CN1659179B - 用于追溯动物产品的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种遗传测试系统，该系统保证了动物及食品的完全可追溯性，本发明还涉及一种为了数据收集、记录管理和检索目的而独特地鉴别动物的方法，其包括一种新的遗传分析方法，使用个体动物亲代的个体DNA指纹分析，以有效提供动物从出生至被消费的全程追溯。

Description

用于追溯动物产品的系统
发明背景
本发明涉及一种以精确和节约成本的方式为数据收集、记录管理和检索目的而独特性鉴别动物的方法。近几年来动物鉴别和登记注册已越来越多地引起关注。一般而言，动物鉴别和登记注册包括收集每个动物一生的数据，由此可以追溯动物的个体特征和历史。这种数据可包括但非必须限于出生日期和地点、祖先、性别、地理移动(geographic movement)、健康和治疗史及其它生产记录。尤其家畜和食品加工业已经深入地涉及这个领域以期提高家畜经营中的生产力和利润率，以及开发一种策略以鉴别、追溯及管理食品安全及家畜传染病爆发方面的风险。考虑到健康和安全问题需要明确知道食品的来源。另外，消费者现在需要及一些国家现在要求肉制品的来源应可追溯，以便可以有效及可靠地进行质量保证的审核及检测。一种基于纸张的记录或追溯系统足以追溯肉制品的起源系统或农场。然而存在纸张丢失，在冷冻箱中贮存时标签破损及记录错误的问题。本发明所述系统具有这样的优势，即如果对结果有怀疑或争论，则可以由独立第三方对提及的样品再加以测试。然而存在一个显著的挑战，即目前还没有统一的系统以足够的特异性鉴别和追溯动物。相反，随着时间的推移，已经制定了许多动物鉴别和登记注册的协定，其根据家畜经营的地理位置和/或特定动物追溯系统的厂商而变化很大。一个实例是缺乏基于地理位置的统一性，这在美国很明显，其中每个州对其州内的家畜农场决定其自己的动物鉴别方案。另一个实例是目前使用各种方法及方法组合以试图通过基于批次或货物交运而保证肉制品的同一性和来源，从而在从屠宰过程至消费者对批次/货物交运一直使用来源地的批号/货物交运号。然而，这些实例表明现有的方法费时、麻烦而且需要来自农场主、加工商和政府或者其它机构的相当多的资源。因此，这种缺乏统一性是有问题的，其变得越来越难以追溯关于一种具体动物的信息。所收集数据的有用性因此大打折扣，从而削弱了提高生产力和在动物完整一生中对其加以追溯的这种工业化目标。这还增加了在限制传染病传播的同时追溯人们食用及潜在食物安全性问题所需要的时间，这在一定情况下可以导致另外出现本可预防的危及人体健康的问题及动物的本可限制疾病的传播，继而可以导致处理掉大量的动物。控制这种风险显然与数据收集和信息管理系统相关，这种系统本来应该已经在运转良好的动物工业中。
通过食物链在零售水平鉴别和追溯食品至其来源农场或生产系统正在成为处理人用安全性问题所需要的方法。追溯食品系统的重要性通过许多现存的实例例证，包括水果和蔬菜中的残留物、家禽中二恶英(dioxin)及大肠杆菌0157污染及牛肉制品中牛海绵状脑病(BSE)等问题。零售商越来越需要保证食品对消费者的卫生性。可以看出目前及未来越来越需要检验产品的质量。本发明解决了本领域这个长期存在的需要及愿望。
由于遗传学和基因组研究将其影响扩展到食品生产领域，因此需要保持链的完整性以便从链到点获取选择特异性基因型的益处。现今可以选择牛和猪基因的特异性等位基因，产生由加工者和消费者评判出的肉质和营养价值改良的肉类。因此，很可能这些等位基因/基因被具体标明，而且链的成员需要证实所做出的声明可被核实。目前需要主动鉴别这样的遗传学，其是用于提供特异性畜体特征和肉质性质的程序或软件包的一部分。
目前可以安装使用纸张或电子护照(passport)的这种可追溯性系统(traceability system)，其能追溯一个动物从其出生至屠宰的全过程，并与标签或其它形式动物证明如视觉成像联系在一起。然而，尽管现在正在开发将这两种成分(护照和动物)联系在一起的技术，但这些系统还是可以有欺骗行为。虽然如此，目前可利用的这些方法和技术也仅是跟踪畜体至分割台上，也即将动物分割成为最初的切块、关节等的地方。一旦这些最初的切块分布于不同的剔骨台上，则至少从单个畜体角度而言，产品的身份和护照丧失。几堆或几批产品仍可被包含，但是在这些产品之间难以保持明确的分离并易于产生误差而且显然增加了生产成本。另外，产品分发于其它工厂进行进一步加工也增加了这个问题。
目前需要在一个累积的、全面的及动态的数据库管理系统中开发遗传学数据，从而增强动物健康的可预测性和寿命。所述系统具有独特的优势，其使用DNA信息追溯肉制品的起源系统或农场。本发明揭示了一种使用DNA标记作为工具以鉴别个体动物的方法，所述方法包括获得所有预期亲本的基因型作为参考输入数据库中，然后将子代样品的基因型与此数据库对比以鉴别每个子代的预期亲本。相似地，可以在一个系统中使用DNA标记进行亲子分析(parentageanalysis)以鉴别畜体及各个肉块(子代)来源于哪个特异的农场(亲本)。本发明与基于身份的现有DNA追溯系统相比成本低，因为本发明不必保留所有屠宰动物的样品及所有屠宰动物的DNA指纹。将来如果在农业生产中使用克隆技术，则所述系统也有效，条件是给定的克隆是一个特定的系统/农场独有的。
由于前述原因，需要一种通过有效及低成本的DNA标记方法追溯动物的系统。本发明的方法的第一步包括提供一种用于动物如猪的独特的通用鉴别系统，其可以进行鉴别和管理以通过食物链追溯食品。
