CN1669585A - 一种肿瘤治疗剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤的基因治疗。更具体而言，本发明涉及一种新的肿瘤治疗剂和其用途。本发明的肿瘤治疗剂含有人类免疫缺陷病毒Vpr基因，该基因处于一种启动子的控制之下，在肿瘤组织中特异性表达。该肿瘤治疗剂可用于肿瘤的治疗，也可以作为肿瘤化学治疗或者放射治疗的增强剂。

Description

一种肿瘤治疗剂及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤的基因治疗。更具体而言，本发明涉及一种新的肿瘤治疗剂和其用途。

背景技术

肿瘤是当前危害人类健康最主要的疾病之一，发病率在不断提高，目前已成为人类最主要的死因之一。据报道，1997年美国死于肿瘤的预期人数是56万人，新发病例为138万余人，在全死因中占第二位。1990-1992年全国27个省、市、自治区的抽样调查结果表明，我国恶性肿瘤在死因顺位中也是第二位，仅次于呼吸系统疾病，肿瘤粗死亡率为108.26/10万，占死因构成的17.94％。最近，专家估计，肿瘤引起的死亡占我国每年死亡人数的20％，每年发病人数在160万人以上。可以相信随着我国工业化、城市化程度的提高和环境污染的不断加剧，其对我国人民健康的危害将不断加大。因此开展恶性肿瘤的防治研究具有十分重要的意义。

虽然肿瘤临床治疗已取得了很大进展，但迄今仍无特效的治疗药物。对于恶性肿瘤的治疗，目前主要有手术、放疗和化疗及联合方案。前两者主要适用未转移的肿瘤(手术治疗仅适用于实体肿瘤)，不适用于转移肿瘤。化学治疗实际上是应用最广泛的治疗方法，目前已用到各种肿瘤的治疗，对于少量肿瘤可达到根治或延长病人生存时间的效果。化学药物的抗癌原理是通过产生阻碍细胞生长、复制的不利环境而使细胞死亡，这些机制包括打乱细胞必需酶的合成、抑制DNA、RNA和蛋白质合成、阻止细胞有丝分裂等。为提高疗效，这类药物的使用剂量都非常高，因此也对正常分裂的机体细胞产生杀灭作用，其治疗结果是使病人元气大伤，玉石俱焚：短期毒副作用包括脱发、发热、头疼、呕吐等，长期使用则对心、肾、肺和生殖系统产生不可逆转的损害和其它潜在危险。化疗、放疗的另一个更大障碍是药物治疗一定时间后肿瘤细胞会产生耐药性最终导致病人无药可用、治疗失败。因此，研制高效、低毒、对于肿瘤具有高度特异性的药物始终是抗肿瘤药物发展一个方向。

基因治疗是医学上的第四次革命，为攻克肿瘤治疗这一难题带来了希望。其原理是将目的基因通过人工方式导入人体特定细胞内，使其成为宿主细胞的一部分，目的基因的表达产物对疾病产生治疗效果。在此过程中外源基因可整合入宿主基因组内，也可以不发生整合。与重组蛋白药物相比，基因治疗具有成本低、容易生产和保存、产品稳定性好、疗效持久、副作用低、可控性好、可实现靶向给药等优点，并且从理论上讲几乎所有基因均可用于基因治疗，因此可开发的药物种类远远大于蛋白质。正因为基因治疗有如此众多的优点，在短短10余年时间里得到飞速发展。至1998年，世界上共记录有3000多例基因治疗病例，美国1700例，针对肿瘤的基因治疗成为研究重点，在现有基因治疗方案中恶性肿瘤占68％。但是肿瘤基因治疗目前存在的问题是有效基因种类较少、特异性仍不理想，严重影响了治疗效果，因此筛选、应用更多、更新的治疗基因并研究其特异性导入和治疗技术一直是肿瘤基因治疗的难点和热点。

肿瘤基因治疗目前需要解决的问题有以下几方面：一是有效的治疗基因，要求能杀灭对现有化疗、放疗耐药的肿瘤细胞；二是给药要能实现特异性或靶向性，以提高效率并降低毒副作用；三是基因转移载体要高效。

发明内容

本发明的特征是利用肿瘤特异性启动子或诱导型启动子控制新型肿瘤杀伤剂HIV Vpr基因的表达作为基因治疗药物，以实现对肿瘤的特异性杀灭作用。

人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体。Vpr基因是HIV-1的非结构基因，编码一15KD的病毒蛋白。Vpr基因的功能目前已经成为HIV研究的热点。Vpr在HIV病毒的生命周期中扮演着非常重要的角色，它可被组装入病毒整合复合体，并将病毒整合复合体带入宿主细胞核中，激发病毒复制。此外它还对宿主细胞的生活周期进行一系列的调控，例如，多项研究表明，Vpr可干扰细胞周期循环，诱导细胞停滞在细胞周期的G2/M期而阻止细胞的增殖，还能诱导细胞凋亡等。(可参见Yao XJ，Subbramanian RA，Rougeau N，et al.Mutagenic analysis ofhuman immunodeficiency virus type 1 Vpr：role of a predicted N-terminalalpha-helical structure in Vpr nuclear location and virion incorporation.J Virol，1995，69：7032-7044.Stewart SA，Poon B，Jowett JBM，et al.Lentiviraldelivery of HIV-1 Vpr protein induce apoptosis in transformed cell.Proc NatlAcad Sci USA，1999，96：12039-12043.Chen MZ，Elder RT，Yu M，et al.Mutation analysis of Vpr-induced G2 arrest，nuclear location and cell death infission yeast.J Virol，1999，73：3236-3245.Zhao Y，Yu M，Chen MZ，et al.Pleiotropic effects of HIV-1 protein R(Vpr)on morphogenesis and cellsurvival in fission yeast and antagonism by pentoxifylline.Virology，1998，246：266-276.)

本研究选择HIV Vpr作为治疗基因，是因为HIV Vpr基因用于肿瘤的治疗具有更巨大的潜力。其原因在于：

(1)HIV Vpr基因可使细胞停留在G2/M期，而长期的研究证明，处于G2/M期的细胞对放疗和化疗都很敏感，Vpr表达载体转入肿瘤细胞可提高放疗和化疗的疗效，尤其可有效杀灭对放化疗耐受的肿瘤细胞；

(2)Vpr引起细胞周期G2停滞的靶点是特异的(Cdc2)，而且对Cdc2的抑制是通过在抗癌治疗中最多用的靶标Cdc25和Wee1实现的；

(3)Vpr通过引起细胞凋亡和坏死可快速杀灭肿瘤细胞。

Vpr基因最终能否成功用于肿瘤治疗，其运载形式或导入方法是关键。由于Vpr干扰细胞周期，目前在各种细胞内都较难实现其高表达，故将其开发成蛋白药物在技术上有一定难度，在这种情况下进行基因治疗有其必然性。

