CN1657537A - 一种中心体定位的新基因及其在医药领域中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中心体定位的新基因，还公开了该基因在医药领域中的应用。本发明通过大规模测序、生物信息学分析以及基因技术等手段，制备一个新基因cep，经内源性与外源性亚细胞定位实验确定该基因定位于中心体，具有促进细胞增殖的作用，与肿瘤发生和转移具有一定的相关性，其在肿瘤组织中的表达丰度明显高于正常对照组织。该基因可作为治疗造血系统疾病及肿瘤发生与转移的候选基因或基因工程药物的靶点。

Description

一种中心体定位的新基因及其在医药领域中的应用

技术领域

本发明涉及一种基因，具体地说涉及一种中心体定位的新基因，还涉及该基因在医药领域中的应用。

背景技术

造血障碍疾病和恶性肿瘤的防治一直是国际性的研究热点。在二十世纪，随着基础医学、生物高技术和临床治疗学的快速发展，在造血障碍疾病和恶性肿瘤的防治这两个领域取得了一些可喜的进展，但由于造血功能的重建，恶性肿瘤的发生、发展和转移，都是极为复杂的过程，因而迄今仍有较多尚待攻克的难题。其重要原因之一是直接参与这些过程的许多重要功能基因及其分子调控网络尚未被表征。

人胎肝70～80年代在我国曾被广泛用于临床治疗多类与造血障碍相关的疾病(如急性放射病、再生障碍性贫血等)并取得显著疗效，从而使其成为造血研究方面的一个重要模型与对象。尤为值得关注的是，胎肝造血还有其特殊的时相性，即胎肝造血涉及到造血组织3月孕期向胎肝的迁入和6月孕期从胎肝的迁出过程。此点和肿瘤转移过程中肿瘤细胞的迁移和定居的现象十分类似。整个造血系统迁入、迁出胎肝的事实表明胎肝中存在着大量与细胞迁移、定居相关的活性分子。

细胞的迁移与定居是细胞生命活动的基本特征之一。在体内的正常条件下，细胞的迁移最普遍地发生于血细胞。那么，这些正常细胞的迁移和肿瘤细胞的转移是否存在相同的分子机制？对这一问题进行深入研究，必将为造血过程、肿瘤迁移过程分子机制的深入研究带来全新的启示。此外，肿瘤中真正危害人们健康的是恶性肿瘤，而恶性、良性肿瘤的最大差别在于前者能侵润并向其它组织转移，而后者无此潜能。因此，上述重要细胞迁移相关基因的功能验证不仅涉及造血系统具有重要生理活性的功能基因，同时也将为肿瘤的诊断、治疗及新型药物筛选提供重要的候选靶标分子。

目前国际上对于中心体的研究正值高涨阶段，最近两、三年内发现的定位于中心体上的蛋白质的文章频频在Nature、Science、Cell等权威刊物上出现，从一个侧面反映了它们的重要性。中心体细胞生物学与人类疾病，特别是肿瘤发生、发展的关系是这一领域中非常令人振奋的发现，许多原癌基因如Nucleophosmin、Aurora、Nek2等、抑癌基因产物如p53、BRCA1等，都非常活跃地参与到了中心体数量平衡的控制之中。这些蛋白质通过干扰中心体的正常生物功能，促进中心体扩增，导致异倍体形成，进一步促进染色体不稳定，最终导致肿瘤的发生和发展。因此，这些蛋白质都已经发展成为肿瘤诊、疗的分子标志与分子靶点。

发明内容

本发明公开了一种中心体定位的新基因cep-11，该基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，该基因所编码的蛋白质具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本发明以探讨造血组织在胎肝迁入和迁出与细胞迁移、肿瘤转移之间是否存在共同的分子机制为出发点，通过对处于造血系统迁入、迁出转换时期的4-6月孕龄的人胎肝cDNA文库进行大规模测序，获得了16000余条EST序列和511条插入片断全长cDNA序列，对这些数据进行生物信息学分析，发现了一个含有亮氨酸拉链的新基因cep，它的mRNA有两种不同的剪接形式：短的mRNA由四个外显子组成，编码99个氨基酸，分子量11kDa，将其命名为cep-11；长的mRNA由五个外显子组成，编码142个氨基酸，分子量16kDa，将其命名为cep-16。其中亮氨酸拉链的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

根据生物信息学分析所预测得到的cep序列设计一对引物，应用RT-PCR技术，从经反转录获得的人胎肝cDNA中进行PCR扩增，获得了预期的cep-11和cep-16两个cDNA。cep-11在其启始密码子前同一相位上存在的另一终止密码子(TAG)，说明获得了其全长cDNA。

经Northern Blotting和Dot Blotting分析，发现cep-11和cep-16具有相同的转录本大小，约为1.5kb，具有看家基因的广泛表达的模式。

发明人将Cep-11基因的CDS区(cDNA编码区)克隆于原核表达载体pGEX-4T-2上，成功地进行了融合蛋白的表达和纯化，然后利用融合蛋白免疫家兔，获得其多克隆抗体。继而利用HiTrip rProteinA FF(AmershamBiosciences)柱子进行抗体的纯化。还构建了GFP-Cep融合表达载体，转染NIH3T3和Cos7细胞后发现，Cep定位于中心体上；瞬时转染Cep后，会引起细胞中微管聚集现象发生。