因此，本发明的主要目的是提供一种使用DNA指纹法进行遗传分析的方法，以提供对动物生产链的完全可追溯能力，由此需要亲代(parentage)样品的集合，而子代组样品集合提供了一种所需的数据库以进一步使用。
本发明的另一目的在于动物的健康概况分析(health profiling)，其通过亲子DNA谱分析(parentage DNA profiling)确定动物的特征。
本发明的再一目的在于动物的健康概况分析，包括使得可以进行动物健康评估的遗传学数据，从而可以进行一种分析以预测健康、疾病和患病概率。
本发明的又一目的为一种利用动物的遗传学数据提供一个通用的数据库的方法，其使得产生一个追溯系统对完整生产链进行追溯。
实现上述目的的方法和手段通过如下详细描述将显而易见。本发明的其它目的和优势在详细描述部分也加以阐明，而且部分通过实施例而显而易见，或者可以通过实施本发明而获知。本发明的目的和优势特别是通过本发明权利要求中指出的手段和组合而获得。
发明概述
本发明揭示了一种使用DNA标记技术鉴别动物的方法和系统，该方法和系统使得DNA标记技术可以利用一个亲子系统追溯肉制品，以低成本地提供对动物生产链至起源系统或农场的完全可追溯能力。这个系统要求利用DNA标记作为工具以鉴别个体动物的亲子关系，鉴别畜体和个体肉块的来源，以及所选动物的精确起源系统或农场。需要进行亲本样品的收集，子代组收集、祖亲(grandparent)样品，在生产链各个控制点基于统计学的取样，和DNA查证系统在以表明遗传和在链中样品的位置的来源，以有效地进行和检验本发明。基因型信息将被输入，然后通过本领域熟知的那些方式如文件上载或数据库链接(link)进行上载。然后从该数据库中提取基因型和取样信息并通过实施例中描述的数据分析软件运行。就亲子分析而言，可以使用本领域技术人员已知的可商购的程序进行。该系统可通过整合信息管理技术而进一步增强，如使用基于web的结果报告和鉴定技术。
通过利用这些分立的和独特的成分创建系统，本发明提供了低成本的动物产品身份保存方法。这个系统与现有系统相比在生产链全程使用的简便性及执行成本方面具有特殊的优势。另外，该系统可以加以修改以符合生产链中每一点的需要，从而提高系统有力防止欺骗行为的能力。这些因素增加了实用性而且对保证生产链参与者所需的采用和必需条件也很重要。本发明的其它方面、特征和优势通过以下对本发明优选的实施方案的描述而显而易见。
附图简述
图1示出针对标记SW2623和SO301分选的等位基因大小分布。X轴＝观察数，Y轴＝由软件得出的等位基因大小。
优选实施方案详述
本发明利用DNA技术的精确性教导了一个可追溯性系统，以追溯个体动物或动物群，如从生产单位返回起源系统或农场。这个系统使得卫生从业人员、生产商、加工商和零售商可以获得关于特定动物及其子代的信息，以评估疾病或病变的存在及流行情况，鉴别合意的可遗传性状及促进形成一个详细的统一系统。
活的生物体在其DNA中呈现一个独特的个体指纹。DNA因此提供了从出生至被消费时的可持续追溯的可能性。然而，从实际观点出发，目前为此目的应用的DNA技术很繁琐，由于其基于身份检验而因此需要深入管理和相对较高的成本。尽管针对牛肉和羊肉正在开发基于身份的系统如爱尔兰的IdentiGen和新西兰的Easi-trace，但这些系统不能真正适用于猪。动物样品收集、基因分型、数据分析、成本/畜体价值及sheer numbers等需要输入阻碍了这种技术在如狗、牛、猫、马和绵羊等物种中的应用。
本发明的方法提供了使用DNA技术以统一及一致的方式独特地鉴别动物的能力，可以快速及简便地获取收集的数据并因此提供了追溯肉制品的起源系统或农场的能力。所要求保护的可追溯性(traceability)程序可用10-100个微卫星标记，优选20-50个微卫星标记建立，以鉴别所控制的起源系统或农场之外的动物。本发明因此将追溯疾病所需要的时间减至最少，从而降低了无病动物被感染的危险并降低了相关的人类健康风险。本发明的方法还具备这样的优势，即提供了无论家畜公司应用的特定动物跟踪系统厂商是谁均可鉴别动物的能力。本发明利用一个数据库和样品储存系统，其可以以易于使用的方式捆绑在一起以使用易于获得的软件进行分析。另外，本发明与先前利用的基于身份的DNA系统相比成本较低，因为本发明不需要保持所有屠宰猪的样品，而且不必对所有动物均采集DNA指纹。这是由于本发明所述系统基于亲子关系(parentage)并因此可以仅使用屠宰后的肉类样品即可进行。本发明的另一个独特优势是由于系统或农场中遗传不同的公畜的有效数可以显著减少，从而使得标记较少及因此所述可追溯性系统的成本显著降低。这使得家畜生产者和食品加工者更易于收集和跟踪个体动物在其一生中的数据以用于增加生产力及保护工人、消费者和动物的全面健康。
