CN1670190A - 干燥保存生物液体样品的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物液体样品的干燥保存方法，其包括将所述生物液体样品与一种平均粒径为0.1到5毫米的颗粒载体相接触，并从吸收了液体样品的颗粒载体中除去液体成分。本发明还提供一种用于本发明方法的装置。

Description

干燥保存生物液体样品的方法和装置

技术领域

本发明涉及一种以颗粒材料为基础的生物液体样品的干燥保存方法，特别是小量生物样品的干燥保存方法。本发明还涉及用于生物液体样品干燥、保存的装置。

背景技术

科学研究中的生物样品采集、保存、运输、重组、回收是进行各种实验科学研究、医学临床各种指标检测的先决条件。液体生物样品是生命科学研究中最为广泛采用的生物样品形式，如何使用最为简便经济有效的方法保持原样品内容物的有效活性(包括结合活性和生物活性)、完整性(如细胞和其它有形成分)、样品重组回收后其浓度的准确性以及生物样品处理全过程中的安全性是生物学、医学、医药、生物技术领域需要解决的基本问题之一。多年来，科学工作者们为此作出了不懈地的努力。

目前，液体样品的保存方法主要分为液态低温保存(摄氏2-8度)；冷冻保存(摄氏-20～-200度)；冷冻(摄氏-60度以下)干燥保存；低温干燥保存(摄氏2-8度)；和常温干燥保存(摄氏10～30度或环境温度)。

现存的上述方法各自存在不同的缺点：例如常温环境中容易导致生物液体样品所含成分在短期内迅速降解或细菌霉菌繁殖等造成原始液体样品性质的改变；低温环境中液体样品不宜作长期保存；冷冻液体样品保存需低温冰箱持续使温度保持在摄氏零度以下，给样品运输带来不便；冷冻干燥液体样品虽然可获得满意的样品回收效率，但其造价过高而不适于单个或小批量液体样品的处理；目前的常温干燥样品保存方法虽然解决了液体样品的干燥保存运输问题，但在样品液体回收、重组和后续分析处理时存在很多缺陷。

Robert Guthrie于1963年首次利用Schleicher & Schuell Bioscience公司(S&S公司)的903滤膜(后称Guthrie Card)收集新生儿血样进行PKU筛查以来，该滤膜已广泛应用生物液体样品的干燥保存。但由于该样品吸收基质为纤维素构成，当吸收液体样品如血液经干燥后行成一种纤维/样品实体结构，给液体样品的重组和回收造成很大困难，使其应用范围受到很大限制。综合起来，这种以纤维素膜作为液体样品吸收基质的主要缺点是样品重组费时，一般至少需30分钟至数小时，并需加热处理以促进样品复溶；回收效率低，由于干燥后形成的样品纤维素膜基质为无间隙实质结构，故极难以再次使干燥样品水化；且纤维素膜对样品成分的吸收和吸附作用造成低回收率，其最佳回收率在短时间内低于50％。

另外，对干燥后生物血液中的细胞成分回收是进行细胞学研究的必要前提。Joseph(USA；Pat.No.：5432,097)于1993年描述了利用酶学消化纤维素膜(Guthrie Card)方法进行干燥血液的白细胞回收。但该方法程序需要用用纤维素酶降解纤维素膜，因此费时、成本高。

因此，本领域需要一种简便、快速、而且样品回收率高的液体样品干燥保存方法。

发明内容

本发明提供一种生物液体样品的干燥保存方法，其包括将所述液体样品与一种平均粒径为0.1mm到5mm的颗粒载体相接触；和从吸收了液体样品的颗粒载体中除去液体成分。

根据本发明的一个实施方案，所述颗粒载体是由选自下组的一种或多种材料构成的：聚合物材料、生物来源的材料、金属材料和无机非金属材料。

根据本发明的另一实施方案，所述生物液体样品是生物体液、人工配制的生物液体样品或液体生物试剂。

本发明还提供一种用于干燥保存生物液体样品的装置，其包括一种平均粒孔径为0.1mm到5mm的颗粒载体。

按照本发明的方法和装置，可以实现液体样品的快速、简便的干燥保存，而且与现有技术方法相比可以快速、高效地回收样品。

附图说明

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。

图1是显示利用本发明的方法进行血液样品干燥、保存和回收、重构过程的示意图。图1A-D分别表示未加样之前的颗粒载体、吸收液体样品(全血)后的颗粒载体、脱水后的载样颗粒载体和血液样品的重构。

