CN1667414A - 阶梯式浓度梯度检测条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种阶梯式浓度梯度检测条，包括矩形薄片式的载体和涂布在载体一面上的药物。在载体的一面等长地划分有若干个等面积区间，在每个等面积区间中心对称地涂布有设定形状及面积的药物块；各药物块的药量呈现出一段或多段的阶梯性变化，即：在不同段中的药物块的浓度不同。但是在同一段中排列的各个药物块的涂布厚度和浓度相同，各药物块的面积大小按顺序阶梯递增或递减。在载体另一面标记有药物品种以及对应各等面积区间上标记有相应的药物浓度数值。本发明的阶梯式浓度梯度药物敏感检测条易于标准化和大批量生产，产品质量稳定且操作方便，测量精确。

Description

阶梯式浓度梯度检测条及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学制品，更具体地说，本发明涉及一种用于微生物药物敏感检测的阶梯式药物浓度梯度检测条及其制备方法。
背景技术
随着现代科学技术的进步，微生物的鉴定基本能够满足人们(尤其是临床医务工作者)的需要。但在微生物对药物敏感试验(简称药敏试验)方面，比如在对苛养菌、厌氧菌、分枝杆菌、真菌的药敏试验中，在采用细菌自动化鉴定仪所作的常规药敏试验方面，目前仍存在着一些急需解决的问题如：某些情况下报告假敏感结果，例如：对耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、肠球菌、产诱导酶的肠道菌及铜绿假单胞菌的测试中，个别耐药株不能显示耐药结果。特别是近年来，由于各种抗生素的大量应用，尤其是广谱及超广谱抗生素的滥用，造成了耐药突变菌株的大量出现，经验用药失败率较高；盲目大剂量治疗也易造成药物中毒。所以，近年来，微生物学研究涉及的一个重要内容就是对病原菌进行体外药物敏感试验(即通常所谓的“药物敏感试验”，简称“药敏试验”)，即测定细菌对药物的敏感程度，以便及时发现耐药菌株，为临床用药提供选择方案。药敏试验的正确与否，直接影响到临床医师合理有效地选用抗菌药物，关系到临床医师正确选用抗生素、避免滥用抗生素、及时有效地控制感染、预防耐药突变菌株的大量出现。因而病原菌的体外药物敏感试验具有重要的临床意义。
目前，体外药物敏感试验主要方法有：定性测定的纸片琼脂扩散法(diskagar diffusion，Kirby-Bauer test)、定量测定的稀释法(dilution test)和浓度梯度试纸法(Episiolometer test，E test)。
其中，纸片琼脂扩散法使用方法非常简便，但只能做定性检测，不能定量，对实验条件要求苛刻，且容易出现误差。特别是近年来，美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)不再推荐用纸片扩散法测定某些抗生素对某些细菌的抗菌作用，其原因是纸片扩散法的结果会造成过多的解释错误。
稀释法是在肉汤或琼脂培养基中将药物进行一系列(对倍)稀释后，定量接种待检菌，35℃孵育24小时后观察。抑制待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)。稀释法尤其是琼脂稀释法测定结果准确，被愈为″金标准″，但操作太繁琐，难以临床广泛、普及使用。
1988年AB Biodisk(Sweden)公司推出了浓度梯度试纸法，已被世界同行公认为″第二金标准″的药敏方法。它的特点是结合琼脂扩散法和稀释法的优点，用扩散法的原理，塑料条的形式定量读出MIC值。这比传统的纸片扩散法测抑菌圈的大小精确可靠。浓度梯度试纸法现已被美国食品及药物管理局(FDA)及世界卫生组织细菌耐药监测网所承认。
浓度梯度试纸法基本原理是结合扩散法和稀释法的原理和特点，在一条规格为5×50mm的塑料条一面吸附有以log2为基础连续变化的抗生素浓度，其另一表面上标记相应的抗生素浓度刻度。当浓度梯度试纸条放在已接种了一定浓度的细菌的特定药敏培养基上后，抗生素立即释放至琼脂中，呈单一方向扩散。在35℃下经一定时间孵育后可能产生一椭圆形的抑菌环。抑菌环与Etest条交界处的刻度即为针对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)值。浓度梯度试纸法如扩散法一样操作方便，但又可同稀释法一样直接测定药物对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)。