本发明还公开了cep基因的医药用途。

发明人完成了该基因的染色体定位、组织表达谱研究以及初步功能研究。发明人通过在活细胞上直接观察Cep与GFP融合蛋白的动态定位、在鼠源NIH3T3细胞中进行稳定转染GFP-Cep的异源性定位、在人源HepG2细胞中进行内源性生理定位的研究手段证明：Cep定位于中心体上；而且它的中心体定位不随细胞周期时相的变化而改变，即它以不依赖于细胞周期进展的方式在细胞周期的各个时期-G1-S-G2-M期都定位于中心体上。

MTT、[³H]TdR以及流式细胞测定等实验结果证明cep基因具有促进细胞增殖的属性；通过软琼脂集落形成实验，裸鼠皮下细胞接种实验证明Cep基因的这种异源过表达还可以引起被稳定转染的NIH3T3细胞发生恶性转化，说明该基因与肿瘤发生和转移具有一定的相关性；应用免疫组化组织芯片的实验证明：该基因在肿瘤组织中的表达丰度明显高于正常对照组织。经内源性与外源性亚细胞定位实验研究表明：cep定位于细胞的中心体上，具有明显的促进细胞增殖、诱导中心体扩增以及诱导细胞癌变的功能。因此，该基因极有可能在造血组织从胎肝迁入和迁出、以及在细胞迁移、肿瘤转移中发挥至关重要的作用，有望成为肿瘤诊、治的靶分子，将提供重要的基因工程药物和基因治疗的靶基因，可用于制备造血系统疾病和肿瘤转移的诊断、治疗药物，因此该基因具有潜在的重要经济价值。

附图说明

图1.为cep-11基因的基因组织结构以及ceps RNA的内部选择性剪接位点。Cep-11异构体有4个外显子：矩形代表外显子；水平线代表内含子。

图2.cep-11的Northern blot以及mRNA表达谱分析。

A为用[α-³²P]dCTP-标记的cep-特异性探针与人的12种组织的Northern blot膜(膜上1μg of poly(A)+RNA/道，Clontech)杂交图；B为人的6种免疫组织Northern blot膜(2μg of poly(A)+RNA/lane，Clontech)杂交图。阴性对照的设置是以β-actin cDNA probe分别与上述两种Northern blot膜进行杂交(A，lower panel)。转录本大小标识于左侧。[α-³²P]dCTP-标记的cep-特异性探针也用于与含有来源于50种人类组织和细胞系的poly(A)+RNA的Dot Blot膜(Clontech)进行杂交反应。

C为放射自显影结果。

图3.GFP-Cep融合蛋白定位于鼠源NIH3T3细胞的中心体上。

A为western blot分析检测到GFP以及具有GFP-标签的Cep蛋白表达正常，分子量大小标识于图左侧；

B为GFP-Cep11转染的NIH3T3细胞的激光共聚焦显微镜图像；

C为GFP-Cep16转染的NIH3T3细胞的激光共聚焦显微镜图像；

D为pEGFP-N1空载体转染的NIH3T3细胞的激光共聚焦显微镜图像；在B和C中可以看到有一中心体样的结构位于细胞质中，而在D中则观察不到这一现象；

E为瞬时过表达Cep多肽的激光共聚焦显微镜图像，可观察到许多额外的中心体状亮点的形成。

图4.Cep蛋白在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常对照组织。

A为组织芯片阵列HE染色：结、直肠癌阵列(upper panel)；宫颈癌、卵巢癌阵列(lower panel)。

B为Cep在结、直肠癌中表达水平高于正常对照组织。a：正常结肠，b：结肠癌；c：正常直肠；d：直肠癌；e：正常卵巢；f：卵巢癌。

图5.GST、GST-Cep-11和GST-Cep-16的表达与纯化图谱。1：低分子量标准蛋白质Marker；2：阴性对照(JM109)；3：GST表达；4：GST纯化；5：GST-Cep-11表达；6：GST-Cep-11的纯化；7：GST-Cep-16的表达；8：GST-Cep-16的纯化；图的左侧是分子量标记；图的右侧标明融合蛋白的名称。

图6.Cep-GFP与中心体特异性蛋白γ-Tubulin共定位，在被转染的NIH3T3细胞中用电子显微镜可以观察到许多无中心粒的中心体形成现象。

A、A’：Cep-GFP融合蛋白的定位；

B、B’：γ-Tubulin的定位；

C、C’：细胞核的位置；

D、D’：A、B、C和A’、B’、C’三个图象的叠加图象；D’：多亮点能够非常精确地与γ-Tubulin重合，说明多个亮点都是中心体；

E：电子显微镜观察到的无中心粒的中心体扩增现象。

图7.为间接免疫荧光、免疫金电子显微镜观察Cep的内源性亚细胞定位以及Cep与γ-Tubulin的免疫共沉淀。

A图象由激光共聚焦显微镜采集，不同的细胞周期时相用字母a～f表示。a：G1期；b：S期；c：G2期；d：有丝分裂中期；e：有丝分裂后期；f：有丝分裂末期。β-tubulin抗原用anti-β-tubulin单克隆抗体标记，用偶联FITC的二抗显色(a～f)；内源性Cep用抗Cep抗体标记，用偶联Rhodamine的二抗显色(a’～f’)；DNA用DAPI显色(a”～f”)。各行的前三个图层合并后得到第四个图片(a～f)。图a、b、c、e、f中的长度标记(Bars)表示10μm；图d中的长度标记表示50μm。

