CN1681833A - Sir2产物及活性 - Google Patents

Sir2产物及活性 Download PDF

Info

Publication number
CN1681833A
CN1681833A CNA028266315A CN02826631A CN1681833A CN 1681833 A CN1681833 A CN 1681833A CN A028266315 A CNA028266315 A CN A028266315A CN 02826631 A CN02826631 A CN 02826631A CN 1681833 A CN1681833 A CN 1681833A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acetylizad
peptide
sir2
ethanoyl
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028266315A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1310937C (zh
Inventor
V·L·施拉姆
J·D·贝克
A·萨维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albert Einstein College of Medicine
Johns Hopkins University
Original Assignee
Albert Einstein College of Medicine
Johns Hopkins University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albert Einstein College of Medicine, Johns Hopkins University filed Critical Albert Einstein College of Medicine
Publication of CN1681833A publication Critical patent/CN1681833A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1310937C publication Critical patent/CN1310937C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

提供了一种新的化合物2′/3′－O－乙酰基ADP核糖。该化合物是O－乙酰基ADP核糖的2′和3′区位异构体的混合物，且从2′－O－乙酰基ADP核糖经过非酶化而形成的，其是Sir2酶与乙酰化的肽及NAD+反应的新发现的产物。也提供了2′/3′－O－乙酰基ADP核糖的类似物。另外，提供了制备2′/3′－O－乙酰基ADP核糖的方法，测定一种测试化合物是否是Sir2酶的抑制剂的方法，在组合物中检测Sir2活性的方法，对乙酰化的肽去乙酰化的方法和抑制乙酰化的肽去乙酰化的方法。也提供了2′/3′－O－乙酰基ADP核糖的前体药物。