目前，在全世界范围内，只有瑞典AB BIODISK公司生产浓度梯度试纸条。他们是将多个(一般在15～22个)不同浓度的抗生素粘附到塑料条上制备浓度梯度试纸条。其生产制备工艺复杂、烦琐。
有国内申请号为93245821.1的专利公开了一种″抗菌药物敏感梯度试条″，从其文献及其申请的专利文献看，虽然其结论是″国产抗菌药物敏感梯度试条是可信的″，但是，由于其制作方法是将″15个含不同浓度的含药小纸片，按浓度大小顺序，用压敏胶粘附在5×50mm涤纶片上″。这种制作方法的缺陷有：(1)生产制作过程难以标准化，无法保证产品的质量稳定；(2)无法大批量生产。
还有中国专利申请号为01217261.8的专利文件公开了一项″浓度梯度药敏试条″的技术方案，其特征是″在载体上按照连续的浓度梯度涂敷有抗生素，同时标有其MIC的刻度。即在横向任一直线上抗生素浓度相同，在纵向任一直线上，抗生素均为连续指数性分布。该项技术产品的药物分布呈连续无级变化的浓度梯度，而非阶梯式浓度梯度。从生产的角度讲，这种连续浓度梯度药物敏感检测条，需在一个50mm左右的长度范围内，实现从256mg/ml至0.016mg/ml的药物浓度变化，即浓度落差达到16000倍的变化，而目前的生产制备和技术几乎无法进行这样的生产。上述种种原因，导致浓度梯度药物敏感检测条至今仍不能广泛普及用于临床常规药敏检测，尚无法全部取代现行的药敏检测方法，如纸片扩散法、琼脂稀释法、各种自动化仪测定等。
发明内容
针对现有技术的上述缺点，本发明所要达到的技术目的是要提供一种易于标准化和大批量生产、产品的质量稳定、且操作方便、测量精确的阶梯式浓度梯度药物敏感检测条及其制备方法。
为此，本发明的技术方案是一种阶梯式浓度梯度检测条，该检测条包括矩形薄片式的载体和涂布在所述载体一面上的药物，所述药物的浓度或药量沿载体轴向呈现出单向性的梯度分布，在所述载体的另一面标记有药物的品种以及对应位置上药物的浓度数值，而所述载体的一面等长地划分有若干个等面积区间，在每个所述的等面积区间中，相对所述区间中心对称地涂布有设定形状及面积的药物块；各个药物块的药量呈现出如下一或多段的阶梯性变化即：在不同段中的药物块的浓度不同，但是在同一段中排列的各个药物块的涂布厚度和浓度相同，且同一段中排列的各药物块的面积大小是按照排列顺序阶梯性地递增或递减；在所述条形载体的另一面、对应各等面积区间上，标记有相应的药量数值或相应药量在区间体积上的均值。本发明的矩形载体薄片上横向均匀地分出多等份的等面积区间，因为各区间的面积均相等，在涂布药物的浓度、厚度相同的前题下，按照涂布面积由大到小的单向性顺序，向等面积区间内均匀涂布不同面积的药物后，等面积区间内所涂布药物的药量与涂布的面积成正比。以此进一步推算，等面积区间内涂布的药量与该区间内单位体积上的药物浓度是一致的。从而，实现了矩形载物条上的各等面积区间内涂布的药物浓度呈精密阶梯式浓度梯度分布。该精密阶梯式浓度梯度药物敏感检测条具有设计理念先进，易于标准化、大批量生产、产品质量的控制有效、使用方便等优点。
为了能精确地按所设定面积涂布得到各个药物块，各个药物块的平面形状为可计算出面积的各种形状。所述药物块的平面形状为长方形、正方形、圆形、椭圆形、棱形中之一。
为了让涂抹的药物块能在药敏检测过程中遇水在区间体积上立即崩解、释放，所述的药物块中包括有速释剂。所述的速释剂由如下成分中的一或几种组成：多糖淀粉类、纤维素类、海藻酸类、陶土类、PVP类、树胶类。所述速释剂选自下列物质中的一或几种：交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素。
本发明的另一技术方案是一种制备如上所述的阶梯式浓度梯度检测条的方法，该方法包括如下步骤：
制作能漏印涂布药浆的大丝印模板即：将大丝印模板区分为多个尺寸相同的长条矩形小模版，再将所述小模版等长地划分为若干个等面积区间，在每个等面积区间中相对区间中心对称地制作出多个面积大小呈一或多段阶梯变化的的漏印区域；
配制一或多种浓度的药浆以便进行一或多段的阶梯性药量涂布；
将所述大丝印模板覆盖在相应尺寸的载体薄片上；
按照药量沿小模版轴向作单向性梯度分布的规律，依次采用某一配制浓度的药浆、经过相应某段的漏印区域，向所述的载体薄片上进行涂布；
将所有漏印区域都涂布药浆后得到的载体薄片按照小模版的边界和尺寸进行裁剪分切、干燥，然后真空包装。
本发明的方法将丝网漏印技术移用于涂布药浆以制备药物阶梯检测条，方法先进，富于创意；大丝印模板中包含多个小模版的结构，便于采用分段遮盖漏印区域的方法，用一种浓度的药浆刮印一次就能够涂布所有小模版的某一段的漏印区域，涂布效率大幅提高，适于大批量生产，且易于标准化和保证产品质量。
