CN1671389A - 用于治疗间变性甲状腺癌的4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－n－[4－甲基－3－基)嘧啶－2－基氨基)苯基]－苯甲酰胺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式（I）的4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－(4－(吡啶－3－基)嘧啶－2－基氨基)苯基]－苯甲酰胺或其可药用盐在制备治疗间变性甲状腺癌的药物中的用途。

Description

用于治疗间变性甲状腺癌的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-基) 嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺
本发明涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(下文称为：“化合物I”)或其可药用盐在制备用于治疗间变性甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer)的药物中的用途，涉及化合物I或其可药用盐在治疗间变性甲状腺癌中的用途，涉及治疗患有间变性甲状腺癌的包括哺乳动物在内的温血动物、尤其是人的方法，该方法通过向需要这种治疗的所述动物施用有效剂量的化合物I或其可药用盐来进行治疗。
甲状腺滤泡细胞衍生的癌在病理学上被分为分化(乳头状和滤泡状)癌和未分化(间变性)癌。分化癌具有较好的预后，然而间变性甲状腺癌非常具有攻击性并且极端致命，治疗应答差。据报道，在间变性癌中肿瘤抑制基因p53突变的发生率为70-85％，而在分化癌中发生率为0-9％。因此，p53基因突变被认为是与甲状腺癌发生中的分化丧失相关的晚期遗传学事件并且是造成该类癌的高度攻击性性质的分子改变之一。
化合物具有式(I)的结构：
化合物I游离碱及其可接受的盐在欧洲专利申请0564409中公开。
化合物I的可药用盐是可药用的酸加成盐，如例如与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸的酸加成盐，或者与适宜的有机羧酸或磺酸的酸加成盐，所述的有机羧酸或磺酸是例如脂肪族一元或二元羧酸，如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸；或者氨基酸如精氨酸或赖氨酸；芳族羧酸，如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙氧基-苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸；芳族-脂肪族羧酸，如扁桃酸或肉桂酸；杂芳族羧酸，如烟酸或异烟酸；脂肪族磺酸，如甲磺酸、乙磺酸或2-羟基乙磺酸，或者芳族磺酸，例如苯磺酸、对甲苯磺酸或奈-2-磺酸。
下文中被称为“盐I”的化合物I甲磺酸盐以及化合物I甲磺酸盐的α和β晶形在1999年1月公布的国际专利申请WO 99/03854中公开。
现已令人惊奇地发现：盐I可用作治疗间变性甲状腺癌、尤其是含有突变p53的间变性甲状腺癌的治疗剂。
因此，本发明涉及治疗患有间变性甲状腺癌的温血动物的方法，该方法包括向需要这种治疗的所述动物施用抗间变性甲状腺癌、尤其是含有突变p53的间变性甲状腺癌治疗有效量的盐I。
本发明涉及向患有间变性甲状腺癌、尤其是含有突变p53的间变性甲状腺癌的人类对象施用式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的酸加成盐且优选单甲磺酸盐的方法。
术语“治疗”包括将盐I施用于需要这种治疗的温血动物，目的是治愈肿瘤或在肿瘤消退和延缓疾病恶化方面具有效果。
此处所用的术语“延缓恶化”意指肿瘤生长或者通常地，疾病恶化至少被该治疗减缓或阻遏并且所述患者比未治疗或用安慰剂治疗的患者显示出更高的存活率。
本发明的药物组合物可以用本身已知的方法制备，并且是那些适于经肠如口服或直肠和经胃肠外施用于包括人在内的温血动物的组合物，其包含治疗有效量的至少一种单独的或与一种或多种可药用载体、尤其是适于经肠或经胃肠外应用的可药用载体组合的药理学活性成分。本发明的剂型的优选施用途径是口服。