Description

Sir2产物及活性
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助号AI 34342的美国政府资助下完成。政府对本发明享有一定权益。
背景
(1)发明领域
本发明总体上涉及酶产物及活性。更具体地，本发明涉及Sir2酶的产物及活性的发现。
(2)相关技术的描述
引用的参考文献
1.Brachmann，C.B.，Sherman，J.M.，Devine，S.E.，Cameron，E.E.，Pillus，L.，和Boeke，J.D.The SIR2 gene family，conservedfrom bacteria to humans，functions in silencing，cell cycleprogression，and chromosome stability.Genes Dev.9，2888-90(1995).
2.Frye，R.A.Characterization of five human cDNAs withhomology to the yeast SIR2 gene：Sir2-like proteins(sirtuins)metabolize NAD and may have protein ADP-ribosyltransferaseactivity.Biochem.Biophys.Res.Commun.260，273-9(1999).
3.Moretti，P.，Freeman，K.，Coodly，L.，和Shore，D.Evidence that a complex of SIR proteins interacts with thesilencer and telomere-binding protein RAP 1.Genes Dev.8，2257-69.(1994).
4.Rine，J.，和Herskowitz，I.Four genes responsible for aposition effect on expression from HML and HMR in Saccharomycescerevisiae.Genetics 116，9-22(1987).
5.Shou，W.，Seol，J.H.，Shevchenko，A.，Baskerville，C.，Moazed，D.，Chen，Z.W.，Jang，J.，Charbonneau，H.，和Deshaies，R.J.Exit from mitosis is triggered by Tem 1-dependent releaseof the protein phosphatase Cdcl4 from nucleolar RENT complex.Cell 97，233-44(1999).
6.Straight，A.F.，Shou，W.，Dowd，G.J.，Turck，C.W.，Deshaies，R.J.，Johnson，A.D.，和Moazed，D.Netl，aSir2-associated nucleolar protein required for rDNA silencingand nucleolar integrity.Cell 97，245-56(1999).
7.Hecht，A.，Laroche，T.，Strahl-Bolsinger，S.，Gasser，S.M.，和Grunstein，M.Histone H3 and H4 N-termini interact withSIR3 and SIR4 proteins：a molecular model for the formation ofheterochromatin in yeast.Cell 80，583-92(1995).
8.Johnson，L.M.，Kayne，P.S.，Kahn，E.S.，和Grunstein，M.Genetic evidence for an interaction between SIR3 and histone H4in the repression of the silent mating loci in Saccharomycescerevisiae.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，6286-90(1990).
9.Braunstein，M.，Rose，A.B.，Holmes，S.G.，Allis，C.D.，和Broach，J.R.Transcriptional silencing in yeast isassociated with reduced nucleosome acetylation.Genes Dev.7，592-604(1993).
10.Imai，S.，Armstrong，C.M.，Kaeberlein，M.，和Guarente，L.Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is anNAD-dependent histone deacetylase.Nature 403，795-800(2000).
11.Landry，J.，Sutton，A.，Tafrov，S.T.，Heller，R.C.，Stebbins，J.，Pillus，L.，和Sternglanz，R.The silencingprotein SIR2 and its homologs are NAD-dependent proteindeacetylases.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，5807-11(2000).
12.Smith，J.S.，Brachmann，C.B.，Celic，I.，Kenna，M.A.，Muhammad，S.，Starai，V.J.，Avalos，J.L.，Escalante-Semerena，J.C.，Grubmeyer，C.，Wolberger，C.，和Boeke，J.D.Aphylogenetically conserved NAD+-dependent protein deacetylaseactivity in the Sir2 protein family.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，6658-63(2000).
13.Tsang，A.W.，和Escalante-Semerena，J.C.CobB，a newmember of the SIR2 family of eucaryotic regulatory proteins，isrequired to compensate for the lack of nicotinate mononucleotide：5，6-dimethylbenzimidazole phosphoribosyltransferase activityin cobT mutants during cobalamin biosynthesis in Salmonellatyphimurium LT2.J.Biol.Chem.273，31788-94(1998).
14.Landry，J.，Slama，J.T.，和Sternglanz，R.Role of NAD(+)in the deacetylase activity of the SIR2-like proteins.Biochem.Biophys.Res.Commun.278，685-90(2000).
15.Tanner，K.G.，Landry，J.，Sternglanz，R.，和Denu，J.M.Silent information regulator 2 family of NAD-dependenthistone/protein deacetylases generates a unique product，1-O-acetyl-ADP-ribose.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，14178-82(2000).
16.Tanny，J.C.，和Moazed，D.Coupling of histonedeacetylation to NAD breakdown by the yeast silencing proteinSir2：Evidence for acetyl transfer from substrate to an NADbreakdown product.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98，415-20(2001).
17.Moazed，D.Enzymatic activities of Sir2 and chromatinsilencing.Curr.Opin.Cell Biol.13，232-8(2001).
18.Min，J.，Landry，J.，Sternglanz，R.，和Xu，R.M.Crystal structure of a SIR2 homolog-NAD complex.Cell 105，269-79(2001).
19.Smith，J.S.，Avalos，J.，Celic，I.，Muhammad，S.，Wolberger，C.，和Boeke，J.D.The SIR2 family of NAD+-dependentprotein deacetylases.Meth.Enzymol.342，in press(2001).
20.Gu，W.，和Roeder，R.G.Activation of p53sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53C-terminal domain.Cell 90，595-606.(1997).
21.Abraham，J.，Kelly，J.，Thibault，P.，和Benchimol，S.Post-translational modification of p53 protein in response toionizing radiation analyzed by mass spectrometry.J.Mol.Biol.295，853-64(2000).
22.Liu，L.，Scolnick，D.M.，Trievel，R.C.，Zhang，H.B.，Marmorstein，R.，Halazonetis，T.D.，和Berger，S.L.p53 sitesacetylated in vitro by PCAF and p300 are acetylated in vivo inresponse to DNA damage.Mol.Cell.Biol.19，1202-9(1999).
23.Sakaguchi，K.，Herrera，J.E.，Saito，S.，Miki，T.，Bustin，M.，Vassilev，A.，Anderson，C.W.，和Appella，E.DNAdamage activates p53 through a phosphorylation-acetylationcascade.Genes Dev.12，2831-41(1998).
24.Sterner，D.E.，和Berger，S.L.Acetylation ofhistones and transcription- related factors.Microbiol.Mol.Biol.Rev.64，435-59(2000).
25.Cervantes-Laurean，D.，Jacobson，E.L.，和Jacobson，M.K.Preparation of low molecular weight model conjugates forADP-ribose linkages to protein.Methods Enzymol.280，275-87(1997).
26.Muller-Steffner，H.M.，Malver，O.，Hosie，L.，Oppenheimer，N.J.，和Schuber，F.Slow-binding inhibition ofNAD+glycohydrolase by arabino analogues of beta-NAD.J.Biol.Chem.267，9606-11(1992).
27.Sauve，A.A.，Deng，H.T.，Angeletti，R.H.，和Schramm，V.L.A covalent intermediate in CD38 is responsible forADP-ribosylation and cyclization reactions.J.Amer.Chem.Soc.122，7855-7859(2000).
28.Gottschling，D.E.Gene silencing：two faces of SIR2.Curr.Biol.10，R708-11(2000).
29.Lin，S.J.，Defossez，P.A.，和Guarente，L.Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorierestriction in Saccharomyces cerevisiae.Science 289，2126-8(2000).
30.Tissenbaum，H.A.，和Guarente，L.Increased dosage ofa sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans.Nature410，227-30(2001).
31.Guarente，L.Sir2 links chromatin silencing，metabolism，and aging.Genes Dev.14，1021-6(2000).
32.Cuperus，G.，Shafaatian，R.，和Shore，D.Locus specificitydeterminants in the multifunctional yeast silencing protein Sir2.Embo.J.19，2641-51(2000).
33.Gotta，M.，Strahl-Bolsinger，S.，Renauld，H.，Laroche，T.，Kennedy，B.K.，Grunstein，M.，和Gasser，S.M.Localizationof Sir2p：the nucleolus as a compartment for silent informationregulators.Embo.J.16，3243-55(1997).
34.Afshar，G.，和Murnane，J.P.Characterization of a humangene with sequence homology to Saccharomyces cerevisiae SIR2.Gene 234，161-8(1999).
35.Perrod，S.，Cockell，M.M.，Laroche，T.，Renauld，H.，Ducrest，A.L.，Bonnard，C.，和Gasser，S.M.A cytosolicNAD-dependent deacetylase，Hst2p，can modulate nucleolar andtelomeric silencing in yeast.Embo.J.20，197-209(2001).
36.Yang，Y.H.，Chen，Y.H.，Zhang，C.Y.，Nimmakayalu，M.A.，Ward，D.C.，和Weissman，S.Cloning and characterization oftwo mouse genes with homology to the yeast Sir2 gene.Genomics69，355-69(2000).
37.Murphy，M.，Ahn，J.，Walker，H.K.，Hoffman，W.H.，Evans，R.M.，Levine，A.J.，和George，D.L.Transcriptional repressionby wild-type p53 utilizes histone deacetylases，mediated byinteraction with mSin3a.Genes Dev.13，2490-501(1999).