B为Cep与γ-Tubulin免疫共沉淀的Western检测结果：分子量标记于左侧，HepG2细胞裂解液与抗-γ-tubulin抗体和proteinA/G-Sepharose共孵育，免疫复合物用抗-Cep抗体来检测。1，10％的总细胞裂解液；2，兔的正常IgG(normal IgG)作为第三道样品的阴性对照；3，来源于免疫共沉淀的细胞裂解液；同时检测了在每个免疫共沉淀反应中γ-tubulin蛋白的量(右侧)。C和D为免疫金标记Cep蛋白的电子显微镜观察结果：金颗粒在中心体上分布很多(C)，当细胞用nocodazole处理之后，金颗粒不在中心粒上分布(D)。说明Cep定位于中心体上依赖于微管蛋白的存在。

图8.为流式细胞计量术、[³H]TdR和MTT细胞增殖实验的统计分析结果。

A为流式细胞仪分析细胞周期所得之三种细胞的S期细胞的百分数，1为pEGFPN1-Cep16转染的NIH3T3细胞，2为阳性对照——鼠黑色素瘤细胞B16，3为阴性对照-pEGFPN1空载体转染的NIH3T3细胞。

B为[³H]TdR细胞增殖实验的结果表明：pEGFPN1-Cep16转染的NIH3T3细胞的cpm值显著高于阴性对照——pEGFPN1空载体转染的NIH3T3细胞的cpm值，每孔[³H]TdR的加入量分别为：1，1μCi或者2，3μCi。

C为MTT法细胞增殖实验的统计结果：在不同的细胞浓度条件下：1，1×10³；2，2×10³；3，3×10³；4，4×10³；5，1×10⁴；6，2×10⁴；7，3×10⁴和8，4×10⁴，两组OD值来源于分别转染pEGFPN1-Cep16和pEGFPN1的NIH3T3细胞，两组值之间表现出了显著的统计学上的差异。

图9.Cep蛋白在NIH3T3细胞中过表达导致细胞的恶性转化。

A稳定转染pEGFPN1-Cep16到NIH3T3细胞中，导致NIH3T3细胞在软琼脂中形成克隆，这是一个代表性的克隆照片；

B软琼脂克隆形成实验在三次独立的实验中进行，阴性对照是稳定转染pEGFPN1空载体的NIH3T3细胞，它在软琼脂中不能形成克隆，阳性对照是人源肿瘤细胞(HepG2 and Hela)。克隆形成数标记于左侧，长度标记(Bar)表示50μm；

C为Cep诱导细胞在体内发生恶性转化照片。注射实验组细胞4周后，裸鼠发生原位肿瘤生长，肿瘤大小为6mm；

D为肿瘤病理切片分析检测图，中部有一块坏死组织，用箭头标示，长度标记(Bar)表示50μm。

图10.为获得cep基因cDNA的RT-PCR反应过程图。

具体实施方式

                 实施例一  cep基因cDNA的获得

经RT-PCR反应，获得cep-11(编码99个氨基酸，分子量11kDa)和cep-16(编码142个氨基酸，分子量16kDa)两个cDNAs

RT-PCR反应体系见图10

            实施例二  Northern Blotting和Dot Blotting实验

材料：

杂交用膜：Human RNA Master Blot^TM膜、Human 12-Lane Multiple TissueNorthern(MTN)^TM Blot膜、Human Immune System Multiple Tissue Northern(MTN)^TM Blot II膜。这三张预转移了RNA的膜均购自CLONTECH公司。HumanRNA Master Blot^TM膜上的样品名称与分布如下表：

多组织点杂交膜上RNA样品、阴性、阳性样品的名称

	1	2	3	4	5	6	7	8
									A	全脑	扁桃体	尾状核	小脑	大脑皮层	前叶	海马	延脑
B	枕极	壳核	黑质	颞叶	丘脑	依状核	脊髓
									C	心脏	主动脉	骨骼肌	肠	膀胱	子宫	前列腺	胃
D	睾丸	卵巢	胰	脑垂体	肾上腺	甲状腺	唾液腺	乳腺
									E	肾	肝	小肠	脾	胸腺	外周血白细胞	淋巴结	骨髓
F	阑尾	肺	气管	胎盘
									G	胎脑	胎心	胎肾	胎肝	胎脾	胎胸腺	胎肺
H	酵母总RNA	酵母tRNA	E.colirRNA	E.coliDNA	Polyr(A)	人类C0t DNA	人类DNA

试剂：ExpressHyb杂交液(Northern、Dot通用)购自博大(Biotech)公司；Prime-a-gene随机引物标记试剂盒(U1100)购自PROMEGA公司；[α-³²P]-dCTP购自北京市亚辉生物医学工程公司。

方法：

A.探针标记：全长为300bp的cep的cDNA公共区序列作为模板用于探针标记。约125ng PCR产物经随机引物法获得标记，然后经过Sephadex G-50DNA纯化柱纯化，用于随后的Northern blot和Dot blot。

B.Northern Blot和Dot Blot杂交条件和数据处理：按照杂交膜生产厂家推荐的条件进行杂交。杂交温度控制在65℃(Northern blot)和68℃(Dot blot)。洗膜温度分别控制在65℃和55℃。杂交完成后，立即将湿润的杂交膜用保鲜膜包裹，放入带增感屏的暗盒中对X-光片曝光。Dot blot杂交获得的阳性信号点，首先用ImageJave软件测量每一阳性点的灰度值和背景的灰度值，然后从背景的灰度值中减去每一组织所代表的灰度值，获得的灰度值再除以每一斑点所含的RNA的量，即得每一斑点相对灰度值，代表cep在每种组织中的相对丰度。