相关领域的技术人员完全能够选择相关的试验模型以证明此处所提及的对间变性甲状腺癌的有益作用。所述化合物的药理学活性可以例如用下述实施例、通过体外试验和在裸鼠或转基因小鼠中进行的体内试验或在适宜的临床研究中被证明。适宜的临床研究为例如在患有间变性甲状腺癌的患者中进行的开放标记、非随机、剂量递增研究。在这些研究中可以例如通过每6周评价癌的大小或通过适宜的血清肿瘤标志物或通过闪烁造影术肿瘤检测、用与活性成分相匹配的安慰剂所达到的功效为对照来测定治疗的功效。
盐I的有效剂量可根据所用的具体化合物或药物组合物、施用方式、所治疗的甲状腺癌的类型或所治疗的甲状腺癌的严重性而改变。根据包括患者的肾功能和肝功能在内的许多其它因素选择剂量方案。普通技术的内科医生、临床医生或兽医可容易地确定和开具预防、逆转和阻止病症恶化所需的化合物的有效量。
根据种属、年龄、个体状况、施用方式和所讨论的临床状况，对体重约70kg的温血动物施用盐I的有效剂量，例如相当于约10-1000mg活性化合物(游离碱)、优选50-600mg、尤其是100至400mg的日剂量。对于患有间变性甲状腺癌、尤其是含有突变p53的间变性甲状腺癌的成年患者，可推荐每天200或400mg的起始剂量。在对治疗应答进行评价后对于应答不充分的患者，可安全地考虑剂量递增，只要患者从治疗中受益并且没有限制性毒性即可以对其进行治疗。
本发明还涉及向患有间变性甲状腺癌、尤其是含有突变p53的间变性甲状腺癌的人类对象施用化合物I或其可药用盐的方法，该方法包括将药学有效量的化合物I或其可药用盐施用于人类对象，例如每天施用一次，例如，施用时间超过3个月。本发明尤其涉及其中对成年人施用的日剂量为50至600mg、优选100至400mg的所述方法。
实施例1：盐I诱导间变性甲状腺癌细胞的S-G2过渡细胞停滞
1)盐I对细胞生长的抑制作用
细胞生长测定法-实验1：
细胞培养：制备检测不到或含突变型p53的人间变性或未分化甲状腺癌细胞系，即FRO和ARO以及含野生型p53基因的分化乳头状甲状腺癌细胞系(KCT-1)。1F3细胞系是将野生型p53基因导入FRO的稳定转化体。将这些细胞系在添加了5％热灭活胎牛血清(FBS；Life Technologies，Inc.)的RPMI 1640培养基中进行培养并在含5％CO2的加湿气氛中于37℃下保持。为了分析盐I的作用，将细胞于0.1％二甲亚砜(DMSO)或被DMSO稀释的盐I(终浓度0.1％)存在下进行温育。将细胞以1×103个细胞/孔的密度接种在96孔微量滴定板中(n＝5)。一天后(第1天)，将细胞用1、10或50μM盐I或在100μl新鲜培养基中的0.1％DMSO进行处理。温育48小时后用细胞计数试剂盒(Wako)测量每孔中的细胞数。该实验进行至少3次。
如下用细胞计数器检查细胞生长曲线。将细胞以0.5或0.8×105个细胞/孔的密度接种在6-孔培养板中(n＝5)。一天后(第1天)，将细胞于10μM盐I或0.1％DMSO存在下进行温育。在第2、3、4和5天对细胞数计数。该实验进行至少3次。
结果：用浓度为0至50μM的盐I处理48小时后，用细胞计数试剂盒(Wako)对细胞数进行定量。表中的数值表示5个独立实验的平均值。
细胞系
FRO ARO KTC-1
 平均值  SD  平均值  SD  平均值  SD
无盐I  1.677  0.020  0.959  0.149  0.413  0.028
盐I 1μM  1.414  0.131  0.785  0.032  0.403  0.028
盐I 10μM  1.192  0.053  0.539  0.071  0.379  0.040
盐I 50μM  0.228  0.013  0.096  0.015  0.064  0.016
表I：在50μM盐I的浓度下所有细胞系均死亡。然而，在低于50μM时，检测不到(FRO)或含突变型p53(ARO)的细胞系显示出盐I剂量依赖方式的生长抑制，但野生型p53(KTC-1)细胞系并非如此。
为期5天的细胞生长曲线显示：与对照细胞相比，用10μM盐I处理的FRO和ARO细胞的细胞生长时间依赖性减少。盐I不改变KTC-1和IF3细胞的细胞生长(未给出数据)。
细胞生长测定法-实验2：