本发明是一种鉴别从中获得食品的动物的方法，所述方法包括对动物组织取样，从样品中提取遗传物质，对提取的遗传物质进行遗传分析及编码分子遗传分析的结果，将样品信息及编码的遗传分析输入进一个数据库并使得可以查询所述样品信息以辨别动物的分子遗传分析。本发明揭示了DNA标记分析的一种改良的程序，该程序使用亲代样品(parentage sample)、子代参考样品及可以快速及同时分析大量DNA标记的其它形式的核酸序列分析。这个系统的独特性在于其基于父子关系(paternity)，这使得该系统成本非常低，因为在工业中使用的种公畜(sire)与雌亲相比非常少。如果在一个系统或农场内专门使用一组种公畜，则例如得自该系统或农场的屠宰后的猪肉可以被有效地追溯回该系统或农场。但是，本发明同样可应用于与其它系统或农场(通过AI)共享公猪的一个系统或农场。在这种情况中，该系统基于雌亲。在这种情况中需要提高参考系列的测试(指纹识别)量，因为这要包含该系统或农场中的所有雌亲(与种公畜相反)，因此全部成本略有些增加，但本发明可以改良追溯肉或肉制品的明确起源系统或农场的能力。这个系统预期的高信息含量将便于进行许多种类的遗传分析，并且获得改良的及更一致的可追溯性系统，如果被授权该系统可以提供不同的可追溯性选择如局部可追溯性。本发明还提供了一种改良的方法以获得从不同的生物学样品中提取的核酸。个体的身份通过“DNA分型”评估，然后鉴别与特异个体相关的基因并定位至染色体上的特异位点。在这个DNA指纹识别程序中，一个物种的不同个体的DNA序列中的变化(DNA序列多态性)通过从不同个体中制备的DNA片段与几百个至几千个寡核苷酸探针的阵列的结合的定量模式的不同而揭示。
本发明的系统是根据生产链的需要而设立的，但基本单位是一个生产单位如一个农场。选择雌性动物(雌亲)以储存该系统，取DNA样品作为个体护照的一部分加以贮存，其提供一种参考样品以及身份记录(如ID标签号等)。本领域技术人员意识到可以使用各种方法将所述护照与动物联系起来，包括电子转发器(transponders)，视网膜扫描系统或虹膜扫描系统。接着选择雄性动物(种公畜)与这些雌亲交配。典型地选择这些雄性动物以独特地用于该系统或相关系统内。与雌亲一样，取种公畜样品作为参考。使用能提供必要的辨别力的任何基于DNA标记的系统针对这些亲本动物产生DNA谱。例如，可能需要对种公畜进行隔离以仅在一个单一生产系统内应用，而且根据实践雌亲仅位于一些特定农场内或者在一特定时间位于一特定农场内。标记是多态性的从而为每个不同的个体提供可鉴别的及可追溯的一种独特性。这些标记可以选自微卫星、特异的单核苷酸多态性(SNP)，AFLP标记或者全部或部分基因组DNA序列的缺失或插入。标记的类型不特别重要，但这些标记要加以选择以提供最有效的系统。例如，通过使用高度多态性微卫星标记，如果亲本样品也可以获得则可以容易地检验动物的亲子关系。在一些情况中，特异的SNP标记可以提供非常有效的第一步辨别。猪的生产者例如也许希望利用Duroc种公畜，因为它们在一些市场中由于其肉质性状而被优选，Duroc猪在MClR基因具有诊断该品种的特异多态性，由此这个系统的猪必须含有至少一个Duroc等位基因。这个Duroc等位基因是阴性的任何样品可以从该系统中排除。这种方法适用于所规定的其它基因的等位基因，如在美国一些加工者规定不能含Halothane基因。在这种系统中，可以排除携带Halothane基因的任何猪。这是本发明系统的一个重要特点，因为个体的规定基因型将被用于证实是否符合系统要求，而且将来得自动物的产品(肉)很可能是基于特异的基因型而估价的。本领域技术人员显而易见鉴别标记所用的技术，这并不是意味着本发明限于这些举例示出的实施方案或机制，在不偏离如所附权利要求所限定的本发明范围和精神的前提下可对本发明加以修改。
本发明的可追溯性系统还具有其它重要益处。例如，在某个具有遗传缺陷的系统或农场中出生的任何猪的种公畜可以立即被追溯。宰杀这些公猪(及如果有正当理由宰杀雌亲)提供了降低该系统或农场中先天缺陷的发生率的优点。下文只是应用DNA指纹识别工具鉴别携带先前未知的遗传性心脏缺陷的AI公猪的一个实例。在使用了来自一特定AI stud的精子的一些农场中观察到具有已知为“足球”猪病症的小猪，但是因为所述stud使用了来自一些公猪的精子以达到其商业AI剂量，因此无人能鉴别是否涉及一或多个公猪，是否这是一种传染病，或者是否这是由于环境中的某些因素所致。利用基于亲子关系和可追溯性工具的本发明系统表明一个单一的公猪是受累小猪的雄亲。
本发明系统的优势的另一个实例是在一个系统或农场中监测种公畜的生育力的能力。例如，这通过在屠宰后对猪进行取样及指纹识别，然后将由给定的公猪产生的子代的真实比例与基于该公猪对系统或农场中使用的AI剂量的已知贡献而预期它所产生的子代的估计比例相对比。这样可以鉴别及挑选先前未确诊的低生育力或不育的公猪并宰杀它们。这还提供了提高某系统或农场的整体生育力的独特优势。目前对stud上的公猪是针对其精子的质量而监测的，所述精子质量是就精子浓度、活动性和形态学而言。如果将其精子与生产AI剂量的其它公猪的精子混和，则其生育力不能被检测。已知在许多情况中雄性哺乳动物的精子浓度、活动性和形态看起来是正常的，但该雄性动物的生育力却很低(例如参与精子/卵识别的基因相互易位、突变等)。
本发明的可追溯性系统与使用父本或母本的系统相反，其具有独特的基于祖亲和曾祖亲设计系统的能力。这样使得其具有在数据库中需要采集的参考动物指纹大大降低的优势，由此成本降低。这种方法确实需要一种不同的方法，因为一个个体不是一定在每个基因座均与其祖亲共享一个等位基因。因此，即使当在一个基因座没有匹配的等位基因时可以排除一种候选的亲本，也不能以相同方式排除一种候选的祖亲。如果对成对的父本祖亲或母本祖亲进行取样，则本发明可以采取一种排除法。一个个体肯定有至少一个等位基因与父系两个祖亲中的一套4个等位基因是相同的，及有一个等位基因与母系两个祖亲中的4个等位基因是一样的。排除概率与亲本/子代情况相似地进行计算。例如，对于两个等位基因标记可以如下进行计算：
只有1111祖亲与22孙代的组合或者2222祖亲与11孙代的组合排除两个祖亲的这种组合。不相关的个体的排除概率(使用具有两种呈现频率相同的等位基因的标记)是：