图2是从按本发明方法保存的血样所回收基因组DNA的电泳图。图中，M为分子量标志；“1-4”分别为从4份干燥保存在本发明固体载体上的血样提取的DNA。每个样品的上样量为1微克(DNA)。

具体实施方式

本发明的发明人经过广泛的研究，发现利用一定粒径范围内的颗粒载体不仅可以快速吸收、干燥液体样品，而且干燥的样品容易从载体上用水或其他溶剂洗脱下来，从而快速、高效地回收、重构样品。

因此，本发明提供一种液体样品的干燥保存方法，其包括将所述液体样品与一种平均粒径为约0.1mm到约5mm的颗粒载体相接触；和从吸收了液体样品的颗粒载体中除去液体成分。

本发明方法中，所用颗粒载体的平均粒径优选为约0.5mm到约3mm之间，更优选在约1mm到约2mm之间。

本发明中的颗粒载体可以是任何材料制成的，例如选自下组的一种或多种材料：聚合物材料、经化学处理或未处理的生物来源的材料的材料、金属材料和无机非金属材料。在一个优选的实施方案中，本发明的多孔固体材料是无机非金属材料。

本发明载体颗粒可以是实心的，也可以是空心的。本发明的载体颗粒可以是表面无孔的，也可以是表面具有开孔的。当本发明的载体颗粒为表面开孔结构时，优选所述开孔的孔径在在0.05-1mm，最优选在0.1-0.5mm范围内。优选所述颗粒表面的开孔是开放式的，即开孔的直径从颗粒内部到颗粒表面是逐渐增大的。当本发明的载体颗粒是多孔性颗粒时，优选该颗粒具有一定的硬度，以避免承载液体后，由于液体重力作用或干燥过程使多孔结构发生塌陷，导致干燥后载样颗粒的孔隙率低于颗粒原孔隙率的20％，不利于样品的重构。

本发明的颗粒载体可以是疏水性的或者亲水性的。在本发明的一个实施方案中，所述颗粒载体是亲水性的。

本发明的颗粒载体可以由聚合物材料制成。所述聚合物材料可以是非生物相容性和/或生物可降解性的，也可以是生物相容性和/或生物可降解的。处于环保的考虑和对于活细胞、微生物样品的保存，优选本发明的聚合物材料是生物相容性和/或生物可降解的。

生物相容性和/或生物可降解性聚合物材料的例子有：羟基羧酸酯，如聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)、3-羟基丁酸酯与3-羟基己酸酯共聚物(PHB-HH)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯；聚原酸酯、聚酸酐等。对于血液相容性而言，具有优良抗凝血性的聚合物材料例如有：亲水性材料如聚甲基丙烯酸β-羟乙酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酰胺和聚乙烯基吡咯烷酮；疏水性材料如硅橡胶；具有微相分离结构表面的高分子材料如聚醚氨酯；和带负电荷表面的材料如表面蒸镀平滑碳膜的涤纶和泡沫状聚四氟乙烯。

非生物可降解性材料的例子有：聚醋酸乙烯酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯等。

所述聚合物颗粒材料可以按现有技术方法方便地获得，所述聚合物颗粒材料的粒径也可以按常规方法来控制，从而获得适于具体应用的颗粒材料。

本领域技术人员已知，几乎所有的热固性和热塑性树脂都能制成颗粒聚合物材料。经常用于制备颗粒聚合物材料的聚合物有：聚苯乙烯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚甲醛、聚酯、聚苯醚、聚砜、酚醛树脂、氟树脂、脲醛树脂、三聚氰胺树脂、不饱和聚酯树脂、环氧树脂、有机硅树脂等。