使用分别检测不到和在密码子273中含突变型p53(Fagin等，J.Clin.Invest.1993，91：179-184)的人间变性甲状腺癌细胞系FRO和ARO。人乳头状癌细胞系NPA在密码子223和226中具有p53突变(Fagin等，J.Clin.Invest.1993，91：179-184)，而TPC-1和KTC-1乳头状甲状腺癌细胞系的p53是野生型的(Kurebayashi等，J.Clin.Endocrinol.Metab.2000，85：2889-96)。用表达野生型p53的载体进行的稳定转染被用于由FRO细胞产生1F3细胞系(Zeki等，Int.J.Cancer，1998，75：391-5)。将细胞在添加了5％FBS的RPMI 1640培养基中、于37℃下、在含5％CO2的加湿气氛中进行培养。如以前(Kawabe等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1989，68：1174-83)所述建立原代人甲状腺细胞培养物并将其保持在添加了3％胎牛血清和青霉素-链霉素的F12营养物混合物和DMEM的2∶1混合物中(所有试剂均来自Invitrogen Life Technologies，Paisley，英国)。
将细胞以1×103个细胞/孔的密度接种在96孔微量滴定板中。一天后(第一天)，将细胞用1、5、10、20或50μM的用DMSO稀释的盐I或在100μl新鲜培养基中的0.1％DMSO处理(每个药物浓度6孔)。温育72小时后用细胞计数试剂盒(Wako)测量每孔中的细胞数。r＝0.5时用线性插值法估算IC50值，其被定义为导致细胞生长减少50％的盐I的浓度。如下使用细胞计数器检查细胞生长的动力学：将细胞以0.5或0.1×105个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中。1天后(第1天)，对它们给予含10μM盐I或0.1％DMSO的培养基并在第2、3、4和5天进行计数。两个实验均进行至少3次。
细胞系
 ARO  FRO  NPA  TPC-1  KTC-1  PT
 IC50值，单位μM  平均值  8.1*  6.4*  15.6  29.5  22.6  24.7
 SD  0.8  0.6  1.3  2.6  2.1  2.3
 n  3  3  3  3  3  3
表2：盐I对人甲状腺癌细胞系生长的影响。盐I对生长速度的影响的IC50。
通过标准WST-测定法测定盐I对5种甲状腺癌细胞系和对人甲状腺细胞(thyrocyte)原代培养物的影响。如表2中所示，p53突变的细胞系FRO、ARO和NPA的IC50显著低于野生型p53细胞系TPC-1和KTC-1以及原代甲状腺细胞(PT)的IC50。盐I选择性地抑制间变性甲状腺细胞系的生长。数据表示至少三次独立的实验；每个值组合了6个孔的结果。*，将对照和处理进行比较P＜0.05。
2)c-Abl、PDGF受体和c-kit的表达
盐I抑制c-Abl、PDGF受体和c-kit的酪氨酸激酶活性。由甲状腺癌细胞系提取的总RNA的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)表明在FRO和ARO细胞中不表达PDGF受体和c-kit(未给出数据)，然而所有细胞系(ARO、FRO、TPC、KTC、NPA和PT)均表达c-Abl mRNA。
3)盐I对S-G2过渡的抑制作用
将分会合细胞与10μM盐I或0.1％DMSO一起温育48小时。为了进行流式细胞仪分析，将细胞用70％乙醇固定并用PBS洗涤。在室温下与RNase A(0.1mg/ml)一起预温育后，将细胞用PI(25μg/ml)染色。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，Mountain View，CA)测量荧光。该实验进行至少3次。
G1 S G2-M
 DMSO  盐I  DMSO  盐I  DMSO  盐I
 FRO  32.16  30.91  43.26  54.11  24.95  14.98
 KTC-1  72.2  74.77  7.68  6.53  20.11  18.7
 1F3  63.3  70.5  9.4  9.1  27.3  20.4
 ARO  76.6  77.6  19.7  13.1  3.8  9.3
 TPC-1  67.8  77.6  9.7  9.3  22.6  13.1
表3：盐I对甲状腺癌细胞系中细胞周期的影响。将细胞仅用0.1％DMSO或用10μM盐I处理48小时并通过流式细胞仪分析细胞周期的分布(结果以处于G2、S和G2-M期的细胞的百分数表示)。