2x(freq 1)4x(freq 2)2＝2x.5x.5x.5x.5x.5x.5＝2x0.0625x.25＝0.01325
具有1111等位基因的一对祖亲的每一个祖亲与另一个候选祖亲一起仍可能是真实的祖亲，因此需要对祖亲种公畜+祖亲雌亲的所有可能组合进行测试。
一次为每个个体确定一个祖亲或曾祖亲还有其它的选择。在最近的出版物中，Milligan(2003)揭示了一种仅基于标记基因型评价任何两个个体之间关系的似然性工具，并综述了其它方法。Milligan，BrookG.，Maximum-Likelihood Estimation of Relatedness，Genetics，163，p1153-1167(2003)。已经表明所述似然性方法对远至第一代表亲这样的关系是有效的，其相关性程度与曾祖亲与其曾孙代甚至与不相关的个体的相关性程度相同。在本发明的可追溯性系统中，将获知一个个体所属的世代。这对于具有0.25相关性例如半同胞关系的成对个体非常有用。本发明使得技术人员明了一个取样的个体所属的世代，因此不需要区分半同胞和祖亲。需要区分的是0.25相关性(真正祖亲)和0.125相关性(真正祖亲的全同胞)，但是为此需要所需的增加的标记数(可能超过30个标记)是便于获得的。另外，会需要减少参考基因型的数目，以产生整体上较廉价的系统。就祖亲分析而言，该分析可以通过与前述亲子分析相似的一个计算机程序进行。设计这种系统的能力是本发明的另一个独特的实施方案。
在本发明的系统中，也从子代收集样品，然而在这种情况中不必对它们进行分型，而是将这些样品贮存起来，以便在遇到一些问题或者需要更高水平的核实时做为参考样品。在一些情况中，甚至不必单独编码这些样品，相反它们可以通过出生组如猪的胎仔数、构成、出生天或周或月数等分组。这是本发明超过先前所有的均需要对个体进行分型的产品的一个重要的及独特的优势。
例如，如果一个个体的一块肉或零售包装因为如外源物体产品污染或者其它这种问题所致而需要追溯回系统，其可以作为一个两阶段系统的一部分而有效进行。将来自包装或销售档案的标签或系统的信息与生物学样品组合以提供DNA进行分析并传送至参比实验室。在此确定DNA分布图并将其与亲本样品相配以确定是否与所述系统匹配。本文描述了亲子关系检验的一种形式。应注意这可以基于动物的出生和/或生产日期而进一步精确。如果与所述系统匹配，则可以鉴别潜在的批次如猪的胎仔。一旦如此进行，则可在个体的基础上以与逐个分型每个畜体相比更有效的及更低成本的方式进行更精确的匹配。在本发明中，针对个体搜索样品以获得具体身份。使用这种方法获得与一个非相同的个体匹配的概率是无限小的。
所述系统可以通过整合信息管理技术如使用基于web的结果报告和鉴别技术而进一步增强。样品信息可以通过文件上载或者web界面或者其它本领域已知方法而输入。所述样品信息包括但非限于取样日期、动物所在地点(例如农场号、围栏)、动物状况(例如亲本、屠宰猪)、样品运输信息和样品贮存信息。输入基因型信息，然后通过本领域熟知的方法如文件上载或数据库链接而上载。然后从数据库中提取基因型和取样信息，并通过实施例中描述的数据分析软件运行。就亲子分析而言，可以使用可商购的本领域技术人员已知的程序进行。就祖亲分析而言，可以通过与前述相似的计算机程序进行。
可以看出通过使用这个系统，可以获得通过简单使用个体身份所不能实现的、对完整食物链具有可追溯性的低成本方法。本发明的系统确实需要高水平的组织以及组合特异性动物基因型(选择的亲本)和不同的DNA标记系统及数据管理和转移技术的能力，以便能为收获量巨大但与牛相比畜体价值相对较低的物种如猪提供一种有效的系统。这个系统是独特的，而且本文描述的本发明代表了在生产链尤其高质量肉制品的生产链中动物产品的可追溯性方面的一个重大进步。另外，可以看出这些潜在的优势也可以用于更高价值的、更小体积的动物产品如牛肉。
本发明教导了通过实施本发明而获得的许多益处。这些益处包括更大程度地符合目前和将来的法规要求，改善企业形象，通过透明度改善企业可信度以保证食品安全性，及核实对产品的要求如由于特异基因型所致的食品质量，核实食品来源的安全描述，确认对农场系统的要求例如组织、福利等及由于代表更高程度的质量和价值或者证实与说明一致的特异基因的存在(如通过遗传标记而证实)而使产品价值提高。
总之，本发明揭示了一种追溯个体动物从出生至被消费过程的系统。进一步地，本发明教导了这样一个目的，即通过一种精确的及节约成本的方法使得可以应用增强的遗传和基因组研究数据及改善人类食品安全性问题。
定义
在本说明书中，以下术语应具有在此所述的含义。单位、前缀和符号以其SI承认的形式表示。除非特别说明，核酸均是以5’-3’方向从左至右书写的，氨基酸序列是从左至右以氨基至羧基方向书写的。数字范围包含限定该范围的数字并包括限定范围内的每个整数。氨基酸在本文以其公知的三字母符号或者IUPAC-IUM Biochemicalnomenclature Commission推荐的单字母符号表示。类似地核苷酸以通行的单字母代码表示。除非特别说明，在此使用的软件、电学及电子学术语具有如The New IEEE Standard Dictionary of Electrical andElectronics Terms(5th edition，1993)所述含义。以下所述术语通过在总体上参考说明书加以更充分的描述。
如本文所用，“动物”是指其肉经商业销售供给人类消费或动物消费的任何物种。动物物种包括但非限于牛、鱼、山羊、绵羊、猪、家禽、甲壳类动物和虾。