38.Juan，L.J.，Shia，W.J.，Chen，M.H.，Yang，W.M.，Seto，E.，Lin，Y.S.，和Wu，C.W.Histone deacetylases specificallydown-regulate p53-dependent gene activation.J.Biol.Chem.275，20436-43(2000).
39.Rising，K.，和Schramm，V.L.Transition state analysisof NAD+hydrolysis by the cholera toxin catalytic subunit.J.Am.Chem.Soc.119，27-37(1997).
40.Borch，R.F.A new method for the reduction of secondaryand tertiary amides.Tetrahedron.Lett.1，61-65(1968).
41.Challis，B.C.，和Frenkel，A.D.The alkylhalidecatalyzed pseudomolecular rearrangements of imidates to amides：an explanation for the ambident nucleophilic properties ofneutral amides.J.Chem.Soc.Perkin II，192-197(1978).
42.Scheuring，J.，Berti，P.J.，和Schramm，V.L.Transition-state structure for the ADP-ribosylation ofrecombinant Gialphal subunits by pertussis toxin.Biochemistry37，2748-58(1998).
43.Munshi，C.B.，Fryxell，K.B.，Lee，H.C.，和Branton，W.D.Large-scale production of human CD38 in yeast byfermentation.Methods Enzymol.280，318-30(1997).
44.Sleath，P.R.，Handlon，A.L.，和Oppenheimer，N.J.Pyridine coenzyme analogs 3.Synthesis of three NAD+analogscontaining a 2′-deoxy-2′-substituted nicotinamide arabinosylmoiety.J.Org.Chem.56，3608-3613(1991).
45.Rustandi，R.R.，Baldisseri，D.M.，和Weber，D.J.Structure of the negative regulatory domain of p53 bound to S100B(betabeta).Nat.Struct.Biol.7，570-4(2000).
46.Luo，J.，Nikolaev，A.Y.，Imai，S.，Chen，D.，Su，F.，Shiloh，A.，Guarente，L.，和Gu，W.Negative control of p53 bySir2α promotes cell survival under stress.Cell 107，137-48(2001).
47.Khamnei，S.，和Torrence，P.F.Neighboring group catalysisin the design of nucleotide prodrugs.J.Med.Chem.39，4109-15(1996).
类Sir2p酶的在从细菌到人类中是广泛保守的。在酵母中，这些蛋白和其它蛋白形成复合物，其通过接近组蛋白7，8并对它们去乙酰化9-12产生了染色质沉默3-6。Sir2酶是细菌酶cobB的同系物，cobB是一种磷酸核糖基转移酶13，其产生了在去乙酰化反应中Sir2p利用NAD+作为共底物的发现10，14，12。对NAD+的特殊需要是化学计量的14且产生新的产物，最初被认为是β-1′-AADPR15，16或可能是2′-AADPR16，17。来自闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)的命名为Sir2-Af1的Sir2p同系物的晶体结构近来被测定，在其的活性位点结合有NAD+，根据产生β-1′-AADPR的催化机制解释了该结构18。一个裂口被认为结合了底物蛋白的乙酰基-赖氨酸侧链以接近结合NAD+的C1′，在肽侧链和NAD+之间提供底物组织以进行乙酰基团的转移18。
从力学和热力学的角度考虑，通过Sir2p的NAD+依赖的去乙酰化是一种特殊的反应，因为赖氨酸N-去乙酰化反应仅通过水解就能完成，水解和ADP核糖转移至乙酸酯的显而易见的偶联形成了产物乙酰基ADP核糖(AADPR)，并产生一种具有未知功能的新代谢物15-17。
到目前为止有证据表明组蛋白在体内是Sir2酶的底物。然而，真细菌如沙门氏菌属(Salmonella)没有组蛋白，但其基因组编码类Sir2蛋白19。类似地，编码Sir2p的古细菌(archaeal)基因组也编码组蛋白类似蛋白，但那些组蛋白缺少在真核生物的组蛋白中作为赖氨酸乙酰化的重要位点的N-末端尾部。一种古细菌，闪烁古生球菌，编码两种具有47％同一性的不同的类Sir2去乙酰化酶，近来测定了它们中一个(Sir2Af1)的X-射线结构。Sir2Af2在生化性质方面已被更广泛地进行了鉴定，并在体外对规定的底物能起作用12。
通过Sir2p的组蛋白去乙酰化被认为是将染色质从活化态转化为沉默态的主要反应9，10，12。通过证实在所有被研究的酵母沉默复合物中Sir2p蛋白是唯一保守的SIR家族成员的对沉默复合物的研究支持了该暗示28。热量的限制增量调节了Sir2p的活性并可延长寿命，表明在不同的生物体中沉默可能具有潜在的生物学作用29，30。对NAD+的需要和沉默因子能“感觉”细胞氧化还原状态的证据暗示了Sir2p家族成员是具有广泛作用的独特的酰胺水解酶12，31。
在没有组蛋白底物的生物中Sir2p家族酶的分布和编码多个Sir2蛋白的真核生物基因组暗示去乙酰化酶家族具有不同的底物。诱变实验暗示Sir2p催化核心域侧翼的N-和C-末端帮助指导其结合不同的靶标32。尽管在真核生物细胞中大部分的Sir2蛋白位于细胞核中33，但其它的位于细胞质中34-36，或甚至在线粒体中(Onyango，Celic，Boeke和Feinberg；未公开的观察结果)，这暗示了其具有另外的底物。
发明简述
本发明是基于以下两项发现。第一项发现是乙酰化的肽和NAD+与Sir2的反应产物是2′-O-乙酰基ADP核糖(2′-O-acetyl-ADP-ribose)。该2′乙酰基团能异构化为3′羟基，具有更慢的反向异构化发生，直到在2′和3′结构之间形成平衡。因此，Sir2反应最终导致2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的产生(图10)。
第二项发现是Sir2酶对除了组蛋白外的其它肽去乙酰化，这样的肽的例子是乙酰化的p53和它的片段。基于在实施例1中所描述的实验结果，本领域技术人员可期望Sir2酶去乙酰化任何具有至少两个氨基酸的乙酰化的肽，其中至少一个氨基酸包含一个在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。
因此，本发明涉及纯化的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖制品，和在细胞中显示增加的稳定性的它们的类似物。
本发明也涉及制备2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的方法。该方法包含在足以使肽去乙酰化的反应条件下在反应混合物中用NAD+和Sir2酶的乙酰化的肽底物组合Sir2酶一段时间，接着从反应混合物中鉴定并纯化2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。
另外，本发明涉及测定一种测试化合物是否是Sir2酶的抑制剂的方法。该方法包含在一定反应条件下用Sir2酶、NAD+和Sir2酶的乙酰化的肽底物组合该测试化合物一段时间，其中所述反应条件和时间使得在不存在该测试化合物的条件下可以去乙酰化该肽，对产生自乙酰化的肽的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖进行定量，接着比较生成的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的量和在相同的反应条件下但不存在该测试化合物时生成的2′/3′O-乙酰基ADP核糖的量。在这些方法中，比不存在该测试化合物时更少的2′-O-乙酰基ADP核糖和/或3′-O-乙酰基ADP核糖表明该测试化合物是Sir2酶的抑制剂。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及在组合物中检测Sir2的活性的方法。该方法包含在一定反应条件下用NAD+和Sir2酶的乙酰化的肽底物组合该组合物一段时间，其中所述反应条件和时间使得在存在Sir2活性的条件下可以去乙酰化该肽，接着测量2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。存在2′/3′-O-乙酰基ADP核糖表明在该组合物中存在Sir2活性。
另外本发明涉及对乙酰化的肽去乙酰化的方法。该方法包含用Sir2酶组合该肽。在这些具体实施方式的新内容中，该乙酰化的肽不是组蛋白。
另外，本发明涉及抑制乙酰化的肽的去乙酰化的方法。该方法包含用2′/3′-O-乙酰基ADP核糖或它的类似物和乙酰化的肽混合。
在另外的具体实施方式中，本发明涉及2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的前体药物。该前体药物包含通过酯酶敏感的键共价结合到另一部分上的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。在这些具体实施方式中，该前体药物能比2′/3′-O-乙酰基ADP核糖更易进入细胞。
附图的简要描述
图1的HPLC和免疫印迹图谱表明，p53和其衍生肽是Sir2p和相关蛋白的底物。A.粗体的残基是在JB11和12中和在JB12D中带有乙酰基的赖氨酸。B-G.底物的HPLC分离(数字是保留时间)和质谱(MS)分析(数字是amu)及产物峰。B.JB11和Sir2p反应的HPLC分析。C，D.来自B栏中HPLC的两个主要峰(产物，C；底物，D)的MS。E.JB12肽的HPLC。F.用Sir2p处理后的JB12肽的HPLC，插入图是主要峰的MS。G.JB12和JB12D肽混合物的HPLC。H.在酵母中表达的全长p53的p53活性，用抗p53的D0-1进行免疫沉淀和在体外用p300乙酰化。顶行是用对赖氨酸373和382特异的抗乙酰基p53抗体进行的免疫印迹。底行是用对乙酰化和去乙酰化的p53能反应的FL-393抗体进行的免疫印迹。
图2显示与Sir2产物的结构相关的不同制品的核磁共振(NMR)图谱。上图：在D2O中β-1′-AADPR的1H NMR(300MHz)。中图：在15℃的D2O中3′-AADPR的1H NMR(600MHz)。下图：来自中图的样品在20℃(600MHz)放置几小时显示了2′-和3′-AADPR异构体的平衡。
图3显示Sir2p产生的AADPR和β-1′-AADPR的MS/MS比较。
图4显示与AADPR结构相关的曲线图及色谱图。左上图：HPLC色谱的时间关系曲线显示在15℃下超过5小时后3′-AADPR转化为2′-AADPR异构体。下图：1D1H NMR谱的堆积图显示在10℃下在3′-(α和β)AADPR(主要的)和2′-(α和β)AADPR(次要的)区位异构体(regioisomer)群体中的改变是时间的函数。上右图：在15℃下通过HPLC测量的3′-O-乙酰基ADPR异构体作为时间的函数的图。实心曲线代表在正文中描述的一阶函数的最佳拟合。打点的线代表经过24小时温育后通过积分HPLC峰面积所测定的平衡。
图5显示在5℃进行的1D 1H NMR谱(600MHz)的堆积图，表明在存在10mM NAD+和1.5mM JB12肽下50mM Sir2Af2催化2′-AADPR的最初形成(共振峰在d 5.15(2′β)和4.93(2′α))。更迟的时间点表明2′-ADPR转化为3′-ADPR(共振峰在d 5.04(3′β)和4.88(3′α))。波谱间隔为1小时。插入图：在反应中和/或在粹灭中用同位素标记的水处理后，Sir2Af2反应产生的AADPR分子离子的MS谱。上图表明在18O水中Sir2Af2反应接着用含10％ d4-乙酸的H2 18O在室温下粹灭3小时产生的离子。中图表明在18O水中Sir2Af2反应不经粹灭而产生的离子。下图表明在无标记的水中SirAf2反应不经粹灭而产生的离子。其它条件的结果和实验详细情况被列在表2和表2的说明中。
图6显示了两张表明乙酰基赖氨酸侧链进入Sir2Af118活性位点空穴的图。左图和右图分别是肽骨架和空间填充模型。位于382位残基的N-乙酰基赖氨酸的乙酰基氧原子和NAD+的C1′通过范德华作用而接触。该乙酰基部分能处于适合起化学反应的几何结构以形成具有α立体化学的酰基-O-C1′键。含有N-乙酰化赖氨酸382的p53 C末端肽仅是一个示意模型。
图7显示对SIR2建议的两种可选的去乙酰化机制：(A)通过乙酰基赖氨酸残基的酰胺羰基的2′-OH亲核进攻引发的去乙酰化机制。机制A是不可能的，因为His到Ala的突变将消除烟酰胺交换，连接3′-OH的His116作为碱催化剂通过质子转移依赖机制经3′-OH而激活2′-OH。(B)依赖于通过2′-OH进攻的1′-O-酰胺化物的分解，其在烟酰胺键断裂后，机制B允许烟酰胺在激活2′-OH前交换，与His到Ala突变的所报道的交换一致。
图8显示在说明书中讨论的不同的反应方案。
方案1A.CD38催化β-1′-AADPR的合成。
方案1B.观察到的2′-取代和3′-取代的α和βAADPRs的平衡和在15℃下处于相对平衡的群体。
方案1C.在Sir2p催化的去乙酰化中从NAD+开始的反应顺序。
方案1D.ADP-核糖基化依赖的去乙酰化产生α-1′-AADPR，其能重排成2′-AADPR。
方案1E.ADP-核糖基化依赖的Sir2p催化的去乙酰化机制产生2′-AADPR、3′-AADPR和13O标记的产物。
图9显示2′/3′-O-AADPR的NMR谱图。
图10显示2′/3′-O-AADPR的结构。
图11显示NAD+和AADPR的分离以通过温育Sir2和NAD+及JB12肽不同时间测量Sir2的活性。最短的温育时间是30分钟。
图12是一副显示Sir2介导的AADPR生成与时间的关系图，通过柱分离AADPR和放射性试验被测量。
图13是一副显示在DEAE分离的肝抽提物(no I)中对硝基苯基乙酸酯所测定的酯酶活性，与在存在毫摩尔(mM)浓度的类AADPR的Sir2抑制剂化合物(I)下用对硝基苯基所测定的酯酶活性的比较。
发明详述
本文中所用的“AADPR”指乙酰基腺苷二磷酸核糖。1′-，2′，和3′-AADPR分别表示AADPR的1′-O，2′-O和3′-O区位异构体。“2′/3′-AADPR”或“2′/3′-O-AADPR”指2′-AADPR和3′-AADPR的混合物(图10)。“ADPR”指腺苷二磷酸核糖。
本文中所用的“Sir2”指沉默信息调节子2，或为本领域技术人员所熟悉的其任何现在已知或将被发现的直向同源物(orthologs)或平行同源物(paralogs)。
本文中所用的“HPLC”指高效液相色谱；“NMR”指核磁共振，和“MS”指质谱法或质谱仪。
本文中所用的“转染”指插入DNA到细胞中使得该DNA编码的基因能被该细胞表达，该DNA可以在此细胞中暂时表达或稳定表达。
本文中所用的“肽”是有至少两个氨基酸的序列。肽可以由短氨基酸序列和长氨基酸序列组成，包括蛋白质。
本文中所用的“NAD+”指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
