CN1665838A - 在蛋白质如病原性/传染性蛋白质中诱导构象转变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在蛋白质中诱导构象转变的体外方法，而所述构象转变导致β折叠二级结构的含量升高，该方法包括步骤：a)提供一种转变缓冲液；b)向转变缓冲液中加入含有带负电荷脂质的层状脂质结构的溶液；c)向转变缓冲液中加入蛋白质分子；d)由转变缓冲液、添加的脂质和蛋白质分子形成一种样品混合物；e)在样品混合物中确定转变温度；和f)将步骤d)的样品混合物置于根据步骤e)的转变温度下足够的时间以形成构象转变的蛋白质。通过这一方法，形成了层状脂质结构和构象转变蛋白质的水溶性复合物，所述构象转变的蛋白质为寡聚的β折叠中间型结构。可以通过有效地破坏层状脂质结构由层状脂质结构和寡聚的β折叠中间型结构的水溶性复合物产生淀粉样聚集物。这类蛋白质可能涉及神经变性疾病像传播性海绵状脑病(TSE)、阿尔茨海默症、多发性硬化症和帕金森病。说明书包括通过该方法生产的蛋白质的应用，例如，开发PrPC向PrPSc转变的不同相；开发新的用于诊断的TSE检测方法以及抗TSE如人克－雅氏病的潜在的治疗方法和预防方法。
Description
相关申请资料
本专利申请要求于2002年7月11日递交的美国临时申请号60/395,203的优先权，这里并入其全部公开内容作为参考。
发明背景
虽然蛋白质折叠的中心范例(Anfinsen，C.B.(1973)蛋白链折叠的指导原则Principles That Govern Folding of Protein Chains.Science，181，223-230)，蛋白质的氨基酸序列编码其独特的三维结构得到了充分证实，但由于最近发展的“朊病毒”的概念使其共性受到了质疑。如首先由Griffith(Griffith，J.S.(1967)自复制和羊瘙痒病Self-replication andscrapie.Nature，215，1043-1044)以通用术语所提出的，引发中枢神经系统退化的传染性羊瘙痒病物质的生化特性显示了疾病传播所必需的成分是蛋白质(Prusiner，S.B.(1982)导致羊瘙痒病的新的蛋白质传染性颗粒Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.Science，216，136-144)。朊病毒增殖进一步包括由称为PrPC的细胞型朊病毒蛋白向有毒性的羊瘙痒病形式PrPSc的转变，通过PrPSc作为模板用于PrPC形成新的PrPSc分子推动了这一转变(Prusiner，S.B.(1987)朊病毒和神经变性疾病Prions and neurodegenerative diseases.N Engl J Med，317，1571-1581)。这种“唯蛋白质”假说暗示同样的多肽序列，在不存在任何翻译后修饰的情况下，能够采用两种明显不同的稳定的蛋白质构象。因而，对于朊病毒来说有可能，尽管没有证实，它们违背了蛋白折叠的中心范例。有一些间接的证据即其它因子可能涉及构象转变过程(Prusiner，S.B.(1998)朊病毒Prions.Proc Natl Acad Sci USA，95，13363-13383)，该过程包括一种由α螺旋变为β折叠二级结构的显著改变。尽管有人提出一种假定的“因子X”可能作为一种分子伴侣而起作用，但其化学特性却一直未得到鉴定(Zahn，R.(1999)朊病毒传播和分子伴侣Prion propagationand molecular chaperones.Q Rev Biophys，32，309-370)。因而“因子X”可能是一种蛋白质、一种脂质、另一种生物大分子或其组合。
对于PrPSc促进细胞同工型的转变的分子机制已提出两种通用的模型(见图1)。关于PrPSc形成的“晶核形成”或“结籽”模型(Jarrett，J.T.和Lans-bury，P.T.，Jr.(1993)淀粉体的“一维结晶”为引入种晶：一种在阿尔茨海默症和羊瘙痒病中的致病机制？Seeding″one-dimensionalcrystallization″of amyloid：a pathogenic mechanism in Alzheimer′sdisease and scrapie？Cell，73，1055-1058)提出PrPC和PrPSc处于快速建立的平衡态中，并且PrPSc的构象只有在陷入于晶体样的晶种内时才是热动力学稳定的(见图1A)。该建议的过程类似于充分描述了特性的成核依赖的蛋白质聚合作用的其它过程，包括微管装配、鞭毛装配以及镰状红细胞血红蛋白原纤维的形成，其中动力学势垒是由单分子周围成核所致。为阐明指数式转变速率，必须假定聚集物不断地分裂以产生增加的堆积表面，尽管分裂的机制还有待于解释。PrPSc形成的“模板辅助”或“异二聚体”的模型(Prusiner，S.B.，Scott，M.，Foster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等(1990)转基因研究暗示了羊瘙痒病朊病毒复制中同源PrP同工型之间存在相互作用Transgenetic studies implicate inter-actions betweenhomologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)提出PrPC在一定程度上是未折叠的并在作为模板起作用的PrPSc分子的作用下重折叠(见图1B)。在没有通过预先存在的PrPSc催化的情况下，高的能量势垒被假定使得这种转变不可能发生。构象变化被认为是通过PrPC-PrPSc异二聚体分解为两个PrPSc分子进行动力学控制的，且能被视为是一种继Michaelis-Menten动力学自动催化之后的一种诱导装配的酶反应。一旦转变开始启动其就引起一种指数式的转变级联，与此同时PrPSc二聚体快速地解聚为单体。模板辅助模型的一个缺点是它没有解释为什么在增殖后PrPSc会聚集为蛋白质原纤维。Manfred Eigen曾进行过朊病毒的两种建议的疾病机制的比较动力学分析(Eigen，M.(1996)Prionics或朊病毒疾病的动力学基础Prionics or the kinetic basis of prion diseases.Biophysical Chemistry，63，A1-A18)。他发现大体而言两种模型在逻辑上都是可行的，但是它们作用过程中的条件似乎是过于狭窄且不切实际。自动催化的模板辅助模型需要协同效应以启动，但接着其在现象上变得与成核模型无法区分，该成核模型也是一种(被动的)自动催化的形式。尽管这两种机制依然可能在两种单体蛋白质构象的哪一种是有利的平衡态的问题上产生不一致，但它们二者都需要一种聚集态作为最终在平衡上有利的形式以及假定类似朊病毒蛋白质的病理形式。Eigen推断需要更多的实验证据来判断两种模型的哪一种是正确的。原则上，对于朊病毒增殖的两种模型都没有排除可能的通过“因子X”的协同作用。