常规用于生产聚合物颗粒材料的方法包括挤出成型、模压成型、注射成型等。

作为本发明载体的颗粒材料可以由金属或合金制得。

可以用作本发明载体的无机非金属材料包括陶瓷、玻璃、水泥、耐火材料、各种矿石、砂粒等。这些材料可以通过本领域的常规方法制成颗粒材料。无机非金属材料的化学组成包括硅酸盐、其它含氧酸盐、氧化物、氮化物、碳与碳化物、硼化物、氟化物、硫系化合物、硅、锗、II-V和II-VI族化合物等。

本发明的载体颗粒可通过粉碎筛分方法制备，即首先使用粉碎设备将物料破碎，然后用筛网分级筛选出需要的物料颗粒。粉碎设备包括机械粉碎机、气流式粉碎机、自击式破碎机、反击式破碎机、球磨机、研磨机、砂磨机等。自击式破碎机适用于耐火材料、水泥、石英砂、钢砂、炉渣粉、铜矿石、铁矿石、金矿石、混凝土骨料、沥青骨料等多种硬、脆物料的细碎与中碎。反击式破碎机适用于石灰石、白云岩、页岩、砂岩、煤、石棉、石墨和岩盐等中等硬度物料。

本发明的载体颗粒还可通过搅拌法造粒、压力成型法造粒、喷雾和分散弥雾法造粒、热熔融成型法造粒等方法制备。

例如，本发明的载体颗粒可为石英石颗粒、大理石、云母石颗粒、金刚石颗粒、陶瓷颗粒、蜡颗粒、玻璃颗粒(玻璃微球)、各种橡胶颗粒、各种塑料颗粒(塑料微球)、各种尼龙颗粒、各种树脂颗粒、聚乙烯颗粒、聚丙烯颗粒、聚苯乙烯颗粒、各种葡聚糖颗粒(Sephadex；Sepharose)、各种金属颗粒、磁性颗粒等。

球形颗粒的粒径为其直径，立方形颗粒的粒径为其一边之长。形状不规则的颗粒，其粒径定义为通过颗粒重心，连结颗粒表面上两点间诸线段长度的统计平均值。在实际测量中，常以一定数量的颗粒即颗粒系统为对象，测量与其粒径相关的某些物理特性量而计算粒径值。被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或其组合)最相近时，就把该球体的直径(或其组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒径分布)。

本发明颗粒载体的平均粒径可以按本领域的常规方法测定。例如，筛分法、图像分析法、沉降分析法、电学分析法、光学分析法等。用筛分方法测量颗粒的粒径分布时，根据测量要求的粒径范围和粒径分布间隔，选则筛孔大小，按筛“上大、下小”顺序将筛套在一起，收集盘放在底部。准确称量样品(通常100g样品称至0.1g，50g样品称至0.05g)，将样品转至套筛最上一层筛中。密封套筛后将套筛装在振筛机上振摇筛分。筛毕，仔细从套筛中取下每一只筛，把筛面上的粉末倾倒在光滑的纸上。夹在网孔和网框底缝中粉末，用软毛刷扫到相邻下(小)一级筛内。称量每只筛筛面上和底盘内收集的粉末质量，100g样品称至0.1g，50g样品称至0.05g。所称取粉末的加和量在不小于取样质量的99％。由每一级筛面上所获颗粒质量和收集粉末总量之比，算出颗粒在该筛孔尺寸范围内(大于该层筛孔径，小于上一层筛孔径)的质量分数，由此画出粒径与不同粒径下微粒数的分布图，分布曲线中峰值对应的颗粒尺寸为平均粒径。

本发明的颗粒载体可以不经任何处理，直接使用。但为了防止污染样品，优选用水、清洁剂水溶液清洗，或用酸或碱溶液浸泡。例如所用酸性溶液的PH在5.0以下，而碱性溶液的PH在8.0以上。用酸或碱处理后的固体载体可用水继续清洗，以去除残余的酸或碱成分。也可以视情况，在用酸或碱处理后不清洗，使固体载体仍然保持在酸或碱环境中直至脱水干燥。