细胞周期的FACS分析表明：盐I处理延长了FRO细胞的S期(43％对54％)并缩短了G2-M期(25％对15％)，但在KTC-1细胞或1F3细胞中没有观察到改变。该结果表明盐I诱导FRO细胞中S-G2过渡细胞停滞。FACS细胞周期分析表明：用盐I处理使ARO细胞系中处于G2/M期的细胞比例增加了2倍以上(9.28％对3.78％)，并增加了FRO中处于S期的细胞数量(54％对43％)。在TPC-1、KTC-1和1F3细胞中没有观察到这些改变。在这些细胞系中，处于G1期的细胞比例有增加趋势。然而，在用盐I处理的培养物中没有观察到生长抑制。因此，用盐I处理在ARO和FRO细胞中分别导致G2/M-和S-期停滞，并且这可能是这些细胞系中所观察到的生长抑制的原因。在任何细胞系中用药物处理48小时后凋亡分数(亚-G1)未显著增加。此外，处理48小时后在DNA梯带分析中未检测到DNA断裂(未给出数据)。
4)蛋白质印迹分析：盐I对甲状腺癌细胞系中细胞周期调节蛋白的影响
将细胞用10μM盐I处理0、12、24、48小时，在RIPA缓冲液中制备细胞裂解物并通过SDS-PAGE(40μg蛋白/泳道)分离。将印迹转移至硝酸纤维素膜(Pall Corporation，Ann Arbor，MI，美国)上后用适宜的抗体进行探测。用β-肌动蛋白作为加样对照。所用的抗体是：抗-p21wafl(Ab-1，Calbiochem，Darmstardt，德国)、抗-p27(F-8，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，美国)、抗-细胞周期蛋白A(C88020，BD Biosciences，Boston，MA，美国)、抗-细胞周期蛋白B1(C23420，BD Biosciences)、抗-CDK1/Cdc2(C12720，BD Biosciences)、抗-细胞周期蛋白D3(C28620，BDBiosciences)、抗-磷酸基-c-ABL(Tyr245，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，美国)、抗-c-Abl(24-11，Santa Cruz Biotechnology)、抗-c-KIT(C-14，Santa Cruz Biotechnology)、抗-PDGFRα(C-20，Santa Cruz Biotechnol-ogy)、抗-PDGFRβ(P-20，Santa Cruz Biotechnology)、抗-ERK1/2(CellSignalling Technology)、抗-p-ERK(Cell Signalling Technology)和抗-肌动蛋白(C-11，Santa Cruz Biotechnology)。用增强化学发光试剂盒(ECL，Amersham Life Sciences，Buckinghamshire，英国)进行检测。蛋白质印迹实验进行至少2次。
结果：蛋白质印迹分析检测到在间变性甲状腺癌细胞系FRO和ARO中以及在p53-突变的乳头状癌细胞系NAP中有高水平的c-Abl蛋白(未给出数据)。在这些细胞系中没有检测到相应于其它盐I敏感性酪氨酸激酶的蛋白条带。由于p53状态可能对c-Abl蛋白的水平具有一定影响，因此还测量了1F3细胞中c-Abl的表达水平。1F3细胞含有比FRO细胞少但比正常甲状腺细胞多的c-Abl。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p21cip1和p27kip1可以阻断细胞周期中S向G2以及G1向S期过渡中的CDK活性。暴露于盐I12小时后，FRO细胞中p21cip1的表达显著增加，但在ARO、KTC-1和1F3细胞中不变。分别暴露24和48小时后，ARO和FRO细胞中p27kip1的表达增加。CDK的活性部分取决于细胞周期蛋白亚基的相对丰度和CDK抑制剂的存在。在细胞周期蛋白和CDK中，细胞周期蛋白A、B和CDC2与由G2向M期的发展有关。盐I处理24小时降低了ARO和FRO细胞系中细胞周期蛋白A、B1和CDC2的水平以及ARO细胞中细胞周期蛋白D3的水平，但在KTC-1和1F3中没有影响。在相同条件下，β-肌动蛋白的水平未受显著影响。
5)体外激酶测定：c-Abl的磷酸化和MAPK激酶活性
用所述的抗体从细胞裂解物中免疫沉淀出Abl。如以前(Dorey等，Oncogene，2000，56：8075-84)所述进行体外激酶测定。使用磷光显像仪(PhosphorImager，Molecular Dynamics，Inc.，Sunnyvale，CA，美国)对放射标记的GST-Crk进行定量。将细胞用各种剂量的盐I处理12小时，用抗体对细胞提取物进行蛋白质印迹以分析磷酸化c-Abl和总c-Abl。通过用32P-ATP的体外激酶测定以GST-Crk作为底物测定c-Abl活性。对于MAPK激酶活性，将细胞在含有0.1％DMSO或10μM盐I的无血清培养基中温育2小时。用20％FCS刺激8分钟，收集细胞裂解物并进行SDS-PAGE，用抗ERK1/2的抗体和ERK1/2的磷酸化形式进行蛋白质印迹。所有实验均进行两次并得到相似结果。