对一种朊病毒疾病的机理的理解需要细胞型和病理型朊病毒蛋白的三维结构的详细知识。只有两种蛋白的结构都得到了解释，那么才能够理解转变是如何发生的。在体内，“健康的”朊病毒蛋白通过一种糖基化肌醇磷酯锚和称为脂质筏的膜结构域部分而附于细胞表面(Vey，M.，Pilkuhn，S.，Wille，H.，Nixon，R.，DeArmond，S.J.，Smart，E.J.，Anderson，R.G.，Taraboulos，A.和Prusiner，S.B.(1996)细胞的亚细胞共区域化和在细胞膜穴样内陷类似膜结构域中的羊瘙痒病朊病毒蛋白Subcellularcolocalization of the cellular and scrapie prion proteins incaveolae-like membranous domains.Proc Natl Acad Sci U S A，93，14945-14949)。近来的结构研究集中在使用核磁共振(NMR)波谱法研究来自不同物种的可溶性重组朊病毒蛋白。这些研究显示了哺乳动物PrPC由两个不同的结构域组成：一个柔性无序的N端尾部，它包含残基23-120，以及残基121-230的一个井状结构的C末端球状结构域，它富含α螺旋二级结构及包含一种少量反平行的β折叠(Lopez Garcia，F.，Zahn，R.，Riek，R.和Wüthrich，K.(2000)牛朊病毒蛋白的NMR结构NMR structureof the bovine prion protein.Proc Natl Acad Sci U S A，97，8334-8339)。当PrPC转变成PrPSc后，代表在哺乳动物和非哺乳动物朊病毒蛋白中最保守序列的残基90-120(Wopfner，F.，Weidenhofer，G.，Schneider，R.，vonBrunn，A.，Gilch，S.，Schwarz，T.F.，Werner，T.和Schatzl，H.M.(1999)分析27种哺乳动物和9种鸟类的朊病毒蛋白揭示了朊病毒蛋白的柔性区域的高保守性Analysis of 27 mammalian and 9 avian prion proteinsreveals high conservation of flexible regions of the prion protein.J Mol Biol，289，1163-1178)，变得抗蛋白酶K的处理(Prusiner，S.B.，Groth，D.F.，Bolton，D.C.，Kent，S.B.和Hood，L.E.(1984)一种主要的羊瘙痒病朊病毒蛋白的纯化和结构研究Purification andstructural studies of a major scrapie prion protein.Cell，38，127-134)，暗示该多肽片段结构变化了。有进一步的证据即PrPC的构象转变伴随着β折叠二级结构的大量的增加(Pan，K.M.，Baldwin，M.，Nguyen，J.，Gasset，M.，Serban，A.，Groth，D.，Mehlhorn，I.，Huang，Z.，Fletterick，R.J.，Cohen，F.E.等.(1993)α螺旋转变为β折叠在形成羊瘙痒病朊病毒蛋白的过程中起重要作用Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins.ProcNatl Acad Sci USA，90，10962-10966)。
在现有技术中观察到的问题
清楚地定义不同类型的PrP的构象特性对于阐释所述转变和疾病机制是决定性的。由于大多数测定蛋白质构象的高效方法依赖于预先排除了聚集物的可溶的均质样品的研究，对于朊病毒来说证明这是挑战性的。到目前为止，病原性的朊病毒蛋白还没有进行过详细的结构分析。它们形成淀粉样蛋白原纤维的趋势阻止了用于X射线研究的晶体的生长，而且用于结构测定的液体核磁共振波谱法到目前为止仅能够应用于最高具有40kDa分子量的蛋白。然而，该原纤维太大了而且此外是不可溶的。固体核磁共振当前是在原子分辨率上对淀粉样蛋白原纤维中的PrPSc进行分析的唯一技术，但要应用到生物大分子上，这种技术仍然需要巨大的发展。
一个朊病毒疾病研究中的科学突破期望于朊病毒蛋白的可溶性聚集物的生产和结构鉴定。依据朊病毒复制的普遍模型该寡聚的PrP聚集物对于细胞型重折叠为具有传染性的瘙痒病型是重要的，并且有一些证据即因子X可能参与这一过程(Prusiner，1998)。PrPSc的可溶性复合物以及PrPC/PrPSc聚集物对于在溶液中的任何生物化学或光谱技术都是有吸引力的靶目标。因而，发展一种从重组PrPC到PrPSc的构象传递方法将具有众多潜在的应用。
较早地以重组PrP进行的转变研究已经显示了没有获得规则的蛋白质原纤维：在酸性pH下并且在高浓度尿素存在时，mPrP(121-231)转变成一种可溶性的富含β折叠的同工型(Hornemann，S.和Glockshuber，R.(1998)通过酸性pH诱导朊病毒蛋白结构域PrP(121-231)的一种洋瘙痒病类似未折叠中间态A scrapie-like unfolding intermediate of the prion proteindomain PrP(121-231)induced by acidic pH.Proc Natl Acad Sci U S A，95，6010-6014)，而hPrP(90-231)在盐酸胍存在时转变为一种富含β折叠的同工型，其形成原纤维样聚集物(Swietnicki，W.，Morillas，M.，Chen，S.G.，Gambetti，P和Surewicz，W.K.(2000)重组人朊病毒蛋白huPrP90-231的聚集作用和原纤维化Aggregation and fibrillization ofthe recombinant human prion protein huPrP90-231.Biochemistry，39，424-431)。但是，这些聚集物的超结构没有被充分地解释，并且没有报道过它们是否显示淀粉样蛋白的典型生物物理特性。在不存在去污剂的还原条件下也已经获得了hPrP(91-231)的不规则的原纤维样聚集物(Jackson，G.S.，Hosszu，L.L.，Power，A.，Hill，A.F.，Kenney，J.，Saibil，H.，Craven，C.J.，Waltho，J.P.，Clarke，A.R.和Collinge，J.(1999)单体人朊病毒蛋白在天然的和原纤维基因状构象之间的可逆转变Reversibleconversion of monomeric human prion protein between native andfibrilogenic conformations.Science，283，1935-1937)。
几种不同的神经变性疾病如阿尔茨海默症、帕金森症和克-雅氏病都涉及具有高含量的β折叠二级结构的特异性蛋白质或肽的形成，它赋予对于蛋白质/肽聚集和称为淀粉样蛋白的极不可溶的细胞内或细胞外沉淀物的形成的高趋向性。有越来越多的本领域权威小组所发表的证据即它是这种“β蛋白”的寡聚物形式，并且不需要淀粉样蛋白的典型的大聚集物，该大聚集物是造成引发神经变性疾病发病的原因。
发明目的和概述
因此，本发明的一个目的就是提供一种由重组的和/或天然的蛋白质产生病原性/传染性蛋白质的方法。通过权利要求1的特征得以实现该目的。本发明的具体实施方案包括涉及神经变性疾病的蛋白质或聚集物的相应方法，所述神经变性疾病包括传播性海绵状脑病(TSE)、阿尔茨海默症、多发性硬化症和帕金森病，以及产生的蛋白质或蛋白质聚集物。
本发明的进一步目的是提供通过这些方法获得的蛋白质的应用，包括研究在受控制的条件下PrPC向PrPSc转变的不同相；筛选用于开发a)对抗传播性海绵状脑病的潜在治疗方法，或b)新的用于诊断传播性海绵状脑病的检测方法的配体；开发特异性结合(PrPSc)的抗体；以及使用核磁共振波谱法或X-射线测定的PrPSc的三维结构作为配体设计的基础。
本发明的另一个目的是提供应用本发明的方法，以开发抗传播性海绵状脑病如人克-雅氏病(CJD)的潜在治疗方法；开发特异性结合(PrPSc)的抗体；以及使用核磁共振波谱法或X-射线测定的PrPSc的三维结构作为配体设计的基础。