结果：

A.Northern杂交结果：前文对cep cDNA的序列分析提示其基因可能存在两个转录本。为了准确了解该基因转录本的实际大小、准确个数以及反映该基因在各种组织中表达的有无、转录本在不同组织中的相对表达丰度，我们以cep-11和cep-16的cDNA的公共区为探针对含有12种人组织(脑、心脏、骨骼肌、结肠、胸腺、脾、肾、肝脏、小肠、胎盘、肺、白细胞)的多组织杂交膜和6种人免疫组织(脾、淋巴结、胸腺、外周血白细胞、骨髓、胎肝)的多免疫组织杂交膜进行Northern杂交，在两张膜上都只检测到一个约1.5kb大小的转录本，见图2。

B.Dot Blotting杂交结果：用同样的探针对cep在人体各组织、器官的分布情况进行了较为详细的分析。斑点杂交结果显示cep在所观查的所有五十种组织(见上表)中都存在，反映出cep基因广泛的组织分布特性。将点杂交获得的信号转换成相对灰度来表示cep在各组织中的相对丰度。cep在颞叶、丘脑、结肠、膀胱、前列腺、睾丸、外周血白细胞、肺、胎儿肺、胸腺等组织中表达水平高于在其它组织中的表达水平。

实施例三  Cep基因的原核表达、多克隆抗体的制备及其纯化

一、材料方法

1、Cep-11和Cep-16的原核表达材料：pGEX-4T-2载体、GST融合表达蛋白纯化系统(Bulk and Redpack GSTPurification Modules，MicroSpin GST Purification Module)、Anti-GSTAntibody及ECL显色剂购自Amersham Pharmacia。

方法：

A.原核表达载体的构建

全长Cep-11和Cep-16分别以EcoR 1和Xho 1酶切位点插入pGEX-4T-2载体，形成pGEX-4T-2-Cep-11和pGEX-4T-2-Cep-16重组载体。然后，转化菌株JM109，用于表达。

B.GST-Cep-11和GST-Cep-16融合蛋白的表达与纯化

把pGEX-4T-2-GST-Cep-11和pGEX-4T-2-Cep-16转化表达菌株JM109。挑阳性克隆菌落，用LB培养基37℃振摇过夜。取350μl菌液加入3.5ml LB(Amp⁺)中，继续37℃震摇，直到OD₆₀₀为0.6-0.8。用1mM IPTG诱导7.5小时，收集菌体，PBS洗涤三次，超声破碎，分别收集上清和包涵体。将样品上清GST-Cep融合蛋白上样Bulk and Redpack GST Purification纯化柱，用PBS洗去未结合的杂蛋白，再用还原性的谷胱甘肽从柱上洗脱下GST-Cep-11和GST-Cep-16融合蛋白。用SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白的表达。

2、多克隆抗体制备

材料：弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂购自Gibcol公司，注射器为市售产品。方法：

(1)高效表达菌株进行诱导表达，然后收集菌体进行SDS-PAGE。

(2)从凝胶上切割下含有特定多肽的凝胶条，经反复冻融并通过狭窄口径的皮下注射针头反复抽吸后，用等体积的弗氏完全佐剂对凝胶碎片进行乳化，然后免疫家兔。

(3)用等体积的弗氏不完全佐剂对凝胶碎片进行乳化，对家兔进行加强免疫三次。

(4)收集兔血清，即多克隆抗体，制好的抗体用ELISA检测其效价。

3、抗体纯化

(1)配制三类缓冲液：20mM pH7.0的磷酸钠高盐结合缓冲液、0.1M pH 3～6的柠檬酸钠梯度洗脱缓冲液、1M pH9.0的Tris-HCl抗体pH值校正缓冲液。

(2)用5倍柱床体积的结合缓冲液将乙醇贮存缓冲液从层析柱中冲洗掉。

(3)用5倍柱床体积pH5的洗脱缓冲液再生层析柱。

(4)用5～10倍柱床体积的结合缓冲液平衡层析柱。

(5)将层析柱与注射器相连，用注射器将所要纯化的样品推进层析柱中，使抗体的IgG与rProtein A结合。

(6)用5～10倍柱床体积的结合缓冲液洗涤层析柱，洗涤次数不能过多，以免将结合能力较弱的抗体洗涤下来。

(7)分别用一倍柱床体积的pH3～6的洗脱缓冲液将抗体从层析柱上洗脱下来，得到4ml纯化了的抗体。

(8)加入100μl 1M pH9.0的Tris-HCl pH值校正缓冲液于纯化了的抗体中，以调整抗体的pH值，并将此抗体贮存于4℃或-20℃。

(9)纯化的抗体用来做Western检测，以判断抗原-抗体的特异性结合程度。

4、ELISA法测定抗血清的效价

(1)纯化抗原浓度的测定。

A.在两组离心管中各加0.5mg/ml BSA(2.5，5，10，15和20μl)，用0.15mM NaCl补至50μl；同时以两管50μl 0.15mM NaCl作空白对照。B.每管各加0.5ml考马斯亮蓝染液，振荡混匀，室温2min。