结果：在正常条件下培养的ARO和FRO细胞具有高水平的c-Abl和其Try245磷酸化形式，该磷酸化形式与c-Abl激酶活性的显著活化相关(未给出数据)。在所检测的时间间隔中，浓度不超过50μM的盐I不明显影响这些细胞系中c-Abl蛋白的水平。然而，连续处理12小时确实减少c-Abl的赖氨酸磷酸化。由于用盐I处理ARO和FRO导致的c-Abl激酶活性抑制与c-Abl磷酸化水平相关，所述的激酶活性抑制用GST-Crk融合蛋白进行测定。相反，在wt-p53细胞系(1F3和KTC-1)中，盐I诱导c-Abl的积累，并且不降低磷酸基-c-Abl水平。盐I处理wt-p53甲状腺细胞系后引起c-Abl积累的机理有待进一步阐明。对胞外信号如生长因子的通常应答是促分裂原活化蛋白(MAP)激酶级联的活化。为了确定盐I是否抑制所研究的细胞系中表达的受体酪氨酸激酶活性，测定在对血清刺激应答中盐I对ERK1/2磷酸化的影响。刺激增加了饥饿KTC-1细胞中p-ERK1/2的水平，但盐I对其磷酸化没有影响。血清刺激不显著调节间变性甲状腺癌细胞系ARO和FRO中ERK1/2激酶的活性，并且盐I不影响p-ERK1/2的水平。另外，向培养基中添加PDGF-BB、PDGFRα和-Rβ配体不改变MAP激酶活性，并且在ARO和FRO细胞中PDGFRβ不被盐I处理所影响(未给出数据)。这些结果表明c-Abl可能是本实验中所用的间变性癌细胞系中有活性的唯一的盐I靶标激酶。
6)c-Abl和p53的免疫组织学分析
将存档的固定组织切片用于免疫组织学研究得到了长崎(Nagasaki)大学医院伦理委员会的批准。由每个个体获得知情同意书。如以前(Hermann等，Int.J.Cancer 2001，92：805-11)所述进行免疫组织化学。简言之，将福尔马林固定的石蜡包埋组织的4μm切片脱蜡、热抗原解掩蔽(0.01mol/l柠檬酸盐缓冲液，pH6.0)，并在室温下暴露于第一抗体1小时。使用以下抗体：鼠单克隆抗-p53抗体、克隆DO-7(DAKO，Copenhagen，丹麦，1∶100稀释)和鼠单克隆抗-c-Abl抗体(24-11，Santa Cruz Biotechnology，1∶200稀释)。结合的抗体用生物素标记的第二羊抗小鼠IgG/IgM F(ab)2抗血清和过氧化物酶标记的链霉抗生物素(Jackson Immuno ResearchLaboratories，West Grove，PA，美国)显现。由两个独立的观察人员检查载玻片，该观察人员不了解所研究病例的病理学或临床数据。为了评价p53染色，评价4个高倍镜视野(×400)的阳性染色肿瘤细胞百分数。如以前在Hermann等，Int.J.Cancer 2001，92：805-11中所述，含＞10％染色细胞的肿瘤被确定为“强阳性”，含≤10％染色细胞的肿瘤被确定为“弱阳性”。根据以前报导的标准(Yanagawa等，Oral Oncol.2000，36：89-94)，用视觉分级系统对c-Abl免疫染色进行半定量，在该视觉分级系统中染色强度被分为等级0、1+、2+或3+。为了简化c-Abl水平与甲状腺癌的组织学特征的相关性，将这些组进一步分为“弱阳性”(0级、1+级)和“强阳性”(2+级、3+级)组。
结果：为了得到关于不同类型的人甲状腺肿瘤中c-Abl和p53表达的更多信息，对不同类型的手术切除肿瘤中的这些蛋白进行免疫组织化学染色(未给出数据)。在5/6(83％)的间变性癌中检测到c-Abl(综合核和胞质免疫染色)的高表达，而在滤泡状和乳头状癌中观察到显著更小的比例：2/9(22％)和1/8(12％)，p＝0.041和p＝0.026，费歇耳恰当检验(表4)。在肿瘤损伤周围的正常组织中以及在腺瘤性甲状腺肿情况下，观察到低水平的c-Abl表达。在所有间变性癌(6/6)中均检测到核p53染色图，而仅在小部分滤泡状和乳头状癌中检测到核p53染色图：分别为1/9和1/9；p＝0.0014和p＝0.005(费歇耳恰当检验)。所检查的良性甲状腺损伤(甲状腺肿)中仅1/10(10％)显示出弱的核p53表达。因此，免疫组织化学发现与在p53-突变的间变性甲状腺癌细胞系中观察到的c-Abl蛋白的过量表达一致。
肿瘤类型            强阳性c-Abl染色              强阳性p53染色
间变性滤泡状乳头状腺瘤性甲状腺肿  病例数5/62/91/80/10   ％83.322.212.50   P*-0.0410.0260.0014   病例数6/61/91/80/10 ％10011.112.50     P*-0.00140.005＜0.001