如本文所用，“基本单位”是一种生产单位如农场，从而雌亲和/或种公畜位于指定的农场或在规定时间内位于一特定农场内。
如本文所用的，“标记”包括染色体上的一个基因座，其用于鉴别染色体上的一个独特位置。“多态性标记”包括一种标记，其以多种形式(等位基因)存在，由此当标记的不同形式以同源对(homologous pair)存在时，使得该成对的染色体的每一个染色体的传递可以被跟踪。基因型可以通过使用一或多个标记加以限定。
如本文所用，“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，而且除非特别说明，涵盖了具有天然核苷酸基本性质的已知类似物，其与单链核酸以与天然存在的核苷酸相似的方式杂交(例如肽核酸)。
实施例
导言
围绕两个母猪单位(SU1和SU2)设计一个可追溯性方案的小型试验计划，这两个单位均利用来自一个共同的公猪stud(BS1)的精子。BS1公猪stud圈养了大约25只PIC品系337种公畜。SU1和SU2均是利用PIC C22雌亲的600母猪单位(每周生产25只小猪)。这两个农场均保持良好的农业生产记录。
另外从源自一个不相关的生产系统(系统II)的不相关的PIC337×C22屠宰猪中取组织样品。将这些样品用作源自上述系统的猪的阴性对照。
提议将DNA标记作为鉴别各个动物亲子关系的工具。另外，评价通过DNA标记进行的亲子分析作为鉴别畜体和各个肉块来源于哪个特异农场的系统的可行性。
材料
样品
进行农场取样，从在取样时存在于BS1中的21头公猪中获得DNA样品及从13窝胎仔(每窝4头小猪)中获得DNA样品，所述胎仔的母猪分别来自两个母猪单位SU1和SU2。在系统II中，从与试系统不相关的猪中获得50个DNA样品。
在屠宰厂从经鉴别由SU1和SU2提供的畜体中取样品。从来自每个农场的50个畜体(carcass)中取皮肤(skin)和腰肉(loin)样品并从每个农场取15个腿肉(ham)样品。在这两个农场均对预期是取样畜体的亲本的额外母猪取样。
全部样品：
表1通过动物来源(农场)和类型或者取样切块的类型对样品数进行细目分类
标记
将由PE AgGen公布的在猪中进行亲子分析的一套9个标记系列用作一套12个标记系列的基础。12个标记是目前在ABI genotyper(4色×3个标记大小范围)上单次运转的极限。PE AgGen系列中有两个标记没有被使用。SW2160在其大小范围中是第5个标记，SW840与该系列中的另一个标记连锁。将5个标记加入AgGen系列，其来自欧洲生物多样性计划中使用的MS标记(http://databases.roslin.ac.uk/pigbiodiv)。就这些额外的标记使用三个标准。首先，它们与所述一套12个标记的系列中的任何标记均不连锁。第二个标准是多态性在平均超过9个PIC品系中有意义。第三，其大小范围应适合剩余位置之一(同一范围中最多有4个)。
最终的标记系列如下：
表2：用于亲子分析的微卫星标记
  色系   标记   大小范围   SSC   ～cM
  TetFamFamFam   SW1430SW2623S0226SW72   159-181123-149169-231100-118   1223p 10cM75cM
  TetFamNedVicNedTetNedVic   S0097S0301SW122TNFBSW857SW936SW2411SW24   208-248254-266110-122156-216144-16080-117179-22989-121   446714151617   120cM27cM
如表2所示，每种色系(color)不是精确具有3个标记。这是由于这些标记之一已经可用Blue染料(Fam)获得，与这个色系中的其它3个不重叠。染色体2和4上各具有2个标记，但它们至少分离65cM，因此实际上不连锁。
软件
基因型分析可以使用软件进行，该软件配置在ABI机器上以对每个标记得出等位基因大小。这个软件构建为完全自动化的，但同时对其结果进行手工核对是必需的。
Figure G038132567D00152
输出信息将以碱基对单位列出等位基因大小，直至两个十进制。
亲子分析：检索出Rockefeller大学的连锁软件是研究亲子分析的软件。发现了如下应用软件可以应用于本发明中：SALP、Borel、Cervus、Newpat/identity，Kinship。优选应用Cervus软件，因为其可以在PC上运行而且如果需要可获得支持。Cervus可易于处理丢失的基因型、基因型错误，及因此在真实数据上运行良好。除了数据分析之外，Cervus还具有一些模拟工具，可以预测某标记系列针对特异性群体参数的能力。
等位基因bins：SAS应用软件已经被写为将来自输出信息的等位基因记录基于每个等位基因所观测到的范围重新编码为整数等位基因数。将在预定范围之外的结果或不能用的基因型得数在一个列表中输出以进一步研究。SAS应用软件将所有可用的基因型写为Cervus输入文件和/或写为易于用户理解的输出文件。
基因型储存：其目前在Excel master文件中进行。目前可以利用储存基因型结果的Access数据库。将来Access原型可以编程为Oracle数据库。就基因型储存而言，该数据库将是过于简化的。当需要时向其中可以加入其它特征如样品储存信息。
结果
基因分型
在表1的全部612个样品上针对表2中的12个标记进行基因分型。其中的一个标记，S0097，在PCR扩增和/或基因分型中存在技术困难，使得不能用