由于Vpr对细胞的杀伤作用是普遍性的，缺乏细胞特异性，因此若将其直接插入持续表达型载体(如在CMV等启动子元件的控制下表达，其在哺乳动物细胞中的表达无特异性)进行导入，则Vpr对正常细胞也会产生非特异性杀灭作用，从而造成毒副作用并影响疗效。另外，若将Vpr直接插入持续表达型病毒载体(如在CMV等启动子元件控制下进行表达)，由于Vpr会杀死宿主细胞而影响病毒的生产。因此，由此推测用CMV等持续型表达启动子控制的Vpr表达在基因治疗中会对正常细胞也发生杀灭作用，从而影响其安全性和治疗效果。

为了避免Vpr的毒副作用，实现对肿瘤的特异性治疗本发明使用了组织(肿瘤)特异性启动子或/和诱导型启动子。已经发现一系列基因，它们在非病理条件下的人的组织细胞中很少显示活性或者没有活性，但是在某些类型肿瘤中开放或者上调。利用这些肿瘤特异性异常可进行肿瘤的特异性基因治疗。例如编码癌胚抗原(CEA)的基因的启动子，其在不同类型的腺癌中可被再激活。另一个例子如编码癌胚甲胎蛋白(AFP)基因的启动子，它在非病理条件下在胎肝中特异地有活性，在出生后非癌肝细胞内，因无特定的转录激活因子(AFP)，基本无活性，而在大部分原发性肝癌内AFP启动子则可被AFP反式激活。因此，不难理解，利用任何一种组织(肿瘤)特异性启动子都有望实现对肿瘤的相对特异性治疗。类似的启动子已经发现很多，如端粒酶启动子(多数肿瘤细胞内表达上调)、前列腺抗原启动子(PSA)、E2F-1启动子、Flk-1启动子、E-selectin启动子、HK-II启动子、c-ebrB2启动子、L-Plastin启动子、SLP-I启动子等。可以利用这些启动子实现对不同肿瘤的特异性抑制作用。

除了这些启动子，诱导表达型启动子也可以利用，已经发现一些基因，在常规条件下不表达，但是当受到外界条件诱导时则启动表达。例如，目前已经发现有低氧反应元件，只有在缺氧时才表达，已知肿瘤细胞由于增殖太快，其组织内部是处于缺氧状态的，因此可用于肿瘤的特异性治疗。再如射线启动子Egr-1，即人早期生长反应-1基因(Early growth response 1，Egr-1)，位于第5号染色体长臂，又称为zif68，Tis-8，NFGI-A，Krox-24。Egr-1基因在真核细胞对外界刺激发生反应、细胞的增殖、分化中发挥着重要功能。细胞在离子辐射后，Egr-1基因被特异性激活。将外源基因置于Egr-1启动子下游，肿瘤放疗时射线照射后将激活其表达，因此也可用于肿瘤的特异性治疗。类似的例子还有糖皮质激素启动子(由糖皮质激素激活)、金属硫蛋白启动子(由锌等金属离子激活)、四环素启动子(由四环素激活)等。

为了增强表达效果，可将上述启动子拼接成杂合启动子。

基因治疗另外要考虑的是导入载体，从理论上讲腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒相关病毒(AAV)以及质粒载体等均可作为表达载体。

附图说明

图1显示腺病毒穿梭质粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)结构。

图2显示rvAdHREAFPvpr的PCR鉴定结果。1：Vpr引物的扩增产物；2：AFP引物的扩增产物；3：DL-2000DNA分子量标准(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp)。

图3显示重组腺病毒rvAdHREAFPVpr中整合的特异性AFP和Vpr基因片段Southern blot分析结果。A：AFP启动子检测1：rvAdHREAFPVpr；2：Ad5(对照)；B：Vpr基因检测3：Ad5(对照)；4：rvAdHREAFPVpr。

图4显示Vpr在AFP(+)肝癌细胞中的特异性表达。

A～C：SMMC-7721(AFP-)细胞中Vpr表达的流式细胞仪检测结果。A：SMMC-7721正常细胞；B：SMMC-7721+rvAd-null；C：SMMC-7721+rvAdHREAFPvpr。

D～F：BEL-7402(AFP+)细胞中Vpr表达的流式细胞仪检测结果。

D：BEL-7402正常细胞；E：BEL-7402+rvAd-null；F：BEL-7402+rvAdHREAFPvpr。

图5显示rvAdHREAFPVpr导致的细胞周期G2停滞。

A：SMMC-7721细胞；B：BEL-7402细胞。

图6显示rvAdHREAFPVpr引起细胞线粒体膜电位的降低。

A：SMMC-7721细胞；B：BEL-7402细胞。

图7显示rvAdHREAFPvpr对BEL-7402细胞中细胞凋亡蛋白表达的影响。

图8显示rvAdHREAFPVpr对裸鼠体内肿瘤增殖的抑制作用和化疗增强作用。

图9显示裸鼠体内肿瘤细胞的凋亡检测(TUNEL法)结果。

A：空白对照组；B：Ad-null组；C：rvAdHREAFPVpr治疗组；D：环磷酰胺治疗组；E：rvAdHREAFPVpr+环磷酰胺联合治疗组。

图10显示rvAdEgrVpr的放疗增强作用。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步详细说明本发明。但是，本领域技术人员可以理解，本发明显然并不局限于以下具体实施例。

实施例一

本实施例的内容是以腺病毒为载体，利用甲胎蛋白-低氧反应元件启动子控制HIV Vpr基因的表达，在细胞和动物水平上证明该制剂对肿瘤细胞有特异性杀伤作用并可增强化疗效果。具体步骤如下：

除非特别指出，下文所有分子克隆的操作均同J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京：科学出版社，2002。

1.腺病毒穿梭质粒pShuttlHREAFPVpr的构建

(1)腺病毒穿梭质粒pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)的构建

含HIV vpr基因的质粒BSVprThy(简称pVPR)见Jowett JBM，PlanellesV，Poon B，Shan NP，Hen ML，Chen ISY.The Human Immunodeficiency Virus Type 1 vprGene Arrests Infected T Cells in the G2+M Phase of the Cell Cycle.J Virol，1995，69：6304-13)；pCI-neo质粒购于Promega、pCDNA II质粒购于Invitrogen公司，腺病毒穿梭载体质粒pShuttle、骨架载体质粒pAdEasy-1和大肠杆菌BJ5183见He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system forgenerating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：2509-14。

1)合成型射线反应性启动子-多克隆位点-多聚腺苷酸尾[hcEgr-CMS-Poly(A)]片段的PCR扩增：

引物由上海生工公司合成：

引物1：

5’-CATAGATCTGCGTGGGGCGGCGTGGGGCGGCGTGGGGCGGCCCCGTTGACGCAAAT-3’(SEQ ID NO 1)

引物2：5’-TATGATATCTACCACATTTGTAGAGGT-3’(SEQ ID NO 2)

以pCI-neo质粒(Promega公司)为模板，利用引物1、2 PCR扩增合成型射线反应性启动子-多克隆位点-多聚腺苷酸尾[hcEgr-CMS-Poly(A)]片段。方法：在50ul反应体系中：pCI-neo质粒lng(1ul)；dNTP(Takara公司，浓度2.5mmol/L)，4ul；10X Vent DNA合成酶缓冲液，5ul；Vent DNA合成酶(Biolabs)，1ul；ddH₂O，37ul。PCR条件：94℃预变性3min后开始PCR循环，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增片段长度分别为750bp。