根据本发明的优选的具体实施方案和额外的特征阐述于从属权利要求中。
本发明包括一种用于产生重组PrP、PrPβ的可溶的、寡聚的富含β折叠的构象变体的体外方法，所述变体聚集成淀粉样蛋白原纤维PrPβf，类似于在羊瘙痒病相关原纤维和朊病毒棒体中的病原型PrPSc。由PrP向PrPβ的转变于pH5.0下在bicellar溶液中发生，所述bicellar溶液含有二已酰-磷酸胆碱和二肉豆蔻酰-磷脂的等摩尔混合物，以及小百分比的带负电荷的二肉豆蔻酰-磷酸丝氨酸。该方法适用于所有PrP受测的物种，包括人类、牛、驼鹿、猪、狗和鼠PrP。使用N末端截短的人PrP片段hPrP(90-230)、hPrP(96-230)、hPrP(105-230)和hPrP(121-230)，我们显示了柔性肽片段105-120对于PrPβ是必需的。PrP的二聚化是转变的限速步骤，其依赖于氨基酸序列。人和牛的PrP二聚化的自由焓为大约130kJ/mol，其它被研究的物种为在260和320kJ/mol之间。因此，提出的体外转变测试方法允许在分子水平上研究传播性海绵状脑病的不同相。
附图简述
以下附图用于证明现有的技术以及本发明。
根据本发明的方法的优选的实施方案将也将通过附图来解释，而这不应限制本发明的范围。
图1对于PrPSc促进细胞同功型转变的分子机制提出的两种通用模型(Zahn，R.(1999)：
图1A“晶核形成”或“结籽”模型；
图1B“模板辅助”或“异二聚体”模型；
图2在bicellar溶液中通过紫外CD所揭示的重组mPrP(23-231)向PrPβ的构象转变：
图2A PrP重折叠为富含β折叠形式的PrPβ；
图2B当用5％二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPG)取代DMPS时所观察到的构象变化；
图2C在中性bicelles中加热蛋白质，即在不存在DMPS和DMPG时不诱导二级结构改变；
图2D在中性bicelles中加热蛋白质，即在无脂质缓冲液中不诱导二级结构改变；
图3人重组PrP向PrPβ的转变对于N端“尾部”长度的依赖性；
图4A在转变缓冲液中测量的鼠PrP转变动力学作为摩尔椭圆率在226nm处的改变值；
图4B在不同温度下相对于PrP浓度测定的起始转变速率的双对数曲线；
图5 Prp向PrPβ转变的温度依赖性：
图5A鼠PrP的转变动力学；
图5B小鼠、人、牛和驼鹿的埃林坐标图，其上绘制有相对于反向绝对温度的对数标度。
图6蛋白酶K消化后重组小鼠PrP(23-230)的十二烷基磺酸钠电泳；
图6A PrPβf-聚集物；
图6B未转变的PrP；
图7 PrP向PrPβ转变的机理模型；
图8通过CLUSTAL W算法得到的哺乳动物PrP序列的序列比对。
发明详述
以住曾对在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组PrP与脂质的相互作用进行过研究。在大量带负电荷脂质存在时，观察到蛋白质二级结构向更多α螺旋(Morillas，M.，Swietnicki，W.，Gambetti，P.和Surewicz，W.K.(1999)膜环境改变了重组人朊病毒蛋白的构象结构Membrane environmentalters the conformational structure of the recombinant human prionprotein.J Biol Chem，274，36859-36865)或β折叠结构(Sanghera，N.和Pinheiro，T.J.(2002)朊病毒蛋白结合到脂质膜及对朊病毒转变的暗示Binding of prion protein to lipid membranes and implications for prionconversion.J Mol Biol，315，1241-1256)的改变，尽管在这些研究中没有报道过PrP聚集成病原性的淀粉样蛋白原纤维。在产生或稳定淀粉样聚集物和富含β折叠的中间态PrP的尝试中，我们研究了在bicellar溶液中的重组蛋白质。Bicelles是由二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPC)、二肉豆蔻酰磷酸丝氨酸(DMPS)和二已酰-磷酸胆碱(DHPC)的混合物组成的盘状脂质颗粒。Bicelles的长链磷脂形成一种液晶态的双分子层部分，它被一圈短链磷脂所包环绕，保护长酰基链不与水接触(Vold，R.R.和Prosser，R.S.(1996)磁定向的磷脂双分子层胶束用于多肽结构研究。理想的bicelle存在吗？Magnetically oriented phospholipid bilayered micelles forstructural studies of polypeptides.Does the ideal bicelle exist？Journal of Magnetic Resonance Series B，113，267-271)。在跨膜蛋白的活性重建中，bicelles显示了优于其它化合物(Dencher，N.A.(1989)膜蛋白温和和快速的跨膜重建Gentle and fast transmembranereconstitution of membrane proteins.Methods Enzymol，171，265-274)。此外，bicelles与脂质筏共有一些结构特征即它们形成盘状脂质双分子层。
在此，我们显示了bicellar溶液特别适于重组PrP向一种可溶的、剐聚的β折叠中间态(PrPβ)的构象转变的产生过程，该中间态能够进一步转变成淀粉样蛋白原纤维(PrPβf)。这些重组的PrP聚集物基本显示了文献记载的PrPSc所有理化性质。起始于重组PrP的PrPβ的产生也许打开了另一条在体外条件控制下研究和利用PrP向PrPSc转变的不同相的途径。
此外，本发明包括下列应用：
1、为开发抗传播性海绵状脑病，如人克-雅氏病(CJD)的潜在治疗方法，在体外和体内筛选“转变抑制物”，该转变抑制物包括结合到PrPC上并因而阻止其向PrPβ构象转变(参见图7)的小分子或生物大分子(如蛋白质或核酸)以及PrPSc寡聚体(参见图1A)或PrPSc/PrPC异二聚体(参见图1B)。转变抑制物进一步包括给合到PrPβ和PrPSc寡聚体或PrPSc/PrPC异二聚体上，并因而阻止PrPβf和PrPSc淀粉样蛋白原纤维形成的小分子或生物大分子(参见图1和7)，转变抑制物还包括结合到PrPSc寡聚体、PrPβ和PrPβf上并导致它们分解成PrPC寡聚体或PrPC单体的良性同工型的小分子或生物大分子。体外筛选方法包括在“发明目的和概述”中所概述的方法，使用CD光谱分析、电子显微镜照相、光学显微镜照相和蛋白酶K抗性分析，以及其它光谱技术如核磁共振波谱法、动态光散射和荧光相关光谱学以及生物化学技术如BIAcore。体内筛选方法包括用实验动物进行的研究和细胞培养实验。
体外筛选PrPSc特异性配体用于开发新的用于诊断的传播性海绵状脑病检测方法，其中PrPβ代表一种理想的筛选模板(参见图7)。PrPSc特异性配体包括结合到PrPβ和/或PrPβf(参见图7)和PrPSc寡聚体(参见图1A)、PrPSc/PrPC异二聚体(参见图1B)或PrPSc淀粉样蛋白原纤维(参见图1)上的小分子或生物大分子，其中在与PrPC的结合相比时该结合亲和性是相对地高。体外筛选方法包括在“发明目的和概述”中所概述的方法，使用电子显微镜照相、光学显微镜照相和蛋白酶K抗性分析，还包括其它光谱技术如动态光散射和荧光相关光谱学以及生物化学技术。