本发明是基于以下两项发现。第一项发现是用乙酰化的肽和NAD+与Sir2反应的产物是2′-O-乙酰基ADP核糖。该2′乙酰基团能转移到3′羟基直到在2′和3′结构之间的平衡形成。因此，Sir2反应最终导致产生2′/3′-O-乙酰基ADP核糖(“2′/3′-AADPR”图10)。这与先前所相信的该反应的产物是β-1′-AADPR正相反。该2′/3′-AADPR在先前没有被描述。因为Sir2利用了重要的代谢物NAD+来产生2′/3′-AADPR，且因为该产物2′/3′-AADPR是代谢不稳定的，所以本领域技术人员可理解该产物可用作信号通路的启动剂。此2′/3′-AADPR产物也可用于测试Sir2酶的抑制剂，和在组合物中用于测定及定量Sir2的活性，并用于抑制Sir2酶。2′/3′-AADPR的这些用途进一步描述如下。
本发明的第二项发现是Sir2酶对除了组蛋白外的其它肽去乙酰化。这样的肽的例子是乙酰化的p53和它的片段。基于在实施例中所描述的实验结果，本领域技术人员可期望Sir2酶去乙酰化任何具有至少两个氨基酸的乙酰化的肽，其中至少一个氨基酸包含在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。该发现将使得本领域技术人员相信Sir2酶在调节转录中具有更广泛的作用，这超出先前所意识到的作用，因为现在明白Sir2酶能对任何乙酰化的蛋白去乙酰化。
因此，本发明涉及纯化的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖制品。本文中所用的“纯化的”指在组合物中占有比在天然中所发现的还大的比例。优选地，纯化的制品是具有至少50％是2′/3′-AADPR的溶质(除了盐)的含水的组合物。更优选地，纯化的制品至少75％是2′/3′-AADPR。在甚至更优选的具体实施方式中，纯化的制品至少90％是2′/3′-AADPR。制品的纯度可通过任何本领域已知的方法被测定。优选的测定2′/3′-AADPR纯度的方法是通过HPLC，如，通过如下实施例中所述的方法。
在活细胞中或细胞的或组织的抽提物中，2′/3′-AADPR通常是短寿的，除非内源性酯酶的活性被抑制。2′/3′-AADPR短寿的特性能通过使用将能被酯酶作用的酯氧原子进行公知取代的设计而能增加对酯酶活性稳定性的2′-AADPR或3′-AADPR的类似物而被克服。在2′-AADPR和3′-AADPR中对酯酶不稳定的氧原子可被认为是连接核糖和乙酸酯基团的酯氧原子，以及位于两个磷原子之间的酯氧原子。在本领域中周知用CF2、NH或S取代这些酯氧原子的任一或两者将被期望能提供显著更稳定的2′-AADPR或3′-AADPR类似物，因为其对酯酶作用的抗性增加。
因此，在一些具体实施方式中，本发明涉及在细胞中显示增加的稳定性的2′-O-乙酰基ADP核糖或3′-O-乙酰基ADP核糖类似物。优选的类似物包含CF2、NH或S取代乙酰基酯氧原子或位于两个磷原子之间的氧原子。最优选的取代基是CF2。尤其优选取代乙酰基酯氧原子。在另一个优选的具体实施方式中，酯氧原子和位于两个磷原子之间的氧原子都独立地被CF2、NH或S取代。
2′/3′-O-乙酰基ADP核糖产物能通过本领域许多的化学或酶方法中的任一方法被制备。优选地，使用Sir2酶制备2′/3′-O-乙酰基ADP核糖，即在反应混合物中在一定反应条件下用NAD+和Sir2酶的乙酰化肽底物和Sir2酶混合一段时间，其中所述反应条件和时间足以使该肽去乙酰化。从反应混合物中2′/3′-O-乙酰基ADP核糖能被鉴定并纯化。优选地，通过色谱分离如通过HPLC来纯化2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。在一些具体实施方式中，2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的分离和/或定量能通过使用放射性标记的NAD+从而使得在肽被去乙酰化后2′/3′-O-乙酰基ADP核糖被放射性标记而简化。见，如作为那些方法的非限制性实施例的实施例2。任选地，本领域技术人员将明白放射性乙酸酯标记的乙酰化的肽也可标记2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。该标记的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖可用更简单的分离方法分离，其中该标记的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖仅需从放射性标记的NAD+或乙酰化的肽底物中被分离，如用Sephadex-DEAE柱(见，如实施例2和图11)。一旦从放射性标记的底物中被分离，放射性标记的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖能容易地被定量，如通过闪烁技术，其对于如下所述的定量Sir2或测定抑制剂活性的方法是有用的，。
如前所讨论的，相信任何有至少两个氨基酸的乙酰化的肽能有效地作为Sir2的底物，前提是至少一个氨基酸是在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。该乙酰化的肽能包含任何数目的氨基酸，包括3、5、10、15、18或更多的氨基酸残基。众所周知，没有某一特定序列是优选的，虽然大多数的去乙酰化产生在碱性氨基酸对中。见，如参考文献10和
实施例1。
在优选的具体实施方式中，乙酰化的肽底物与p53的调节域的乙酰化区是同源的，例如在实施例中所述的JB11肽或JB12肽。乙酰化的p53也是Sir2的有效底物。
在另一具体实施方式中，乙酰化的肽底物与组蛋白的乙酰化区是同源的，或是乙酰化的组蛋白自身。
除了Sir2Af1外(见实施例)的任何Sir2酶期望具有所述的酶反应。众所周知的可催化所述的反应的Sir2酶包括，尤其是，Sir2Af2、人Sir2A、酵母Sir2p、来自于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的Sir2Tm和来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的cobB。有用的酶包括那些源自包括古细菌和真细菌的原核生物的酶，和源自那些包括酵母和人的原核生物的酶。
本文中所用的术语“源自”，当涉及Sir2酶时，指(a)抽提自天然产生该酶的生物体，或(b)在体外或在体内翻译来自生物体的编码Sir2酶的基因。包括转染进不同的生物体中的基因，如来自人的Sir2基因，翻译自转染进大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或完整的哺乳动物中的人Sir2基因。
在另外的具体实施方式中，本发明涉及用于测定一种测试化合物是否是Sir2酶的抑制剂的方法。该方法包含如下步骤：
在一定反应条件下在反应混合物中混合Sir2酶、NAD+和Sir2酶的乙酰化肽底物以及该测试化合物一段时间，其中所述反应条件和时间使得在不存在该测试化合物的条件下可以去乙酰化该肽；
定量产生自乙酰化的肽的2′/3′O-乙酰基ADP核糖；接着
比较生成的2′/3′O-乙酰基ADP核糖的量和在相同的反应条件下但不存在该测试化合物时生成的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的量。在这些方法中，存在该测试化合物时比不存在该测试化合物时产生更少的2′-O-乙酰基ADP核糖和/或3′-O-乙酰基ADP核糖表明该测试化合物是Sir2酶的抑制剂。
这些方法用于评估通常产生2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的Sir2酶的潜在抑制剂。用于这些反应的肽包括任何前述的Sir2的肽底物。如前所讨论的，使用放射性标记的Sir2底物能使这些方法简单化。
在相关的具体实施方式中，本发明涉及抑制Sir2酶的方法。该方法包含用通过前述的方法发现的抑制剂与Sir2酶混合。在这些方法中，通常产生2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的任何Sir2酶是有效的作用对象，被抑制的Sir2酶可能位于活细胞中，其中该抑制剂通过基于该抑制剂的化学特性而用本领域公知的许多方法中的任一方法插入到细胞中。例如，该活细胞可以是细菌细胞或真核生物细胞，如酵母或包括人细胞的哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是活的哺乳动物中的细胞。在一些有用的具体实施方式中，哺乳动物具有患通过缺少p53-DNA结合诱导的癌症的风险或患有该癌症。在那些具体实施方式中，Sir2抑制剂将被期望能阻止Sir2乙酰化p53，因而增加了p53 DNA的结合。
本发明也涉及在组合物中检测Sir2活性的方法。该方法包含如下步骤：
在一定反应条件下混合NAD+和Sir2酶的乙酰化肽底物以及该组合物一段时间，其中所述反应条件和时间使得在存在Sir2活性的条件下可以去乙酰化该肽；接着
测量2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。在这些具体实施方式中，存在2′/3′-O-乙酰基ADP核糖表明在该组合物中存在Sir2活性。这些方法能被用于任何乙酰化的肽底物，包括前述的放射性标记的底物。
本发明另外的具体实施方式涉及对乙酰化的肽去乙酰化的方法。该方法包含混合Sir2酶和该肽。在这些具体实施方式的新内容中，该乙酰化的肽不是组蛋白。结合如前所述的方法，任何能产生2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的Sir2酶可有效地用于这些方法；这些方法也将被期望能有效地去乙酰化由至少两个氨基酸组成的任何的乙酰化的肽，其中至少一个氨基酸包含一个在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。
本发明也涉及抑制乙酰化的肽的去乙酰化的方法。该方法包含用通过前述的方法测定的Sir2抑制剂与乙酰化的肽混合。这些方法能有效地抑制任何乙酰化的肽在体内或体外的去乙酰化。例如，该乙酰化的肽可以在活细胞中，如哺乳动物细胞，其可以是在活的哺乳动物中的细胞，例如人类。一个有用的具体实施方式是在具有患通过缺少P53-DNA结合诱导的癌症的风险的或患有该癌症的哺乳动物中抑制p53的去乙酰化。
众所周知，酶反应的产物通常是该酶的抑制剂。这也适用于Sir2，即烟酰胺抑制该酶。我们也已经证明ADPR是AfSir2的一个有效抑制剂(见实施例1)。因而，也将期望2′/3′-O-乙酰基ADP核糖可抑制Sir2。因此，本发明涉及抑制Sir2介导的对乙酰化的肽去乙酰化的方法。该方法包含用2′/3′-O-乙酰基ADP核糖或任何前述的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖类似物和乙酰化的肽混合。优选的适用于该方法的肽包括组蛋白和p53。虽然这些方法在体外有用，在优选的具体实施方式中该乙酰化的肽位于活细胞中。该活细胞可以是原核生物细胞或，优选地，真核生物细胞。该真核生物细胞可以是哺乳动物细胞，可选地位于活的哺乳动物中，如人。有效地，该哺乳动物具有患通过缺少P53-DNA结合诱导的癌症的风险或患有该癌症。
另外，本发明涉及2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的前体药物。该前体药物包含通过酯酶敏感的键共价结合到另一部分上的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。在这些具体实施方式中，该前体药物能比2′/3′-O-乙酰基ADP核糖更易进入细胞。已知制造该前体药物的许多方法。一个例子是使用水杨酸作为另一部分的方法，如使用Khamnei和Torrence所描述的方法47。
在如下的实施例中描述了本发明的优选的具体实施方式。考虑到在本文中所披露的本发明的说明和本发明的实施，在本文的权利要求的保护范围中的其它具体实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。说明书和实施例被认为仅是作为例证的，通过附在实施例后的权利要求表明了本发明的保护范围和精神。
        实施例1.涉及Sir2的产物、机制和底物的研究
方法
酶的纯化和分析除了Sir2Af1和Af2以天然酶形式被纯化外，其它Sir2酶以GST融合蛋白形式被纯化19，用所述的方法对酶对[3H]-乙酰化的小鸡组蛋白活性进行分析19。用约翰霍普金斯医学研究所测序和合成设备(Johns Hopkins Medical Institutions Sequencing andSynthesis Facility)合成肽并在使用前通过HPLC上的RP-18柱进行纯化。用于去乙酰化的JB11和JB12肽被分析如下。肽JB12D(去乙酰基型)被作为标准并与JB12产物峰在HPLC上共迁移。对于JB11和JB12肽，100μg的肽与10μg的GST-Sir2p和200mM的NAD在30℃下在50mMTris-Cl pH8.0，50mM NaCl中温育过夜。反应产物在Star色谱工作站(Star chromatography workstation)上用C-18分析柱和0-100％梯度的乙腈分离，流速为0.4ml/min；检测210nm处吸收值。除了Af2Sir2和TmSir2的温育在55℃下和GST-Sir2A的温育在37℃下进行外，同样的反应条件也应用于Af2Sir2、TmSir2和GST-Sir2A。经HPLC分离后所收集的HPLC组分(500μl)在Applied Biosystems Voyager DE-STR设备上用基质辅助激光解吸电离飞行时间光谱法(MALDI-TOFspectrometry)进行分析。
GST-p300的纯化和与p53的反应从Shelley Berger赠送的pGEx-2T-p300质粒29中纯化GST-p300。含有表达载体的细菌细胞用300μM OD600＝0.6的IPTG诱导并在30℃下培养6小时。细胞被收集并根据厂商说明书的指导使用谷胱甘肽-琼脂糖4B(glutathione-Sepharose4B)珠(Amersham-Pharmacia)纯化蛋白。
用含有p53 cDNA的表达质粒pRB16转化的酵母菌种YPH500制备乙酰基-p53并制备细胞抽提物1，12。含有4.6mg蛋白的抽提物用12μg结合于琼脂糖的抗p53抗体DO-1(Santa Cruz Biotechnology)在4℃下温育1小时。清洗该珠并用5μg的GST-CBP和37.5ml的[3H]-乙酰基-CoA(3.7Ci/mmol，67μM，Amersham-Pharmacia)在HAT缓冲液(50mMTris-Cl pH 8.0，10％甘油，0.1mM EDTA，1mM DDT，50mM NaCl和4mM丁酸钠)中在30℃下温育1小时。乙酰化反应后，清洗珠并分置于四个试管中，每一试管含有10μl，并与5μg的GST-Sir2A(37℃)、GST-Sir2(30℃)和Af2Sir2(55℃)，200μM NAD，50mM Tris-Cl pH 8.0和50mM NaCl在终体积为30μl的溶液中温育3小时。对照反应在不存在酶及37℃条件下进行。去乙酰化反应后，清洗珠，并通过添加SDS样品缓冲液及煮沸释放蛋白。样品在10％SDS-PAGE上被分离。在电泳结束后，样品转移到PVDF膜上并根据厂商说明书的指导用06-758抗体(Upstate Biotechnology)或DO-1进行免疫印迹。
分析方法试剂和缓冲液购自代理商。NAD和其产物的HPLC分离物流经装有Waters 2487双波长UV/Vis检测器或Waters 996 PDA多波长检测器的Waters 600泵/控制器。除非另有指定，HPLC色谱图在260nm吸收值处被记录。用具有温度控制的可编程的Waters 717自动取样器进行经HPLC的动力学研究。1H NMR研究在具有计算机化温度控制的300MHz或600MHz的Bruker波谱仪上进行。MS和MS/MS实验使用连接有Micro Tech的毛细管C-18柱的Perseptive Mariner ESI-TOF或Finnigan LCQ设备来进行。