2)质粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)的构建

i)用EcoR V(Takara)酶切pCDNAII(Invitrogen公司)制备平端连接载体片段。体系：质粒pCDNAII 5ul；缓冲液H 2ul；EcoR V 1ul；水12ul。

ii)合成型射线反应性启动子-多克隆位点-多聚腺苷酸尾[hcEgr-CMS-Poly(A)]片段PCR产物用生工公司PCR产物回收试剂盒回收纯化目的片段。

iii)载体片段和目的片段的连接。方法：在20ul体系(pCDNAII载体片段，2ul；目的片段，10ul；10X T4 DNA连接酶缓冲液，2ul；T4 DNA连接酶(Promega公司)，1ul；ddH₂O，5ul)中于12～16℃进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经转化、质粒提取和酶切鉴定，得到阳性质粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)，以质粒pCDNAII上T7启动子为引物进行测序，验证PCR产物的正确。

3)腺病毒穿梭质粒pShuttle-heEgr-CMS-Poly(A)的构建

i)用Bgl II和EcoR V(Takara)双酶切质粒pShuttle，制备连接载体片段。

体系：质粒pShuttle 5ul；Bgl II和EcoR V各1ul；缓冲液H 2ul；水11ul。

ii)用Bgl II和EcoR V双酶切阳性质粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)，回收小片段hcEgr-CMS-Poly(A)目的片段。

体系：质粒pCDNAII-hcEgr-CMS-Poly(A)5ul；Bgl II和EcoR V各1ul；缓冲液H 2ul；水11ul。

iii)载体片段和目的片段的连接

在20ul体系(载体片段，2ul；目的片段，10ul；10X T4 DNA连接酶缓冲液，2ul；T4 DNA连接酶，1ul；ddH₂O，5ul)中进行连接反应。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随机挑取克隆，碱法提取质粒，BglII-EcoRV双酶切鉴定，得到阳性质粒，命名为pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)。

(2)腺病毒穿梭质粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)的构建

1)质粒pCDNAII-Vpr的构建

PCR引物由上海生工公司合成，其序列为

引物3：5’-TATGCTAGCATGGAACAAGCCCCAGAA-3’(SEQ ID NO 3)

引物4：5’-TATACGCGTCTAGGATCTACTGGCTCC-3’(SEQ ID NO 4)

以pVPR质粒为模板，PCR扩增HIV Vpr基因片段。50ul反应体系：pVPR质粒1ul(1ng)；引物3、4各1ul(50pmol)；dNTP(2.5mmol/L浓度)，4ul；10×Vent DNA合成酶缓冲液，5ul；Vent DNA合成酶，1ul(5U)(Biolabs公司)；ddH₂O，37ul。条件：94℃预变性3min后开始PCR循环，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增片段长度分别为300bp。按生工公司PCR产物回收试剂盒回收纯化HIV Vpr基因片段，插入pCDNAII(Invitrogen公司)EcoRV位点，阳性质粒命名为pCDNAII-Vpr，以质粒pCDNAII上T7启动子为引物进行测序，证明PCR产物的正确。

2)腺病毒穿梭质粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)的构建

i)Nhe I和Mlu I(Takara)双酶切pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)制备粘端载体片段。第一步先用Nhe I酶切pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)，体系：质粒pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)20ul；缓冲液M 5ul；Nhe I 2ul；水23ul。酶切后，无水乙醇法沉淀回收基因片段。第二步再用Mlu I酶切线性化片段pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)。体系：在回收片段pShuttle-hcEgr-CMS-Poly(A)沉淀中加入水17ul；缓冲液H 2ul；Mlu I 1ul。

ii)同法用Nhe I和Mlu I双酶切阳性质粒pCDNAII-Vpr，用生工公司DNA回收试剂盒回收小片段Vpr目的片段。

iii)载体片段和目的片段的连接反应

方法：在20ul体系中(载体片段，2ul；目的片段，10ul；10X T4 DNA连接酶缓冲液，2ul；T4 DNA连接酶，1ul；ddH₂O，5ul)进行连接反应。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随机挑取克隆，碱法提取质粒，NheI-Mlu I双酶切鉴定，得到阳性质粒，命名为pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，其结构见图1。

(3)腺病毒穿梭质粒pShuttleHREAFPVpr的构建

1)用Hind III酶切pLN[HRE]AFTK(见Ido A，Uto H，Moriuchi A，Nagata K，Onaga Y，Onaga M，Hori T，Hirono S，Hayashi K，Tamaoki T，Tsubouchi H.Gene TherapyTargeting for Hepatocellular Carcinoma：Selective and Enhanced Suicide Gene ExpressionRegulated by a Hypoxia-inducible Enhancer Linked to a Human a-Fetoprotein Promoter.Cancer Res，2001，61：3016-21)，无水乙醇沉淀法回收片段后，建立补平反应

体系：10X缓冲液，2ul；10X BSA，2ul；dNTP，2ul，；Klenow酶(Promega公司，下同)，1ul；ddH₂O，13ul。

室温反应10分钟，75℃终止反应10分钟。进行无水乙醇沉淀法回收片段。

2)BamH I再酶切补平线性化pLN[HRE]AFTK，回收小片段HRE-AFP启动子。

3)Nhe I酶切腺病毒穿梭质粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，Klenow酶补平，方法同上。

4)Bgl II再酶切补平线性化pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，切去hcEgr启动子，回收大片段载体。

5)小片段HRE-AFP启动子和大片段载体的连接：利用BamH I和BglII同尾酶的特性，建立一端粘端、一端平端的连接反应。这样得到重组腺病毒的穿梭载体pShuttleHREAFPVpr，在该载体中Vpr的上游为HRE-AFP杂合启动子，下游为polyA，Vpr的转录被上游的杂合启动子控制。

2.重组腺病毒质粒pAdHREAFPVpr的获得

用碱裂解法小量制备克隆有Vpr的重组穿梭质粒pShuttleHREAFPVpr及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1，溶解于50μl ddH₂O中备用。

(1)重组穿梭质粒的线性化与回收：取约500ng重组穿梭质粒，分别用Pme I(Biolabs公司)单酶切以线性化，加水将体积补至200μl，加入20μl3mol/L乙酸钠，再加入2～2.5倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃沉淀过夜，次日15,000rpm离心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于6μl ddH₂O中，备用。