C.测A₅₉₅，取A₅₉₅对标准蛋白浓度作标准曲线。

标准蛋白浓度为：0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.15mg/ml，0.2mg/ml。

D.测待测样品的A₅₉₅，从BSA标准曲线中确定其浓度。

(2)用Cep-GST融合蛋白(10ug/ml)包被96孔酶标板。一般应用交叉连续

稀释法确定最佳的包被剂中抗原的浓度，以10、5、2.5、1.25μg/ml的浓度梯度进行试验。包被的目的是使抗原结合到某种固相载体表面，并保持抗原的免疫活性。

(3)用5％(组中值)和10％(最大值)的牛血清白蛋白封闭酶标板，每孔200μl，37℃，3-6小时或4℃反应过夜，PBST洗涤三次。

(4)加待测样品孵育，待测样品稀释于PBST中，抗血清稀释倍数分别为：兔1∶1000×、2000×、4000×、8000×、16000×；兔2∶500×、1000×、2000×、4000×、8000×、16000×。每孔加入稀释于PBST中的抗血清200μl，37℃，反应1小时。

(5)PBST洗涤4-5次，再加酶标二抗(羊抗兔1∶5000)，每孔100μl，37℃，1小时。同时设免疫前血清各两孔做为阴性对照，免疫前血清稀释倍数为400倍和800倍。

(6)37℃反应1小时，PBST洗涤4-5次。

(7)加200μl OPD显色，用2mol/L H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定D₄₉₂nm和D₆₅₀nm值，求得两数之比值。

(8)在样品与阴性对照之间进行该值的比较，抗血清样品测定值与阴性对照测定值相等或接近的那个样品的稀释倍数即为该抗血清的效价值。

二、结果

1、GST-Cep-11和GST-Cep-16融合蛋白的表达与纯化

GST-Cep-11和GST-Cep-16融合蛋白在大肠杆菌JM109中获得高效表达。GST分子量为29kD，Cep-11分子量为10kD，Cep-11融合蛋白则为39kD；Cep-16分子量为14kD，Cep-16融合蛋白则为43kD。本实验实际表达的GST融合蛋白分子量，基本与理论值一致。GST-Cep-11和GST-Cep-16表达形式为可溶性蛋白，菌体超声上清直接可以用于亲和层析纯化。图5为GST-Cep融合蛋白表达与纯化的结果。

2、抗体效价的ELISA测定结果

数据表明，抗血清稀释倍数为16000时D₄₉₂nm/D₆₅₀nm的值为0.765，与阴性对照免疫前血清稀释为400×时的测定值0.729和免疫前血清稀释800×时的测定值0.743相比很接近，所以兔1的抗血清测定值为16000。

抗血清稀释倍数为8000时D₄₉₂nm/D₆₅₀nm的值为0.657，与阴性对照免疫前血清稀释为400×时的测定值0.688和免疫前血清稀释800×时的测定值0.835相比很接近，所以兔2的抗血清效价值为8000。

3、Cep-11和Cep-16蛋白表达的western检测

为了检测Cep-11和Cep-16蛋白的真实存在性，运用上述纯化了的抗体对内源性蛋白进行了western检测，该抗体可以特异性地识别Cep-11和Cep-16蛋白，说明抗体是特异的，同时说明该蛋白是真实存在的。

           实施例四  GFP-Cep融合表达载体的构建与

                   瞬时转染、Western表达检测

材料：绿色荧光蛋白载体(pd1EGFP-N1)、GFP多克隆抗体均购自Clontech公司。Lipofectamine购自GIBCO公司。荧光显微镜Olympus公司产品。

方法

载体构建

将全长Cep11和Cep16的编码区cDNA以酶切位点EcoR I和Bam H I将其插入pd1EGFP-N1载体中，形成pEGFP-Cep11和pEGFP-Cep16重组载体。所得重组克隆经测序鉴定正确无误。

细胞培养

在六孔板中，接种NIH3T3细胞(1×10⁵/ml)，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养至细胞约达到50％的汇合率时，用Lipofectamine进行转染。

转染细胞

分别取2μg pEGFP-Cep11质粒和2μg pEGFP-Cep16质粒，同时加入5μlLipofectamine，然后转染NIH3T3细胞，24小时后在荧光显微镜下观察其表达。

稳定转染细胞克隆的获得

转染24小时后在荧光显微镜下观察到目的蛋白的表达，然后，用含有1100μg/ml G418的DMEM培养液进行稳定转染细胞克隆的筛选，一般经15天左右就会长出单克隆。长出的单克隆用胰酶消化，扩大培养，直至冻存。

Western blot检测

方法包括SDS-PAGE，转膜，western blot，显色等步骤，按《分子克隆实验指南》所述方法进行。

结果

A.稳定转染细胞株的western检测

提取稳定转染了pEGFPN1-GFP、pEGFPN1-Cep11与pEGFPN1-Cep16质粒的NIH3T3细胞株的蛋白质，用抗GFP的多克隆抗体进行western检测。GFP分子量为27kD，Cep11分子量为11kD，Cep11融合蛋白则为38kD；Cep16分子量为16kD，Cep16融合蛋白则为43kD。本实验实际表达的GFP融合蛋白分子量，基本与理论值一致。图5说明融合蛋白表达正常。

B.Cep11与Cep16在NIH3T3细胞中稳定表达的定位结果

当我们将所获得的稳定转染细胞株在荧光显微镜下观察时，我们发现在稳定转染了pEGFPN1-Cep11与pEGFPN1-Cep16质粒的NIH3T3细胞群落中，Cep除了大部分位于细胞浆中外，在每一个细胞中都可以观察到在细胞核的区域，至少有一个形状类似大风车的结构存在，此结构中央紧实，周围发出辐射状的纤维丝。这样的结构在只转染pEGFPN1空载体的细胞中是观察不到的。