Figure G038132567D00162
软件给出等位基因大小，通过人工干预也不行。
303个样品的基因型结果用于阐明等位基因bin范围。来自这些基因型的606个等位基因通过大小(来自输出信息)加以分选并绘图，如针对SW2623和S0301的图1所示。
观测到的SW2623的bin范围用不同范围之间的2个碱基对步进可易于说明。每个范围的起始点和终点扩展.10个碱基对，然后用作等位基因binning SAS应用软件中的截断点(cut-off)。
在此包括S0301以用这个标记证明一个问题。在等位基因大小249和255之间观测到1个碱基对的间隔。这在少数其它标记中也观测到，在这种情况中可以确定在1个碱基对内的两个观测结果实际上是相同的等位基因，而且可以binned在相同范围内。例如就TNFB而言，可以总是将161或162的
Figure G038132567D00172
得数(call)重新编码为162等位基因，因为所述161只是该系统的一个罕见的“错误”。对于S0301，申请人就不是这样幸运了，因为有若干途径来以一个249
Figure G038132567D00173
得数结束(一个真249等位基因、一个错误标记的250等位基因或一个247/251杂合子)，不能毫无疑义地区分它们。因此S0301被从亲子分析中除去。表3列出了等位基因bin范围。
有两只BS1种公畜被取样两次，因此在发现种公畜1和21有相同基因型模式以及种公畜2和19有相同基因型模式之后将2个样品(BVS19和BVS21)剔除。由此剩下610个样品用于亲子分析中。
在亲子分析开始时丢失基因型(missing genotype)的比例为2.4％，这其中大部分是由于落入预定范围之外的等位基因所致。这些结果可被逐个检查并用于精确等位基因bin范围，但这尚未进行。2.4％已经是一个非常低的百分比，不太可能影响结论。
亲子分析
试验建议表明进行3个测试，这些测试的结果如表4所示。
表4：来自测试1、2和3的双亲可以被确认为每行中指明的亲本的样品的比例。粗斜体结果表示预期/希望有匹配，下划线结果表示预期/希望没有匹配。
                          SU1                      SU2                     系统II
                          测试2                    测试2                   测试2
                   测试1          测试3     测试1         测试3     测试1         测试3
                          畜体                     畜体                    畜体
                   猪             肉(腿肉)  猪            肉(腿肉)  猪            肉(腿肉)
                           (皮肤)                  (皮肤)                  (皮肤)
BS1种公畜          47/56   25/50  9/15      28/56  23/56  7/15      13/50  -      -
SU1雌亲            54/56   38/50  11/15     8/56   31/50  12/15     5/50   -      -
BS1 sires+SU1 dams 40/56   12/50  7/15      0/56   3/50   0/15      0/50   -      -
SU2 dams           11/156  17/50  9/15      56/56  28/50  13/15     7/50   -      -
BS1 sires+SU2 dams 0/56    1/50   0/15      23/56  6/50   1/15      0/50   -      -
为进行测试1，出生于3个农场中每一农场的子代(分别为56、56和50个)与表4第1栏所列的候选亲本匹配。这些亲本是表1所列的21个雄亲和表1中以母猪a一栏列出的雌亲。SU1和SU2加在一起，112个子代中有75个即67％在取样时能够与BS1中存在的种公畜匹配(第1行的结果)。换句话说，有33％的子代的雄亲被确认为一不同的公猪。而在交配和取样之间被屠宰的公猪百分比为20％。
SU1的56个子代中有54个与预期生下了它们的14个SU1母猪中的一个匹配，这54个子代中仅有1个子代的雌亲被确定为与记录不同的母猪(第2行的结果)。SU2的所有子代均可以与14个SU2母猪中的一个匹配，除了2个以外所有子代的雌亲均被确定为与所记录的母亲相同。这是相当高的确认子代的正确母猪农场的成功率(第4行的结果)。这一结果的一个缺点是分别有11个SU1母猪和8个SU2母猪被确认为一错误系统的子代的雌亲。另外，分别有5和7个系统2的子代的雌亲被确认为来自SU1和SU2。