表4：在间变性、滤泡状和乳头状癌以及腺瘤性甲状腺肿中用免疫组织化学检测c-Abl和p53。对于c-Abl将切片用苏木精复染色，对于p53用甲基绿复染色。注意染色方式：c-Abl：核/胞质，p53：核(AC中)(未给出数据)。
7)盐I对FRO细胞的体内作用
小鼠异种移植模型：所有小鼠均在长崎大学(长崎，日本)动物设施中喂养，并且该研究中所述的所有动物实验均按照长崎大学医学院的《实验动物照管和使用指南》中所规定的原则和步骤进行。将混悬在RPMI 1640中的5百万个FRO细胞皮下注射至8周龄雌性BalB/c nu/nu小鼠(Charles-River Japan，东京，日本)的肋腹。用测径器每隔一天测量肿瘤大小并根据以下公式计算肿瘤体积：a2×b×0.4，其中a是最小直径，b是与a垂直的直径。肿瘤达到至少100mm3后，将小鼠随机分为实验组或对照组，每组5只动物。将在无菌水中的盐I溶液以50mg/kg的日剂量每天进行腹膜内注射，注射2周。对照组小鼠接受纯水注射。监测每只动物的体重、进食行为和运动活力作为综合健康指标。
统计分析：除非特别说明，否则数据以平均值±SD给出。分别使用“学生”t-检验和Mann Whitney U检验比较两组间参数和非参数数据。认为p值＜0.05是统计学显著的。
结果：为了检测盐I对甲状腺间变性癌的可能体内抗肿瘤作用，将FRO细胞植入无胸腺小鼠，并腹膜内注射盐I或赋形剂(H2O)。如表5中所示，在连续14天中每天一次施用50mg/kg盐I产生强的抗肿瘤效果。暴露于盐I的小鼠的体重和生理活动未受显著影响。
天数   0   2   4   6   8   10   12   14
平均值±SEM H2O   100   108±9.5   120±10.4   153±28   180±32   228±45   280±89   295±97
盐I 100   108±12   108±10   100±13   94±12   96±15   98±13   98±16*
n   5   5   5   5   5   5   5   5
表5：在植入无胸腺小鼠的FRO细胞中盐I的抗肿瘤效果。将每组动物(n＝5)用腹膜内注射盐I或安慰剂(H2O)进行处理。该表显示了实验组和对照组中以mm3表示的肿瘤生长动力学。*，将对照组和实验组进行比较P＜0.05。
本发明中表明特异酪氨酸激酶抑制剂、即盐I是抗含有突变p53的未分化甲状腺癌的潜在抗癌药。用盐I处理在p53缺失的FRO、ARO和NPA细胞系中诱导显著的生长抑制，但在含野生型p53的KTC-1和TPC-1中不诱导显著的生长抑制。类似地，盐I对用野生型p53稳定转染的FRO细胞没有作用，因此证明盐I的效果依赖于p53状态。在p53-突变的间变性癌细胞系ARO和FRO中，在临床可达到的浓度下观察到细胞抑制作用(IC50分别为5.9和7.8μM)。这些IC50值低于NPA细胞(IC50 16μM)和其它乳头状瘤细胞系中的IC50值。本研究集中于间变性癌细胞。流式细胞术显示盐I的生长抑制作用是由于使这些细胞系中的G2/M期或S晚期停滞。
盐I的细胞抑制作用已经不仅在CML中、而且在以PDGFR活性增加为特征的小细胞肺癌中以及在显示出强c-KIT酪氨酸激酶活化的胃肠基质瘤中被证明。
PT-PCR分析显示在所有细胞系中均存在c-Abl mRNA。PDGFRα、PDGFRβ和c-KIT的表达在间质性细胞系中检测不到或非常低，并且在其它细胞系中显示出各种模式。用蛋白质印迹发现：在间质性甲状腺癌细胞系ARO和FRO中c-Abl的水平与原代甲状腺细胞和乳头状癌细胞系相比显著更高。在p53-突变的乳头状癌细胞系NPA中，c-Abl水平也高于wt-p53乳头状癌细胞系TPC-1和KTC-1中的水平。此外，wt-p53稳定转染至间变性甲状腺癌细胞系FRO中减少了c-Abl蛋白的表达。与这些体外数据一致的是，免疫组织化学研究显示在大部分p53强阳性的间变性癌病例中观察到高水平的c-Abl阳性免疫染色。这些数据表明p53状态可影响甲状腺癌细胞中c-Alb蛋白的水平。
为了阐明盐I抑制细胞生长的机理，观察了其对c-Abl和ERK1/2、MAP激酶的磷酸化状态的影响。盐I以剂量依赖和时间依赖方式抑制ARO和FRO中的c-Abl激酶活性，但不能降低wt-p53细胞系中磷酸基-c-Abl水平。在所试验的任何一种细胞系中MAP激酶活性均不被盐I所抑制。因此，间变性癌细胞中药物诱导的生长抑制不由“受体型酪氨酸激酶-ras-MAPK”途径介导，而是与c-Abl激酶的抑制相关。
在盐I处理的FRO细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21cip1和p27kip1的表达增加并且细胞周期蛋白A和B1的表达减少。在另一种间变性癌细胞系ARO中观察到p27kip1、细胞周期蛋白A和B1的类似变化以及细胞周期蛋白D3的表达减少，但在KTC-1和1F3 wt-p53细胞中未观察到。因此，用盐I处理诱导p53-缺失的甲状腺细胞系中S晚期或G2/M期过渡的停滞。值得注意的是p21cip1过量表达与包括p53缺失/突变的T98G细胞在内的一些其它模型系统中的S-期停滞相关(Potapova等，J.Biol.Chem.2000，275：24767-75)。与我们的发现一致的是，暴露于盐I增加过量表达BCR/ABL的丧失IL-3的祖-B(pro-B)细胞系BaF3-p210中p27kip1的mRNA和蛋白质水平(Parada等，J.Biol.Chem.2001，276：23572-80)。因此，似乎表明盐I对c-ABL激酶活性的抑制可通过改变细胞周期调节剂的表达/活性而导致细胞生长抑制。盐I如何上调p21cip1和p27kip1的一个可能解释如下：c-ABL激酶可以磷酸化PKC-δ，导致c-Jun NH2末端激酶(JNK)活性增加(Sun等，J.Biol.Chem.2000，275：7470-3)。我们最近的工作还表明：在ARO细胞中，胞内信号转导级联PKC-δ-MKK7-JNK被活化(Mitsutake等，Oncogene，2001，20：989-96)，并且JNK特异性反义寡核苷酸已经显示出与p21cip1诱导一起诱导S-期停滞。因此，盐I对c-ABL-PKC-δ-MKK7-JNK级联的抑制可能是造成p53-突变的甲状腺癌细胞系生长抑制的原因。总之，我们的结果证明c-Abl在p53突变/缺失的间变性甲状腺癌细胞系中被过量表达，并且盐I对c-Abl活性的选择性抑制在这些细胞中具有明显的细胞抑制作用。另外，盐I有效地抑制植入免疫受损小鼠中的FRO细胞的体内生长而无明显副作用。因此，盐I的用途是人间变性甲状腺癌的潜在抗癌治疗方法。
实施例2：含4-(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶 基]氨基]苯基]-苯甲酰胺甲磺酸盐，β-晶形的胶囊剂
用以下组合物制备含有相当于100mg化合物I(游离碱)的119.5mg盐I作为活性物质的胶囊剂：
组合物
盐I                      119.5mg
纤维素MK GR              92mg
交联聚维酮XL             15mg
Aerosil 200              2mg
硬脂酸镁                 1.5mg
                         230mg
通过混合各组分并将混合物填充入1号硬明胶胶囊中制备该胶囊剂。
实施例3：含4-(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶 基]氨基]苯基]-苯甲酰胺甲磺酸盐，β-晶形的胶囊剂
用以下组合物制备含有相当于100mg化合物I(游离碱)的119.5mg盐I作为活性物质的胶囊剂：
组合物
活性物质                 119.5mg
微晶纤维素               200mg
PVPPXL                   15mg
Aerosil                  2mg
硬脂酸镁                 1.5mg
                         338.0mg
通过混合各组分并将混合物填充入1号硬明胶胶囊中制备该胶囊剂。
实施例4：盐I用于治疗难治的进行性甲状腺癌的临床研究方案
A-研究对象-入组标准
1)患有有转移性损伤的甲状腺癌且体能状况为0至2(见下表)；并且原则上，具有暗示为自乳头状或滤泡状癌向未分化癌转化的疾病临床恶化，该恶化对其它治疗不应答或不可能应答。
2)年龄20至80岁。
3)开始治疗前具有可通过CT/MRI成象和肿瘤标志物(甲状腺球蛋白)评价的损伤。
4)具有一定程度的心脏、肺和肾功能，并且无严重出血倾向；即原则上满足以下标准：
a)超声心动描记术显示射血分数＞50％，进入研究前一年内无缺血性心脏病史。
b)无论是否存在肺转移，血气分析中pO2＞60mmHg。
c)无论是否存在肝转移，血清胆红素＜2mg/dL。
d)血清肌酸酐＜2mg/dL。
e)白细胞≥2000/mm3，且血小板≥50000/mm3。
f)PT＞50％，APTT＜50秒，Fbg＞100mg/dL，且FDP＜20μg/mL。
5)无难以控制的活动性感染。
6)同意参加该研究并递交填写好的知情同意书。
             体能状况(PS)(由SWOG制定)
    等级 体能状况
    0 无症状。能不受限制地进行所有正常社会活动；能以与该疾病发生前相同的方式行动。
    1 轻微症状。在身体费力的活动中受限制，但可走动并能进行轻微的劳动(例如家务、办公室工作)。
    2 可走动并能自理，有时需要少许帮助；不能进行任何劳动；清醒时间中50％以上的时间起床走动。
    3 仅能有限自理，有时需要帮助；清醒时间中50％以上的时间卧床。
    4 完全丧失能力；不能进行任何自理；需要完全帮助；完全卧床。
这些标准是体能状况的指标。当局部活动受限时，进行临床评价。
B-研究方法
该临床研究是I/II期临床研究的一部分，其性质是探索性的。
1.治疗方案
盐I以相当于400mg化合物I的剂量每天饭后施用一次。如果有效并且不产生副作用或仅有轻微的可接受的副作用，则继续盐I治疗达最长6个月。当发生任何轻微副作用时，根据副作用的程度将剂量减少至200mg，每天一次。治疗2个月时，评价盐I的有效性并作出之后的治疗决定(继续治疗、剂量增加、中断治疗等)。原则上，当肿瘤大小减半时，剂量增加至高达800mg/天并继续治疗达最长6个月。如果治疗2个月时肿瘤大小更大，或如果肿瘤大小保持不变但优选与肿瘤相关的症状的任何进一步改善，可能时考虑进行放射治疗和盐I治疗的组合治疗。原则上不允许伴随使用抗癌药。可以伴随使用减轻其它病症或症状的药物并小心它们的副作用。
2.有效性评价
在治疗1、2、3、4、5和6个月时基于(1)通过生理学发现和肿瘤一致性变化确定的病症的改善；(2)通过成象确定的肿瘤大小；和(3)肿瘤标志物的变化来评价盐I的有效性。
评价项目
(1)对象的背景要素：医疗记录号、身份证号、姓和名的首字母、性别、出生日期、身高、体重；并发症、既往疾病、目前疾病、既往治疗、家族史；
(2)化合物I的剂量；
(3)依从性和伴随用药记录；
(4)主观症状和客观发现；
(5)血压和脉搏率；
(6)血液学(红细胞、白细胞、血小板、分类WBC)：每月两次；
(7)生物化学(肝功能、肾功能、血糖、LDH、CPK)：每月两次；
(8)肿瘤标志物(甲状腺球蛋白)：每月一次；
(9)肿瘤所在部位、肿瘤大小和CT或MRI成象显示的浸润程度：每两月一次；
(10)X线胸透(正面)：每两月一次；
(11)与肿瘤相关的症状检查；
(12)尿分析。
C-初步结果
第一个患者在2002年12月进入临床研究。开始盐I治疗而无任何其它治疗。与前一年中肿瘤的快速生长和侵害相比，肿瘤已停止生长3个月。

Claims (8)

1.式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可药用盐在制备治疗间变性甲状腺癌的药物中的用途：
Figure A038173750002C1
2.式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可药用盐在治疗间变性甲状腺癌中的用途。
3.治疗患有间变性甲状腺癌的人的方法，该方法包括向需要这种治疗的所述的人施用抗所述疾病有效剂量的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可药用盐。
4.权利要求3的方法，其中向成年人施用日剂量为50至600mg的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺。
5.权利要求3的方法，其中施用式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的单甲磺酸盐。
6.权利要求3的方法，其包括向人类对象施用药学有效量的式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可药用盐，每天施用一次，施用时间超过3个月。
7.权利要求1至6中任一项的用途或方法，其中式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺是其甲磺酸盐形式且是β晶形。
8.权利要求1至7中任一项的用途或方法，其中间变性甲状腺癌含有突变的p53。
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