(2)用线性化的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共同电转化大肠杆菌BJ5183，分别取出约100ng pAdEasy-1、上述经线性化处理过的重组穿梭质粒pShuttleHREAFPVpr和-70℃保存备用的BJ5183电转化菌，按下述方法进行电转化：将BJ5183电转化菌置于冰水浴中缓慢解冻，同时将预冷的0.2cm的电转杯继续置于冰水浴中，将pAdEasy-1、线性化的穿梭质粒加入到含有BJ5183的Ep管中，轻轻混匀后，转移到电转化杯中，电穿孔的条件为2,500V、200Ohms和25mFD，电穿孔完成后，立即用1ml SOC培养液(配方见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京：科学出版社，2002)悬浮电转化混合物，37℃慢摇10min，取细菌悬液分别涂入卡那霉素(Kan)培养板中，37℃培养16～20h，挑选10～20个较小的菌落，接种Kan的LB培养液中，置37℃摇床，培养10～15h，碱裂解法小量提取质粒DNA，用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并进行限制性内切酶图谱分析。得到重组腺病毒质粒pAdHREAFPVpr。将所得的重组腺病毒质粒转化宿主菌DH10B感受态细胞，在此宿主菌中可产生高拷贝数的质粒，挑取目的克隆，经适当的酶切鉴定后，-70℃保存菌种备用。

3.重组腺病毒rvAdHREAFPVpr的获得

(1)用Pac I酶切重组的腺病毒质粒，完全消化以去除ori和kan抗性基因等质粒构件，并暴露其倒置末端重复序列(ITR)。阳性质粒用氯化钙法重新转化宿主菌DH10B，挑取单克隆，接种至3ml含Kan的LB培养液中，37℃振摇8h，按照1/500的比例将培养菌接种至25ml含Kan的LB培养液中，37℃振摇12～16h。利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司)提取质粒，方法如下：25ml菌液4℃ 6,000g离心15min收集细菌，用4ml含有RNase的溶液P1重悬细菌；加入4ml溶液P2，轻轻混合4～6次，室温孵育5min；加入4ml预冷的溶液P3，混合4～6次，冰上孵育15min；4℃≥20,000g×离心30min，将上清转移至一新的离心管中，继续4℃≥20,000g×离心15min，将上清转移至另一新的离心管中，以彻底除去沉淀；在将离心上清上QIAGEN-tip100柱子之前，先用4ml溶液QBT平衡柱子，平衡后，使离心上清通过重力作用通过柱子，用10ml溶液QC洗柱子两次，加5ml溶液QF洗脱DNA，洗脱液接入一新的离心管中，加入3.5ml(0.7倍体积)异丙醇沉淀DNA，混匀后4℃ 15,000g离心30min，小心去掉上清，用2ml 70％乙醇洗DNA沉淀，4℃ 15,000g离心10min，仔细倒掉上清，室温干燥沉淀5～10min，溶于100μl TE(PH8.0)中，经紫外分光光度计测定DNA的量约250ng/μl。

取20μl DNA Pac I(Biolabs公司)酶切，酶切后产物加入ddH₂O将体积补足200μl，加入20μl 3mol/L乙酸钠，再加入2～2.5倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃沉淀过夜，次日15,000rpm离心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于20μl无菌的ddH₂O中，备用。

(2)脂质体介导的转染：将生长状态良好的293细胞(购自美国ATCC)传至12.5cm²的细胞培养瓶中，待细胞长至50％～70％时即可转染，将Pac I酶切线性化后的重组腺病毒DNA 20μl及6μl的Lipofectine 2000(Invitrogen公司)分别与100μl M溶液(M溶液为无血清、无抗生素的含有谷氨酰胺及碳酸氢钠的DMEM培养液，Invitrogen公司)充分混匀，室温下温育15min，混合两种悬液，室温继续作用30min。在上述等待的时间内，移去293细胞的原培养液，用4ml M溶液小心洗细胞一次。补加800μl M溶液至Lipofectine-DNA的复合物中，充分混匀后，轻轻加入细胞瓶中，置37℃5％CO₂培养箱，温育3～5h。补加2ml含10％小牛血清的DMEM完全培养液，置37℃ 5％CO₂培养箱，培养过夜。次日，吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液，补加2ml含2％小牛血清的MEM维持液，继续培养，逐日观察细胞。7～14d左右，293细胞出现肿胀变圆等细胞病变(CPE)，收集病变细胞连同上清冻存于-20℃。细胞反复冻融三次，使细胞完全破碎，冻融三次后离心，取上清接种一瓶293细胞，加入含2％小牛血清的DMEM维持液，逐日观察，7d左右出现细胞病变。获得的重组腺病毒命名为rvAdHREAFPVpr。

4.重组腺病毒的鉴定

(1)形态学鉴定：293细胞在接种腺病毒病变后，相对于正常细胞形态出现圆缩，聚集，且可见典型的“葡萄串”样形态学特征。

(2)293细胞经反复冻融后释放出重组腺病毒rvAdHREAFPVpr，经磷酸钨负染，在透射电镜下略呈典型二十面体结构，直径约为70nm，具有典型的腺病毒形态，未见有其它病毒、支原体、细菌和真菌污染。

(3)外源启动子AFP和外源基因Vpr整合的PCR分析：直接取反复冻融后的重组腺病毒悬液1ul，用特异性引物进行PCR扩增。外源启动子AFP和外源基因Vpr PCR引物，均由上海生工生物工程公司合成，反应体系为：10×缓冲液5μl，2.5mmol/L dNTP(Takara公司)4μl，引物Beg和End(100ng/μl)各1μl，重组腺病毒悬液1μl，Taq DNA聚合酶(Takara公司)1μl，补水至总体积50μl，混匀后加入液体石蜡。94℃预变性3min后开始PCR循环，条件为：94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，共30个循环，最后72℃延伸7min。扩增片段长度分别为500bp。

Vpr引物

Beg：5’-TATGCTAGC ATGGAACAAGCCCCAGAA-3’(SEQ ID NO：5)

End：5’-TAT ACGCGT CTAGGATCTACTGGCTCC-3’(SEQ ID NO：6)

AFP引物

Beg：5’-GAGCTCTTACGCGTGCTA-3’(SEQ ID NO：7)

End：5’-GCGATCCGGTGTTATT-3’(SEQ ID NO：8)

分别用AFP和Vpr引物对经反复冻融后获得的重组腺病毒模板进行PCR扩增，可以检测到特异性扩增条带，在此位置野生型腺病毒Ad5为阴性，说明两个重组腺病毒基因组中都整合有AFP和Vpr基因。结果见图2。

(4)外源基因整合的Southern Blot分析

全部采用Roche公司探针标记与杂交试剂盒，按说明书操作。

①重组腺病毒基因组DNA的提取

腺病毒DNA的提取：按常规方法培养293细胞，取重组病毒rvAdHREAFPVpr以及野生型腺病毒Ad5以m.o.i＝5病毒量分别感染细胞，待细胞病变达80％时收获。沉淀细胞加2ml TE(配方见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京：科学出版社，2002)重悬，分装四个1.5ml Ep管，每管加蛋白酶K(20μg/μl)7μl和10％ SDS 50μl，37℃孵育1h，再加5mol/L NaCl 150μl置于4℃作用2h，13,000rpm离心30min，转移上清，用等体积酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次后，上清加入1/10体积3mol/L的乙酸钠和2倍体积无水乙醇，置-20℃过夜。次日13,000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗两次，室温晾干后，每管加50μl TE和RNase 6μl溶解，BamH I酶切后用于Southern Blot分析。