最严格的测试是为子代同时确定雄亲和雌亲。这通过首先确定雄亲，随后用确定的雄亲作为已知亲本而确定雌亲来进行(如Cervus文件中推荐的方法)。这种方法中，对双亲的成功确定总是低于或等于具有确定雄亲的子代的比例。对于SU1子代，56个子代中有40个子代的双亲可以被确定(第3行)，对于SU2，56个子代中有23个子代的双亲被确定。在系统2中，如所预期和希望的，没有一个子代被确定为BS1雄亲和SU1或SU2雌亲。
测试2和3需要在屠宰厂取样的、记录为来自SU2和SU1的畜体、腰肉和腿肉与在这两个农场的亲本进行匹配。在本例中，候选亲本是表1列出的21个BS1雄亲加上全部母猪(a和b)。由于产生这些被屠宰猪的交配行为与在BS1取样之间较长的时间滞后，预计与SU1和SU2出生的子代相比，有较少百分比的畜体能与BS1雄亲匹配。预计在SU2和SU1取样的有限数目的雌亲仅包括产生被取样的屠宰猪的雌亲的一部分。并且，与SU1相比有更少的SU2雌亲被取样，这一点从来自SU2的匹配的屠宰猪的比例更小而反映出(28/50vs.38/50)。表4的结果支持了这些预测。当仅雌亲被确定时，有相当大比例的屠宰猪与来自错误农场的母猪匹配(第2行和第4行)。当双亲均被确定时，仅有非常少的畜体被指错农场来源，而没有腿肉被指错农场来源。对腰肉样品未进行独立分析。来自每一农场的10％的腰肉样品被进行基因分型，并与其相应的皮肤样品进行对比。未发现不一致之处。
结论
从最有希望的结果出发，112个小猪中有110个可以与正确农场中的至少一个母猪匹配。这显示了这一项目中标记的精确性，因为申请人非常肯定已经对全部候选亲本进行了取样。已知在子代的交配和取样过程中有至少5个雄亲被选出而杀死，这意味着不是全部雄亲被包括在这一测试中。通过将屠宰后的畜体与系统内两个农场中的母猪相匹配，申请人了解到仅有部分母猪被取样，分别为600个中有133个和64个。另外，额外候选亲本的存在增加了畜体与来自一错误农场的母猪之间随机匹配的几率(假阳性)。
所获得的结果使得人们可以预测在这一测试系统中采用的可追溯性系统的能力，并对其在其它(更大)系统中的表现做出预测。
当前系统的效果
在一可追溯性系统中的主要参数是排除概率(Pe)。这是一套标记告诉你一随机选择的候选亲本不是子代的真正亲本的概率。最容易的解释是这样一种情形，其中具有2个等位基因的一个单标记被应用(表5)。有两种亲本子代组合(以斜体表示)将一个候选者排除为这一子代的亲本。对于一对由2个动物组成的随机配对，使用这一标记导致这一点发生的频率为2/16，即0.125。因此这一标记的排除概率为12.5％。这一2个等位基因的标记显然不能提供很多信息，这就是为什么使用微卫星标记的原因。表6中给出了使用1、2个、直至10个标记时的排除概率。
表5亲子关系实例，其中基因型为黑体，频率为分数
Figure G038132567D00201
表6确定的(assigned)或观察的候选亲本的排除概率和平均数
第一亲本的Pe值用来预测28个候选者中被确定给每一小猪的雌亲(dam)平均数。当与最后一栏的观察值对比时，预测值保持非常好的同步性。第二亲本的Pe值随后用于对一更大的系统进行预测。第二亲本的Pe是当已知第一亲本的基因型时将一随机动物排除为第二亲本的概率。
由于预测值与观察到的结果非常接近，因此申请人可以对一个更大的可追溯性系统进行预测。一个更大的系统意味着有更多的候选亲本。候选亲本数越多，则排除具有给定数目的标记的全部(而非一个)亲本的概率越小。如果一种标记系统的Pe为95％，则其意味着每一假候选者有95％的几率被排除。其还意味着20个候选这中有1个将被认定(而非排除)为一个可能亲本，因此在具有10000个母猪的系统中，最终会有500个候选亲本。为了测量一个特异系统中一套标记的值，申请人定义了Pex，其中x是候选亲本数。
表7采用5到50个标记的Verspeq系统的Pex值。40和50个标记的Pe值(第一亲本)或20和30个标记的Pe值(第二亲本)是估计值，其它为来自实际数据的计算值。
Pex第一亲本
#标记  Pe          50    100   600   10,000  20,000  30,000  40,000  50,000
5      0.931       0.03  0     0     0       0       0       0       0
10     0.988       0.55  0.30  0     0       0       0       0       0
15     0.999195    0.96  0.92  0.62  0       0       0       0       0
20     0.999865    0.99  0.99  0.92  0.26    0.07    0.02    0       0
30     0.999998    0.99  0.99  0.99  0.98    0.96    0.94    0.92    0.90
40     0.9999999   0.99  0.99  0.99  0.99    0.99    0.99    0.99    0.99
50     0.99999999  0.99  0.99  0.99  0.99    0.99.   0.99    0.99    0.99
Pex第二亲本
#标记  Pe         50    100   600  10,000  20,000  30,000  40,000  50,000
5      0.989      0.58  0.33  0     0      0       0       0       0