开发特异性结合PrPSc的抗体，其中PrPβ和/或PrPβf代表理想的抗原(参见图7)。特异性结合PrPSc的抗体可以通过体外工程方法或在人和动物以PrPβ或PrPβf主动免疫之后而产生。该抗体可用于人和/或动物的被动免疫。
工业化生产“重组PrPSc”作为用于传播性海绵状脑病检测方法的“PrPSc标准”，其中PrPβ和/或PrPβf代表重组PrPSc(参见图7)。“PrPSc标准”包括一种用于测定蛋白酶K抗性和聚集行为的重组PrP标准，其使用光谱技术如动态光散射和荧光相关光谱。传播性海绵状脑病检测方法可以应用于人和各种动物如牛、羊、驼鹿、鹿、猫、猪和马。
生产“重组PrPSc”用于实验动物的接种研究或细胞培养实验，其中PrPβ和/或PrPβf代表重组的PrPSc(参见图7)。
使用核磁共振波谱法、X射线结晶学或电子显微镜照相所测定的PrPSc的三维结构用作为配体和先导化合物设计的基础。PrPβ代表液体核磁共振和X射线结晶学的理想底物，而PrPβf代表固体核磁共振和电子显微镜检查的理想底物(参见图7)。
本发明及其应用可以用于涉及神经变性疾病(例如阿尔茨海默症、帕金森病和多发性硬化症)的其它蛋白质或通常应用于在构象转变以后引发疾病的蛋白质(构象疾病如原发性系统淀粉样变性、II型糖尿病、动脉淀粉样变性)。
本发明进一步包括根据1-7点的野生型蛋白及其变体的产生和/或应用。这些变体包括蛋白片段、突变蛋白、融合蛋白、源自合成的蛋白和肽，以及蛋白质-配体复合物。
实验结果
重组鼠PrP向PrPβ的转变
在含有25mM二已酰-磷酸胆碱(DHPC)、23.75mM二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPC)和1.25mM二肉豆蔻酰磷酸丝氨酸(DMPS)的转变缓冲液中，mPrP(23-231)发生了从占优势的α螺旋向可溶的富含β折叠的同工型，称为PrPβ的转变。
图2显示了在bicellar溶液中mPrP(23-231)向PrPβ的构象转变。在含有25mM长链(DMPX；含DMPC，DMPG和/或DMPS)以及25mM短链DHPC磷脂的转变缓冲液中记录远紫外圆二色(CD)谱。首先，光谱在37℃累积(圆形)，随后加热样品到65℃ 15分钟。于37℃平衡后，记录第二次CD谱(三角形)。图2A显示在5％DMPS和95％DMPC存在时，鼠PrP重折叠为富含β折叠的PrPβ型，其在CD谱中215nm处具有特征性的最小值。图2B显示了当使用5％的二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPG)代替DMPS时所观察到的类似的构象改变。图2C显示在中性bicelles中加热蛋白质，即在不存在DMPS或DMPG时没有诱导二级结构改变。图2D显示在无脂质的缓冲液中加热蛋白质没有再次诱导二级结构改变。
如在脂质不存在时对于mPrP(23-231)所观察到的(Hornemann，S.，Korth，C.，Oesch，B.，Riek，R.，Wider，G.，Wuthrich，K.和Glockshuber，R.(1997)重组全长鼠朊病毒蛋白mPrP(23-231)：纯化和光谱特性Recombinant full-length murine prion protein，mPrP(23-231)：purification and spectroscopic characterization.Febs Letters，413，277-281)，图2A进一步显示了mPrP(23-231)在37℃下，对于α螺旋具有特征性的208nm处的最小值和217nm处的肩部。加热蛋白质到65℃ 15分钟导致PrPβ的形成，它显示了在CD谱中215nm处的单一最小值，提示β折叠二级结构的相对增加。将样品冷却回37℃后，只观察到极小的光谱的变化。没有可以看到的聚集并且在20,000g下离心30分钟后并不引起沉淀。而且，在室温温育多至100天并没有显著地改变CD谱。图2B进一步显示在bicelles中DMPS取代带负电荷的DMPG导致了与图2A相比类似的结果。图2C、D进一步显示在中性bicelles或无脂质缓冲液中mPrP(23-231)的加热没有导致PrPβ的形成。
将DMPS的相对数量增加到10％或更多似乎增加了未转变PrP中的α螺旋二级结构的含量(数据未显示)，暗示该形式也直接与带负电荷的bicelles相互作用。然而，加热后的快速沉淀使CD谱的定量分析成为不可能。因而PrPβ的形成好像是不可逆的脂质相关的过程，它依赖于在脂质双分子层上负电荷的分布。
2.N端截短的人PrP片段的转变
图3显示人PrP向PrPβ的转变对于N端“尾部”长度的依赖性。如对图2所描述地记录了CD谱：圆形，加热前；三角形，加热后。指出了重组的PrP构建体。
在试图缩小形成PrPβ所需要的肽片段的努力中，我们分析了完整的人PrP及其各种N端截短的片段的光谱特性。在转变缓冲液中加热后，hPrP(23-230)、hPrP(90-230)和hPrP(105-230)显示了一种从占优势的α螺旋向富含β折叠的蛋白的类似转变(图3A-C)。对于这些蛋白在加热后没有观察到聚集作用。但是，在转变缓冲液中加热的片段hPrP(121-230)立即导致了沉淀，从而没能记录到有意义的CD谱。因而，在哺乳动物PrP中肽片段105-120的存在似乎对于重组PrP向PrPβ的转变是必需的。值得注意的是，在所有目前已知的朊病毒蛋白中(Wopfner等，1999)这种最保守的序列元件都含有AGAAAAGA基序，它已被显示了对于体内PrPc向PrPSc的转变是必不可少的(Holscher，C.，Delius，H.和Burkle，A.(1998)非转化型PrPCδ114-121在羊瘙痒病感染的小鼠成神经细胞溜细胞中的过表达导致了野生型PrP(Sc)聚集的转显性抑制Overexpression ofnonconvertible PrPC delta114-121 in scrapie-infected mouseneuroblastoma cells leads to trans-dominant inhibition of wild-typePrP(Sc)accumulation.J Virol，72，1153-1159)。
3.转变的动力学机制
为从机理上深入了解PrPβ的形成，在蛋白质溶液快速加热后在恒定的波长226nm处我们测量了转变动力学(参见材料和方法)。所有的动力学测量在100mM氟化钠存在下进行以模仿生理环境。
图4A显示在转变缓冲液中测量的鼠PrP的转变动力学作为摩尔椭圆率在226nm处的改变值。不同的蛋白质浓度在相应的曲线旁指出。图4B显示了在不同温度下相对于PrP浓度(45 to 180 uM)所测定的起始转变速率的双对数曲线。
图4A进一步显示了在不同鼠PrP浓度时所获得的有代表性的数据系列。随着不断增加的蛋白质浓度反应变得显著更快，提示了与PrPβ的形成相关联的构象的改变以一种包括PrP分子寡聚化的协同方式发生。当转变在预形成的PrPβ存在下进行时，观察到的速率常数没有增加。在图4B中，相对于蛋白质浓度的对数绘制了起始反应速率的对数。不考虑温度，这些曲线的斜度为n＝2.1±0.2。因而，二聚化似乎是单体PrP向寡聚的PrPβ转变的限速步骤。
图5显示PrP向PrPβ转变的温度依赖性。根据图5A在恒定的蛋白质浓度100μM和介于57℃和65℃之间的不同温度下测量鼠PrP的转变动力学。图5B显示小鼠、人、牛和驼鹿PrP的埃林坐标图，其中转变的速率常数k被绘制于相对于反向的绝对温度的对数标度上。