根据具体应用目的的不同，本发明的颗粒载体可以是经过下列一种或多种方法特殊处理的。

对颗粒载体进行加热处理；高压灭菌处理；紫外线照射；放射性照射；防腐剂类处理；抗菌素类处理；抗霉菌素类处理；有机溶剂类处理，有机溶剂的例子有乙醇、异丙醇、丙酮、氯仿、酚类、醚类等；去垢剂类处理，去垢剂的例子有吐温类(TWEEN-20、TWEEN-60、TWEEN-80、TWEEN-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton类(Triton X-100、Triton X-114、Triton X-200)等；抗凝血剂类处理，抗凝血剂的例子有肝素、枸橼酸钠(盐)、乙二胺四乙酸(EDTA)等。

例如可以用含蛋白的液体封闭颗粒载体内外表面的蛋白结合位点，防止样品中蛋白分子的吸附导致样品回收效率的下降。

再例如，可以通过化学方法在颗粒载体的表面上联结各种化学基团以利于吸附液体样品中的内含物，例如氨基、羧基、羟基、烷基或其它化学基团。

还可能通过物理或化学方法在载体上包被或联结适当的分子如各种蛋白分子、核酸分子、酸酸底物等，借以特异性或非特异性地捕获样品中所含的相应成分。有利于特异性地回收某一种或某一类生物样品成分。

本发明中的生物液体样品定义为任何以液体状态存在的在水性或非水性溶剂中含有待保存生物物质或生物试剂的混合物。所述样品混合物可以是溶液、悬浮液、乳液或其他任何液体形式。

例如本发明的生物液体样品可以是生理或病理性生物体液：血液、汗液、尿液、脑脊液、脊髓液、关节腔液、阴道分泌液体、精液、血浆、血清、羊水、乳汁、胸腔液、腹腔液、骨髓液、唾液、胆汁、泪液等其他生物体在正常生理状态和疾病状态下所产生的任何液体。

本发明的生物液体样品也可以是经人工配制而成的液体样品，例如含细菌、霉菌、真菌、寄生虫等的液体，各种生物组织的液态提取物如生物各种细胞或/和组织提取物(心、肝、脾、肺、肾等的液体提取物)和各种植物细胞的液体提取物等。

本发明的生物液体样品还可以是含有固体溶质的液体生物试剂，如各种缓冲液以及由其配制的液体。由所述液体试剂配制的液体例如为含蛋白质、核酸、细胞、血小板、细菌、质粒、病毒颗粒、寄生虫、精液、阴道分泌物等的液体。

在利用本发明的方法进行生物液体样品干燥保存的过程中，可以加入能够提高生物活性物质耐受干燥和提高保存能力的保护剂。这样的保护剂是本领域技术人员已知的。例如多元醇，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木酮糖、核糖、甘露糖、果糖、棉子糖、海藻糖等糖类；山梨糖醇等糖衍生物；合成聚合物，如聚乙二醇、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺；多聚糖如聚蔗糖和葡聚糖；蛋白质；以及上述物质的组合。

对于血小板的保存，例如可以加入的保护剂的例子有血清蛋白、酪蛋白水解物、聚乙烯基吡咯烷酮和羟乙基淀粉。

对于核酸如RNA、DNA、寡核苷酸等的保存，可以加入SDS、胍类、TWEEN类、Triton类、尿素、Tris、苯酚类、EDTA、乙醇等。

在本发明的一个优选实施方案中，所述生物液体样品是人或动物的全血样品或血液成分的样品。

生物液体样品加入固体载体后的脱水干燥可在自然室温蒸发条件下进行，也可加热(如在摄氏37-100度的烘箱内)、热风(如吹风机)、减压条件下加速液体样品的液体成分的去除形成干燥样品。