为了更充分发挥丝网漏印技术的优势，本发明进一步安排：所有漏印区域的厚度相同。在大丝印模板中，所有长条矩形小模版的属于同一阶梯变化段的漏印区域相互对齐。所述大丝印模板中排列有250个长条矩形小模板。
本发明的药浆中包括有如下一或几种成分组成的速释剂：多糖淀粉类、纤维素类、海藻酸类、陶土类、PVP类、树胶类。这样能保证最终产品的组分合理、崩解迅速。
下面通过实施例和附图更详细地解释本发明的技术方案。
附图说明
图1为本发明的大丝印模板实施例的结构示意图。
图2为本发明的阶梯式浓度梯度检测条实施例的正面示意图。
图3为本发明的阶梯式浓度梯度检测条实施例的背面示意图。
具体实施方式
实施例1：如图1、2、3所示，首先在一块305mm×250mm的大丝印模版1上，按如下方式制作250个相同的长条矩形小模版2：每一个长条矩形小模版2，长61mm，宽5mm，从其一端起始，在52.2mm的长度范围内，横向均匀密分、并标记出29等份的空白区域3(见图2、3)，各空白区域3的面积均相等：L(1.8mm)×宽度W(5mm)，模版2厚度H(0.3mm)。在模版2的各等分空白区域3内，按照面积由大到小，顺序标号1～29，按如表一所示顺序分别制备长方形或圆形的漏印区域4(参图2、3)，
                        表一
阶梯式浓度梯度药物敏感检测条药物浓度与面积、序号对应表
  序号 单位体积药物浓度(mg/ml)   漏印区域面积(mm2)    长×宽(mm×mm)    直径(mm)
    1  256  9.000  1.80×5.00
    2  192  6.750  1.50×4.50
    3  128  4.500  1.00×4.50
    4  96  3.375  0.75×4.50
    5  64  2.250  1.693
    6  48  1.688  1.467
    7  32  1.125  1.197
    8  24  0.844  1.037
    9  16  0.563  0.846
    10  12  0.422  0.733
    11  8  0.281  0.599
    12  6  0.211  0.518
    13  4  0.141  0.423
    14  3  0.105   0.367
    15  2  9.000  1.80×5.00
    16  1.5  6.750  1.50×4.50
    17  1.00  4.500  1.00×4.50
    18  0.75  3.375  0.75×4.5
    19  0.50  2.250  1.693
    20  0.38  1.688  1.467
    21  0.25  1.125  1.197
    22  0.19  0.844  1.037
    23  0.125  0.563  0.846
    24  0.094  0.422  0.733
    25  0.064  0.281  0.599
    26  0.047  0.211  0.518
    27  0.032  0.141  0.423
    28  0.023  0.105  0.367
    29  0.016  0.070  0.299
如第1号位漏印区域形状为长方形L1(1.8mm)×W1(5mm)，漏印区域面积为S1(9mm2)，第2号位漏印区域形状为长方形L2(1.5mm)×W2(4.5mm)，漏印区域面积为S2(6.75mm2)…，第12号位漏印区域形状为圆形，直径为D12(0.518mm)，漏印区域面积为S12(0.211mm2)…，第15号位漏印区域形状为长方形L15(1.8mm)×W15(5mm)，漏印区域面积为S15(9mm2)…，第22号位漏印区域形状为圆形，直径D22(1.037mm)，漏印区域面积为S2(0.844mm2)，依此类推，制成模版。配制两种浓度的涂抹药浆，如浓度Ca(256mg/ml)、Cb(2mg/ml)的庆大霉素，这两种浓度的药物中同时混入7％的速释剂：交联羧甲基纤维素钠(交联CMC-Na)。将大丝印模版1上第15～29号漏印区域4遮盖，借助大丝印模版1，将浓度Ca(256mg/ml)的药浆涂抹到塑料载体薄片5上，形成在第1号位上的单位体积浓度C1为256mg/ml，阶梯递减直至第14号位上的单位体积浓度C14为3mg/ml的浓度梯度(具体推算方式如下：在第1～29号位内，每一号位的空间体积相同，V＝L(1.8mm)×W(5mm)×H(0.3mm)＝2.7mm3，每一号位内涂布的药量为：涂布药物的药物浓度C×涂布药物面积S×涂布药物的厚度H。