C.稳定表达GFP-Cep的NIH3T3细胞出现多亮点聚集现象

在稳定异源过表达Cep11和Cep16的NIH3T3细胞中，可以观察到在细胞核的区域有额外的多亮点聚集现象。这种具有额外多亮点的现象在瞬时共转染Cep11和Cep16到Cos7细胞中时也能观察到，现象更为明显。出现的GFP-Cep多亮点能够非常精确地与γ-Tubulin重合，说明多个亮点都是由γ-Tubulin组成的。

             实施例四  cep基因的定位试验

发明人通过在活细胞上直接观察Cep与GFP融合蛋白的动态定位、在鼠源NIH3T3细胞中进行稳定转染GFP-Cep的异源性定位、在人源HepG2细胞中进行内源性生理定位的研究手段证明：Cep定位于中心体上；而且它的中心体定位不随细胞周期时相的变化而改变，即它以不依赖于细胞周期进展的方式在细胞周期的各个时期-G1-S-G2-M期都定位于中心体上。

1、免疫共沉淀

A.材料与方法

材料

免疫共沉淀试剂盒(Immunoprecipitaion Kit)购自Santa Cruz；裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl，50mM NaF，2mM EDTA，0.5mMsodium vanadate，1％NP-40，2g/ml leupeptin，5g/ml aprotinin，1mMbenzamidine，0.2mM PMSF)

方法

细胞蛋白提取：

培养细胞铺板48小时后，用裂解缓冲液裂解细胞(冰上振摇30min)，4℃离心收集上清即细胞总蛋白，供免疫共沉淀用。

B.免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)流程

1mg细胞总蛋白(或组织蛋白)，加入0.25g对照IgG，20L protein-A/Gagarose 4℃，摇30min；4℃，离心5min(2500rpm)；小心收取上清(沉淀的agarose待用，作为对照)；加入1-10L主抗体，4℃摇1hr；加入20Lprotein-A/G agarose，4℃摇1hr或过夜；4℃离心5min；收取agarose沉淀(小心弃去上清)；加细胞裂解液，4℃离心(2500rpm)洗四次(与上面的待用沉淀的agarose同时做)；洗过的agarose沉淀重悬于40L 1x上样缓冲液；煮2-3min进行SDS-PAGE和Western blotting。

2、免疫金标记实验

(1)HepG2细胞分为两组：一组细胞不经任何处理，直接用于实验；另一组细胞经微管解聚药物nocodazole处理2小时后，与第一组细胞一起进行免疫金标记实验；

(2)用戊二醛进行固定处理细胞；

(3)用溶于TBS中的0.5％的Triton X-100对样品进行透化处理；

(4)用溶于TBS中的1∶50的Cep多抗进行孵育；

(5)用1∶50的金耦联的羊抗兔的二抗进行孵育；

(6)样品干燥后，进行电镜观察。

3、免疫荧光实验

(1)配制pH 7.4的PBS缓冲液，用滤纸或滤膜过滤，置于4℃备用。在22×22mm的玻璃盖玻片上培养细胞，一个盖玻片正好适合放在一个35mm的培养皿中或六孔板的一个孔里。对于一些特殊要求的观察，可以订购特制的免疫荧光专用培养皿。每孔中细胞接种的数量为4～5×10⁴。但可以随着实验的研究情况而改变。

(2)在室温下，用PBS洗涤细胞三次。洗涤动作要温和，以免冲掉细胞。

(3)用含多聚甲醛(浓度可以从0.1～5％)的PBS(pH 7.2)在室温下固定细胞。

(4)用透化剂进行处理，目的是在细胞膜上打孔，以便抗体能够进入细胞内部。

(5)用PBS洗三次。如果用盖玻片操作，将盖玻片做记号，以标明有细胞的一侧。

(6)用3％的BSA(稀释于PBS中)在37℃封闭30分钟。

(7)用PBS洗三次。

(8)同时加入两种一抗(稀释于PBS中)，37℃，在湿盒中进行温育，时间为1小时以上或过夜。

(9)用PBS洗三次。

(10)同时加入两种二抗，稀释于PBS中，于37℃，在湿盒中同时进行温育，时间为0.5～1小时。

(11)用PBS洗三次。

(12)在常温，于避光的情况下，用核染料DAPI对DNA进行复染，以避免光对荧光染料的光漂白作用。

4、在HepG2细胞内用Cep抗体对内源性蛋白的定位

选择人源肝癌细胞HepG2作为研究材料，进行Cep在人源细胞中的内源性定位研究。同时标记内源性Cep和纺锤体蛋白β-Tubulin，β-Tubulin抗体用FITC偶联的二抗进行显色、Cep抗体用Rhoda mine偶联的二抗进行显色，红色与绿色荧光的重合部分显示黄色，即指示着Cep的内源性亚细胞位置。根据中心体复制的细胞生物学行为，判定细胞所处的细胞周期。对细胞周期各期G1-S-G2-M(包括有丝分裂中、后、末期)的细胞都进行了重复的图象采集。结果表明：Cep在以上所观察的所有各期中都定位于中心体上，表现出不依赖于细胞周期的变化而定位于中心体上的定位方式。

5、Cep与γ-Tubulin在HepG2细胞内可以发生内源性共定位，Cep定位于中心体上，而不定位于中心粒上

实验组的细胞不用nocodazole处理，经免疫金标记实验，表明Cep定位于中心体上；对照组的细胞用微管解聚药物nocodazole处理后，使微管组织彻底解聚，这时再进行免疫金标记实验，Cep不定位于中心粒上，说明：Cep定位于中心体上依赖于Cep与γ-Tubulin之间的相互作用。