合成β-1′-AADPR如报道的，CD38被表达并纯化43。100mgNAD+溶解在5mL 4M NaOAc pH 6.5中。向该溶液中加入溶解于50mM pH 5.0NaOAc中的50μg CD38酶。在37℃下温育过夜后，该原料被过滤(Millipore Biomax 10K NMWL离心过滤设备)，注射到尺寸为19mm×300mm的Waters C-18制备柱上，并用0.5％TFA在流速为4mL/min的条件下洗脱。在NAD+前的一个洗脱峰(分别是40min对50min)被收集并冻干。此产物(产率-28％)通过用MS和NMR进行鉴定并被确定为β-1′-AADPR。数据：1H NMR D2O d(8.61，s，1H)，(8.38，s，1H)，(6.14，d，1H)，(5.86s，1H)，(4.5，m，1H)，(4.35，m，1H)，(4.18-4.00，m，6H)，(2.02，s，3H)。MS(阴离子)600amu。MS/MS(600)：540，352和333amu。
3′-AADPR的纯化和NMR鉴定进行NMR分析的Sir2Af2产物通过在5mL 40mM pH 6.25磷酸钾缓冲液中温育(40℃过夜)300μg Sir2Af2酶、20mg NAD+和70mg JB12肽而被获得。该反应通过截留分子量10,000的膜(Millipore Biomax 10K NMWL离心过滤设备)的过滤而被粹灭。滤出液的组分(1mL)加入到用25mM pH6.0 NaOAc预平衡的DEAE A-50柱(1mL)上。用2mL的25mM pH 6.0 NaOAc、3mL 100mM pH6.0 NaOAc和2mL 1M pH 6.0 NaOAc对产物进行分级洗脱。如MS和HPLC所示，最后三个1mL组分含有60％-100％的乙酰基O-ADP核糖。使用半制备C-18柱用1mM磷酸钾(pH 5.0)在2mL/min的流速下(5mL注射体积)洗脱实现了2′-AADPR和3′-AADPR的分离。最大峰(3′-AADPR)在14min时被洗脱出并在2℃下在少于30min的时间内在高真空条件下旋转蒸发干燥。该物质的HPLC色谱图(用尺寸为7.8mm×300mm的半制备C-18柱、50mM醋酸铵洗脱液)表明其为95％纯。该物质保持于冰冷的D2O中，且进行1H NMR测定，其中探针温度为0-25℃。进行1D和2D COESY和NOESY实验可对3′-AADPR提供明确地测定，并观察到了该物质时间依赖性地转化为2′异构体。3′-AADPR 1H NMR，D2O，δ(8.52，s，1H)，(8.22，s，1H)，(6.09，d，1H)，(5.32，d，1Hβ异构体)(5.17，d，1Hα异构体)，(5.02，m，1H)，(4.7，m，1H)，(4.45，m，1H)，(4.32，m，1H)，(4.23，m，1H)，(4.14，m，2H)，(4.126，m，1H)，(3.95，m，2H)，(2.05，s，3H).NOEs(2.05，5.02)，COESY交叉峰(5.02，4.23)，(5.32，4.23)，(5.17，4.23)。MS(阴离子型)：600，540和346amu。
2′-AADPR的纯化和NMR鉴定  2′-AADPR异构体洗脱自上述的HPLC色谱图中的第二个峰。HPLC(50mM pH 5.0醋酸铵)表明2′-AADPR容易转化为3′-AADPR。通过使3′-AADPR和2′-AADPR达到平衡，在通过积分HPLC的峰面积所测定的47∶67比率(2′-AADPR∶3′-AADPR)的条件下，来表征2′-AADPR。COESY和NOESY交叉峰和1H NMR数据允许全面地表征：2′-AADPR。1H NMR，D2O，δ(8.52，s，1H)，(8.22，s，1H)，(6.09，d，1H)，(5.39，d，1Hβ异构体)(5.20，s，1Hα异构体)，(4.87，m，1H)，(4.7，m，1H)，(4.45，m，1H)，(4.32，m，1H)，(4.23，m，1H)，(4.14，m，2H)，(4.126，m，1H)，(3.95，m，2H)，(2.12，d，3H)。NOEs(2.12，4.87)，COESY交叉峰(4.02，4.87)，(5.39，4.87)，(5.20，4.87)。MS(阴离子型)：600，540，346。
2′和3′-AADPR的相互转变的速率2′和3′-AADPR样品都在15℃下温育并通过HPLC以40min间隔(C-18柱；50mM pH 5.0醋酸铵)被分析。在给定的时间处，3′异构体的百分比用方程式3′-AADPR(％)＝Pa exp(-kt)+Pf表达，其中Pa+Pf＝Po，；其中Pa是3′异构体在时间＝0超过平衡的百分比，t是时间和k是转化的一阶速率常数。Pf是在平衡时的百分比和Po是起始时的百分比。HPLC和NMR分析确定了2′和3′-异构体浓度是时间的函数。NMR是在0℃下在10％d4-甲醇/90％D2O中或在20℃下在100％D2O中测定的。
Sir2Af2的低温研究以鉴定产物生成的顺序在8℃下进行Sir2Af2催化的去乙酰化反应以测定产物形成的顺序。在40mM pH 6.2磷酸钾中含有150μM NAD+、300μM JB12肽的200μL溶液被冷却到8℃并接着加入1μL的9μg/μL Sir2Af2以起始该反应。反应用以0.5％TFA作为洗脱液的HPLC进行分析。在17和20min的峰被用于以30分钟的间隔对3′-和2′-AADPR进行定量。
Sir2p反应产物的低温1H NMR分析1.7mg Sir2Af2酶在95％D2O，50mM pH 6.3磷酸钾中的溶液用离心过滤浓缩到550μL。在600MHz NMR波谱仪中，该样品与2mg JB12肽混合并冷却至5℃。获得波谱且280μL在99％D2O中在50mM pH 6.3磷酸钾中冰冷的22mM NAD+溶液被加入以起始该反应。在5℃的条件下，在间隔超过18小时后获得了1H NMR 1D波谱。
排除β-1′-AADPR作为Sir2p的产物真正的β-1′-AADPR(100μM，在40mM pH 6.25的磷酸盐缓冲液中)在55℃下温育1小时，并用HPLC分析2′-或3′-AADPR异构体的产生。与对照作比较，色谱图的结果表明β-1′-AADPR没有变化且没有产生2′-或3′-AADPR。
H2 18O掺入2′-和3′-AADPR在200μL H2 18O(94.5％，含有40mM pH7.0的磷酸钾缓冲液)中含有2μg Sir2Af2，和100μg JB12肽和300mMNAD+的反应物在55℃下温育并通过注射到用0.5％甲酸作为洗脱液的LCMS阴离子型的C-18毛细管柱上进行分析。肽、NAD+、ADPR和AADPR被很好地分辨出。18O温育物与16O对照的MS表明由于单个18O的掺入，对于AADPR有2amu质量的增加(602比600)。由于失去了HOOCCH3，16O和18O样品的MS/MS是相同的并被鉴定具有在m/z＝540被观察到的主要片段，并证实了18O掺入乙酸酯基团中。从18O反应物中纯化2′-和3′-AADPR证实了两者都掺入了一个单独的18O。
酸催化的 18O交换反应用2倍体积在10％d4-乙酸中的H2 16O或H2 18O粹灭含有H2 16O或H2 18O(如上)的Sir2反应物。通过LCMS(如上)和MS/MS(分子质量和片段)分析给出：(16O，Sir2Af2反应，18O，H+)M-＝602，片段＝542；(18O，Sir2p反应18O，H+)M-＝604，片段＝542，540；(18O，Sir2p反应，16O，H+)M-＝602，片段＝540；(16O，Sir2p反应，16O，H+)M-＝600，片段＝540。ADPR样品温育于粹灭介质中作为对照，得到的结果如下：(16O，H+)M-＝558；(16O，pH 7.5)M-＝558；(18O，H+)M-＝560；(18O，pH 7.5)M-＝558。在酵母的Sir2p中也获得了类似的结果。
Ara-F-NAD + 作为NAD + 的类似物Ara-F NAD+是ADP核糖基转移酶的抑制剂并被用来评估Sir2Af2。如前所报道的，Ara-F NAD+被合成44。在存在ara-F-NAD+(50μM)的条件下通过Sir2Af2(10μg)对JB12肽(300μM)的去乙酰化在200μL的40mM pH6.25的磷酸钾中被测试。通过C-18反相HPLC检测，ara-F-NAD+没有改变。ara-F-NAD+与5mM[羰基-14C]-烟酰胺(55mCi/mmol；American radiolabeled chemicals)在存在300μM肽和10μSir2Af2(20μL)的条件下温育，接着通过HPLC分析证明没有放射性活性掺入ara-F-NAD+中。用JB 12-[羰基-14C]-肽和NAD+的对照反应证实了[羰基-14C]-烟酰胺交换入NAD+，确认了Sir2碱基交换反应。使用ADP核糖基转移酶CD38作为交换酶的第二个对照反应，证实了在[14C]烟酰胺和ara-F-NAD+之间完全的碱基交换。通过在存在pH 6.25的磷酸钾缓冲液中的300μM JB12肽的条件下温育Sir2Af2酶(7μM)和ara-F-NAD+(20μM)评估ara-F-NAD+对Sir2Af2的抑制。缺少ara-F NAD+的反应混合物作为对照。正对照用同样的反应成分但在存在5μM ara-F-NAD+的条件下有500nM CD38。通过添加150μM NAD+反应在6小时后开始。使用HPLC来评估反应的催化反应率。在这些反应条件下，Sir2Af2的催化反应率不被ara-F-NAD+抑制。
结果
乙酰基p53和片段是Sir2去乙酰化酶的底物在酵母和其它生物体中，组蛋白被认为是Sir2蛋白的主要底物。然而，许多蛋白在赖氨酸的∈-氨基基团被乙酰化24，一个得到很好鉴定的实例是p53，在赖氨酸373和382处被乙酰化。合成对应与p53乙酰化位点片段的18肽，其与Sir2酶温育。除了Sir2Af1外所有被测试的酶，包括Sir2Af2，人Sir2A和酵母Sir2，对在残基373(JB 11)和382(JB 12)被乙酰化的这些肽去乙酰化(图1A；表1)。进一步实验证明了JB 12在作为Sir2Af2底物方面比JB 11好大于4倍(图1B，1F)。对于组蛋白和组蛋白衍生的肽的去乙酰化，p53肽去乙酰化绝对依赖于NAD+。通过经HPLC的C-18柱(图1B，E-G)分离底物和产物并用MS测定底物和产物峰的质量(图1C，D，F插入图)，直接证实了去乙酰化作用。
Sir2Af2和其它的类Sir2酶也被测试对全长天然乙酰化的p53的活性。天然乙酰化的p53通过在体外用p300乙酰化免疫沉淀的p53获得。免疫沉淀反应使用抗p53 N-末端的单克隆抗体DO-1。其沉淀乙酰化的和非乙酰化的p53。乙酰化的p53在存在和不存在Sir2酶的条件下温育(图1H)。蛋白在SDS-PAGE凝胶上分离并用对在373和382位点乙酰化的p53特异的抗体进行免疫印迹，同样可用FL-393，即一种结合所有类型的p53的抗体进行免疫印迹。所有被测试的三种Sir2p酶都对p53能去乙酰化(图1H)。
表1.不同的Sir2酶对组蛋白和p53底物的活性
酶 生物体  底物和产物
Sir2pSir2Af1Sir2Af2Sir2TmcobBSir2A 啤酒糖酵母(Saccharomyescerevisiae)闪烁古生球菌闪烁古生球菌海栖热袍菌鼠伤寒沙门氏菌现代人(Homo sapiens)     [3H]-组蛋白+-++++ p53(天然)+-+NTNT+     JB 11+NTb++++    JB 12+-++NTNT  分析的NAD+产物a+NT++++
aAADPR和烟酰胺产物通过HPLC/MS被观察到
bNT，没有测试
几个类Sir-2去乙酰化酶的活性和反应产物是保守的测试的Sir2酶(酵母Sir2p，Sir2Af1和2，Sir2Tm，cobB和人Sir2A)的p53去乙酰化酶活性是系统上保守的。这些酶分为两类：(1)主要一类的蛋白作用于所有被测试的生理底物(完整组蛋白，天然的p53，JB 11和JB 12肽)，和(2)除此之外的Sir2Af1，被报道能作用于用化学方法乙酰化的p5318，但无法作用于所有在此被测试的底物。
通过HPLC观察到的反应产物包括在反应中通过来自古细菌的Sir2Af，人Sir2A，酵母Sir2p和真细菌的cobB和Sir2Tm蛋白的纯化的酶催化得到的烟酰胺，ADP核糖和AADPR。在所有例子中形成了AADPR，同样也形成了不同数量的ADP核糖。
β-1′-AADPR的化学合成Sir2反应的AADPR产物预期具有β-1′-AADPR的质量，但是也同样预期是2′-AADPR和3′-AADP15，16的质量。我们通过对先前所报道的方法进行改变真正地合成了β-1′-AADPR25。当在饱和的(4M)pH 6.5的乙酸钠中用毫摩尔浓度的NAD+温育时，保留有糖水解酶(glycohydrolase)活性的CD38形成毫克量的β-1′-AADPR异构体(见图8合成和结构的方案1A)。标准的β-1′-AADPR与Sir2p产生的AADPR的HPLC比较(见图2的NMR)证明了这两个化合物是不同的(保留时间分别是28和32min)。在Sir2p产生的AADPR和β-1′-AADPR之间的化学性质的差异通过MS/MS研究被证实了，虽然它们的质量是同样的，但是显示了Sir2p产物的断裂模式与β-1′-AADPR的不同(图3)。
来自Sir2p反应的2′-和3′-AADPR的鉴定Sir2p反应产物在含有100mg JB 12肽，30mg NAD+和300μg酶的反应中产生并通过阴离子交换和HPLC色谱法纯化。在1H NMR分析前，溶解于750μl体积冰冷的D2O中的样品被测定是大约95％纯。
虽然乙酸酯部分是存在的，但是基于甲基共振峰在2.1ppm(图2，上图和下图)，Sir2p产物的1H NMR(图2，中图)是不同于β-1′-AADPR的。当被冷藏过夜后，重新分析该样品，其1H NMR波谱改变了。次要峰(图2，中图)变得更完全地扩展了(图2，下图)；随后的波谱证实已经确立了峰的稳定比率。HPLC分析在260nm处产生两个峰。MS和MS/MS分析证实了两个分子离子都有预计的600(m/z，负模式)的AADPR的质量和两者都有同样的断裂模式(MS/MS)，强烈支持了产物是AADPR的2′-和3′-区位异构体(见方法部分)。
鉴定2′-和3′-AADPR异构体在0℃下在10％d4-甲醇，90％D2O中对刚纯化的AADPR进行2D NMR实验(COESY和NOESY)的基础上，我们鉴定出两种异构体是2′-和3′-AADPR。这些波谱清楚地阐明了，基于一组完整的COESY交叉峰和在乙酰基甲基基团及H3′的峰之间的NOE，首先被HPLC分离的异构体是3′-异构体。3′-到2′-异构体转化达到一个67∶47的平衡，并且在含有2′-和3′-异构体两者的样品中2′-异构体被鉴定。用一组完整的COESY交叉峰和在乙酰基甲基基团及H2′的峰之间的NOE来进行2′-异构体的鉴定(图9)。
NMR和HPLC方法证明了分别在15℃和20℃下3′-到2′-异构体的相互转化可提供一种处于平衡状态的混合物。两种方法的堆积图(图4)拟合成一种指数式衰减曲线且可以测定乙酰基转移的一阶速率常数k3′→2为0.32h-1(图4，上图)。基于对2′-和3′-异构体的HPLC峰的积分，发现在15℃时平衡常数K是1.4。k3′→2′的计算值因此是0.45h-1。乙酰基转移的完全平衡和动力学描述包括端基异构体形式显示于图8的方案1B中。
2′-和3′-AADPR异构体的产生顺序通过Sir2p生成AADPR区位异构体的顺序被5℃下的1H NMR实验证实了(见方法)。堆积波谱(图5)揭示了在反应早期2′-异构体形成，接着生成3′异构体。分别来自区位异构体的C1′-Hα和β型的每一个峰被很好地分辨出，该结果证实了AADPR生成的动力学顺序是2′先于3′(图8的方案1C)。在5℃下Sir2p的催化速率超过了相互转化速率常数，kcat/k2′→3′的比率为20。
H2 18O掺入到产物中对Sir2p反应的化学计量(图8的方案1C)表明了两个新的氧原子掺入到AADPR中。曾经假设一或更多的这些氧原子来自水14，16，18。Sir2p去乙酰化反应可被视为一种产生氨基赖氨酸和乙酸酯的水解反应，其与ADP核糖基的转移反应(其中ADPR被转移到乙酸酯)相偶联。
在18O水中的反应，接着通过MS分析AADPR的产物表明产物的质量增加了2amu，这与掺入一个来自水的单独的18O到AADPR的结果一致。18O的丰度(65％)与最初18O在水分析中得到的含量是一致的(图5，插入图)。稀释样品于2倍体积的pH 7.5的16O水中或10％d4-乙酸中，接着通过MS分析(时间范围为30分钟到24小时)表明18O的含量没有改变(表2)。因此18O掺入位点在2′-AADPR和3′-AADPR分子中是一个非交换的氧原子。