检查了图5A显示了反应速率随着温度提高从而能够根据埃林方程测定与转变限速步骤相关联的活化焓。相对于反向绝对温度的反应速率常数k的对数坐标图，以及实验数据的拟合值显示于图5B。计算出的各种片段的活化参数和PrP的物种总结于表1。
表1：PrP向PrPβ转变实验的动力学参数
| 物种 | 片段 | 转变1 | ΔH≠ | ΔS≠2 | ΔG≠3 | K4 |
| 2 | ||||||
| (kJ/mol) | (J/K.mol) | (kJ/mol) | (s-1.M-1) | |||
| 人 | 23-230 | 是 | 130 | 200 | 66 | 60 |
| 90-230 | 是 | 140 | 230 | 67 | 40 | |
| 96-230 | 是 | |||||
| 100-230 | 是 | 140 | 230 | 67 | 40 | |
| 105-230 | 是 | |||||
| 121-230 | 否 | |||||
| 牛 | 25-242 | 是 | 140 | 230 | 65 | 60 |
| 驼鹿 | 25-234 | 是 | 260 | 580 | 76 | 0.9 |
| 猪 | 25-235 | 是 | 260 | 600 | 77 | 0.7 |
| 狗 | 25-233 | 是 | 310 | 730 | 80 | 0.2 |
| 小鼠 | 23-231 | 是 | 320 | 760 | 81 | 0.1 |
| 23-2315 | 是 | 250 | 570 | 75 | 2 | |
| 121-231 | 否 |
1通过特征性的β折叠CD谱以及加热后不存在沉淀所证明了PrP向PrPβ的转变(参见材料和方法)。
2通过将方程5与在不同温度下实验测定的反应速率k拟合后所获得的值。
3，4在37℃下分别使用方程6和5计算。
5在2M尿素存在下进行的转变。
对于鼠和狗的PrP，获得大约300kJ·mol-1的活化焓，它是完整人和牛PrP的相应的热焓的两倍。这一发现与人和牛PrP的核磁共振结构近似的观点相一致，而它们都与鼠PrP的结构显著不同(Lopez Garcia等，2000)。
4.产生重组PrP原纤维：PrPβf
去污剂DHPC构成了在转变缓冲液中的bicelles的主要成分。在与长链磷脂的混合物中，DHPC的临界胶束浓度(cmc)大约是5mM(Ottiger，M.和Bax，A.(1998)在大分子中鉴定用于测量偶级耦合的磷脂胶束的磁定向Characterization of magnetically oriented phospholipid micelles formeasurement of dipolar couplings in macromolecules.J Biomol NMR，12，361-372)，低于此浓度，在中度酸性或在中性pH下长链磷脂都形成小泡(Ottiger，M.和Bax，A.(1999)在酸性和碱性pH值下基于液晶的Bicelle用于偶级耦合的NMR测量Bicelle-based liquid crys-tals for NMR-measurement of dipolar coupling at acidic and basic pH values.J BiomolNMR，13，187-191)。在我们的转变测定中，稀释的PrPβ-bicellar溶液明显地低于DHPC的临界胶束浓度，立即导致了PrPβ沉淀为PrPβf。以非变性去污剂如辛基葡糖苷处理这些聚集物导致规则原纤维PrPβf的形成，它可以在电子显微镜中观察到。当直接以去污剂处理而没有脂质的前期稀释时观察到了类似的原纤维。
对去污剂处理的PrP淀粉样蛋白原纤维进行电子显微镜照相：将25μM的小鼠PrPβf在20,000g下进行沉淀并在50mM Tris-HCI、150mM NaCl、320mM蔗糖和0.5％(w/v)辛基葡糖苷中重悬。产生的淀粉样蛋白原纤维有形成大束的趋向。但是，也分别观察到由两个或四个螺旋缠绕的直径为10.5±0.6nm和25.8±0.6nm原丝组成的单个原纤维(数据未显示)。这些原丝包含一种直径为4到4.5nm的念珠状亚结构。
用于羊瘙痒病相关的原纤维的类似的亚结构已被过描述，并且据推测它们可能是原纤维的亚单位(Merz，P.A.，Somerville，R.A.，Wisniewski，H.M.和Iqbal，K.(1981)来自羊瘙痒病感染脑组织的异常原纤维Abnormalfibrils from scrapie-infected brain.Acta Neuropathol(Berl)，54，63-74)。假定为一种球状，单个PrPβf念珠包含34-48nm3的体积，是相应于hPrP(90-230)体积的1.7-2.5倍。这与PrPβ形成中的限速步骤为二聚体化的观察结果是一致的。因而，PrPβf可能是PrP二聚体聚合的聚集物，并且羊瘙痒病相关的原纤维可能也由类似的构件组成。
我们发现PrPβf结合刚果红并显示交叉偏振光的绿-金黄色双光折射(数据未显示)，并且它包含一种相应于真正的PrPSc的部分蛋白酶K抗性的核心(参见图6)。
图6显示了蛋白酶K消化后重组小鼠PrP(23-230)的十二烷基磺酸钠电泳结果。图6A显示了PrPβf聚集物。箭头指示介于16.0和16.4kDa之间的蛋白水解片段，分别对应于PrP残基105-230和99-230。图6B显示了未转变的PrP。箭头指示介于13.5和14.7kDa之间的主要的蛋白水解片段。
结果的讨论
PrP转变的机制
在图7中显示了在bicellar溶液中形成PrPβ的一种可能的机制。
图7显示了PrP向PrPβ转变的一种机理模型。重组PrP由一种椭圆体(残基121-230)和一段不规则的线条(残基90-120)所表示。在PrPβ中，柔性尾部变得结构化如几何线条所显示。在PrPβ中球状结构域或者保持不变，或者参与α螺旋向β折叠的构象转变(长方形)。对由脂质分子和蛋白分子所组成的bicelles的相对尺度进行近似的测量。
对于有效转变负电荷必须在bicelles的双分子层表面存在的观察结果证明了在反应中的第一步是PrP静电吸附到双分子层/水界面。重组朊病毒蛋白分布到带负电的双分子层上的先前观察结果支持了这种观点(Morillas等，1999；Sanghera和Pinheiro，2002)。转变反应的PrP浓度依赖性暗示在反应途径中的所有其它的速率都必须明显地快于PrP的二聚化。而且，二聚化本身并不引起CD谱中可观察到的变化，而重折叠却可以。因此，将PrP向PrPβ的转变与蛋白质二聚化偶联。我们估计在我们的试验中所用的bicelles具有大约10nm的直径(Vold和Prosser，1996)，基于PrP分子相对于bicellar膜的定位它将提供足够的空间以容纳10-20个PrP的单体。在DHPC稀释到超过临界胶束浓度后或在去污剂存在下，颗粒个体将会相遇，导致高度聚合的PrP聚集物PrPβf的形成。这种PrP转变的模型与Caughey及其合作者在一种无细胞的转变反应中所得到的观察结果相一致(Baron，G.S.，Wehrly，K.，Dorward，D.W.，Chesebro，B.和Caughey，B.(2002)筏相关的朊病毒蛋白到具有蛋白酶抗性状态的转变需要插入PrP-res(PrP(Sc))到与之接触的膜中Conversion of raft associatedprion protein to the protease-resistant statere-quires insertion ofPrP-res(PrP(Sc))into contiguous membranes.Embo J，21，1031-1040)，提示了在TSE传染的过程中产生新的PrPSc需要：(i)PrPC从靶细胞中移除；(ii)细胞间膜交换；或(iii)引入的PrPSc插入受体细胞的脂筏区。