②探针的合成和标记

采用Roche公司地高辛探针标记试剂盒。以重组质粒pShuttleHREAFPVpr为模板，用特异性引物，进行PCR扩增，所用引物和反应条件参见上文，PCR产物用无水乙醇沉淀回收目的基因片段，建立如下标记反应：将回收的PCR基因片段溶于15μl水中，放入沸水浴中煮沸10min，然后立即放入冰浴中，防止已变性的两条链重新退火成双链，然后迅速加入dNTP(10×)2μl，六聚核苷酸混合物(10×)2μl，Klenow酶1μl。37℃反应1h后，EDTA终止反应，乙醇沉淀，溶于50μl TE中。以试剂盒中的标准品为对照，检测探针的含量。

③琼脂糖凝胶电泳及Southern Blot

配制试剂，均参照J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京：科学出版社，2002

0.2mol/L HCl    500ml蒸馏水中加入36％的盐酸11.8ml

变性液            0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl

中和液            1mol/L Tris.HCl(pH7.4)及1.5mol/L NaCl

20×SSC           3mol/L NaCl，300mmol/L柠檬酸钠，用2mol/L NaOH调pH至7.0，高压灭菌

6×SSC            30ml 20×SSC加70ml蒸馏水

预杂交液          5×SSC，0.1％十二烷酰肌氨酸钠，0.02％SDS，1％封闭液

杂交液            在上述预杂交液中加入新变性的探针DNA(约10μl PCR探针/1ml杂交液)

洗膜I液           2×SSC，0.1％SDS

洗膜II液          0.1×SSC，0.1％SDS

缓冲液I        0.1mol/L顺丁烯二酸，0.15mol/L NaCl，以NaOH调pH至7.5，高压灭菌

10×封闭液     6克脱脂奶粉溶于50ml缓冲液I中，68℃水浴溶解，定容至60ml

缓冲液II       以缓冲液I 10倍稀释10×封闭液，即封闭液终浓度为1％

缓冲液III      100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，调pH至9.5

显色液

BCIP           50mg/ml，溶在100％的二甲基甲酰胺内

NBT            75mg/ml，溶在70％的的二甲基甲酰胺内

凝胶电泳及转印：取重组腺病毒DNA，BamH I酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，切去凝胶的多余部分，将凝胶浸泡在0.2mol/L HCl中轻摇10min，进行脱嘌呤，用蒸馏水漂洗两次后放入变性液中，进行碱变性，轻摇45min，用蒸馏水漂洗一次，中和液连续中和两次，每次15min。将与凝胶同样大小的尼龙膜(AmshamPharmacia)先用蒸馏水自上而下润湿，再置10×SSC中浸泡5min以上，电转仪经抽真空检测后，在塑料纸上剪一个略小于凝胶的洞，洞的下方自下而上为三层经10×SSC浸泡后的滤纸和尼龙膜，塑料纸的上方为凝胶，在胶上倒少量的10×SSC，打开电源，使抽真空的压力保持在5毫米汞柱，转膜1.5h，其间在胶上补充几次10×SSC，以保证转膜效果。

预杂交和杂交：转膜结束后，以6×SSC泡膜5min，去除琼脂碎片，将膜置于滤纸上，室温干燥30min以上，80℃烤膜1～2h。将膜装入杂交袋中，68℃预杂交1h。将适量标记探针用杂交液稀释后，100℃ 10min完全变性，迅速置冰浴中。将变性探针加入预杂交液中，排除气泡，封口。于68℃恒温水浴中反应过夜。

洗膜：倒掉杂交液，室温下，将膜泡入适量洗膜I液中洗两次，每次5min。倒净洗膜I液，68℃水浴中用洗膜II液洗两次，每次15min。

显色：杂交膜在缓冲液I中洗5min，继续用缓冲液II，洗60min，倒掉缓冲液II，加入适量的用缓冲液II配制的抗地高辛(DIG)抗体(Roche公司)，室温孵育30min，倒掉抗体液，用缓冲液I洗膜两次，每次15min，继续用缓冲液III，浸膜2min，弃去液体，加入用缓冲液III配制的NBT/BCIP的底物工作液，室温下避光显色，至出现目的条带，水冲洗终止反应，干燥保存。

结果表明在重组腺病毒中确有特异性的基因稳定整合。图3为重组腺病毒的BamH I酶切产物分别与AFP和Vpr特异性探针杂交的结果。

5.腺病毒感染肝癌细胞效率的测定

用表达β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒rvAd-LacZ(该病毒与本发明中制备的重组腺病毒骨架相同，均缺失了腺病毒的E1和E3区基因)为代表，按不同的感染复数(Multiplicity of infection，MOI)感染肝癌细胞BEL-7402、SMMC-7721(均购自中国科学院上海细胞生化研究所细胞中心)48h后，弃去培养基，用10％福尔马林固定10min后，加入X-gal染液[1mg/mL X-gal溶于0.1mol/L二甲基甲酰胺中，1.3mmol/L MgCl₂，3mmol/LK₃Fe(CN)₆，3mmol/L K₄Fe(CN)₆)]放37℃温箱作用2h至过夜。镜下计数蓝染细胞的百分率。用rvAd-LacZ按MOI为5，10，25，50，100，200的量分别感染SMMC-7721(AFP-)、BEL-7402(AFP+)细胞，培养48h后进行X-gal染色，结果证实当MOI大于50的感染强度时，重组体腺病毒即可实现对上述两细胞接近100％的转导效率。

6.重组腺病毒中外源基因在肝癌细胞中的表达

以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null(该病毒无外源基因和启动子插入，与本发明中制备的重组腺病毒骨架相同，均缺失了腺病毒的E1和E3区基因)、rvAdHREAFPVpr接种BEL-7402、SMMC-7721 96h后，收集细胞2×10⁶个，用冷的PBS 2ml洗涤细胞一次，800rpm×5min离心。4％多聚甲醛2ml室温固定细胞40分钟，800rpm×5min离心。PBS 2ml重悬细胞，800rpm×5min离心，用含0.2％ Triton-X100和5％血清的PBS 1ml重悬细胞，冰上放置10分钟，800rpm×5min离心。Vpr兔多克隆抗体(Santa Cruz公司)1∶50稀释，饱和剂量加入，冰上放置40分钟，800rpm×5min离心，洗去未结合的一抗，重复一次；加入FITC标记的羊抗兔IgG(SantaCruz公司)，冰上避光放置40分钟后，800rpm×5min离心，去上清，PBS洗涤两次，加入1％多聚甲醛0.5ml重悬细胞，上Coulter EPICS XL型流式细胞仪检测平均荧光强度。实验重复三次。流式细胞仪检测平均荧光强度数值，统计学处理表明，在甲胎蛋白表达阴性的SMMC-7721中没有表达，而Vpr基因在甲胎蛋白表达阳性的BEL-7402细胞中特异性表达(图4)，充分表明Vpr的表达具有细胞特异性，即只有在表达AFP的细胞中才表达。