18O原子可位于2′-和3′-AADPR分子的乙酸部分或位于产物的1′-OH部分。在室温下在10％d4-乙酸中的18O中温育未标记的ADPR和2′-和3′-AADPR 3小时后质量增加了2amu，这与一个单独的18O掺入到该分子中的结果是一致的，但在中性条件下没有观察到任何在质量上的此种变化。只有1′-OH与此种交换的结果一致。产生自含有18O的Sir2p反应的2′-和3′-AADPR当与10％d4-乙酸和18O水温育时掺入第二个18O到AADPR分子中(质量＝604)，这与1′-OH的同位素交换结果一致，且证实了存在自由羟基(图5，插入图)。
交换实验联合MS/MS的研究加强了化学方面的解释(表2)。2′-和3′-AADPR在18O水中的酸催化的交换反应产生了542amu的碎片，这与一个单独的18O掺入到核糖部分的结果一致。Sir2p在16O或18O水中进行的反应导致由于乙酸的丢失而产生的540amu的碎片。因此，获得自溶剂的非交换18O原子被掺入到2′-和3′-乙酸酯的羰基氧原子中。
表2.质谱：在存在18O和16O的水中观察到的种类
反应条件     粹灭条件     分子种类(m/z)     碎片(主要种类)
16O18O16O18O18OADPRADPR      NQNQ18O，H+ 18O，H+ 16O，H+ 18O，pH 7.518O，H+     600602602604602558560     540，346540，346542，346542，346540，346346346
前面五个实体的反应条件反映了SirAf2介导的去乙酰化是在pH 7.8，50mM磷酸钾中于55℃下进行30分钟，表明了同位素丰度在反应的水中具有的含量(最小65％)。反应随后通过在MS和MS/MS模式中的LCMS来分析。分子种类反映了观察到的在7分钟时(AADPR在LC中的保留时间)被鉴定的主要离子。碎片基于主要分子离子选择产生的MS/MS谱。未被粹灭的(NQ)反映注射了另外的未处理的反应混合物。在使用粹灭的例子中，在最初55℃的温育和在室温下反应3小时后，2倍体积95％H2 18O或含有10％d4-乙酸的未标记的水被加入到反应混合物中。样品随后通过LCMS和MS/MS被分析.底下的两个例子反映了在室温下温育3小时后ADPR在50mM pH 7.5磷酸钾中或在含有10％d4-乙酸的95％H2 18O的特性。
抑制剂ara-F-NAD + 底物反应、交换和抑制Ata-F-NAD+对于许多ADP核糖基转移酶是一种有效的抑制剂26，因为氟取代了在2′位的OH使ara-F-NAD+比NAD+大概更稳定50倍26，并因此可化学捕集酶-ADP-核糖共价中间体27。Ara-F-NAD+在去乙酰化反应或交换反应中并不作为一种底物。对照能很容易地将放射性标记的烟酰胺(5mM)交换入ara-F-NAD+中，在这些条件下Sir2p交换烟酰胺进入50μM NAD+中。Ara-F-NAD+在存在或不存在肽的条件下无法失活Sir2p，尽管其对使用CD38的对照具有活性。因此，在Sir2p反应中ara-F-NAD+是惰性的。
讨论
于此我们证明了乙酰化的人p53肿瘤抑制剂和其衍生的肽在体外对于不同的Sir2p酶是十分有效的底物。因为乙酰化在激活有效的序列特异性DNA结合中是必需的，预计去乙酰化作用能减少细胞中的p53活性。在前研究已经表明了在p53和Rpd3去乙酰化酶家族之间的复杂关系。p53在某些位点作为一种阻遏物，且Rpd3组蛋白去乙酰化酶相关因子，即Sin3p，介导该阻遏37。自相矛盾地，有一个研究暗示p53自身能作为Rpd3去乙酰化酶家族的底物，至少当其过表达时38。通过Sir2p的p53去乙酰化可使其活性间接地通过细胞新陈代谢作用或氧化还原状态来调节。可以理解，特别是在氧化应激反应后，什么是与DNA的损伤有关的。然而，我们的研究没有证实Sir2蛋白对p53有任何的特异性。那些能有效地对组蛋白去乙酰化的酶也能对p53同样好地作用-即使它们来自古细菌。其它实验室近来的工作也证明了乙酰化的牛血清白蛋白(BSA)，即一种非生理性底物，是Sir2af1的底物18。因此，如果Sir2p在调节p53活性中扮演着调节物角色，应该存在未鉴定的因子或反应条件使得该NAD+-调节的去乙酰化反应具有特异性。
Sir2p的产物对作为Sir2p去乙酰化反应的产物的2′-AADPR的鉴定已经增强了Sir2p是一种独特类型的NAD+-依赖的酶的观点。Sir2p的产物曾经被认为是β-1′-AADPR15-17，并且根据这一分子对来自Min等18的Sir2p的X-射线晶体结构进行了解释。从其它也催化类似于Sir2p反应的烟酰胺交换反应的ADP-核糖基转移酶的先例中暗示了此产物。NAD+糖水解酶和CD38都形成具有β-构型的产物并都能催化碱交换反应。因此对Sir2p产物的暗示是已知酶学内容的逻辑外延15-17。碱交换需要酶对ADPR亲电子体的稳定，或能形成共价的酶中间体27，通常导致ADPR转移到具有1-β-立体化学构型的亲核试剂上。我们合成了真正的β-1′-AADPR并证实了通过Sir2p没有形成相应于该化合物的产物。观察到的β-1′-AADPR稳定性也证实了在Sir2p反应中其不是中间体。释放自Sir2p催化位点的产物是2′-AADPR，其形成了Sir2p-非依赖的2′-和3′-乙酰基异构体。在15℃下乙酰基基团的化学交换的结果产生了差不多是67∶47的2′∶3′的平衡比率。在该温度下该交换以0.45hr-1和0.32hr-1的速度发生。在37℃的生理温度下，该平衡将在60分钟内达到。因此，可以相信通过自发产生的2′-到3′-AADPR的转化Sir2p作用的下游级联是时控的。每一个区位异构体存在1′α和β端基异构型，通过NMR鉴定产生了四种截然不同的类型(图8的方案1B)。α/β端基异构平衡是很快的(＞50s-1)。
产生2′-AADPR的Sir2p催化步骤形成2′-AADPR需要在化学反应机制的某一阶段中2′-羟基作为亲核试剂。已经暗示有2′-羟基的参与。该2′-羟基被认为直接作为亲核试剂对酰胺部分去乙酰化16。该直接的2′-亲核试剂机制需要在由Sir2p释放2′-AADPR的过程中来自溶剂水的18O掺入到1′-位置作为唯一的18O标记。然而，MS分析证实了在乙酰基基团中出现了18O，因此2′-羟基基团作为主要亲核试剂的作用能被排除。
为了使ADPR转移和去乙酰化的偶联能一致，该反应能与通过ADP-核糖化毒素催化的ADP-核糖基转移酶反应作比较，在后一反应中该酶产生可通过弱亲核试剂进攻的高反应性的ADP-核糖氧碳正离子。例如，在霍乱毒素中，ADPR从NAD+被转移到精氨酸上，同时对APP-核糖进行立体化学构型转化以产生α-1′-取代的ADPR-酰胺39。在Sir2p反应中该同样的机理产生了可捕捉N-乙酰基-赖氨酸的酰基氧原子以产生O-烷基-酰胺化物的ADP-核糖-氧碳正离子(图8的方案1D)。O-烷基酰胺化物被化学激活且能在水中自发地水解以形成自由胺和酯40，41。对于Sir2p，这些相应于去乙酰化的赖氨酸和α-1′-AADPR。所有迄今进行的ADP-核糖转移反应的跃迁态研究表明产生了一个可促进ADPR转移的有效的核糖-氧碳正离子亲电试剂42。
该机制解释了在烟酰胺交换中对肽底物的需要；甚至在缺少去乙酰化酶活性的突变酶的情况下也是如此18。存在两种可能的能生成2′-AADPR的反应途径。在第一种途径中，中间体O-烷基酰胺化物水解为1′-取代的α-AADPR，其可异构化为2′-区位化学物(regiochemistry)以给出所观察到的产物(图7的机制A；图8的方案1D)。可选地，2′-羟基能进攻O-烷基-酰胺化物中间体以产生环酰基氧鎓，接着通过水解形成观察到的2′-AADPR产物(图7的机制B；图8的方案1E)。
α-1′-AADPR中间体的性质在5℃下进行的使用SirAf2的低温NMR研究没有提供α-1′-AADPR积聚的新证据。因为α-1′-AADPR的检测水平接近于酶浓度，因此α-1′-AADPR到2′-AADPR的转化的发生≥该酶的催化速率。2′-AADPR到3′-AADPR的相互转化以系数20低于kcat，且酶依赖的2′-异构体的生成通过NMR被观察到(图4)。与结果最一致的机制是2′-羟基进攻1′-O-烷基酰胺化物以产生1′-2′  取代的酰基氧鎓结构作为该酶生成2′-AADPR的前体(图7的机制B；图8的方案1E)。
来自H2 18O掺入的标记方式通过从18O水中掺入一个单独18O原子到AADPR产物中证实了水参与了该催化机制。该氧原子是乙酰基基团中的非交换的氧。单个水分子的机制和在C1′-羟基上酸可交换的氧的确认证实了酰基-氧-C1′键的形成和水对酰胺羰基的碳原子的进攻。
X-射线结构与观察到的产物的结构一致对Sir2-Af1 X-射线结构最初的观察18显示在NAD+结合距离内不存在推定的亲核残基以支持共价ADPR转移和β-立体化学构型的产生。一个根据我们实验结果的对于该结构的新的观点是令人感兴趣的，即所结合的乙酰基对NAD+的α面的进攻并不受阻碍，并且2’-羟基并不受限于酶的任何侧链。实际上，一个建模研究可使得p53的C-末端肽的NMR结构更容易结合到Sir2Af1的晶体结构上(图6)。在该模型中，乙酰基氧实际上非常合适地定位从而可接近结合于Sir2Af1的烟酰胺的α面。此外，通过诱变表明位于3’羟基附近的组氨酸对去乙酰化酶功能是必需的，暗示NAD+分子的底面参与了酸-碱转移途径从而完成催化功能。
Sir2p机制的简述综合这些结果对图8的方案1E的反应步骤提供了强大的支持。大多数组蛋白去乙酰化酶是简单的水解酶-N-乙酰基基团的水解是简单的化学反应和能量有利的反应。对于作为共底物的代谢上有价值的NAD+的消耗的生物学基本原理可包括底物信号传送；NAD+水平可反映细胞的能量和氧化还原状态以控制基于Sir2p的基因调节。第二种可能性是反应通过产生新化合物2′-和3′-AADPR启动了Sir2p信号转导通路。之前在新陈代谢作用中这些分子没有被确认，并具有与信号通路的其它启动剂所普遍具有的化学不稳定性的特征。近来证实了某些Sir2p同系物位于细胞质中35，36且能接受来自其它非组蛋白的蛋白如化学方法乙酰化的BSA18或p53的乙酰基基团，暗示它们在细胞发育中和通过乙酰基-转移酶反应的转录调节中起广泛作用。Sir2p产物的鉴定提供了用于进一步研究这些通路的工具并提供了对这一特殊的ADP核糖基转移酶具有特异性的抑制剂的设计信息。
         实施例2.对Sir2和SIR2抑制剂的改进分析方法
如上所讨论的，Sir2和NAD+及适合的蛋白或肽乙酰基供体的反应生成了2′-和3′-O-乙酰基ADP核糖(AADPR)和去乙酰化的蛋白或肽。通过测量AADPR产物的产生量，Sir2活性的检测能被有效地进行。先前用于检测活性的方法是基于使用HPLC来检测产物。通过用公知的方法放射性化学标记NAD+，放射性标记AADPR的产生和定量通过在Sephadex-DEAE柱上从未反应的NAD+中快速分离AADPR而被完成。
实际所用的方法如下：
300μl的含有150μM JB 12肽(基于p53的)和150mM[5′-14C]NAD+(每一样品中特异性活性100000cpm)的50mM pH6.2(或7.0或7.5)磷酸钾缓冲液与5μL的缓冲液中的3μg的Sir2酶(酵母同系物Sir2p或古细菌(Archaeglobus fulgidus)AF2Sir2)在反应30分钟到4小时。在反应时间完成后，取反应混合物50μL等分用干冰冷冻。在4小时后解冻所有的试管并加在用25mM pH 7.0醋酸铵预平衡的1mL DEAESephadex柱上，6mL 25mM醋酸铵被用于洗脱柱子并收集1mL的组分。该柱子接着用6mL 500mM醋酸铵洗脱并再收集1mL的组分。每一个柱子的产物量通过添加9mL闪烁液和置于闪烁计数器中被计算出。图11中显示了洗脱图。使用该方法，未反应的NAD+首先洗脱出(组分1-6)，接着是AADPR(组分7-12)。超过了100cpm的这些组分的总和减去在0时间的计数值(图12)。相对于NAD的AADPR的检测灵敏度是在50μL中检出5μM，换句话说，即250pmoles的AADPR。
当与NAD+的非Sir2降解作为对照联合使用时，该方法具有多种用途可以用于在生物抽提物中检测Sir2的活性。我们已经证实了含有Sir2的抽提物，当其与适合的乙酰基供体底物混合时，能产生AADPR，且经上述的柱层析方法，其活性能通过AADPR的形成而被直接测量出。除了用加入整个细胞的匀浆代替添加纯酶外，在表达Sir2活性的细菌提取物中AADPR的检测可用与上述类似的方法进行。对照使用未诱导的细胞，或诱导产生突变失活的Sir2的细胞，通过上述分析测定证明没有AADPR生成，也没有NAD+分解的发生。该分析法的灵敏度可以允许检测被认为接近于生物学相关浓度(5μM)的AADPR。
该方法的优点在于分析的速度，对于高达20份样品其仅需要4到7小时，且其依靠于Sir2反应的独特产物-AADPR的直接测定。该方法也可以容易地纯化出纯的AADPR，因为所设想的分离方法也可以在反应混合物中将AADPR与其它成分分离。来自于细胞的Sir2反应产生的纯化的AADPR能接着通过HPLC或MS进行化学结构证实，或用于其它特定的分析方法中。
该方法进一步的应用包括用于发现和评估Sir2活性的抑制剂。发现和定量评估小分子对Sir2活性的作用能导致发现潜在的治疗化合物。使用AADPR来检测Sir2的抑制依赖于检测在细胞中Sir2反应的唯一独特产物。在该方法中反应的进行如上所述，潜在的抑制剂以不同的浓度被加入。通过使用反应进行的起始线性阶段来测定每一样品中Sir2的反应速率，该反应速率是最快的且等于斜率。反应的抑制剂显示能降低速率。抑制作用通过方程式被量化
1/v＝1/Vmax(1+[I]/Kii)+Km/Vmax(1+[I]/Ki)
其中Km和Vmax是用于描述可和抑制剂竞争性结合的底物的米氏常数(Michaelis constants)的参数，[I]是抑制剂的浓度且Ki和Kii是竞争性和非竞争性结合常数。该方法也被期望能发现具有1mM的结合亲和力的Ki值的竞争性抑制剂，和特别地能鉴定具有在100μM范围内或更低的结合亲和力的抑制剂。在一个具体实施方式中，该方法包含添加200μM抑制剂到300μL的含有100μM NAD+和肽底物的反应混合物中。
研究了一些抽提物，包括仓鼠卵巢细胞和大鼠肝，已经证实了有能分解AADPR形成ADPR和乙酸的高酯酶活性存在。一种鉴定和发现在体内可降解或利用AADPR的酯酶(或其它酶)的方法使用了AADPR或放射性标记的AADPR。特别地，AADPR降解能通过HPLC或TLC方法被测量。当放射性标记被使用时，用于此目的的所需的AADPR量可以少至250pmoles。
对于AADPR的生成，使用检测AADPR降解的基于AADPR的方法提供了该独特的Sir2反应产物作为一种研究在细胞中利用该化合物的活性的手段。根据时间对降解进行定量提供了一种不但发现利用AADPR的活性而且也发现能抑制该活性的化合物的方法。通过小分子化合物在细胞中抑制AADPR降解能增加AADPR在细胞中的作用，因此通过在细胞中Sir2反应仅有的独特产物寿命的增加，延长了Sir2的作用。
通过释放自对硝基苯基乙酸酯(400nm)的对硝基苯酚而测定的DEAE分离的大鼠肝抽提物的酯酶活性如图3所示。表明了在肝细胞中AADPR被高本底的内在酯酶所作用。AADPR作为底物来研究酯酶的这一广泛活性测定在细胞中的AADPR特异性酯酶。一种方法是使用AADPR酯酶活性/对硝基苯基乙酸酯酯酶活性的比率来度量作用于AADPR产物的活性与作用于一般底物的活性的比值。酶学理论认为酶活性对于该酶设计时所针对的底物是最优的。因此，活性比率对于被设计为可识别AADPR的酶应该是最高的。
也能采用其它的方法，如使用类似于AADPR的小分子抑制剂。如图13所示，酯酶对于毫摩尔(mM)浓度的添加的AADPR类似物敏感。
在上述的观点中，可以看到达到了本发明的一些优点并保持了其它的优点。
由于对上述方法和组合物可以进行多种改变而不背离本发明的保护范围，因此在上述描述中含有和在附图中所显示的所有内容应被认为是只作为解释而不作限制。
在说明书中引用的所有的参考文献在此一并作为参考文献引用。在本文中对参考文献的讨论仅仅用来总结作者的主张，但并不认为其构成现有技术。申请人保留对引用的参考文献的正确性和相关提出怀疑的权利。