PrP与bicelles相互作用的可能方式包括吸附到双分子层表面和通过DHPC边缘侧向插入的跨膜片段的形成。转变发生需要疏水肽片段112-130证明了支持PrP的该部分插入到双分子层内的观点，尽管PrPβ也可能仅仅吸附到脂质表面。如果构象的转变是伴随着β折叠的形成，那么在柔性无序的尾部或球状结构域或二者中的二级结构不能够轻易地通过我们现有的数据来确定(参见图7)。但是，肽片段90-120在转变后变得抗蛋白酶K的事实显示了尾部参与了构象的转变。在表1中收集的PrPβ形成的过渡态动力学提供了进一步有价值的信息。所有的过渡态熵都具有大的正值，显示了过渡态包含了与未转变的PrP相比更高程度的无序。肽片段105-120在未转变的PrP中为柔性无序的，使得它不太可能对ΔS≠有正面贡献。这些数据提示柔性尾部，以及球状结构域121-230的未折叠部分在转变过程中起着重要作用，这将与在图2A、B和3A-C中所观察到的减少的α螺旋和增多的β折叠二级结构的结果相一致。这一模型好像似是而非，因为已证明肽片段110-140以PrP的跨膜形式横穿脂质双分子层，它可能涉及TSE因子的发病机制和传播(Hegde，R.S.，Mastrianni，J.A.，Scott，M.R.，DeFea，K.A.，Trembla，P.，Torchia，M.，DeArmond，S.J.，Prusiner，S.B.和Lin-gappa，V.R.(1998)在神经变性疾病中朊病毒蛋白的跨膜型A transmembrane form of the prion protein in neurodegen-erativedisease.Science，279，827-834；Hegde，R.S.，Trembla，P.，Groth，D.，DeArmond，S.J.，Prusiner，S.B.和Lingappa，V.R.(1999)可传染的和遗传的朊病毒疾病与神经元退化具有共同的途径Transmissible andge-netic prion diseases share a common pathway of neurodegeneration.Nature，402，822-826)。由于这种肽片段的三分之二在PrPC构架中是结构化的，因此这种膜关联的形式非常可能包含一个结构改变的球状结构域。
2.TSE传播的物种屏障的含义
在两组哺乳动物朊病毒蛋白，包括人和牛PrP，以及驼鹿、猪、狗和小鼠PrP之间，分别观察到在PrP向PrPβ转变的活化焓中的巨大差异(表1)。完整的人和牛PrP的相对低的活化熵说明与其它朊病毒蛋白相比过渡态为更少的折叠化。而且，从计算得出的转变的自由能值以及相应的于37℃估测的反应速率常数，得出在人和牛PrP中自发的转变比在例如小鼠PrP中的快约600倍。值得注意的是，人和牛PrP在氨基酸序列和三维结构方面非常类似(Lopez Garcia等，2000)。由于在转变反应中唯一的区别是PrP的氨基酸序列，在动力学参数中的变化必须在物种特异性氨基酸序列的基础上进行合理地说明。在上述两个PrP组之间相同的序列变化仅在155位发现，与在其它朊病毒蛋白中的酪氨酸相比此处人和牛的PrP含有一个组氨酸(图8)。
图8显示通过CLUSTAL W算法(1.8版；(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)C通过序列加权，位点特异性缺口罚分和权重矩阵选择lustal-W改善了累进的多序列比对Clustal-W-Improving theSensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment throughSequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties and Weight MatrixChoice.Nucleic Acids Research，22，4673-4680)得到的哺乳动物PrP序列的序列比对，从上到下以逐渐升高的转变活化焓进行排列(参见表1)。个别序列的同一性在左面标出。在上方，标出人PrP的二级结构单元(Zahn，R.，Liu，A.，Luhrs，T.，Riek，R.，von Schroetter，C.，Lopez Garcia，F.，Billeter，M.，Calzolai，L.，Wider，G.和Wuthrich，K.(2000)人朊病毒蛋白的NMR溶液结构NMR solution structure of the human prionprotein.Proc Natl Acad Sci USA，97，145-150)：空心框，常规二级结构；黑线，非常规二级结构。依据人PrP，残基号在下面标出。
溶剂暴露的His155的质子化(Zahn，R.，Liu，A.，Luhrs，T.，Riek，R.，von Schroetter，C.，Lopez Garcia，F.，Billeter，M.，Calzolai，L.，Wider，G.和Wuthrich，K.(2000)人朊病毒蛋白的NMR溶液结构NMRsolution structure of the human prion protein.Proc Natl Acad Sci USA，97，145-150)似乎实质上增加了能够转变为PrPβ的有能力转变的蛋白质构象。由于用嵌合小鼠/仓鼠PrP的无细胞转变实验已经显示了仓鼠PrPC的PrPSc抗原表位包括Met139、Asn155和Asn170(Kocisko，D.A.，Priola，S.A.，Raymond，G.J.，Chesebro，B.，Lansbury，P.T.，Jr.和Caughey，B.(1995)在朊病毒蛋白的无细胞转变为蛋白酶抗性型中的物种特异性：物种特异性：一种关于羊瘙痒病屏碍的模型Species specificity in thecell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms：amodel for the scrapie species barrier.Proc Natl Acad Sci USA，92，3923-3927)，His155对重组PrP转变的影响是令人感兴趣的。因而，在我们的转变分析中观察到的PrP向PrPβ的构象转变以及二聚化似乎反映了天然PrPC向PrPSc的转变。假如这样的话，就得到结论即在人和牛之间TSE传播的物种屏障比其它的研究物种更低些。
3.家族性克-雅氏病的含义
在人PrP的球状结构域中单个氨基酸的取代已显示与家族性克-雅氏病无关(参见综述(Prusiner，1998))。但是，还不了解关于这一过程的详细机理。不像在大多数折叠实验中那样，在其中对在蛋白质的未折叠和折叠状态之间的转变进行研究，PrP向PrPβ的转变发生在两种折叠的构象之间。因而，家族性氨基酸的取代可以影响PrP的天然态、过渡态或转变态的三维结构。以前曾以重组鼠PrP研究过家族性克-雅氏病的变体对于热动力学稳定性的影响(Liemann，S.和Glockshuber，R.(1999)与遗传性人朊病毒疾病相关的氨基酸取代对细胞朊病毒蛋白热力学稳定性的影响Influence of amino acid substitutions related to inherited human priondiseases on the thermodynamic stability of the cellular prion protein.Biochemistry，38，3258-3267)。尽管五种氨基酸替换使PrP(121-231)的天然状态不稳定，但三种其它变体事实上对热动力学稳定性并没有影响。而且，对于不稳定的变体没有观察到PrPSc样聚集物的自发形成，提示了PrPC构象的解折叠自身并不足以产生PrPSc。这些结果与我们的在2M尿素存在下进行的转变实验结果相一致(表1)，显示高浓度变性剂对于过渡态参数的影响比单个氨基酸残基的取代，例如155位上的酪氨酸替代为组氨酸，要低得多。
