕨属(Pteridium)、萝卜属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高梁属(Sorghum)、可可树属(Theobromus)、胡芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豆花属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉米属(Zea)。

此领域的熟练技术人员将认识到，表达盒稳定地掺入转基因植物中并确定可操作后，可通过有性杂交将其引入其它植物。根据要杂交的物种可采用任何一种标准育种技术。

采用已知方法，精通此领域的技术人员可通过检测转基因植物中NHX1 mRNA或蛋白质的增加或减少来筛选本发明的植物。检测和定量mRNA或蛋白质的方法是此领域熟知的，例如有Northern印迹、Western印迹或活性测定。也可通过检测所需表型来鉴定本发明的植物。例如用下述方法来检测耐盐性或对干旱的耐性。

本发明的转基因生物的检测

可用已经建立的分子生物学技术，并用对包括耐盐性在内的多种表型进行选择的培养基来监测生长速度，可分析含有本发明多核苷酸的转化的酵母菌株。

或者可对包含本发明的转基因植物进行分析。制备含有本发明多核苷酸的表达盒并将其引入植物后，可对所得转基因植物与增加或减少的NHX1表达有关的表型特征进行测定。例如，将表达盒引入植物后，可就转基因的存在情况对植物进行筛选，并与近交系或杂交系杂交。然后就转基因的存在情况筛选后代植物并进行自花授粉。培养自花授粉植物的后代。可测定所得转基因植物提高的耐盐性和提高的干旱耐性以及降低的对毒素的敏感性。例如，可对转基因植物提高的耐盐性或干旱耐性进行测定。测定提高的耐盐性的方法是已知的，包括测量在升高的盐浓度下植物的生长速度、植物的生物量、根/芽比例和组织离子含量。可测量根和下胚轴的生长速度并与不同盐浓度下生长的植物的组织含水量。测定增加的干旱耐性的方法也是已知的，包括测量转基因植物组织的蒸腾速度、气孔传导、分离的叶中水分流失率测定或检测叶膨压。例如，蒸腾速度降低的转基因植物具有增加的干旱耐性。

实施例

实施例1：定点诱变和截短的AtNHx1的克隆

通过RT-PCR得到AtNHX1的全长cDNA并将其克隆入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。通过测序完整的开放读框来确定序列。然后采用BamH1和EcoR1克隆位点将全长cDNA亚克隆入酵母载体pYPGE15。按照QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)的说明进行定点诱变。用来产生SM-23的引物如下：SM-23-F，ggagacaatttgatgactgcttcatgcgacccgtc；SM-23-R，gacgggtcgcatgaagcagtcatcaaattgtctcc。对于截短的AtNHX1的克隆，通过PCR扩增截短的cDNA并将其克隆入pYPGE15载体。截短的AtNHX1克隆的引物如下：EXCH-5，agctaggatccggatctagaagaagataacaatgttgg；EXCH-DL-1，agctgaattcctagggtacaaagccacgacctc；EXCH-DL-2，agctgaattcctacaagaagccacgtatactg；EXCH-DL-3，agctgaattcctaagataacatgctcgtggtg。所有序列通过测序鉴定。

实施例2：酵母转化和滴凝试验

用醋酸锂/PEG法转化酵母细胞。将酵母细胞接种到渗出(drop-out)液体培养基中并在30℃培育过夜。通过离心收集细胞，并悬浮于APG培养基(Rodriguez-Navarro和Ramos，J.Bacteriol.，159：940-945(1984))并将OD600调至1.0。制备一系列10倍稀释液并将3l细胞接种到添加有不同盐分的APG培养基或接种到含有10mg/L潮霉素的YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基。

实施例3：修饰的AtNHX1赋予了增加的耐盐性

如图1所示，与对照菌株(enal)相比，缺乏内源NHX1Na⁺/H⁺反向转运蛋白的酵母突变菌株(enal nhxl)对NaCl以及潮霉素更敏感。AtNHX1在酵母突变体中表达部分恢复了突变体的表型，标明AtNHX1作为Na⁺/H⁺反向转运蛋白以将区室中的Na+转运入液泡的功能。与完整的形式相比，包括SM-23、Dl-1、Dl-2和Dl-3在内的修饰的AtNHX1使酵母细胞对盐和潮霉素更耐受。这一结果说明，修饰的AtNHX1具有较高的反向转运活性并能将更多的Na⁺转运入液泡。