如：第1号位内涂布的药量为A1＝涂布药物的药物浓度Ca×涂布药物面积S1×涂布药物的厚度H，第1号位的单位体积药物浓度C1＝A1/V，第2号位内涂布的药量为A2＝涂布药物的药物浓度Ca×涂布药物面积S2×涂布药物的厚度H，第2号位内的单位体积药物浓度为C2＝A2/V，以此类推。由此不难推算出：C1/C2……C14＝A1/A2……A14＝S1/S2……S14，C15/C16……C29＝A15/A16……A29＝S15/S16……S29)。然后，解除模版上第15～29号位的遮盖，遮盖模版上第1～14号位，借助大丝印模版1，将浓度为Cb(2mg/ml)的涂抹药物涂抹到塑料载体薄片5第15～29号位上，形成C152mg/ml(第15号位)～C290.016mg/ml(第29号位)的浓度梯度。
实施例2：如附图2、3所示，为将上述的塑料载体薄片5裁剪分切、干燥、真空包装制成的长条矩形的精密阶梯式浓度梯度药物敏感检测条6。在药物敏感检测条6的52.2mm的长度范围内，形成了256mg/ml(第1号位)～0.016mg/ml(第29号位)的精密阶梯式浓度梯度。预先在塑料载体薄片5即药物敏感检测条6的背面，对应256mg/ml(第1号位)～0.016mg/ml(第29号位)药物浓度的背面位置，分别印上256、192、128、96、64、48、……、0.016等数字，在8.8mm空白区域31内印上抗生素代号，如庆大霉素代号为GM，青霉素代号为PG。

Claims (10)

1、一种阶梯式浓度梯度检测条，该检测条包括矩形薄片式的载体和涂布在所述载体一面上的药物，所述药物的浓度或药量沿载体轴向呈现出单向性的梯度分布，在所述载体的另一面标记有药物的品种以及对应位置上药物的浓度数值，其特征在于：所述载体的一面等长地划分有若干个等面积区间，在每个所述的等面积区间中，相对所述区间中心对称地涂布有设定形状及面积的药物块；各个药物块的药量呈现出如下一或多段的阶梯性变化即：在不同段中的药物块的浓度不同，但是在同一段中排列的各个药物块的涂布厚度和浓度相同，且同一段中排列的各药物块的面积大小是按照排列顺序阶梯性地递增或递减；在所述条形载体的另一面、对应各等面积区间上，标记有相应的药量数值或相应药量在区间体积上的均值。
2、如权利要求1所述的阶梯式浓度梯度检测条，其特征在于：各个药物块的平面形状为可计算出面积的各种形状。
3、如权利要求1或2所述的阶梯式浓度梯度检测条，其特征在于：所述药物块的平面形状为长方形、正方形、圆形、椭圆形、棱形中之一。
4、如权利要求1所述的阶梯式浓度梯度检测条，其特征在于：所述的药物块中包括有速释剂。
5、如权利要求4所述的阶梯式浓度梯度检测条，其特征在于：所述的速释剂由如下成分中的一或几种组成：多糖淀粉类、纤维素类、海藻酸类、陶土类、PVP类、树胶类。
6、一种制备如权利要求1、2、3、4或5之一的阶梯式浓度梯度检测条的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：
制作能漏印涂布药浆的大丝印模板即：将大丝印模板区分为多个尺寸相同的长条矩形小模版，再将所述小模版等长地划分为若干个等面积区间，在每个等面积区间中相对区间中心对称地制作出多个面积大小呈一或多段阶梯变化的的漏印区域；
配制一或多种浓度的药浆以便进行一或多段的阶梯性药量涂布；
将所述大丝印模板覆盖在相应尺寸的载体薄片上；
按照药量沿小模版轴向作单向性梯度分布的规律，依次采用某一配制浓度的药浆、经过相应某段的漏印区域，向所述的载体薄片上进行涂布；
将所有漏印区域都涂布药浆后得到的载体薄片按照小模版的边界和尺寸进行裁剪分切、干燥，然后真空包装。
7、如权利要求6所述的阶梯式浓度梯度检测条的制备方法，其特征在于：所有漏印区域的厚度相同。
8、如权利要求6所述的阶梯式浓度梯度检测条的制备方法，其特征在于：在大丝印模板中，所有长条矩形小模版的属于同一阶梯变化段的漏印区域相互对齐。
9、如权利要求6所述的阶梯式浓度梯度检测条的制备方法，其特征在于：所述的药浆中包括有如下一或几种成分组成的速释剂：多糖淀粉类、纤维素类、海藻酸类、陶土类、PVP类、树胶类。
10、如权利要求6所述的阶梯式浓度梯度检测条的制备方法，其特征在于：所述大丝印模板中排列有250个长条矩形小模版。
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