本发明的方法特别适于小量生物液体样品的干燥和保存。例如干燥前液体样品的体积为约500毫升以下，优选约100毫升以下，更优选50毫升以下，最优选10毫升以下。

如上所述，本发明还提供一种用于干燥保存生物液体样品的装置，其包括一种平均粒径为0.1-5mm的颗粒载体。上述关于本发明方法的描述和优选条件同样适用于本发明的装置。

在本发明的装置中，颗粒载体可以呈任何立体形状，例如球形、圆柱形、立方体形、长方体形、三角体形、圆环或半圆环状、螺旋状、二棱体形、三棱体形、多棱体形或不规则形状等。

本发明的装置中，本发明的颗粒载体可以被容纳在任何形状的支持体或容器中，优选是本领域常用的生物样品采样、保存、运输、处理、及后续处理所用的容器，例如试管、离心管、透析管、培养皿、样品保存卡(card)等。优选本发明颗粒载体的表面由一种允许生物液体样品通过而阻止颗粒载体通过的片状材料覆盖。更优选本发明的颗粒载体被包封在由所述支持体或容器和所述片状材料构成的封闭空间中。对上述片状材料的性质没有限制，但优选由非吸附性材料构成，例如金属网、烧结玻璃网、织物、尼龙网或其他高分子材料制成的网状结构等。

按照本发明吸收干燥的样品易于通过洗涤、离心等常规操作从固体载体中回收，并重构液体样品。重构的液体样品可用于样品内含物的检测、提纯等后续操作和应用，例如各种蛋白、离子、维生素、抗原、抗体、细胞、核酸等的检测和纯化。

按照本发明方法，样品内含物的回收快，回收率高。例如样品的回收操作可以在数秒到数分钟的时间内完成。按照本发明干燥保存的样品，回收率可以达到至少约70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％。

本发明的方法和装置优选地可应用于各种生物细胞的干燥保存。例如血液中的红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板等的干燥保存。在吸收含细胞的液体样品前优选对固体载体预先进行处理，如用含蛋白液体包被封闭、使用一定浓度的细胞固定剂如福尔马林、醛类、醚类、醇类等有机溶剂处理。当样品中的细胞成分与上述防腐剂或固定剂接触时可使细胞成分得到固定并随后脱水干燥，形成固定化的脱水干燥的细胞样品。该样品在加入适当溶剂后，细胞可再次得以水化，重新恢复原有的结构形式，可进一步应用于细胞的组织化学染色、免疫组化染色、免疫荧光染色、细胞表面分子的检测、特定细胞的分选或纯化，如用磁珠或利用流式细胞仪分选细胞或分类检测等。

本发明的方法和装置优选结合适当的稳定剂应用于各种蛋白质分子、尤其是各种抗原、抗体、各种酶的脱水干燥或玻璃化保存。本发明方法的优点在于当上述分子处在脱水干燥状态或玻璃化状态时可长期稳定地保持其结合活性和/或酶活性。当加入溶剂时上述成分可在短时间内(通常5分钟内)迅速水化、均匀分布在液相中，从而能与相应的配体或底物进行有效反应。

本发明的方法和装置还优选地应用于血液样品的采集、干燥和保存。在血液样品采集前可对固体载体进行抗凝剂处理或直接混入抗凝剂，例如肝素、EDTA二钠。血样采集直接采取手指穿刺采血或脚底穿刺(婴儿)采血方法。让血滴直接滴入颗粒载体，然后脱水干燥形成抗凝干血微粒和固体载体的混合物。也可以通过常规静脉穿刺采血，使用加样器将血液定量转移到上述多孔载体上。当样品重构时，例如加入约相当于原血样容积的溶剂(通常为纯水或蒸馏水)可迅速获得与原样品接近的重构血样，可用于进一步检测分析等后续处理。根据应用目的不同，也可不使用抗凝剂直接将血滴入未用抗凝剂处理的颗粒载体中制成干血样品。

实施例

实施例1

利用玻璃颗粒材料干燥保存血样

取2毫升平均粒径为约2毫米的玻璃小珠。将所述玻璃小珠用金属网固定于离心管盖子的内表面。将0.5毫升加有肝素的全血样品均匀加载在上述玻璃小珠上。将上述加载了血液样品的装置置于通风处室温干燥。将载有干燥样品的盖子与离心管密合，直到使用时。

与此平行，另外一份同样来源的0.5毫升血样直接用于测定血红蛋白含量。

实施例2

干燥血样的回收

将按实施例1获得的带有干燥样品的离心管打开，在离心管中加入约0.6毫升去离子水。盖好盖子，将离心管颠倒，使水与玻璃小珠接触约5分钟。然后，盖子朝上将离心管甩动几次或稍微离心，即获得重构的血液样品。

通过测定样品的血红蛋白含量，并与实施例的对照血红蛋白含量比较，计算得出血样的回收率为约96％。

实施例3

利用砂粒干燥保存血样

按照与实施例1同样的方法操作，但用粒径范围为0.8-2.0mm的砂子代替玻璃小珠。按照实施例2的同样方法操作，回收血样。以血红蛋白的量计，血样的回收率为约93％。

实施例4

从干燥血样中提取基因组DNA

将0.25毫升血样按照实施例1的方法干燥并保存。在带有载血样载体的1.5毫升离心管中加入1毫升血红细胞溶解液，使其与载样固体载体接触5分钟。振摇试管，在Eppendorf离心机上以最大速度离心15秒。吸弃上清液。再加入1毫升血红细胞溶解液，振摇试管后离心，吸弃上清。

在试管中加入0.3毫升DNA释放液，与白细胞沉淀混匀并静置5分钟。然后，加入0.1毫升蛋白沉淀液，混匀，离心5分钟。

将含有基因组DNA的上清液转移到一试管中，测定DNA浓度。按常规方法进行电泳，鉴定DNA的质量(结果见图2)。

以相同来源的0.25毫升新鲜血样作为平行对照。

结果4次实验的平均DNA回收量为35微克，而从新鲜血液的平均回收量为36微克。

实施例5

血清T3、T4和TSH的回收

将0.2毫升血清加入与实施例1同样的载体中，室温下干燥3小时。密封后在室温下保存1个月。

将上述带有干燥血清样品的颗粒载体与0.2毫升蒸馏水接触10分钟。离心后取出上清。以化学发光免疫法分别测定T3、T4和TSH的浓度。同时对冻存的相同来源的血清样品进行同样的测定。

结果发现，上述各因子的三次实验的平均回收率(相对于冻存样品)均接近98％。

Claims (12)

1.一种生物液体样品的干燥保存方法，其包括将所述液体样品与一种平均粒径为0.1mm到5mm的颗粒载体相接触；和从吸收了液体样品的固体载体中除去液体成分。

2.根据权利要求1的方法，其中所述颗粒载体的平均粒径为0.5mm到3mm。

3.根据权利要求2的方法，其中所述颗粒载体的平均粒径为1mm到2mm。

4.根据权利要求1的方法，其中所述颗粒载体是由选自下组的一种或多种材料构成的：聚合物材料、生物来源的材料、金属材料和无机非金属材料。

5.根据权利要求1的方法，其中所述颗粒载体是通过粉碎筛分法、搅拌法造粒、压力成型法造粒、喷雾和分散弥雾法造粒、热熔融成型法造粒获得的。

6.根据权利要求4的方法，其中所述聚合物材料是通过挤出成型、模压成型、注射成型制备的聚合物颗粒。

7.根据权利要求4的方法，其中所述无机非金属材料是由陶瓷、玻璃、水泥或耐火材料制成的颗粒材料。

8.根据权利要求1的方法，其中所述从固体载体中除去液体成分是通过风干进行的。

9.根据权利要求1的方法，其中所述从固体载体中除去液体成分是在减压下进行的。

10.根据权利要求1的方法，其中所述液体样品是生物体液、人工配制的生物液体样品或液体生物试剂。

11.根据权利要求8的方法，其中所述生物体液是血液或其组成成分。

12.一种用于干燥保存液体样品的装置，其包括一种平均粒径为0.1mm到5mm的颗粒载体。