实施例4：修饰的AtNHX1的改变的离子选择性

当在不含NaCl的APG培养基上生长时，酵母细胞的生长同样地不考虑完整的或修饰的AtNHX1的表达(图2)。然而，当提高培养基中的K⁺浓度时，与表达完整形式AtNHX1的酵母细胞相比，表达修饰的AtNHX1的酵母细胞显示出较高的对NaCl的耐性。这一结果说明NHX1基因的C-末端调控Na⁺/K⁺选择性。

实施例5：修饰的AtNHX1赋予增加的Li⁺耐性

酵母NHX1可转运Na⁺和Li⁺。与对照酵母菌株相比，缺乏NHX1基因的酵母突变体对Li⁺更敏感(图3)。尽管AtNHX1可挽救酵母突变体的Na⁺敏感性表型(图1)，但如图3所示，AtNHX1不能恢复酵母突变体的Li⁺敏感性表型，表明AtNHX1对于Li⁺转运只有小的活性或没有活性。令人惊奇的是，表达修饰的AtNHX1的酵母突变体细胞显示了几乎与对照酵母菌株水平相同的Li⁺耐性。这一结果提供了一种修饰能够解毒不同离子的转运蛋白的可能性，并提供了当过表达修饰的转运蛋白时对植物进行工程改造能耐受不同毒性离子的可能方法。

实施例6：在表达修饰的AtNHX1的酵母中提高了对渗透应力的耐性

液泡Na⁺/H⁺反向转运蛋白可将Na⁺汇集如液泡中并保持细胞的膨压。可对膨压进行调节以使水在渗透应力下流入细胞。在生长培养基中加入过量的1M KCl后，缺乏NHX1的酵母突变体细胞显示出敏感性表型(图4)，这说明NHX1对于渗透压的调节也很重要。由于生长培养基中不含Na⁺，NHX1对渗透压的调节可能是通过将K⁺转运入液泡实现的。完整形式AtNHX1的表达可由突变表型实现，但修饰形式的AtNHX1能使突变细胞生长到与野生型(enal)相同的水平，这说明修饰形式的AtNHX1具有高于完整形式的K⁺转运活性。

可用修饰形式的NHX1来遗传构建对干旱更具耐性的植物。由于修饰形式的AtNHX1可将更多的K⁺转运入液泡，液泡中K⁺浓度较高可使水被摄入细胞，这将会产生更高的力以使更多的水流过木质部。理论上，过表达这些修饰形式AtNHX1的转基因植物将更有效地摄取水，并且更耐受干旱应力。

实施例7：修饰的NHX1

用上面的实施例1和2中所述的方法生产了修饰的NHX1多核苷酸，包括AtNHX1cDNA的23个点突变、3个N-末端缺失和3个C-末端缺失(见表1和图5)。将酵母载体中的修饰的AtNHX1 cDNA转化入缺乏内源Na⁺/H⁺反向转运蛋白NHX1和Na⁺泵ENA1-4的酵母突变体。转化体的活性和离子选择性通过测试具有不同形式的AtNHX1的酵母在不同生长条件下的生长来确定。

表1

名称	突变体	生长情况
名称	突变体	生长情况	Full	不适用	++++

SM-1	Y85C/L86R	+
SM-1	Y85C/L86R	+	SM-2	D137C	+++++
SM-3	D142C	+	SM-2	D137C	+++++
SM-3	D142C	+	SM-4	D145C	++++
SM-5	D157C	++++	SM-4	D145C	++++
SM-5	D157C	++++	SM-6	D168C/E169V	++++
SM-7	E180V	++++	SM-6	D168C/E169V	++++
SM-7	E180V	++++	SM-8	D185C	+++
SM-9	H202A	+++	SM-8	D185C	+++
SM-9	H202A	+++	SM-10	H205A	++++
SM-11	H210A	++++	SM-10	H205A	++++
SM-11	H210A	++++	SM-12	H285A	++++
SM-13	H289A	++++	SM-12	H285A	++++
SM-13	H289A	++++	SM-14	N290D	++++
SM-15	H301A	++++	SM-14	N290D	++++
SM-15	H301A	++++	SM-16	R390C	++++
SM-17	G391E	++++	SM-16	R390C	++++
SM-17	G391E	++++	SM-18	R404C	++++
SM-19	H407A	++++	SM-18	R404C	++++
SM-19	H407A	++++	SM-20	R411C	++++
SM-21	H499A	++++	SM-20	R411C	++++
SM-21	H499A	++++	SM-22	D506C/D507C	+++++
SM-23	S508C	+++++	SM-22	D506C/D507C	+++++
SM-23	S508C	+++++	DL-1	17氨基酸缺失	+++++
DL-2	47氨基酸缺失	+++++	DL-1	17氨基酸缺失	+++++
DL-2	47氨基酸缺失	+++++	DL-3	84氨基酸缺失	+++++
NDL-1	17氨基酸缺失	+++++++++	DL-3	84氨基酸缺失	+++++
NDL-1	17氨基酸缺失	+++++++++	NDL-2	69氨基酸缺失	+++
DDL-3	98氨基酸缺失	+++	NDL-2	69氨基酸缺失	+++

实施例8：AtNHX1 N-末端和跨膜结构域的鉴定

用上面实施例1和2所述的方法鉴定了AtNHX1的游离N-末端和第一个跨膜结构域的功能。产生了三种N-末端缺失形式的AtNHX1并在酵母互补实验中进行分析。AtNHX1的游离N-末端的缺失(NDL-1，缺失前17个氨基酸)使酵母突变菌株(ΔenalΔnhx1)比全长的AtNHX1更耐受潮霉素和NaCl。表达NDL-1的酵母细胞的生长比表达全长AtNHX1的酵母细胞高约30倍，这说明AtNHX1的游离N-末端是酵母细胞中反向转运蛋白功能的负调节物。缺失前两个跨膜结构域(NDL-2)和缺失前三个跨膜结构域(NDL-3)能在一定程度上取消AtNHX1的功能。这些结果提供了通过遗传工程构建对盐更耐受的植物的可能性，这是通过过表达具有提高的反向运转活性的修饰形式的AtNHX1(如NDL-1)实现的。

参考资料

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以上实施例是为了例证本发明而不是限制其范围。本发明的其它变化对于此领域的一般技术人员是显而易见的，且包含在所附权利要求的范围之内。出于所有目的，这里提到的所有出版物、专利和专利申请纳入本文以供参考。