Claims (119)

1.一种纯化的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖制剂。
2.一种在细胞中显示增加的稳定性的2′-O-乙酰基ADP核糖类似物或3′-O-酰基ADP核糖类似物，其中2′-O-乙酰基ADP核糖和3′-O-乙酰基ADP核糖都包含具有酯氧原子的乙酸酯基团，和位于两个磷原子之间的氧。
3.权利要求2的类似物，其中CF2、NH或S取代了酯氧原子或位于两个磷原子之间的氧。
4.权利要求2的类似物，其中CF2、NH或S独立地取代了酯氧原子和位于两个磷原子之间的氧。
5.权利要求3或4的类似物，其中CF2、NH或S取代了酯氧原子。
6.权利要求3或4的类似物，其中CF2取代了酯氧原子和/或位于两个磷原子之间的氧。
7.权利要求3的类似物，其中CF2取代了酯氧原子。
8.一种制备2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的方法，该方法包含：在一定反应条件下在反应混合物中使NAD+和Sir2的乙酰化肽底物与Sir2酶混合一段时间，其中所述反应条件和时间足以使得该肽去乙酰化，接着
从反应混合物中鉴定并纯化2′/3′-O-乙酰基ADP核糖。
9.权利要求8的方法，其中2′/3′-O-乙酰基ADP核糖用色谱法纯化自反应混合物。
10.权利要求9的方法，其中2′/3′-O-酰基ADP核糖通过HPLC纯化自反应混合物。
11.权利要求9的方法，其中2′/3′-O-乙酰基ADP核糖经Sephadex-DEAE柱纯化自反应混合物。
12.权利要求8-11任一项的方法，其中NAD+被放射性标记以致在肽被去乙酰化后2′/3′-O-乙酰基ADP核糖被放射性标记。
13.权利要求12的方法，其中NAD+在5′位用14C放射性标记。
14.权利要求8-11任一项的方法，其中在乙酰化的肽上的乙酰基基团被放射性标记。
15.权利要求8-14任一项的方法，其中乙酰化的肽底物由至少2个氨基酸组成，其中至少一个氨基酸由在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基组成。
16.权利要求15的方法，其中乙酰化的肽底物由至少3个氨基酸残基组成。
17.权利要求15的方法，其中乙酰化的肽底物由至少5个氨基酸残基组成。
18.权利要求15的方法，其中乙酰化的肽底物由至少10个氨基酸残基组成。
19.权利要求15的方法，其中乙酰化的肽底物由至少15个氨基酸残基组成。
20.权利要求15的方法，其中乙酰化的肽底物由至少18个氨基酸残基组成。
21.权利要求8-20任一项的方法，其中乙酰化的肽底物与p53的调节域的乙酰化区同源。
22.权利要求21的方法，其中乙酰化的肽包含JB11或JB12。
23.权利要求21的方法，其中乙酰化的肽底物是乙酰化的p53。
24.权利要求8-20任一项的方法，其中乙酰化的肽底物与组蛋白的乙酰化区同源。
25.权利要求24的方法，其中乙酰化的肽是乙酰化的组蛋白。
26.权利要求8-25任一项的方法，其中Sir2酶源自原核生物。
27.权利要求26的方法，其中Sir2酶源自古细菌。
28.权利要求26的方法，其中Sir2酶源自真细菌。
29.权利要求8-25任一项的方法，其中Sir2酶源自真核生物。
30.权利要求29的方法，其中Sir2酶源自酵母。
31.权利要求30的方法，其中Sir2酶源自人。
32.一种测定一种测试化合物是否是Sir2酶的抑制剂的方法，该方法包含：
在一定反应条件下在反应混合物中将Sir2酶、NAD+和Sir2酶的乙酰化肽底物与该测试化合物混合一段时间，其中所述反应条件和时间使得在不存在该测试化合物时可以去乙酰化该肽；
对产生自乙酰化的肽的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖进行定量；接着
比较生成的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的量和在相同的反应条件下但不存在该测试化合物时生成的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的量；
其中比不存在该测试化合物时产生更少的2′-O-乙酰基ADP核糖和/或3′-O-乙酰基ADP核糖表明该测试化合物是Sir2酶的抑制剂。
33.权利要求32的方法，其中2′/3′-O-乙酰基ADP核糖在反应混合物进行色谱法后被定量。
34.权利要求33的方法，其中色谱法是HPLC。
35.权利要求33的方法，其中色谱法在Sephadex-DEAE柱上进行。
36.权利要求32-35任一项的方法，其中NAD+被放射性标记以致在肽被去乙酰化后2′/3′-O-乙酰基ADP核糖被放射性标记。
37.权利要求36的方法，其中NAD+在5′位用14C放射性标记。
38.权利要求32-35任一项的方法，其中在乙酰化的肽上的乙酰基基团被放射性标记。
39.权利要求32-38任一项的方法，其中乙酰化的肽底物由至少2个氨基酸组成，其中至少一个氨基酸包含在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。
40.权利要求39的方法，其中乙酰化的肽底物由至少3个氨基酸残基组成。
41.权利要求39的方法，其中乙酰化的肽底物由至少5个氨基酸残基组成。
42.权利要求39的方法，其中乙酰化的肽底物由至少10个氨基酸残基组成。
43.权利要求39的方法，其中乙酰化的肽底物由至少15个氨基酸残基组成。
44.权利要求39的方法，其中乙酰化的肽底物由至少18个氨基酸残基组成。
45.权利要求32-44任一项的方法，其中乙酰化的肽底物与p53的调节域的乙酰化区同源。
46.权利要求45的方法，其中乙酰化的肽包含JB11或JB12。
47.权利要求45的方法，其中乙酰化的肽底物是乙酰化的p53。
48.权利要求32-44任一项的方法，其中乙酰化的肽底物与组蛋白的乙酰化区同源。
49.权利要求48的方法，其中乙酰化的肽是乙酰化的组蛋白。
50.权利要求32-49任一项的方法，其中Sir2酶源自原核生物。
51.权利要求50的方法，其中Sir2酶源自古细菌。
52.权利要求50的方法，其中Sir2酶源自真细菌。
53.权利要求32-49任一项的方法，其中S i r2酶源自真核生物。
54.权利要求53的方法，其中Sir2酶源自酵母。
55.权利要求53的方法，其中Sir2酶源自人。
56.一种抑制Sir2酶的方法，该方法包含用通过权利要求32-55任一项的方法发现的抑制剂和Sir2酶混合。
57.权利要求56的方法，其中Sir2酶位于活细胞中。
58.权利要求57的方法，其中活细胞是细菌细胞。
59.权利要求57的方法，其中活细胞是真核生物细胞。
60.权利要求59的方法，其中活细胞是酵母细胞。
61.权利要求60的方法，其中活细胞是哺乳动物细胞。
62.权利要求61的方法，其中哺乳动物细胞位于活的哺乳动物中。
63.权利要求62的方法，其中哺乳动物是人。
64.权利要求62或63的方法，其中哺乳动物有患癌症的风险或患有癌症，所述癌症由缺乏p53-DNA结合而诱导。
65.一种在组合物中检测Sir2的活性的方法，该方法包含：
在一定反应条件下在反应混合物中将NAD+和Sir2的乙酰化肽底物与该组合物混合一段时间，其中所述反应条件和时间使得在存在Sir2活性的条件下足以去乙酰化该肽；接着测量2′/3′-O-乙酰基ADP核糖；
其中存在2′/3′-O-乙酰基ADP核糖表明在该组合物中存在Sir2活性。
66.权利要求65的方法，其中2′/3′-O-乙酰基ADP核糖在反应混合物进行色谱法后被测量。
67.权利要求66的方法，其中色谱法是HPLC。
68.权利要求66的方法，其中色谱法在Sephadex-DEAE柱上进行。
69.权利要求65-68任一项的方法，其中NAD+被放射性标记以致在肽被去乙酰化后2′/3′-O-乙酰基ADP核糖被放射性标记。
70.权利要求68的方法，其中NAD+在5′位置用14C放射性标记。
71.权利要求65-68任一项的方法，其中在乙酰化的肽上的乙酰基基团被放射性标记。
72.权利要求65的方法，其中乙酰化的肽底物由至少2个氨基酸组成，其中至少一个氨基酸包含在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。
73.权利要求72的方法，其中乙酰化的肽底物由至少3个氨基酸残基组成。
74.权利要求72的方法，其中乙酰化的肽底物由至少5个氨基酸残基组成。
75.权利要求72的方法，其中乙酰化的肽底物由至少10个氨基酸残基组成。
76.权利要求72的方法，其中乙酰化的肽底物由至少15个氨基酸残基组成。
77.权利要求72的方法，其中乙酰化的肽底物由至少18个氨基酸残基组成。
78.权利要求65-77任一项的方法，其中乙酰化的肽底物与p53的调节域的乙酰化区同源。
79.权利要求78的方法，其中乙酰化的肽包含JB11或JB12。
80.权利要求78的方法，其中乙酰化的肽底物是乙酰化的p53。
81.权利要求65-77任一项的方法，其中乙酰化的肽底物与组蛋白的乙酰化区同源。
82.权利要求81的方法，其中乙酰化的肽是乙酰化的组蛋白。
83.权利要求65-82任一项的方法，其中组合物是原核生物的抽提物。
84.权利要求65-82任一项的方法，其中组合物是源自真核生物的抽提物。
85.权利要求84的方法，其中组合物是源自酵母的抽提物。
86.权利要求84的方法，其中组合物是源自人的抽提物。
87.权利要求65-86任一项的方法，其中对Sir2活性进行定量。
88.一种对乙酰化的肽去乙酰化的方法，该方法包含用Sir2酶和NAD+与该肽混合，其中乙酰化的肽不是组蛋白。
89.权利要求88的方法，其中乙酰化的肽底物由至少2个氨基酸组成，其中至少一个氨基酸包含在∈-氨基部分被乙酰化的赖氨酸残基。
90.权利要求89的方法，其中乙酰化的肽底物由至少3个氨基酸残基组成。
91.权利要求89的方法，其中乙酰化的肽底物由至少5个氨基酸残基组成。
92.权利要求89的方法，其中乙酰化的肽底物由至少10个氨基酸残基组成。
93.权利要求89的方法，其中乙酰化的肽底物由至少15个氨基酸残基组成。
94.权利要求89的方法，其中乙酰化的肽底物由至少18个氨基酸残基组成。
95.权利要求88-94任一项的方法，其中乙酰化的肽底物是乙酰化的p53。
96.权利要求88-95任一项的方法，其中肽位于活细胞中。
97.权利要求96的方法，其中Sir2酶通过转染进细胞中的Sir2基因被产生。
98.权利要求96或97的方法，其中活细胞位于哺乳动物中。
99.权利要求98的方法，其中哺乳动物是人。
100.一种抑制乙酰化的肽去乙酰化的方法，包含用通过权利要求32-55任一项的方法测定的Sir2抑制剂和乙酰化的肽混合。
101.权利要求100的方法，其中乙酰化的肽是组蛋白。
102.权利要求100的方法，其中乙酰化的肽是p53。
103.权利要求100-102任一项的方法，其中肽位于活细胞中。
104.权利要求103的方法，其中活细胞是哺乳动物细胞。
105.权利要求104的方法，其中哺乳动物细胞位于活的哺乳动物中。
106.权利要求105的方法，其中哺乳动物是人。
107.权利要求102-106任一项的方法，其中肽是p53且该哺乳动物有患癌症的风险或患有癌症，所述癌症由缺乏p53-DNA结合而诱导。
108.一种抑制乙酰化的肽去乙酰化的方法，包含用2′/3′-O-乙酰基ADP核糖或权利要求2-7任一项的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖的类似物和乙酰化的肽混合。
109.权利要求108的方法，其中乙酰化的肽是组蛋白。
110.权利要求108的方法，其中乙酰化的肽是p53。
111.权利要求108-110任一项的方法，其中乙酰化的肽位于活细胞中。
112.权利要求111的方法，其中活细胞是原核生物细胞。
113.权利要求111的方法，其中活细胞是真核生物细胞。
114.权利要求113的方法，其中活细胞是哺乳动物细胞。
115.权利要求114的方法，其中哺乳动物细胞位于活的哺乳动物中。
116.权利要求115的方法，其中哺乳动物是人。
117.权利要求110-116任一项的方法，其中肽是p53且该哺乳动物有患癌症的风险或患有该癌症，所述癌症由缺乏p53-DNA结合所诱导。
118.一种2′/3′O-乙酰基ADP核糖的前体药物，该前体药物包含通过酯酶敏感的键共价结合到另一部分上的2′/3′-O-乙酰基ADP核糖，其中该前体药物能比2′/3′-O-乙酰基ADP核糖更易进入细胞。
119.权利要求118的前体药物，其中另一部分是水杨酸或其酯或盐。
CNB028266315A 2001-11-21 2002-11-21 Sir2产物及活性 Expired - Fee Related CN1310937C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33191901P 2001-11-21 2001-11-21
US60/331,919 2001-11-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1681833A true CN1681833A (zh) 2005-10-12
CN1310937C CN1310937C (zh) 2007-04-18