            实施例五  Cep基因的生物学活性试验

发明人经MTT实验、3HTdR掺入实验和流式细胞仪测定的实验手段，发现Cep具有促进细胞增殖的作用；通过软琼脂集落形成实验、裸鼠皮下细胞接种实验，证明cep的这种异源过表达还可以引起被稳定转染的NIH3T3细胞发生恶性转化；经免疫组化组织芯片分析，发现Cep在肿瘤组织中的表达丰度明显高于正常对照组织。

1、MTT实验

材料

MTT；酸化异丙醇；酶联检测仪。

方法

(1)细胞培养板中培养细胞至贴壁。

(2)在贴壁后不同的时间点，吸去培养液，用PBS将细胞洗一次。

(3)每孔加PBS和MTT染液。

(4)每孔加酸化异丙醇，在振荡器上震荡混匀，置酶联检测仪上测定光密度(OD)值，检测波长570nm，参考波长630nm。

结果

以两类稳定转染Cep的NIH3T3细胞作为实验组、两类稳定转染相应空载体的NIH3T3细胞作为阴性对照以及人源细胞HepG2作为阳性对照。结果说明实验组与阴性对照组相比，细胞的能量代谢前者明显高于后者。见图8C。

2、[³H]TdR掺入实验

材料

[³H]TdR，脉冲洗涤器，液闪记数仪，玻璃纤维滤纸，

方法

接种细胞于培养板中；用DMEM培养液洗涤细胞两次，洗去小牛血清；加入含有[³H]TdR的培养液；用胰酶将细胞消化，用脉冲洗涤器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上；用液闪记数仪测定细胞的放射性活度。

结果

以两类稳定转染Cep的NIH3T3细胞作为实验组、两类稳定转染相应空载体的NIH3T3细胞作为阴性对照。结果说明实验组与阴性对照组相比，细胞DNA的合成量前者明显高于后者，与MTT法的检测结果吻合。见图8B。

3、流式细胞仪测定实验

材料

pEGFP-N1-Cep-11\16和pcDNA3.1(A)-Cep-11\16两类稳定转染NIH3T3细胞株；流式细胞计量仪；RNA酶A；BSA(牛血清白蛋白)。

方法

用胰酶将贴壁细胞消化下来，分离细胞并移至15ml的离心管中，1000g离心5分钟，弃上清；用不含Ca或Mg的PBS将细胞洗两次，记数细胞总数；用500μl的PBS重悬细胞，避免细胞凝集成团；加5ml冰冷的乙醇，4℃固定过夜。细胞在进行分析以前，可以保持固定3周以上；1000g离心5分钟，弃乙醇；旋搅沉淀，用5ml的PBS+1％BSA或小牛血清洗涤两次；用含1％BSA或小牛血清的800μl的PBS重悬细胞沉淀；加入100μl煮沸过的RNA酶A，37℃孵育30分钟；加入100μl的10×PI溶液；用流式细胞计量术分析固定的样品。

结果

以两类稳定转染Cep的NIH3T3细胞作为实验组、两类稳定转染相应空载体的NIH3T3细胞作为阴性对照以及小鼠黑色素瘤细胞B16作为阳性对照，处于S期的细胞数增多。见图8A。

4、软琼脂集落形成实验

材料

低溶点琼脂糖；2×DMEM(含有2×抗生素和20％的小牛血清)，保存于37℃中；35mm六孔细胞培养板。

方法

(1)琼脂制备：用去离子水分别制备出1.4％和0.6％两个浓度的低溶点琼脂糖，高压灭菌后，维持在40℃中勿令凝固。

(2)无菌制备出2×DMEM(含有2×抗生素和20％的小牛血清)，保存于37℃中。

(3)底层琼脂制备：按1∶1混合1.4％的琼脂糖和2×DMEM后，注入六孔板中，令冷却凝固。

(4)消化细胞，用营养液制成单细胞悬液、计数。

(5)顶层琼脂制备：按1∶1混合0.6％的琼脂糖和2×DMEM后，加入580个细胞(悬浮于培养液中)，充分混匀，加入已铺有0.7％底层琼脂的六孔板中，形成双层琼脂，待上层琼脂凝固后，置于37℃CO₂细胞培养温箱中，培养15-20天。

(6)观察细胞集落并计数；计数克隆无绝对标准，10个以上的细胞群为一个克隆，以100个以上的细胞群记做一个克隆。

结果

经过三次独立的重复实验，稳定转染pEGFPN1-Cep16的NIH3T3细胞克隆形成数为35个，阳性对照HepG2细胞克隆形成数为30，另一个阳性对照Hela细胞克隆形成数为39。说明Cep的异源过表达可以引起被转染细胞在体外发生恶性转化。见图9A，B。

5、裸鼠皮下细胞接种实验

材料

36支裸鼠，分为两组：实验组与对照组各6支；共进行三个重复实验；注射用针头，注射器；满足裸鼠培养条件要求的动物房；4％多聚甲醛固定液；石蜡；切片机；二抗：羊抗兔IgG-HRP；Bio-Horse anti-Rabbit IgG，Streptavidin-HRP，Streptavidin-FITC和免疫组化试剂盒(SP-9000 kits)均购自中山公司。