7.rvAdHREAFPVpr对肝癌细胞周期的影响

以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null、rv AdHREAFPVpr接种BEL-7402、SMMC-7721中，分别在接毒后的24小时、48小时、72小时和96小时，弃去营养液，加入适量细胞消化液后弃去消化液，加入5ml PBS吹打细胞，800rpm离心5分钟收集细胞，加入0.5ml PBS重悬细胞，吸入1ml一次性注射器中，缓慢的将细胞悬液滴加入3ml 70％乙醇中，4℃固定。PBS洗2次，加入含RNase A(终浓度40ug/ml，Sigma公司)的PBS 200ul，37℃水浴45分钟，800rpm×5min离心，加入4℃ PBS 400ul，加入碘化丙锭(PI，Sigma公司)至终浓度50ug/ml，4℃放置45分钟，400目尼龙网过滤，计数10000个细胞，Coulter EPICS XL型流式细胞仪测定细胞周期分布。rvAdHREAFPVpr接种SMMC-7721细胞后，在各个时间相对于阴性对照rvAd-Null而言，重组腺病毒rvAdHREAFPVpr接种于AFP(-)的SMMC-7721，没有引起SMMC-7721细胞周期G2期的特异性阻滞，而在AFP(+)的BEL-7402细胞内则引起典型的细胞周期停滞。图5为SMMC-7721和BEL-7402各时间段内各个细胞周期DNA含量的流式细胞仪检测结果。可见重组腺病毒rvAdHREAFPVpr感染BEL-7402细胞96小时后G2期细胞可达50％，而在AFP(-)的细胞中则只有25％，二者差异显著(p＜0.05)，表明重组腺病毒只能引起AFP(+)细胞的G2期停滞，与预先设计相符。

8.rvAdAFP-Vpr对肝癌细胞凋亡作用

(1)形态学观察

以完全RPMIl640培养液培养BEL-7402细胞(购自中国科学院上海细胞生化研究所细胞中心)，设立空白对照组、rvAd-null、rvAdHREAFPVpr组。在37℃，5％CO₂下培养24h，弃去rvAd-null、rvAdHREAFPVpr组培养中上清液，加入m.o.i＝50病毒液，吸附1h，弃病毒液，加入5ml正常细胞培养液。空白对照组细胞也同时换5ml正常培养液。分别在48h、72h、96h后，用胰酶消化法，制成细胞悬液，浓度1×10⁷/ml。取95ul细胞悬液，加入5ul吖啶橙贮存液混匀，置室温5～10min。吸一滴混合液点在洁净玻片上，直接用盖玻片封片。在激光共聚焦扫描电子显微镜(Leica公司)下观察，正常细胞为圆形或椭圆形，细胞结构完整，细胞核为均匀绿色荧光。凋亡细胞可见细胞核固缩，染色质周边化，在核膜内侧形成新月体，或核碎裂成片段，分布在核膜周边。还可见到出芽形成的凋亡小体。重组腺病毒rvAdHREAFPVpr感染BEL-7402(AFP+)细胞可以看到很多细胞出现典型的凋亡形态变化，而rvAd-null则不明显。

(2)细胞膜电位检测

以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null、rvAdHREAFPVpr接种BEL-7402、SMMC-7721中，分别在接毒后的24小时、48小时、72小时和96小时，弃去营养液，加入适量细胞消化液后弃去消化液，PBS洗一次，800rpm离心5分钟收集细胞。重悬细胞于无血清RPMIl640培养液中，加入Rhodamine 123使终浓度为0.5umol/L，37℃水浴20分钟。用Coulter EPICSXL型流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位，结果表明rvAd-null和rvAdHREAFPVpr接种SMMC-7721(AFP-)后，在观察的三个时间段内，虽然随着时间的延长出现线粒体膜电位的下降，但rvAdHREAFPVpr和rvAd-Null两组间无差异(P＞0.05)。rvAdHREAFPvpr接种BEL-7402细胞(AFP+)后，在各个时间相对于rvAd-Null，引起了明显的BEL-7402线粒体膜电位下降(P＜0.05)，呈现出时间依赖性，但在96h线粒体膜电位又有轻度上升(图6)。

(3)流式细胞仪检测BEL-7402中与细胞凋亡相关蛋白的表达

以m.o.i＝50病毒量的rvAd-null、rvAdHREAFPVpr接种BEL-7402 96h后，收集细胞2×10⁶个，用冷的PBS 2ml洗涤细胞一次，800rpm×5min离心。4％多聚甲醛2ml室温固定细胞40分钟，800rpm×5min离心。PBS 2ml重悬细胞，800rpm×5min离心，用含0.2％Triton-X100和5％血清的PBS1ml重悬细胞，冰上放置10分钟，800rpm×5min离心。Bax、Caspase 9、Caspase8、Capase 3、细胞色素C多克隆抗体(均购自SantaCruz公司)1∶50稀释，饱和剂量加入，冰上放置40分钟，800rpm×5min离心，洗去未结合的一抗，重复一次；加入FITC标记的二抗，冰上避光放置40分钟后，800rpm×5min离心，去上清，PBS洗涤两次，加入1％多聚甲醛0.5ml重悬细胞，上流式细胞仪检测Bax、Caspase 9、Caspase 8、Capase 3、细胞色素C等细胞凋亡相关蛋白的表达情况。结果表明，相对于以相同滴度rvAd-Null接种BEL-7402对照而言，Caspase 3、Caspase 9、细胞色素C表达都有所升高，而Bax蛋白有明显升高，提示细胞凋亡过程被激活。图7所示为各蛋白表达的流式细胞仪结果。

9.rvAdHREAFPVpr在动物体内对肿瘤的抑制作用

取对数生长期BEL-7402细胞，经0.25％胰蛋酶消化，离心去上清后用PBS重悬细胞，细胞浓度为5×10⁹/ml。用6号针头的注射器吸取200ul细胞悬液，接种于裸鼠的前肢右腋下。选择肿瘤生长旺盛且无破溃，健康情况良好的荷瘤动物，脱臼处死，固定于手术板上，用碘伏消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内用无菌剪刀剥离肿瘤，将瘤块切成直径为2mm左右的小块，塞入套管针内。在裸鼠前肢右腋旁边用眼科剪刀剪一1cm左右豁口，套管针经豁口进入裸鼠前肢右腋皮下，将肿瘤组织小块接种于此。共接种35只裸鼠，分5组：第一组，空白对照组；第二组，rvAd-null治疗组；第三组，rvAdHREAFPVpr治疗组；第四组，环磷酰胺治疗组；第五组，联合用药治疗组(rvAdHREAFPVpr联合环磷酰胺治疗组)。皮下接种瘤块后的第三天开始治疗，瘤体内多点直接注射rvAd-null、rvAdHREAFPVpr100ul。每周给药两次，共一个月。环磷酰胺组于第3天、第15天腹腔内按100mg/kg注射两次环磷酰胺。

裸鼠接种后，置入恒温(25±2℃)、恒湿(45％-50％)无菌净化屏障系统内饲养。定期观察裸鼠精神、饮食和排便。用游标卡尺每隔5天测量肿瘤结节的长径a和短径b，根据公式V＝1/2ab²计算肿瘤体积大小绘制肿瘤生长曲线。实验结束后，处死裸鼠剥离瘤块，称取每组瘤块总重计算平均瘤重，按抑瘤率(％)＝(对照组瘤重-治疗组瘤重)/对照组瘤重×100％公式计算抑瘤率。

结果表明(图8和表1)，空白对照组与rvAd-null相比，其肿瘤抑制能力没有差别，说明腺病毒载体本身对肿瘤无特异性抑瘤作用。与空白对照组和rvAd-null组相比，rvAdHREAFPVpr治疗组能明显抑制肿瘤的生长(P＜0.05)，其抑瘤率明显高于rvAd-null，也高于环磷酰胺治疗组，说明由HRE-AFP启动子控制的Vpr在动物体内可特异性抑制肝癌细胞的增殖。

从表1还可以看出，rvAdHREAFPVpr不仅自身具有肿瘤的抑制作用，而且还与环磷酰胺等化疗药物具有协同作用，进一步增强肿瘤抑制作用，其肿瘤生长的抑制作用和抑瘤率均明显高于单独的rvAdHREAFPVpr和环磷酰胺治疗组，提示该重组病毒对化疗具有增强作用。

按上文方法，将各组动物处死后，立即取肿瘤组织进行病理切片，采用TdT介导的脱氧核苷酸原位末端标记法(TUNEL法，试剂盒购自Promega公司)染色检测凋亡细胞，以细胞核呈棕黄色染色者为凋亡细胞。所有实验均按试剂盒说明书操作，结果发现在第一组的肿瘤细胞中凋亡细胞很罕见，而在第三、四、五组细胞中均见到很多凋亡细胞(图9)，说明重组腺病毒rvAdHREVpr在动物体内可以诱导肿瘤组织的细胞凋亡，与预期结果相符。

从表1可以看出，单纯腺病毒治疗组的终末平均体重要高于环磷酰胺和腺病毒+环磷酰胺联合治疗组，说明腺病毒的毒副作用(对裸鼠生长的抑制作用)要低于环磷酰胺等化疗药物，但是其抑瘤作用要强于环磷酰胺，显示基因治疗的优势。

上述结果表明，HRE-AFP启动子控制Vpr表达的重组腺病毒可特异性诱导AFP(+)肿瘤细胞的细胞周期G2期停滞、细胞凋亡，对小鼠体内的肿瘤具有明显的抑制作用并与化学治疗有协同作用。由是推之，本发明的思路也适用于其他组织(肿瘤)特异性启动子。

                表1重组腺病毒rvAdHREAFPVpr的抑瘤作用

组别	鼠数(只)	体重(克)x±s	瘤重(克)	抑瘤率％
					前  后	前          中           后	总重  x±s
	第一组	7    7	15.0±1.48  19.4±1.62   21.5±0.816					11.7  1.67±0.83	/
第二组				7    7	16.3±1.7   20.6±0.987  21.3±0.732	10.7  1.528±0.742	8
	第三组	7    7	14.7±1.34  19.3±0.952  21.4±0.747					6.9   0.986±0.303	41
第四组				7    6	16.0±1.41  19.1±0.899  19.0±0.899	7.0   1.16±0.22	31
	第五组	7    7	16.0±2.05  19.6±1.396  19.0±1.069					3.9   0.557±0.231	66.7

实施例二

除非另外指出，本实施例中具体实验操作均同实施例一。

研究表明，放射治疗可使肿瘤细胞处于G2期停滞，从而抑制肿瘤的生长。本实施例的内容是在腺病毒载体中用射线启动子(Egr-1)控制HIV Vpr基因的表达，证明该制剂在射线诱导后对肿瘤细胞有特异性增强细胞周期G2停滞的作用，从而可以增强肿瘤放射治疗的效果。具体步骤如下：

1.重组腺病毒穿梭质粒pShuttleEgrVpr的构建

(1)用Sal I(5’端)和BamH I(3’端)双酶切含有射线反应性启动子(Egr-1)的pE425，(见Seung LP，Mauceri HJ，Beckett MA，Hallahan DE，HellmanS，Weichselbaum RR.Genetic radiotherapy overcomes tumor resistance to cytotoxic agents.Cancer Res，1995，55：5561-5.)，获得一450bp大小的Egr启动子片段。体系：缓冲液T：2ul；BamH I 1ul；Sal I 1ul；pE425 10ul；水6ul(以上酶及缓冲液购于Takara公司)。

(2)Xho I和BamH I双酶切pCDNAII(Invitrogen公司)制备粘端连接载体片段。体系：缓冲液K：2ul；BamH I 1ul；Xho I 1ul；pCDNAII 10ul；水6ul(以上酶及缓冲液购于Takara公司)。

(3)利用Sal I和Xho I酶是同尾酶的特性，片段和载体可在同一体系建立连接反应，连接后此酶切位点消失。体系：连接缓冲液2ul；载体片段pCDNAII 1ul；目的片段Egr启动子片段5ul；连接酶1ul；水11ul。(以上酶及缓冲液购于Takara公司)，得到重组质粒pCDNAII-Egr。

(4)Xba I和Hind III双酶切pCDNAII-Egr，回收小片段Egr启动子目的片段，将其插入腺病毒穿梭载体pShuttle相应位点。体系：Xba I 1ul；HindIII 1ul；缓冲液M 2ul；pCDNAII-Egr或pShuttle 5ul；水11ul。(以上酶及缓冲液购于Takara公司)。然后将Egr启动子插入pShuttle载体。连接反应体系：连接缓冲液2ul；载体片段pShuttle 1ul；目的片段Egr启动子片段5ul；连接酶1ul；水11ul。(以上酶及缓冲液购于Takara公司)，得到重组质粒pShuttleEgr。

(5)Xba I酶切pShuttle-Egr，无水乙醇沉淀法回收片段后，建立补平反应体系：10X缓冲液，2ul；10X BSA，2ul；dNTP，2ul；Klenow酶，1ul；ddH₂O，13ul。室温反应10分钟，75℃终止反应10分钟。进行无水乙醇沉淀法回收片段。

(6)Bgl II再酶切已补平的线性化pShuttle-Egr，回收小片段Egr启动子。

(7)Nhe I酶切腺病毒穿梭质粒pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，Klenow酶补平，方法同上。

(8)Bgl II再酶切已补平的线性化pShuttle-hcEgr-vpr-Poly(A)，切去hcEgr启动子，回收大片段载体。

(9)小片段Egr启动子和大片段载体的连接：建立一端粘端、一端平端的连接反应。获得重组腺病毒穿梭载体pShuttleEgrVpr。

2.重组腺病毒质粒pAdEgrVpr的获得

用碱裂解法小量制备克隆有Vpr的重组穿梭质粒pShuttleEgrVpr及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1，溶解于50μl ddH₂O中备用。

(1)重组穿梭质粒的线性化与回收取约500ng重组穿梭质粒，分别用Pme I(Biolabs公司)单酶切以线性化，加水将体积补至200μl，加入20μl 3mol/L乙酸钠，再加入2～2.5倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃沉淀过夜，次日15,000rpm离心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于6μl ddH₂O中，备用。