在人PrP的氨基酸序列中额外的八肽的存在已经证明了不具有发展成家族性克-雅氏病的遗传性风险，并且在人类中已发现多至9个额外的八肽重复(Goldfarb，L.G.，Brown，P.，McCombie，W.R.，Goldgaber，D.，Swergold，G.D.，Wills，P.R.，Cervenakova，L.，Baron，H.，Gibbs，C.J.，Jr.和Gajdusek，D.C.(1991)在PRNP基因中重复编码传染性家族克—雅氏病相关的5，7，和8个额外的寡肽Transmissible familialCreutzfeldt-Jakob disease associated with five，seven，and eight extraoctapeptide coding repeats in the PRNP gene.Proc Natl Acad Sci USA，88，10926-10930)。每个八肽重复都含有一个色氨酸，它是优选隔开脂/水界面的一种氨基酸。因而，这种序列基序可能通过结合到膜表面并导致PrP浓度局部升高而促进转变。但是，包含成熟PrPN末端的残基23-88的截短形式并没有阻止在转基因小鼠(Fischer，M.，Rulicke，T.，Raeber，A.，Sailer，A.，Moser，M.，Oesch，B.，Brandner，S.，Aguzzi，A.和Weissmann，C.(1996)具有邻近氨基缺失的朊病毒蛋白(PrP)恢复了PrP敲除小鼠对羊瘙痒病的易感性Prion protein(PrP)with amino-proximaldeletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie.Embo J，15，1255-1264)以及在ScN2a细胞中的(Rogers，M.，Yehiely，F.，Scott，M.and Prusiner，S.B.(1993)在培养细胞中截短和延伸的朊病毒蛋白转变为羊瘙痒病同工型Conversion of trun-cated and elongatedprion proteins into the scrapie isoform in cultured cells.Proc NatlAcad Sci USA，90，3182-3186)PrPSc的合成，提示了八肽区对于朊病毒增殖并非是必需的，尽管在转基因小鼠中孵育的时间比在野生型小鼠中要长(Flechsig，E.，Shmerling，D.，Hegyi，I.，Raeber，A.J.，Fischer，M.，Cozzio，A.，von Mering，C.，Aguzzi，A.和Weissmann，C.(2000)缺乏八肽重复区域的朊病毒恢复了PrP敲除小鼠中羊瘙痒病的易感性Prionprotein devoid of the octapeptide repeat region restoressusceptibility to scrapie in PrP knockout mice.Neuron，27，399-408)。我们的观察(表1)反映了这些发现，即在37℃下完整的人PrP的反应速率常数仅比缺少八肽重复的N端截短的人朊病毒蛋白稍高一些。
材料和方法
1.缓冲液和溶液
CB＝转变缓冲液(25mM DHPC，23.75mM DMPC，1.25mM DMPS，50mM醋酸钠pH5.0，100mM氟化钠)；
NaAc＝醋酸钠缓冲液
(50mM醋酸钠pH5.0)；
TNO＝Tris-HCI/辛基葡糖苷缓冲液(25mM Tris-HCI pH7.5，150mM NaAc，1％(w/v)辛基葡糖苷)；
TNSucO＝含有0.32M蔗糖的TNO。
2.朊病毒蛋白的纯化
如前所述，表达并纯化重组朊病毒蛋白(Zahn，R.，Liu，A.，Luhrs，T.，Riek，R.，von Schroetter，C.，Lopez Garcia，F.，Billeter，M.，Calzolai，L.，Wider，G.和Wuthrich，K.(2000)人朊病毒蛋白NMR溶液结构NMR solution structure of the human prion protein.Proc NatlAcad Sci USA，97，145-150.；Zahn，R.，von Schroetter，C.和Wuthrich，K.(1997)在大肠杆菌中表达人朊病毒蛋白并通过高效亲和层析柱重折叠纯化Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purifiedby high-affinity column refolding.FEBS Lett，417，400-404)，通过DNA测序、N端氨基酸测序以及MALDI-TOF质谱分析确证它们的同一性。
3.CD谱分析
在配备了PFD-350S温度控制单元的Jasco J-815分光光度计上使用一种0.2mm的石英比色皿进行测量。在不含氟化钠的转变缓冲液中用50μMPrP来测量CD谱。一般以10nm/min的速度0.5nm的间隔进行10次扫描且累积的反应时间为1秒钟。通过在转变缓冲液中快速加热45-180μM的PrP，并且自动记录226nm波长上椭圆率的变化而进行动力学测量。数据间隔和反应时间均为1秒钟，并使用4nm的带宽。未转变PrP作为基线，在37℃下获得动力学。在转变缓冲液中使用100μM的PrP在55-65℃的温度范围中对转变的温度依赖性进行测定。
4.数据分析
假设n.PrP类型→PrPn的寡聚化作用，对动力学数据进行分析，其中n表示每个合作单元中PrP单体的数量。形式上，这一反应通过方程
dc/dt＝-k·cn
[1]
来描述，其中c、t和k分别表示PrP浓度、时间和反应速率常数。方程1的一般解法为：
c(t)＝{c0 (1-n)-(n-1)·k·t}1/(1-n)
[2]
在t＝0时，蛋白质的浓度等于起始浓度C0，而起始反应速率V0可以写成
V0＝k·C0 n
[3]
或
log(V0)＝n·log(C0)+log(k) [4]
通过将动态数据以n＝2拟合于方程2并使用k作为拟合常数而获得速率常数。通过埃林方程描述与限速步骤相关联的活化势垒：
k(T)＝kb T/h·exp(ΔS≠/R)·exp(-ΔH≠/RT) [5]，
其中kb、h、ΔS≠和ΔH≠分别表示玻耳兹曼(Boltzmann)常数、普朗克(Planck)常数、活化熵和活化焓。随后通过将方程5拟合k(T)的实验值而获得ΔS≠和ΔH≠。从这些值活化作用的自由能被计算为
ΔG≠＝ΔH≠-ΔT·ΔS≠
[6]。
PrP淀粉样蛋白原纤维的制备
将在转变缓冲液中的重组鼠PrP(50-250μM)加热15分钟至65℃并使其冷却至室温(RT)15分钟，产生PrPβ。随后，通过加入9倍体积的NaAc诱导聚集作用，产生PrPβf。60分钟后通过于20,000g下离心15分钟收集聚集的物质。
5.蛋白酶K消化
在缓冲溶液中于37℃存在50μg/ml蛋白酶K下于100μM的蛋白质浓度中测定重组PrP(23-230)的蛋白酶抗性，缓冲溶液含有50mM pH7.0的磷酸钠和150mM氯化钠。60分钟后收集蛋白质作十二烷基磺酸钠凝胶电泳。
电子显微镜照相
在刚用碳涂覆的EM载网(400 MESH)上滴一滴悬浮于TNO或TNSucO中的PrPβf。在室温温育1分钟以后，用一张滤纸将多余的液体小心地从载网上移除，然后以三滴蒸馏水洗涤。以一滴2％(w/v)的醋酸双氧铀对含EM载网的淀粉样蛋白纤维原进行染色，并在Philips H600电子显微镜上在100kV下放大10,000倍到30,000倍进行分析。
Claims (29)
1.一种在重组蛋白质和/或其变体中诱导构象转变的体外方法，其中所述的构象转变导致β折叠二级结构含量的增加，该方法包括步骤：
a)提供一种转变缓冲液；
b)向转变缓冲液中加入含有带负电荷脂质的层状脂质结构的溶液；
c)向转变缓冲液中加入重组的蛋白质分子和/或其变体；
d)由转变缓冲液、添加的脂质和蛋白质分子形成一种样品混合物；
e)在样品混合物中确定转变温度；和
将步骤d)的样品混合物置于根据步骤e)的转变温度下足够的时间以形成构象转变的蛋白质；其中
形成层状脂质结构和构象转变的蛋白质的水溶性复合物，构象转变的蛋白质为寡聚的β折叠中间态结构。
2.根据权利要求1的方法，其中通过有效地破坏层状脂质结构由层状脂质结构和寡聚的β折叠中间态结构的水溶性复合物产生淀粉样聚集物。
3.根据权利要求2的方法，其中为产生所述的淀粉样聚集物，水溶性复合物的层状脂质结构通过下述方式被破坏：
a)稀释层状脂质结构和寡聚的中间态结构水溶性复合物的溶液至明显低于所用脂质的临界胶束浓度；或
b)稀释层状脂质结构和寡聚的中间态结构的水溶性复合物溶液至明显低于所用脂质的临界胶束浓度，并以非变性去污剂如辛基葡糖苷处理如此产生的淀粉样聚集物；或
c)直接以去污剂处理层状脂质结构和寡聚的中间态结构的水溶性复合物，而无须前述的脂质的稀释。
4.根据权利要求1的方法，其中在步骤b)中的层状脂质结构溶液为bicellar脂质溶液；在步骤e)中将样品混合物加热到高于形成样品混合物温度的转变温度，并且水溶性的寡聚β折叠中间态结构是一种聚集成淀粉样蛋白原纤维(PrPβf)的寡聚β折叠中间态(PrPβ)。
5.根据权利要求4的方法，其中在步骤e)中将样品混合物加热到从37℃到65℃的范围的转变温度。
6.根据权利要求4的方法，其中这些蛋白质涉及：
a)包括传播性海绵状脑病(TSE)、阿尔茨海默症、多发性硬化症和帕金森病的神经变性疾病；和/或其它
b)包括原发性系统淀粉样变性、II型糖尿病、动脉淀粉样变性的构象性疾病。
7.权利要求1的方法，其中转变缓冲液含有25mM长链(DMPX)和25mM短链(DHPC)磷脂以形成bicellar溶液。
8.权利要求7的方法，其中在转变缓冲液中的长链磷脂为23.75mM(DMPC)和1.25mM(DMPS或DMPG)，且其中短链磷脂为25mM(DHPC)。
9.权利要求1的方法，其中转变缓冲液的pH低于重组蛋白质的等电点。
10.通过一种用于诱导在重组的蛋白质和/或其变体中的构象转变的体外方法生产的寡聚β折叠中间态结构，其中所述的构象转变导致β折叠二级结构的含量升高，该方法包括步骤：
a)提供一种转变缓冲液；
b)向转变缓冲液中加入含有带负电荷脂质的层状脂质结构的溶液；
c)向转变缓冲液中加入重组的蛋白质分子和/或其变体；
d)由转变缓冲液、添加的脂质和蛋白质分子形成一种样品混合物；
e)在样品混合物中确定转变温度；和
f)将步骤d)的样品混合物置于根据步骤e)的转变温度下足够的时间以形成构象转变的蛋白质；其中
寡聚的β折叠中间态结构为构象转变的蛋白质，它们是含有层状脂质结构的水溶性复合物的部分。
11.由权利要求10的寡聚β折叠中间态结构生产的淀粉样聚集物，其中淀粉样聚集物来自通过有效地破坏层状脂质结构和构象转变的蛋白质的水溶性复合物的层状脂质结构而产生寡聚的β折叠中间态结构。
12.根据权利要求10的寡聚的β折叠中间态结构和层状脂质结构的水溶性复合物或根据权利要求11的淀粉样聚集物，用于开发在受控制条件下转变的不同相。
13.根据权利要求6的方法的应用，用于筛选“转变抑制物”以开发抗在人和/或动物中的构象性疾病的诊断剂和/或预防剂和/或治疗方法。
14.根据权利要求10的寡聚的β折叠中间态结构和层状脂质结构的水溶性复合物或根据权利要求11的淀粉样聚集物的应用，用于筛选“转变抑制物”以开发针对在人和/或动物中的构象性疾病的诊断剂和/或预防剂和/或治疗方法。
15.根据权利要求10的寡聚的β折叠中间态结构和层状脂质结构的水溶性复合物或根据权利要求11的淀粉样聚集物，用于筛选配体以开发
a)针对人和/或动物中的构象性疾病的治疗方法；或
b)针对人和/或动物中的构象性疾病的预防剂；或
c)针对人和/或动物中的构象性疾病的诊断检测方法。
16.根据权利要求6的方法用于筛选配体以开发
a)针对人和/或动物中的构象性疾病的治疗方法；或
b)针对人和/或动物中的构象性疾病的预防方法；或
c)针对人和/或动物中的构象性疾病的诊断检测方法。
17.根据权利要求10的寡聚的β折叠中间态结构和层状脂质结构的水溶性复合物，或根据权利要求11的淀粉样聚集物在开发特异性结合到构象转变的蛋白质上的抗体中的用途。
18.根据权利要求6的方法在开发特异性结合到构象转变的蛋白质上的抗体中的用途。
19.根据权利要求1的方法用于工业生产重组的构象转变的蛋白质。
20.根据权利要求10的寡聚的β折叠中间态结构和层状脂质结构的水溶性复合物或根据权利要求11的淀粉样聚集物的用途，即用于利用核磁共振分光镜检查、X射线或电子显微镜检查确定构象转变的蛋白质的三维结构作为配体设计的基础。
21.根据权利要求1的方法用于利用核磁共振波谱法、X射线或电子显微镜照相确定构象转变的蛋白质和/或淀粉样聚集物的寡聚β折叠中间态结构的三维结构以作为配体设计的基础。
22.根据权利要求15、16、20或21得到的配体用于进行人和/或动物中的构象性疾病的诊断和/或预防和/或治疗性处理。
23.根据权利要求13或14得到的“转变抑制物”用于进行人和/或动物中的构象性疾病的诊断和/或预防和/或治疗性处理。
24.根据权利要求17或18得到的抗体用于进行人和/或动物中的构象性疾病的诊断和/或预防和/或治疗性处理。
25.根据权利要求10的寡聚的β折叠中间态结构和层状脂质结构的水溶性复合物或根据权利要求11的淀粉样聚集物用于进行抗神经变性疾病和/或其它构象性疾病的人或动物的主动免疫，所述神经变性疾病包括传播性海绵状脑病(TSE)、阿尔茨海默症、多发性硬化症和帕金森病；所述其它构象性疾病包括原发性系统淀粉样变性、II型糖尿病和动脉淀粉样变性。
26.根据权利要求17或18得到的抗体用于制造对抗神经变性疾病和/或其它构象性疾病的人或动物的被动免疫的药物，所述神经变性疾病包括传播性海绵状脑病(TSE)、阿尔茨海默症、多发性硬化症和帕金森病；所述其它构象性疾病包括原发性系统淀粉样变性、II型糖尿病和动脉淀粉样变性。
27.用于人和/或动物中的构象性疾病的诊断或治疗性或预防性处理的组合物，包含根据权利要求13或14的方法所获得的“转变抑制物”。
28.用于人和/或动物中的构象性疾病的诊断或治疗性或预防性处理的组合物，包含根据权利要求15、16、20或21的方法所获得的配体。
29.用于人和/或动物中的构象性疾病的诊断或治疗性或预防性处理的组合物，包含根据权利要求17或18的方法所获得的特异性结合到构象转变的蛋白质上的抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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