方法

(1)培养细胞达到注射用细胞数量要求后，用胰酶将其消化下来，重悬于0.1ml无血清的DMEM中(含抗生素)，每只裸鼠的注射量为2×10⁷。

(2)将裸鼠颈背部皮肤用乙醇消毒，将细胞注射进其颈背部皮肤下；

(3)每天对其进行观察，发现有生病的裸鼠及时清除，以免感染其它健康小鼠；

(4)两周后，开始有小的肿瘤长出，随着肿瘤的生长，导致裸鼠出现腹水以及肿瘤转移，最后裸鼠死于肿瘤；

(5)将肿瘤组织进行石蜡包埋、切片，并用HE染色，进行病理分析。

结果

皮下注射1×10⁷细胞时，阴性对照和实验组均不能生长成瘤；当注射细胞数增加到2×10⁷时，只有实验组可在接种部位长成肿瘤，阴性对照不能在注射部位生长成瘤。注射3天后，阴性对照和实验组细胞被裸鼠全部吸收，注射10天后，实验组裸鼠在注射部位有小的结节生长，随着注射部位肿瘤体积的逐渐增加，肿瘤在裸鼠体内发生转移，并伴有腹水发生。到28天左右，裸鼠注射部位肿瘤的直径达到约6mm。取注射部位肿瘤、腹水、裸鼠的胃、脾、肠进行病理切片分析。样品用4％多聚甲醛固定液固定后，用石蜡包埋，用切片机切片，用HE染色裸鼠注射部位肿瘤；很有趣的是，发现在注射部位的原位肿瘤组织内部，有大块的坏死组织。见图9C。

6、免疫组化组织芯片实验

材料

肿瘤及其相应正常对照组织，免疫组化组织芯片阵列与结果来自中国医学科学院肿瘤医院与肿瘤研究所；二抗(羊抗兔IgG-HRP；Bio-Horseanti-Rabbit IgG)和免疫组化试剂盒(SP-9000kits)均购自中山公司；DAB(二氨基联苯胺)底物显色液。

方法

(1)石蜡切片脱水后，0.1M的柠檬酸钠，pH 6.0，微波炉抗原修复。

(2)3％的过氧化氢消除内源性过氧化物酶。

(3)10％的正常山羊血清封闭30分钟。

(4)一抗(Cep多抗1∶100稀释)，4℃，过夜。

(5)PBS洗五次，生物素标记的二抗，37℃温育30分钟，PBS洗五次。

(6)链亲和素标记的HRP，37℃温育30分钟，PBS洗五次。

(7)加DAB底物显色液，复染，封片，镜检。同时用免疫前兔IgG为阴性对照。

结果

组织芯片阵列HE染色结果为：Cep在结、直肠癌中表达水平高于正常对照组织；Cep在宫颈、卵巢癌中表达水平高于正常对照组织。见图4。

                          序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所

<120>一种中心体定位的新基因cep及其在医药领域中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>507

<212>DNA

<213>

<400>1

ccgacttgat ggaatgaagg caagtggagg gatgtcggaa caggctgctt tggctggatt    60

agcaccgggt gtaggcggga cacttagtca ttctcccttg gcccagacga tgccgccgtg    120

gagacagctg aggaagcaaa ggagcctgct gaagctgaca tcactgagct ctgccgggac    180

atgttctcca aaatggccac ttacctgact ggggaactga cggccaccag tgaagactat    240

aagctcctgg aaaatatgaa taaactcacc agcttgaagt atcttgaaat gaaagatatt    300

gctataaaca ttagtaggaa cttaaaggac ttaaaccaga aatatgctgg actgcagcct    360

tatctggatc agatcaatgt cattgaagag caggtagcag ctcttgagca ggcagcttac    420

aagttggatg catattcaaa aaaactggaa gccaagtaca agaagctgga gaagcgatga    480

gaaacttatt tctatgggac agagtct                                        507

<210>2

<211>99

<212>PRT

<213>

<400>2

Met Phe Ser Lys Met Ala Thr Tyr Leu Thr Gly Glu Leu Thr Ala Thr

1               5                   10                  15

Ser Glu Asp Tyr Lys Leu Leu Glu Asn Met Asn Lys Leu Thr Ser Leu

            20                  25                  30

Lys Tyr Leu Glu Met Lys Asp Ile Ala Ile Asn Ile Ser Arg Asn Leu

        35                  40                  45

Lys Asp Leu Asn Gln Lys Tyr Ala Gly Leu Gln Pro Tyr Leu Asp Gln

    50                  55                  60

Ile Asn Val Ile Glu Glu Gln Val Ala Ala Leu Glu Gln Ala Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Lys Lys Leu Glu Ala Lys Tyr Lys Lys Leu

                85                  90                  95

Glu Lys Arg

<210>3

<211>66

<212>DNA

<213>

<400>3

cttgagcagg cagcttacaa gttggatgca tattcaaaaa aactggaagc caagtacaag    60

aagctg                                                               66

<210>4

<211>22

<212>PRT

<213>

<400>4

Leu Glu Gln Ala Ala Tyr Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Lys Lys Leu Glu

1               5                   10                  15

Ala Lys Tyr Lys Lys Leu

            20

Claims (6)

1、一种中心体定位的新基因cep-11，其特征在于具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

2、权利要求1所述基因在医药领域中的应用。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于用作制备造血系统疾病或肿瘤治疗药物的靶基因。

4、根据权利要求2所述的应用，其中所说的药物为基因工程药物或基因治疗药物。

5、权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

6、权利要求5所述的蛋白质在制备肿瘤或造血系统疾病治疗药物中的应用。

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