10     0.999532   0.98  0.95  0.76  0.01   0       0       0       0
15     0.999995   0.99  0.99  0.99  0.95   0.90    0.86    0.82    0.78
20     0.999999   0.99  0.99  0.99  0.99   0.98    0.97    0.96    0.95
30     0.9999999  0.99  0.99  0.99  0.99   0.99    0.99    0.99    0.99
Pe500值为95％的一个标记系统可以在一个数目为500、时间为95％的系列中排除所有的候选者。通常人们希望从500中仅排除499个，但是如果人们进行排除所有候选者的运算，则结果却非常相似，并且数学也相当容易一些。对于Pe值为95％，则Pe10＝(.95)10或者60％，但是Pe10,000是非常接近0的一个数(约为1.7×10-233)。本文计算的Pex(表7)基于这一试验中观察的真Pe值。
10个标记的Pe14值是84％，这意味着申请人预计有16％的小猪被指定了来自错误农场的雌亲。这与在具有从SU1或SU2指定的母猪的系统II小猪中所观察到的12％接近，并且与具有从另一农场确定的母猪的SU1和SU2的小猪的17％也接近(表3的结果)。1-Pe21值为22％同样也与在从BS1确定一个雄亲的系统II的猪中所观察到的26％接近。
应理解的是所有这些显然的修饰和改动均包括在所附权利要求书定义的本发明范围内。权利要求书意在包括能有效满足所述目的的任何顺序的所述成分和步骤，除非上下文特意说明不是这样。还应理解的是本文引用的所有文章等均以其全文并入本文做参考。
表3：可追溯性分析中使用的等位基因bin范围

Claims (17)

1.一种追溯一种动物产品至其起源系统或农场的方法，所述方法包括：获得一种所述动物产品的样品；利用一种基于DNA标记的系统对所述动物产品进行基因分型分析以获得基因分析信息；将所述动物产品的基因分析信息与一种参考数据库进行对比，其中所述参考数据库包含不同的系统或农场独特的相关动物的DNA标记分布图；用所述参考数据库分析所述基因分析信息以确定所述产品的起源系统或农场。
2.权利要求1的方法，其中所述的基因分型分析选自如下一组：微卫星、单核苷酸多态性、扩增片段长度多态性及所有或部分所述DNA标记分布图的缺失和插入。
3.权利要求1的方法，其中所述基于DNA标记的系统包括鉴别10-100个微卫星标记以鉴别一种选定的动物产品是来自受控的起源系统或农场之中或之外。
4.权利要求3的方法，其中所述基于DNA标记的系统还包括鉴别20-50个微卫星标记以鉴别一种选定的动物产品是来自受控的起源系统或农场之中或之外。
5.权利要求1的方法，其中所述参考数据库还包含选自下组的样品信息：取样日期、动物所在地点、动物状况、样品运输信息和样品贮存信息。
6.权利要求1的方法，其中所述参考数据库含有来自动物及额外样品的可检索DNA分布图，所述额外样品选自子代、同胞、半同胞、表亲、双亲、祖亲和曾祖亲组成的组，这样使得可以确定它们的DNA标记分布图加入到所述参考数据库中并使得能够与其它动物样品相对比。
7.权利要求1的方法，其中所述动物产品源自农场动物物种。
8.权利要求7的方法，其中所述农场动物物种选自牛、猪、家禽、绵羊、山羊、鱼类、甲壳类及虾类组成的组。
9.一种遗传学鉴别是一种动物产品来源的动物的起源农场或系统的系统，其包括：用于利用基于DNA标记的系统对所述动物进行基因分型分析以产生基因型信息的工具；将所述基因型信息输入该系统的工具；将该基因型与参考数据库中已知动物基因型进行对比的工具，其中所述参考数据库含有每一系统或农场独特的相关动物的基因型信息和样品信息；提取所述参考数据库中匹配的基因型以鉴别所述动物所起源的系统或农场的工具。
10.权利要求9的系统，其中所述样品信息包含选自如下一组的信息：取样日期、动物所在地点、动物状况、样品运输信息和样品贮存信息。
11.权利要求9的系统，其中所述基因型信息选自与如下一或多种分析相关的数据：与所述相关动物或所述相关动物样品相关的遗传作图、遗传背景或遗传筛选。
12.权利要求9的系统，其中所述基因型信息由通过选自下组的数据产生的DNA标记分布图组成：微卫星、单核苷酸多态性、扩增片段长度多态性及全部或部分所述DNA标记分布图中的缺失和插入。
13.权利要求12的系统，其中所述DNA标记分布图包括对10-100个微卫星标记的鉴别以鉴别一种选定的动物产品是来自受控的起源系统或农场之中或之外。
14.权利要求13的系统，其中所述DNA标记分布图进一步包括对20-50个微卫星标记的鉴别以鉴别一种选定的动物产品是来自受控的起源系统或农场之中或之外。
15.权利要求9的系统，其中所述参考数据库含有动物的基因组和样品信息，所述动物包括如下一或多种：子代、同胞、半同胞、表亲、双亲、祖亲和曾祖亲，这样使得可以确定所述起源系统或农场独特的DNA标记分布图加入到所述参考数据库中并使得能够与其它动物样品相对比。
16.权利要求9的系统，其中所述动物是农场动物物种。
17.权利要求9的系统，其中所述动物选自牛、猪、家禽、绵羊、山羊、鱼类、甲壳类和虾类组成的组。
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