(2)用线性化的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共同电转化大肠杆菌BJ5183分别取出约100ng pAdEasy-1、上述经线性化处理过的重组穿梭质粒和-70℃保存备用的BJ5183电转化菌，按下述方法进行电转化：将BJ5183电转化菌置于冰水浴中缓慢解冻，同时将预冷的0.2cm的电转杯继续置于冰水浴中，将pAdEasy-1、线性化的穿梭质粒加入到含有BJ5183的Ep管中，轻轻混匀后，转移到电转化杯中，电穿孔的条件为2,500V、200Ohms和25mFD，电穿孔完成后，立即用1ml SOC培养液(配方见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京：科学出版社，2002)悬浮电转化混合物，37℃慢摇10min，取细菌悬液分别涂入卡那霉素(Kan)培养板中，37℃培养16～20h，挑选10～20个较小的菌落，接种Kan的LB培养液中，置37℃摇床，培养10～15h，碱裂解法小量提取质粒DNA，用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并进行限制性内切酶图谱分析。得到重组腺病毒质粒pAdEgrVpr。

3.重组腺病毒rvAdEgrVpr的获得

(1)用Pac I酶切重组的腺病毒质粒pAdEgrVpr，完全消化以去除ori和kan抗性基因等质粒构件，并暴露其倒置末端重复序列(ITR)。将pAdEgrVpr质粒用氯化钙法重新转化大肠杆菌DH10B(Invitrogen公司)，挑取单克隆，接种至3ml含Kan的LB培养液中，37℃振摇8h，按照1/500的比例将培养菌接种至25ml含Kan的LB培养液中，37℃振摇12～16h。利用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司)提取质粒，将所得质粒溶于100μl TE(PH8.0)中，经紫外分光光度计测定DNA的量约250ng/μl。

取20μl pAdEgrVpr DNA用Pac I酶切，酶切后产物加入ddH₂O将体积补足200μl，加入20μl 3mol/L乙酸钠，再加入2～2.5倍体积的无水乙醇沉淀，-20℃沉淀过夜，次日15,000rpm离心10min，75％乙醇洗一次，晾干后溶解于20μl无菌的ddH₂O中，备用。

(2)脂质体介导的转染：将生长状态良好的293细胞传至12.5cm²的细胞培养瓶中，待细胞长至50％～70％时进行转染，将Pac I酶切线性化后的重组腺病毒DNA 20μl及6μl的Lipofectine 2000(Invitrogen公司)分别与100μl M溶液(M溶液为无血清、无抗生素的含有谷氨酰胺及碳酸氢钠的DMEM培养液，Invitrogen公司)充分混匀，室温下温育15min，混合两种悬液，室温继续作用30min。在上述等待的时间内，移去293细胞的原培养液，用4ml M溶液小心洗细胞一次。补加800μl M溶液至Lipofectine-DNA的复合物中，充分混匀后，轻轻加入细胞瓶中，置37℃5％CO₂培养箱，温育3～5h。补加2ml含10％小牛血清的DMEM完全培养液，置37℃ 5％CO₂培养箱，培养过夜。次日，吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液，补加2ml含2％小牛血清的MEM维持液，继续培养，逐日观察细胞。7～14d左右，293细胞出现肿胀变圆等细胞病变(CPE)，收集病变细胞连同上清冻存于-20℃。重悬细胞反复冻融三次，使细胞完全破碎，冻融三次后离心，取上清接种一瓶293细胞，加入含2％小牛血清的DMEM维持液，逐日观察，7d左右出现细胞病变。将获得的重组腺病毒命名为rvAdEgrVpr。重组腺病毒的PCR与Southern blot检测与实施例1相同。

4.rvAdEgrVpr的放疗增强作用

以m.o.i＝50病毒量的rvAdEgrVpr感染U251细胞(人神经胶质瘤细胞，购于中国科学院上海细胞与生物化学研究所细胞库)中，在感染后的48小时，分别用5Gy、10Gy剂量照射细胞。弃去营养液，加入适量细胞消化液后弃去消化液，加入5ml PBS吹打细胞，800rpm离心5分钟收集细胞，加入0.5ml PBS重悬细胞，吸入1ml一次性注射器中，缓慢的将细胞悬液滴加入3ml 70％乙醇中，4℃固定。PBS洗2次，加入含RNase A(终浓度40ug/ml，Sigma公司)的PBS 200ul，37℃水浴45分钟，800rpm×5min离心，加入4℃PBS 400ul，加入碘化丙锭(PI，Sigma公司)至终浓度50ug/ml，4℃放置45分钟，400目尼龙网过滤，计数10000个细胞，Coulter EPICS XL型流式细胞仪测定细胞周期分布。发现未经任何处理的细胞G2期细胞所占比例很低，只有3％。用5Gy剂量照射细胞后，接种重组腺病毒组G2期细胞的数量远远高于只用射线剂量组(p＜0.05)，并且G2期细胞的数量达到了只用射线照射组10Gy照射时的水平，说明Vpr有增强放射治疗的效果(图10)。

                                   序列表

<110>王健伟 魏强 洪涛

<120>一种肿瘤治疗剂及其用途

<130>1040002

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

catagatctg cgtggggcgg cgtggggcgg cgtggggcgg ccccgttgac gcaaat          56

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

tatgatatct accacatttg tagaggt                                          27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

tatgctagca tggaacaagc cccagaa                                          27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

tatacgcgtc taggatctac tggctcc                                          27

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

tatgctagca tggaacaagc cccagaa                                          27

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

tatacgcgtc taggatctac tggctcc                                          27

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

gagctcttac gcgtgcta                                                    18

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

gcgatccggt gttatt                                                      16

Claims (10)

1.一种肿瘤治疗剂，其中含有人类免疫缺陷病毒Vpr基因，该基因处于一种启动子的控制之下，可以在肿瘤组织中特异性表达。

2.按照权利要求1的治疗剂，其中所述Vpr基因位于选自以下的任意载体上：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒相关病毒以及质粒载体。

3.权利要求2的治疗剂，其中所述载体是腺病毒载体。

4.权利要求1-3任一项的治疗剂，其中所述启动子选自肿瘤组织特异性启动子、诱导型启动子和它们的杂合启动子。

5.权利要求4的治疗剂，其中所述肿瘤组织特异性启动子选自甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、前列腺抗原启动子、端粒酶启动子、E2F-1启动子、Flk-1启动子、E-selectin启动子、HK-II启动子、c-ebrB2启动子、L-Plastin启动子和SLP-I启动子，所述诱导型启动子选自低氧反应元件启动子、射线诱导启动子、糖皮质激素诱导启动子、金属诱导启动子和四环素诱导启动子。

6.权利要求4的治疗剂，其中所述杂合启动子是甲胎蛋白—低氧反应元件启动子。

7.权利要求1的治疗剂，其为重组腺病毒rvAdHREAFPVpr。

8.权利要求1的治疗剂，其为重组腺病毒rvAdEgrVpr。

9.权利要求1-8任一项的治疗剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

10.权利要求1-8任一项的治疗剂在制备肿瘤化学治疗和放射治疗的增强剂中的用途。

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