序列表

SEQ ID NO：1

野生型AtNHX1

1 atgttggatt ctctagtgtc gaaactgcct tcgttatcga catctgatca cgcttctgtg

61 gttgcgttga atctctttgt tgcacttctt tgtgcttgta ttgttcttgg tcatcttttg

121 gaagagaata gatggatgaa cgaatccatc accgccttgt tgattgggct aggcactggt

181 gttaccattt tgttgattag taaaggaaaa agctcgcatc ttctcgtctt tagtgaagat

241 cttttcttca tatatctttt gccacccatt atattcaatg cagggtttca agtaaaaaag

301 aagcagtttt tccgcaattt cgtgactatt atgctttttg gtgctgttgg gactattatt

361 tcttgcacaa tcatatctct aggtgtaaca cagttcttta agaagttgga cattggaacc

421 tttgacttgg gtgattatct tgctattggt gccatatttg ctgcaacaga ttcagtatgt

481 acactgcagg ttctgaatca agacgagaca cctttgcttt acagtcttgt attcggagag

541 ggtgttgtga atgatgcaac gtcagttgtg gtcttcaacg cgattcagag ctttgatctc

601 actcacctaa accacgaagc tgcttttcat cttcttggaa acttcttgta tttgtttctc

661 ctaagtacct tgcttggtgc tgcaaccggt ctgataagtg cgtatgttat caagaagcta

721 tactttggaa ggcactcaac tgaccgagag gttgccctta tgatgcttat ggcgtatctt

781 tcttatatgc ttgctgagct tttcgacttg agcggtatcc tcactgtgtt tttctgtggt

841 attgtgatgt cccattacac atggcacaat gtaacggaga gctcaagaat aacaacaaag

901 catacctttg caactttgtc atttcttgcg gagacattta ttttcttgta tgttggaatg

961 gatgccttgg acattgacaa gtggagatcc gtgagtgaca caccgggaac atcgatcgca

1021 gtgagctcaa tcctaatggg tctggtcatg gttggaagag cagcgttcgt ctttccgtta

1081 tcgtttctat ctaacttagc caagaagaat caaagcgaga aaatcaactt taacatgcag

1141 gttgtgattt ggtggtctgg tctcatgaga ggtgctgtat ctatggctct tgcatacaac

1201 aagtttacaa gggccgggca cacagatgta cgcgggaatg caatcatgat cacgagtacg

1261 ataactgtct gtctttttag cacagtggtg tttggtatgc tgaccaaacc actcataagc

1321 tacctattac cgcaccagaa cgccaccacg agcatgttat ctgatgacaa caccccaaaa

1381 tccatacata tccctttgtt ggaccaagac tcgttcattg agccttcagg gaaccacaat

1441 gtgcctcggc ctgacagtat acgtggcttc ttgacacggc ccactcgaac cgtgcattac

1501 tactggagac aatttgatga ctccttcatg cgacccgtct ttggaggtcg tggctttgta

1561 ccctttgttc caggttctcc aactgagaga aaccctcctg atcttagtaa ggct

SEQ ID NO：2

野生型AtNHX1，蛋白质序列

MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENR

WMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQ

FFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVC

TLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLY

LFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGIL

TVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVS

DTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLM

RGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTTTVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQ

NATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQF

DDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA

SEQ ID NO：3

SM-23，S508C，单个核酸变化，cDNA序列

atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatctgatcacgcttctgtggttgcgttgaatctctttgt

tgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatcttttggaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgt

tgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagat

cttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaattt

cgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttcttta

agaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgt

acactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaac

gtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaa

acttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagcta

tactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagct

tttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggaga

gctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatg

gatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatggg

tctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgaga

aaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaac

aagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttag

cacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttat

ctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagactcgttcattgagccttcagggaaccacaat

gtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgacacggcccactcgaaccgtgcattactactggagacaatttgatga

ctGcttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgttccaggttctccaactgagagaaaccctcctg

atcttagtaaggct

SEQ ID NO：4

SM-23，S508C，单个氨基酸取代，蛋白质序列

MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFSED

LFFTYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVC

TLQVLNQDETPLLYSLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKL

YFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGM

DALDIDKWRSVSDTPGTSIAVILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYN

KFTRAGHTDVRGNAIMITSTTTVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHN

VPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDCFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA

SEQ ID NO：5

DL-1，从C-末端缺失17个氨基酸，cDNA序列

ATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAACTGCCTTCGTTATCGACATCTGATCACGCTTC

TGTGGTTGCGTTGAATCTCTTTGTTGCACTTCTTTGTGCTTGTATTGTTCTTGGTCA

TCTTTTGGAAGAGAATAGATGGATGAACGAATCCATCACCGCCTTGTTGATTGGG

CTAGGCACTGGTGTTACCATTTTGTTGATTAGTAAAGGAAAAAGCTCGCATCTTC

TCGTCTTTAGTGAAGATCTTTTCTTCATATATCTTTTGCCACCCATTATATTCAATG

CAGGGTTTCAAGTAAAAAAGAAGCAGTTTTTCCGCAATTTCGTGACTATTATGCT

TTTTGGTGCTGTTGGGACTATTATTTCTTGCACAATCATATCTCTAGGTGTAACAC

AGTTCTTTAAGAAGTTGGACATTGGAACCTTTGACTTGGGTGATTATCTTGCTATT

GGTGCCATATTTGCTGCAACAGATTCAGTATGTACACTGCAGGTTCTGAATCAAG

ACGAGACACCTTTGCTTTACAGTCTTGTATTCGGAGAGGGTGTTGTGAATGATGC

AACGTCAGTTGTGGTCTTCAACGCGATTCAGAGCTTTGATCTCACTCACCTAAAC

CACGAAGCTGCTTTTCATCTTCTTGGAAACTTCTTGTATTTGTTTCTCCTAAGTAC

CTTGCTTGGTGCTGCAACCGGTCTGATAAGTGCGTATGTTATCAAGAAGCTA

TACTTTGGAAGGCACTCAACTGACCGAGAGGTTGCCCTTATGATGCTTATGGCGT

ATCTTTCTTATATGCTTGCTGAGCTTTTCGACTTGAGCGGTATCCTCACTGTGTTTT

TCTGTGGTATTGTGATGTCCCATTACACATGGCACAATGTAACGGAGAGCTCAAG

AATAACAACAAAGCATACCTTTGCAACTTTGTCATTTCTTGCGGAGACATTTATTT

TCTTGTATGTTGGAATGGATGCCTTGGACATTGACAAGTGGAGATCCGTGAGTGA

CACACCGGGAACATCGATCGCAGTGAGCTCAATCCTAATGGGTCTGGTCATGGTT

GGAAGAGCAGCGTTCGTCTTTCCGTTATCGTTTCTATCTAACTTAGCCAAGAAGA

ATCAAAGCGAGAAAATCAACTTTAACATGCAGGTTGTGATTTGGTGGTCTGGTCT

CATGAGAGGTGCTGTATCTATGGCTCTTGCATACAACAAGTTTACAAGGGCCGGG

CACACAGATGTACGCGGGAATGCAATCATGATCACGAGTACGATAACTGTCTGT

CTTTTTAGCACAGTGGTGTTTGGTATGCTGACCAAACCACTCATAAGCTACCTATT

ACCGCACCAGAACGCCACCACGAGCATGTTATCTGATGACAACACCCCAAAATC

CATACATATCCCTTTGTTGGACCAAGACTCGTTCATTGAGCCTTCAGGGAACCAC

AATGTGCCTCGGCCTGACAGTATACGTGGCTTCTTGACACGGCCCACTCGAACCG

TGCATTACTACTGGAGACAATTTGATGACTCCTTCATGCGACCCGTCTTTGGAGG

TCGTGGCTTTGTACCC

SEQ ID NO：6

DL-1，从C-末端缺失17个氨基酸，蛋白质序列

MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLG

TGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTI

ISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFG

EGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVI

KKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTE

SSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVG

RAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGH

TDVRGNAIMITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLL

DQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVP

SEQ ID NO：7

DL-2，从C-末端缺失47个氨基酸，cDNA序列

agaattggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgt

tactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatggcgtatctttcttatatgcttgcttgctgagct

tttcgacttagcggtatatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggaga

gatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgagtgacacaccgggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatggg

tctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctactaacttagccaagaagaatcaaagcgaga

aagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtcttttag

gtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttg

SEQ ID NO：8

DL-2，从C-末端缺失47个氨基酸，蛋白质序列

MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLG

TGVTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTI

ISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLYSLVFG

EGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVI

KKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTE

SSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVG

RAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGH

TDVRGNAIMTSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLL

DQDSFTEPSGNHNVPRPDSIRGFL

SEQ ID NO：9

DL-3，从C-末端缺失84个氨基酸，cDNA序列

tgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcatcttctcgtctttagtgaagat

agaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatttgctgcaacagattcagtatgt

ct

SEQ ID NO：10

DL-3，从C-末端缺失84个氨基酸，蛋白质序列

MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLG

TGVTILLISKGKSSLLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVIMLFGAVGTI

ISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFG

EGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVI

KKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTE

SSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSLMGLVMVG

RAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGH

TDVRGNAIMITSTTTVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLS

SEQ ID NO：11

NDL-1 cDNA 序列

atggcttctgtggttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatctttggaagagaa

tagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactggtgttaccattttgttgattagtaaaggaa

aaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggttt

caagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgtactattatgctttttggtgctgttgggactattatttcttgcac

aatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattg

gtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtctt

gtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacct

aaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccg

gtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgctt

atggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgat

gtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttg

cggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacaccggga

acatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttct

atctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatga

gaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatg

atcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctatt

accgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaag

actcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttgacacggcccactcga

accgtgcattactactggagacaatttgatgactccttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgt

tccaggttctccaactgagagaaaccctcctgatcttagtaaggct

SEQ ID NO：12

NDL-1蛋白质序列

MASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHL

LVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVYIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKK

LDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVF

NAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGISAYVIKKLYFGRHSTDRE

VALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLS

FLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSN

LAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTI

TVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHN

VPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA

SEQ ID NO：13

NDL-2 cDNA 序列

atgaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagg

gtttcaagtaaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattattctt

gcacaatcatattctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgct

attggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgtaactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacag

tcttgtattcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactc

acctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgca

accggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgat

gcttatggcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattg

tgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcattt

cttgcggagacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacacc

gggaacatcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgt

ttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctc

atgagaggtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaat

catgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacc

tattaccgcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggac

caagactcgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgacacggcccac

tcgaaccgtgcattactactggagacaatttgatgactccttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccct

ttgttccaggttctccaactgagagaaaccctcctgatcttagtaaggct

SEQ ID NO：14

NDL-2蛋白质序列

MKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGV

TQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDAT

SVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRH

STDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSSRITTKHT

FATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPL

SFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAI

MITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPS

GNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYWRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPP

DLSKA

SEQ ID NO：15

NDL-3 cDNA序列

atgaaaaagaagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgcttttggtgctgttgggactattatttcttgcacaat

catatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacctttgacttgggtgattatcttgctattggtg

ccatatttgctgcaacagattcagtatgtacactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgta

ttcggagagggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctcactcacctaaa

ccacgaagctgctttcatccttcttggaaacttcttgtatttgtttctcctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtc

tgataagtgcgtatgttatcaagaagctatactttggaaggcactcaactgaccgagaggttgcccttatgatgcttatg

gcgtatctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgtc

ccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaacaaagcatacctttgcaactttgtcatttcttgcgg

agacatttattttcttgtatgttggaatggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaaca

tcgatcgcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccgttatcgtttctatc

taacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatgagag

gtgctgtatctatggctcttgcatacaacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatc

acgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcataagctacctattacc

gcaccagaacgccaccacgagcatgttatctgatgacaacaccccaaaatccatacatatccctttgttggaccaagact

cgttcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttgacacggcccactcgaacc

gtgcattactactggagacaatttgatgactccttcatgcgacccgtctttggaggtcgtggctttgtaccctttgttcc

aggttctccaactgagagaaaccctcctgatcttagtaaggct

SEQ ID NO：16

NDL-3蛋白质序列

MKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATD

SVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGN

FLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMLMAYLSYMLAELFDLS

GILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWR

SVSDTPOGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWS

GLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLL

PHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLDQDSFIEPSGNHNVPRPDSIRGFLTRPTRTVHYYW

RQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA

Claims

1.一种增强植物耐盐性的方法，其特征在于，所述方法包括

a.在植物中引入编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸，当其表达时能增加植物的耐盐性，且其中所述的转运蛋白多肽包括：

i.与SEQ ID NO：2有至少80％同一性的氨基酸序列；和

ii.少于530个氨基酸；以及

b.选择与未引入该多核苷酸的植物相比耐盐性增强的植物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：11。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赋予耐盐性的多肽是SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是SEQ ID NO：7或SEQID NO：13。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赋予耐盐性的多肽小于500个氨基酸。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赋予耐盐性的多肽是SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸是SEQ ID NO：9或SEQID NO：15。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赋予耐盐性的多肽小于475个氨基酸。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述赋予耐盐性的多肽是SEQ IDNO：10。

10.一种增强植物耐盐性的方法，其特征在于，所述方法包括

a.在植物中引入编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸，当其表达时能增强植物的耐盐性，且其中所述的转运蛋白多肽包括：

i.与SEQ ID NO：2有至少80％同一性的氨基酸序列；和

ii.与SEQ ID NO：2中第508位的丝氨酸相对应的残基被Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的赋予增强的耐盐性的氨基酸替代；以及

b.选择与未引入该多核苷酸的植物相比耐盐性增强的植物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述取代第508位丝氨酸的氨基酸是中性的极性氨基酸。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述取代第508位丝氨酸的氨基酸选自苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述取代第508位丝氨酸的氨基酸是半胱氨酸。

14.一种纯化的包含编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的核苷酸序列的多核苷酸，当其表达时能增强植物的耐盐性，其特征在于，所述转运蛋白多肽包含：

i.与SEQ ID NO：2有至少80％同一性的氨基酸序列；和

ii.少于522个氨基酸。

15.如权利要求14所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQ IDNOS：5、7、9、11、13和15。

16.如权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQ ID NOS：6、8、10、12、14和16。

17.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：3。

18.如权利要求10所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQ ID NO：4。

19.一种转基因或诱变的植物，其特征在于，它包含编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸，当其表达时能增强植物的耐盐性；且其中所述转运蛋白多肽包含与SEQ IDNO：2有至少80％同一性的小于530个氨基酸的氨基酸序列。

20.一种转基因或诱变的植物，其特征在于，它包含编码Na⁺/H⁺转运蛋白多肽的多核苷酸，当其表达时能增强植物的耐盐性；且其中所述转运蛋白多肽包含与SEQ IDNO：2有至少80％同一性的氨基酸序列；且

所述与SEQ ID NO：2中第508位的丝氨酸相对应的残基被赋予增强的耐盐性的氨基酸替代。