Family

ID=23295921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028266315A Expired - Fee Related CN1310937C (zh) 2001-11-21 2002-11-21 Sir2产物及活性

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6987091B2 (zh)
EP (1) EP1453848A4 (zh)
JP (1) JP2005528331A (zh)
CN (1) CN1310937C (zh)
AU (1) AU2002356992A1 (zh)
CA (1) CA2467854A1 (zh)
WO (1) WO2003045907A2 (zh)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003045907A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 Albert Einstein College Of Medecine Of Yeshiva University Sir2 products and activities
WO2003046207A2 (en) * 2001-11-27 2003-06-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for inhibiting deacetylase activity
US7977049B2 (en) * 2002-08-09 2011-07-12 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms
JP2007535475A (ja) 2003-07-02 2007-12-06 イェシバ・ユニバーシティ Ｓｉｒ２制御
US8017634B2 (en) 2003-12-29 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions for treating obesity and insulin resistance disorders
EP1708689A2 (en) 2003-12-29 2006-10-11 The President and Fellows of Harvard College Compositions for treating or preventing obesity and insulin resistance disorders
AU2005262472B2 (en) * 2004-06-16 2011-10-27 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for modulating bax-mediated apoptosis
WO2006004722A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Biomol Research Laboratories, Inc. Compositions and methods for selectively activating human sirtuins
EP1844157A4 (en) * 2005-01-25 2009-11-25 Univ Johns Hopkins STRATEGIES TO DEVELOP MEDICINES THAT TARGET THE SIR2 ENZYME FAMILY
WO2006094239A2 (en) * 2005-03-03 2006-09-08 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Fluorescence polarization assays for acetyltransferase/deacetylase activity
WO2006138418A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 President And Fellows Of Harvard College Improvement of cognitive performance with sirtuin activators
CA2615105A1 (en) 2005-07-14 2007-01-25 Takeda San Diego, Inc. Histone deacetylase inhibitors
EP1955077B1 (en) * 2005-12-02 2012-06-13 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry assays for acetyltransferase/deacetylase activity
US20070225246A1 (en) * 2006-03-27 2007-09-27 Denu John M O-acetyl-ADP-ribose non-hydrolyzable analogs
US9132087B2 (en) 2008-04-21 2015-09-15 Otonomy, Inc. Auris formulations for treating otic diseases and conditions
US11969501B2 (en) 2008-04-21 2024-04-30 Dompé Farmaceutici S.P.A. Auris formulations for treating otic diseases and conditions
US8784870B2 (en) * 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
EP2670404B1 (en) 2011-02-02 2018-08-29 The Trustees of Princeton University Sirtuin modulators as virus production modulators
WO2012170494A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Non-enzymatic synthesis of o-acetyl-adp-ribose and analogues thereof
US10464280B2 (en) 2011-08-30 2019-11-05 Shanghai Yanfeng Jinqiao Automotive Trim Systems Co. Ltd. Trim component for vehicle interior
US8939745B2 (en) 2011-08-30 2015-01-27 Johnson Controls Technology Company System and method for manufacturing a vehicle trim component via concurrent compression forming and injection molding
WO2013149258A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Charles Drew University of Medicine and Science Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders
CA3029281A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Otonomy, Inc. Triglyceride otic formulations and uses thereof
WO2020006290A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Shanghai Yanfeng Jinqiao Automotive Trim Systems Co. Ltd. Vehicle trim component

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4495180A (en) * 1982-06-21 1985-01-22 Merck & Co., Inc. Prodrugs of Ara-A an antiviral agent
US5569650A (en) * 1993-06-11 1996-10-29 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research C-nucleoside isosters of analogs thereof and pharmaceutical compositions
JP2002106665A (ja) * 2000-10-04 2002-04-10 Honda Motor Co Ltd ダブルキャビティ・トロイダル型無段変速機
WO2002038579A1 (en) 2000-11-11 2002-05-16 Oregon Health & Science University Compositions and methods for identifying agents which regulate chromosomal stability, gene activation and aging
WO2003045907A2 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Albert Einstein College Of Medecine Of Yeshiva University Sir2 products and activities
US20060292652A1 (en) 2003-01-16 2006-12-28 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Substrate detection assay
JP2007535475A (ja) 2003-07-02 2007-12-06 イェシバ・ユニバーシティ Ｓｉｒ２制御

Also Published As

Publication number Publication date
US20060058520A1 (en) 2006-03-16
WO2003045907A2 (en) 2003-06-05
CA2467854A1 (en) 2003-06-05
AU2002356992A1 (en) 2003-06-10
US7741295B2 (en) 2010-06-22
US20090068695A1 (en) 2009-03-12
JP2005528331A (ja) 2005-09-22
EP1453848A4 (en) 2009-09-09
EP1453848A2 (en) 2004-09-08
US7432246B2 (en) 2008-10-07
US20030149261A1 (en) 2003-08-07
WO2003045907A3 (en) 2003-07-17
CN1310937C (zh) 2007-04-18
US6987091B2 (en) 2006-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1310937C (zh) Sir2产物及活性
EP3690057A1 (en) Method for producing nicotinamide mononucleotide and transformant used in said method
Kim et al. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase
Parker et al. Action and timing of BacC and BacD in the late stages of biosynthesis of the dipeptide antibiotic bacilysin
Jungmann et al. The supersized class III lanthipeptide stackepeptin displays motif multiplication in the core peptide
Zhao et al. Nitric oxide as a source for bacterial triazole biosynthesis
Zhang et al. Bioorganic chemistry of cyclic ADP-ribose (cADPR)
Chu et al. Harnessing phosphonate antibiotics argolaphos biosynthesis enables a synthetic biology-based green synthesis of glyphosate
Patel et al. Queuosine salvage in fission yeast by Qng1-mediated hydrolysis to queuine
Holzberger et al. A highly active DNA polymerase with a fluorous core
Baulig et al. Biosynthetic reconstitution of deoxysugar phosphoramidate metalloprotease inhibitors using an N–P-bond-forming kinase
Grüschow et al. Diversity in natural product families is governed by more than enzyme promiscuity alone: establishing control of the pacidamycin portfolio
JP6798085B2 (ja) 糖化合物、糖化合物の製造方法、ＥＮＧａｓｅ活性検出用組成物、及びＥＮＧａｓｅ活性阻害剤のスクリーニング方法
Blanot et al. Synthesis of α and β anomers of UDP-N-acetylmuramic acid
Schmidt et al. Comparison of the biotransformation of the 14C‐labelled insecticide carbaryl by non‐transformed and human CYP1A1‐, CYP1A2‐, and CYP3A4‐transgenic cell cultures of Nicotiana tabacum
Guo et al. Biochemical studies of inositol N-acetylglucosaminyltransferase involved in mycothiol biosynthesis in Corynebacterium diphtheria
Bavaro et al. Recombinant lipase from Candida rugosa for regioselective hydrolysis of peracetylated nucleosides. A comparison with commercial non-recombinant lipases
CN114958790B (zh) 肝素骨架合酶及其突变体与应用
KR101251620B1 (ko) 아데노신 디아미네이즈의 효소 활성 증가 방법, 상기활성이 증가된 아데노신 디아미네이즈 변이체, 및 상기변이체를 이용한 디옥시구아노신의 생산방법
JP4346449B2 (ja) ＵＧＰＰａｓｅの製造
WO2023219065A1 (ja) シアル酸含有糖鎖の製造方法
Jockmann et al. Expanding the Substrate Scope of N‐and O‐Methyltransferases from Plants for Chemoselective Alkylation
KR101654004B1 (ko) 애기장대 ap 엔도뉴클레아제를 이용한 dna 메틸화 부위의 형광 표지 방법
NamShin et al. Characterization of aldolase from Methanococcus jannaschii by gas chromatography
Ko Unusual carbohydrate biosynthesis: mechanistic studies of DesII and the biosynthesis of formycin A

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee