CN1655826A - 非病毒类基因送递系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新颖的组合物，它含有核酸和含有共价连接于其氨基的支链基的脱乙酰壳多糖，其中所述支链选自具有2个或更多个碳原子的烷基、单糖、寡糖或多糖。该组合物特别可用作非病毒类基因送递系统。该组合物促进核酸导入它所给予的细胞中，并促进该核酸的功能的表达。

Description

非病毒类基因送递系统
                         发明领域
本发明涉及一种新的用于核酸的非病毒类送递系统。更具体而言，本发明涉及一种系统，用于在给予宿主组织核酸后促进该核酸进入该组织的细胞中。本发明的组合物以可生物降解的多糖脱乙酰壳多糖为基础，由于具有某些化学修饰的缘故，该多糖能够更有效地送递编码所需产物和/或促进所需产物在所述组织细胞中表达的生物学活性核酸，如寡核苷酸或多核苷酸。
                         发明背景
基因治疗的概念是以核酸(DNA或RNA)可作为药物产品从而在适当位点引起治疗性蛋白质的体内生产为基础。通常将送递核酸的系统分为病毒类送递系统和非病毒类送递系统。由于其高度进化和特化的组分，病毒类系统是目前最有效的DNA送递工具，实现高效的送递和表达。但是，病毒类送递系统涉及到安全性问题。毒性、免疫原性、对特殊细胞类型的有限靶向、有限的DNA携带能力、生产和包装问题、重组和非常高的生产成本都阻碍了它们的临床应用(Luo和Saltzman，2000)。为此，在基础研究实验室和临床应用中越来越需要非病毒类送递系统。但是，从制药学的角度看，由于与病毒类送递系统相比非病毒类送递系统在体内获得的表达相对较低，送递核酸的途径仍然是一个挑战(Saeki等，1997)。
现有技术已描述了各种非病毒类送递系统，包括阳离子脂质、肽或聚合物与质粒DNA(pDNA)形成的复合物(Boussif等，1995；Felgner等，1994；Hudde等，1999)。带负电的核酸主要通过离子-离子相互作用而与阳离子分子相互作用，并从游离形式转变形成紧密状态。在这种状态下，阳离子分子可提供针对核酸酶降解的保护，而且还赋予该核酸-阳离子复合物一些表面特性，以有利于该复合物与细胞的相互作用并被细胞摄取(Ledley，1996)。
在这些阳离子分子中，已显示合成的聚合物聚氮丙啶(PEI)能与pDNA形成稳定的复个物，并介导了转基因在体外和体内的相对高的表达(Boussif等，1995；Ferrari等，1997；Gautam等，2001)。为此，常用PEI作为试验设计的参比系统。但是，已提出PEI的毒性和效率之间的大致相关性(Luo和Saltzman，2000)，最近的研究还提出使用PEI所涉及到的毒性(Godbey等，2001；Putnam等，2001)。PEI的另一缺点是，它不是可生物降解的。因此，它可能被长时间存储在体内。因此，仍非常需要研究有效、无毒的可生物降解的非病毒类送递系统。
最常见的是通过肠胃外途径将非病毒类送递系统体内送递。静脉给予小鼠后，紧密的核酸-阳离子分子复合物主要沉积在肺毛细血管中，在那基因在肺泡隔膜(alveolar septi)中毛细血管的内皮细胞中表达(Li和Huang，1997；Ki等，2000；Song等，1997)，甚至在肺泡细胞中表达(Bragonzi等，2000；Griesenbach等，1998)。但是不在上皮细胞中表达。但未配制的裸DNA在达到目的地前在血液循环中快速降解，因此通常没有基因表达。相反，将裸DNA注射到骨骼肌肉则导致剂量依赖性的基因表达(Wolff等，1990)，当将该DNA与非紧密但“相互作用”的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯醇(PVA)复合时，基因表达进一步提高(WO 96/21470)(Mumper等，1996；Mumper等，1998)。因此，体内基因转染是组织依赖性的，其方式不可预测，因而这仍是个挑战。
还描述了非病毒类送递系统的粘膜送递，即送递给胃肠道、鼻和呼吸道(Koping-Hoggard等，2001；Roy等，1999，WO 01/41810)。除了以非紧密形式送递到鼻组织获得最佳的基因表达(WO 01/41810)外，当需要在粘膜组织中获得高基因表达时，紧密型核酸-阳离子分子复合物要优于非紧密型DNA。
现有技术中，非病毒类送递系统是以分子量相当高〔通常具有几百个千道尔顿(kDa)，5kDa是下限〕的阳离子聚合物(如脱乙酰壳多糖)为基础的，(如MacLaughlin等，1998；Roy等，1999；WO 97/42975)。主要的原因是低分子量(＜5kDa聚合物)与DNA形成不稳定的复合物，导致基因表达少(Koping-Hoggard，2001)。但是，高分子量阳离子分子有很多缺点，如紧密型核酸-阳离子分子复合物的聚集增加、溶解问题(MacLaughlin等，1998)。此外，使用较低分子量的阳离子分子存在一些生物学优点，即与较高分子量的阳离子分子相比，它们通常显示出减少的毒性和减少的补体激活(Fischer等，1999；Plank等，1999)。
现有技术已描述了使用低分子量阳离子分子与核酸复合的一些例子(Florea，2001；Godbey等，1999；Koping-Hoggard，2001；MacLaughlin等，1998；Sato等，2001)。但是，这些低分子量阳离子分子与DNA形成不稳定的紧密物(compact)，该紧密物在电场中分离(琼脂糖凝胶电泳)，结果导致与较高分子量阳离子分子相比没有体外基因表达或表达量少。这可以解释为DNA和低分子量阳离子分子之间形成的复合物通常是不稳定的，易于分解(Koping-Hoggard，2001)。实际上，琼脂糖凝胶电泳期间阳离子分子-DNA紧密物的离解和裸DNA的释放在文献中通常被用作区分无效制剂与有效制剂的试验(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。
现有技术公开了使用非病毒载体将核酸送递给呼吸道的方法的各种例子(Deshpande等，1998；Ferrari等，1997；Gautam等，2000)。我们最近鉴别和表征了基于DNA-复合聚合物脱乙酰壳多糖的这样一种系统(Koping-Hoggard等，2001)，该脱乙酰壳多糖是一种线性多糖，可从壳多糖衍生得到。在美国专利5972707(Roy等，1999)、美国专利申请号2001/0031497(Rolland等，2001)和WO 98/01160中也描述了脱乙酰壳多糖基的基因送递系统。
已将脱乙酰壳多糖作为紧密连接-修饰剂引入，以增强药物通过上皮屏障的送递(Artursson等，1994)。认为它在给人口服后是无毒的，而且已被批准作为食物添加剂使用，并且还被加到伤口愈合产品中(Illum，1998)。
脱乙酰壳多糖包括一类由(1→4)-连接的2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A单元)和2-胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(GlcN，D单元)以各种组成和顺序形成的水溶性线性多糖，可参见图1。A单元和D单元的相对含量可以A单元的分数表示：
FA＝A单元数量/(A单元数量+D单元数量)
FA与去-N-乙酰化单元的百分比具有以下关系：％去-N-乙酰化单元＝100％-(1-FA)。
各D单元含有亲水和可质子化的氨基基团，而各A单元含有疏水的乙酰基。两种单体的相对量(如A/D＝FA/(1-FA))可大范围地变化，导致它们的化学、物理和生物学性质有较宽的变动。这包括脱乙酰壳多糖在溶液、胶凝状态和固体状态下的性能，以及它们与其他分子、细胞和其他生物的和非生物的物质的相互作用。
当脱乙酰壳多糖被用于非病毒类基因送递系统时，其化学结构的影响最近被证实(Koping-Hoggard等，2001)。不同化学组成的脱乙酰壳多糖作为基因送递系统，显示出结构依赖性效率。仅有与pDNA形成稳定的复合物的脱乙酰壳多糖给出显著的转基因表达。
不管脱乙酰壳多糖的FA还是分子量是多少，都可通过引入化学取代基而对其进行化学修饰。葡糖胺单元的氨基基团由于其反应性的缘故而非常容易衍生。其次，羟基上的取代也是衍生脱乙酰壳多糖的一种可能途径，如O-羧甲基脱乙酰壳多糖(Kurita，2002)。
文献中已描述了大量的脱乙酰壳多糖衍生物，但在基因送递系统中进行了测试的衍生物非常少。但已报道三甲基化的脱乙酰壳多糖在上皮细胞系中起到基因送递载体的作用(Thanou等，2002)。
Tommeraas等(2002)已描述一系列支化脱乙酰壳多糖，其中通过席夫碱形成(Schiff base formation)使醛与D单元上的氨基反应而形成分支。如Yalpani&Hall(1984)所述，通常可通过在糖类的醛基和脱乙酰壳多糖的未取代氨基之间形成席夫碱而将单糖(如葡萄糖、半乳糖)、二糖(如乳糖)以及寡糖连接到脱乙酰壳多糖上。在大多数碳水化合物中，还原端上的醛基涉及到分子内环的形成。但是，由于环形式(半缩醛)和开链(醛形式)之间的平衡，所有或大多数碳水化合物作为醛类发生反应。对于酮糖如果糖，在环形式(半酮缩醇)与开环(酮形式)之间也存在相应的平衡。
另一类型的碳水化合物基的醛类可通过用硝酸降解长链碳水化合物(如脱乙酰壳多糖)而获得。在此反应中，葡糖胺的残基被脱去氨基，形成2，5-脱水-D-甘露糖，此产物具有一个醛基，该醛基不参与传统的环形成。终止于此残基的寡聚物易于通过席夫碱形成而连接到脱乙酰壳多糖或其他胺类的氨基(Tommeraas等，2002；Hoffman等，1983；Casu等，1986)。
根据本发明，令人惊讶地发现某些支化脱乙酰壳多糖在基因送递方面与相应的先前已知的非支化脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖寡聚物相比是更有效的复合剂(complexing agent)。
                          发明概述
一方面，本发明涉及一种组合物，它含有：
a)核酸；和
b)含共价连接于氨基基团的支链基的脱乙酰壳多糖，其中，所述支链选自以下基团：具有2个或多个碳原子的烷基；单糖；寡糖或多糖。含有支化脱乙酰壳多糖的所述组合物特别适用于将核酸送递到宿主组织的细胞中。根据本发明，意想不到的是，含有核酸如质粒DNA和某些支化脱乙酰壳多糖的制剂能有利地实现核酸向所选择组织的送递，并获得由各种核酸编码的所需分子在体内的表达。
在优选的实施例中，本发明的组合物含有可在脱乙酰壳多糖的氨基与羰基化合物支链基之间形成席夫碱的反应中获得的支链。该反应可由下式表示：
式中N代表连接于脱乙酰壳多糖的葡糖胺残基的C-2的N原子；R1和R2各自独立表示氢原子，或R1表示氢原子、R2表示任选取代的直链或支链饱和或未饱和的至多达10个碳原子的烃基，或者R1和R2各自独立表示任选取代的直链或支链饱和或未饱和的具有达10个碳原子的烃基；或者该羰基化合物表示单糖、寡糖或多糖；有可能的是，该席夫碱产物被还原，得到下式化合物：
Figure A0381234800102
本发明的另一目的是提供一种制备用于向宿主组织细胞送递核酸的含有核酸(如质粒DNA)和某些支化脱乙酰壳多糖的组合物。本发明的方法包括以下步骤：
(a)将权利要求1(b)所述的支化脱乙酰壳多糖暴露于水性溶剂中；
(b)将步骤(a)所得的水性溶液与水性溶剂中的所述核酸混合；和
(c)减少步骤(b)所获得的产物溶液的体积，获得所需的组合物浓度。
本发明又一目的是提供一种向宿主组织细胞给予核酸(如质粒DNA)和某些支化脱乙酰壳多糖的方法。本发明向哺乳动物给予核酸的方法是通过将该组合物引入该哺乳动物而实现。
本发明又一目的是本发明组合物作为哺乳动物预防性或治疗性药剂的用途。本发明组合物可同等地用作体外或体内诊断剂。
本发明的这些和其他目的由下文所述的一个或多个实施例提供。
本发明制备用于将核酸送递给宿主组织细胞的组合物的方法包括以下步骤：制备某些支化脱乙酰壳多糖，和(a)将所述支化脱乙酰壳多糖暴露于pH范围为4.0-8.0的水性溶剂中，(b)将步骤(a)的水性溶液与水性溶剂中的所述核酸混合，和(c)将步骤(b)获得的溶液脱水，得到体内给予前所需的组合物浓度。步骤(c)可通过以下方式进行：(1)将步骤(b)中的产品溶液的液体蒸发，得到所需的浓度；或(2)冻干步骤(b)所得的产品溶液，接着重新配制，以获得所需的浓度。
本发明另一实施例提供了一种将制剂送递给宿主组织细胞的方法。较佳的是，通过口腔、颊、舌下、直肠、阴道、鼻或肺部途径，以给予粘膜组织的方式将所述组合物给予哺乳动物。根据一个具体实施例，通过肠胃外给药将所述组合物给予哺乳动物。
更具体的是，本发明涉及权利要求1-15所定义的组合物。本发明的实施例还涉及权利要求16-24的主题。
在下文详细描述的基础上将能更容易理解本发明的其他目的、特征和优点。但是，应当注意的是，这些详细的描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但它们仅仅是阐述性的，因为在这些详细描述的基础上，在本发明精神和范围内的各种改变和变动对于本领域技术人员来说都是显而易见的。
                          附图描述
图1：脱乙酰壳多糖的化学结构。此例子显示了脱乙酰壳多糖链的一个片段，其中该片段含有一个N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基(A单元)和3个β-D-葡糖胺残基(D单元)。D单元的氨基可以是质子化的，也可以是非质子化的，这取决于pH。
图2：支化脱乙酰壳多糖的例子。其中支链已通过与乙酰的还原性N烷基化而引入，结果导致在氨基上得到作为取代基的乙基。支化的程度可通过如改变加入的乙醛量或改变反应时间而加以控制。
图3：支化脱乙酰壳多糖。其中支链已通过与D-葡萄糖的还原性N-烷基化而引入。
图4：在对应于还原端的链末端上含有2，5-脱水-D-呋喃型甘露糖(M)残基的脱乙酰壳多糖的化学结构。在此例子中，余下的所有残基都是N-乙酰基-D-葡糖胺(FA＝1.0)。
图5显示三聚体AAM通过还原性胺化支化成脱乙酰壳多糖的氨基。
图6：含有AAM支链的不同程度支化(DS)的脱乙酰壳多糖的1H-NMR光谱(DPn＝25，FA＜0.001)。
图7显示琼脂糖凝胶延迟检测，表明在支化脱乙酰壳多糖与pLuc之间形成了稳定的复合物。
图8显示在用支化脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc之间形成的稳定复合物转染293细胞72小时后支化分子对荧光素酶基因表达的影响。
图9显示用三聚体支化脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc之间形成的复合物转染(A)293细胞和(B)  Calu-3细胞72小时后，三聚体支化的程度对荧光素酶基因表达的影响。
图10显示用经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物转染后，(A)293细胞和(B)Calu-3细胞中荧光素酶基因表达的时间-过程研究。
使用报道子蛋白质荧光素酶的表达作为体外细胞模型中治疗性蛋白质的模型，结果意想不到地发现，本发明含有质粒DNA和某些支化脱乙酰壳多糖的组合物能有利地实现将该核酸送递给细胞，并获得由所述核酸编码的所需分子的表达。
已发现某些支化脱乙酰壳多糖与pLuc形成稳定的复合物(如琼脂糖凝胶电泳所揭示的)，结果导致高的荧光素酶基因表达。已发现稳定的复合物的形成受到以下因素的影响：(1)脱乙酰壳多糖与pDNA之间的胺/磷酸盐电荷比(+/-)；(2)脱乙酰壳多糖的支化程度；和(3)支化的类型。通常，当支化程度增加时，要形成稳定的复合物则需要较高的支化脱乙酰壳多糖与pDNA之间的胺/磷酸盐电荷比(+/-)。结果，介导低基因表达的不稳定复合物甚至可在经40％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物具有高达60∶1(+/-)的电荷比时形成，而介导高基因表达的稳定的pDNA-复合物在经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物具有的电荷比为10∶1(+/-)时即可形成。
稳定的复合物比不稳定复合物产生较高的基因表达的事实与现有技术相符(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanow，2001；Koping-Hoggard等，2001)。因此，在体内基因转染方面，与较不稳定的复合物相比，具有较高复合物稳定性的制剂被认为是有利的。
与未分支脱乙酰壳多糖相比，基于所述分支脱乙酰壳多糖的稳定复合物获得较高的荧光素酶基因表达。
已发现人胚胎肾细胞系293中介导基因表达的效率依赖于支化分支的结构，具有以下几个排列顺序：7％三聚体AAM＞6％葡萄糖＞5％乙醛＞未支化脱乙酰壳多糖寡聚物。
根据现有技术，基于脱乙酰壳多糖的pDNA-复合物与基于合成性聚合物聚氮丙啶PEI的pDNA-复合物相比，已显示出较慢的基因表达的启动，在转染48小时后在早期时间点上介导低的基因表达(Koping-Hoggard等，2001；Erbacher等，1998)。
令人惊讶的是，与基于未支化的脱乙酰壳多糖相比，基于经7％三聚体AAM支化的某些脱乙酰壳多糖的pDNA-复合物在人胚胎肾细胞系293中获得的基因表达动力学与PEI的类似。此外，在人肺上皮细胞系Calu-3中也获得类似的基因表达动力学，但与使用PEI相比，使用经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物获得意想不到的高10倍的表达。
现有技术已描述含有偶联于DNA复合剂的糖残基的pDNA复合物在气管上皮细胞中的增加的胞内摄取和增强的胞内阻塞(Kollen等，1996；Fajac等，1999；Kollen等，1999)。在细胞表面膜上特殊糖结合外源凝集素的存在以及细胞内外源凝集素的存在可能对含有糖残基的这些pDNA系统的增加的转染效率负责。但是，在如具有糖残基偶联到其上的多赖氨酸的情况下，效率依赖于与另一试剂氯喹的共给予，该试剂不能像本发明组合物那样容易地被相同的细胞靶定，或者由于其明显的毒性而不能在体内使用。在上述基于含有某些支链的脱乙酰壳多糖的pDNA-复合物的描述中，没有同时给予过其他试剂。
适当地，含有支链的所述脱乙酰壳多糖通过选择未支化的FA为0-0.70、较佳0-.035、更佳0-0.10、最佳0-0.01的脱乙酰壳多糖而获得。然后通过酸水解、酶水解或通过与硝酸反应而降解所述脱乙酰壳多糖，得到聚合的重均聚合度(DPw)为2-2500、较佳为3-250、最佳为4-50的产物。任选地，可将降解的脱乙酰壳多糖进行分级分离，如进行凝胶过滤，以产生具有更窄的分子量分布的脱乙酰壳多糖。用于分支的特别有用的起始原料脱乙酰壳多糖是同一日提出申请的未授权挪威专利申请20022148中描述的哪些化合物，本文将该文献纳入作为参考。在涉及在羰基化合物(较佳是醛)和脱乙酰壳多糖的D-葡糖胺残基上的氨基形成席夫碱的方法中对该脱乙酰壳多糖进行分支化。分支反应较佳在合适的还原剂如NaCNBH3的存在下进行，以减少席夫碱。通常，通过控制羰基化合物和D-葡糖胺残基间的比例来控制分支的程度。
在本发明的一个实施例中，所述羰基化合物是乙醛，它在与所述脱乙酰壳多糖分支化后得到图2所示的结构。
在本发明的另一实施例中，所述羰基化合物是D-葡萄糖，它在与所示脱乙酰壳多糖分支化后得到图3所示的结构。
在本发明的又一实施例中，所述羰基化合物是通过与硝酸反应而部分解聚而从脱乙酰壳多糖衍生得到的多糖或寡糖，从而获得所需的平均DP，并在链末端存在反应性醛2，5-脱水-D-甘露糖，如图4所示(Tommeraas等，2002)。任选地，可将部分降解的壳多糖分级分离，如进行凝胶过滤，获得单分散性寡聚物(单DP)，如Tommeraas等(2002)所述。含有所述反应性醛的这些寡聚物还可进一步与任何脱乙酰壳多糖反应，产生图5所示类型的支链。
在本发明的又一实施例中，所述羰基化合物是经酸或脱乙酰壳多糖酶(chitosanase)部分水解而从脱乙酰壳多糖衍生得到的多糖或寡糖，从而获得所需的平均DP和正常的还原末端(Varum等，2001)。任选地，可将部分降解的壳多糖分级分离，如进行凝胶过滤，获得单分散性寡聚物(单DP)，如Tommeraas等(2001)所述。含有所述还原末端的这些寡聚物还可与任何脱乙酰壳多糖发生进一步的反应，如产生如Yalpani和Hall(1984)在关于寡糖的综述中所述的支链。
应理解的是，本领域熟练的技术人员能够制备用其他分子(如用于靶向特定组织和/或细胞的肽)和稳定剂〔如聚乙二醇，(PEG)〕支化的脱乙酰壳多糖。
本发明组合物的核酸适当地含有编码序列，当该核酸被导入宿主细胞时该编码序列将表达其功能。
根据本发明的另一优选实施例，所述核酸选自RNA和DNA分子。这些RNA和DNA分子包括环状的分子、线性分子或两者的混合物。较佳的是，所述核酸包括质粒DNA。
根据本发明的一个方面，所述核酸含有编码生物学活性产品如具有治疗、诊断、免疫或抗原活性的蛋白质、多肽或肽的编码序列。
本发明还涉及上述组合物，其中所述核酸含有编码蛋白质、酶、多肽抗原或多肽激素的编码序列，或所述核酸含有起到反义分子如RNA或化学修饰RNA的作用的核苷酸序列。
本发明还涉及制备本发明组合物的方法，其中该方法包括以下步骤：提供上述支化脱乙酰壳多糖，(a)将所述支化脱乙酰壳多糖暴露于pH为3.5-8.0的水性溶剂中，(b)将步骤(a)所得的水性溶液与水性溶剂中的所述核酸混合，和(c)将步骤(b)中获得的产品溶液脱水，得到体内给药前的高浓度的该组合物。可采用以下方式实现步骤(c)：(1)将步骤(b)的产品溶液中的液体蒸发，获得所需的浓度，或者(2)将步骤(b)的产物溶液冻干，接着重新配制以获得所需的浓度。通常，步骤(b)中所述核酸的浓度为1ng/ml-300μg/ml，较佳是1μg/ml-100μg/ml，更佳是10-50μg/ml；步骤(c)(1)中所述核酸的浓度为10ng/ml-3000μg/ml，较佳为10μg/ml-1000μg/ml，更佳是100-500μg/ml。
应理解，本领域熟练的技术人员能以不同的胺/磷酸盐电荷比形成本发明组合物，以包括各种负电荷比、中性电荷比或正电荷比。
本发明还涉及一种将本发明的组合物导入哺乳动物从而向哺乳动物给予核酸的方法。较佳的是，通过肺部、鼻、口腔、颊、舌下、直肠或阴道途径经粘膜组织给予所述组合物。根据一个具体实施例，通过肠胃外给予哺乳动物所述组合物。
本发明还涉及上述组合物在制备用于哺乳动物的预防性或治疗性治疗的药剂中的用途，或者在制备用于体内或体外诊断方法的诊断剂的用途。本发明尤其涉及所述组合物在制备用于基因治疗、反义治疗或遗传接种以预防或治疗恶性肿瘤、自身免疫疾病、遗传病、致病性感染以及其他病理性疾病的药剂中的用途。
                         实施例
实施例1
全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖(de-N-acetylated chitosan)的制备(FA＜0.01)
通过非均一性碱去酰基化〔50％(w/w)NaOH溶液，4小时，100℃，在密封的玻璃容器中〕将市售获得的FA为1.0的脱乙酰壳多糖(10g)进一步去N-乙酰化。过滤该脱乙酰壳多糖，用2×150毫升的甲醇和1×150毫升的甲醚洗涤，之后室温干燥，接着用0.2M NaCl和去离子水透析。1H NMR光谱显示FA＜0.01。
实施例2
全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖的解聚(DPn＝25)
如Allan和Peyron(1989，1995a、b)所述用亚硝酸(17mg NaNO2)将脱乙酰壳多糖(FA＜0.01，500毫克，成HCl形式)解聚。接着使用NaBH4进行常规的还原、透析和冻干。发现该脱乙酰壳多糖被全部还原，采用1H NMR和13C NMR光谱测得重均聚合度(DPn)为25。
实施例3
具有反应性还原端的N乙酰化寡聚物的制备
将脱乙酰壳多糖(FA-0.59，固有粘度[η]＝826毫升/克，500毫克，HCl形式)溶解在30毫升2.5％(v/v)乙酸中。将氮气鼓泡吹入该溶液中5分钟，除去溶解的氧。冷却到4℃后，加入新鲜配制的NaNO2溶液(100mg)，使反应在黑暗中、在4℃进行12小时。离心产物(10分钟，5000rpm)，过滤(8μm)，除去全长N-乙酰化寡聚物的不溶级分，然后冻干。
实施例4
N-乙酰化寡聚物的分离和他们的化学结构的测定
用Superdex 30(Pharmacia Biotech，Uppsala)包裹的、串联的两根2.5厘米×100厘米柱进行凝胶过滤，分离出寡聚物(500毫克)，用0.15M、pH4.5的乙酸铵洗脱，流量为0.8毫升/分钟。使用实时折光率(refraction index，RI)检测器(Shimadzu RID-6A)监测洗脱。收集4毫升的级分，合并，最后经冻干获得纯化的寡聚物。
实施例5
经寡糖支化的全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖的制备
在下述程序后，使用纯化的三聚体对全长去-N乙酰化脱乙酰壳多糖(FA＜0.01，DPn＝25)进行还原性N-烷基化：使低分子量全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖(DPn＝25，20μmol的D单元)和全长N-乙酰化三聚体(A-A-M)(2.0，12，20和40μmol)在0.1M乙酸中的溶液与0.1M氯化钠(5毫升，pH5.5，室温)反应4天。分别在第2和24小时将NaCNBH3(50毫克)加到反应混合物中。反应过程中的pH值从不超过6.5。透析除去未反应的三聚体(A-A-M)，将支化脱乙酰壳多糖转化成氯盐，冻干，-20℃保存。
实施例6
经D-葡萄糖支化的全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖的制备
采用与实施例5相同的方法，用D-葡萄糖还原性N-烷基化全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖(FA＜0.01，DPn＝25)，不同之处在于用D-葡萄糖(4.0μmol)代替三聚体(A-A-M)。
实施例7
经乙醛支化的全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖的制备
采用与实施例5相同的方法用D-葡萄糖还原性N-烷基化全长去N-乙酰化脱乙酰壳多糖(FA＜0.01，DPn＝25)，不同之处在于用乙醛(4.0μmol)代替三聚体(A-A-M)。
实施例8
含有支化的脱乙酰壳多糖与pDNA的组合物的配制
根据实施例5-7所述的方法，分别制得经6、10和20％乙醛和葡萄糖支化和经7、23和40％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物和脱乙酰壳多糖寡聚物。从Aldevron(Fargo，ND，美国)购得荧光虫荧光素酶质粒DNA(pLuc)。在无菌蒸馏去离子水中配制阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物的原液(2mg/ml)，pH6.2±0.1，接着无菌过滤。先将阳离子寡聚物、接着将pLuc加到用涡流搅拌器(Heidolph REAX 2000，KEBO实验室，Spanga，Sweden)剧烈搅拌的无菌水中，以10∶1、30∶1和60∶1(+/-)的电荷比配制阳离子脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc之间形成的复合物。pDNA的浓度保持在13.3μg/ml的恒定值。此外，用25kDa的PEI(Aldrich Sweden，Stockholm，Sweden)以先前优化的电荷比5∶1(+/-)配制pLuc(Bragonzi等，2000；Koping-Hoggard等，2001)。
在琼脂糖凝胶电泳中测试复合物的稳定性。复合物的稳定性高度依赖于支化的程度。以10％和20％的支化程度与乙醛和葡萄糖支化的脱乙酰壳多糖寡聚物没有形成稳定的复合物。在此试验中，与40％三聚体支化的脱乙酰壳多糖寡聚物也没有形成稳定的复合物。
图7显示表明在支化脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc之间形成稳定的复合物的琼脂糖凝胶延迟试验。未取代的脱乙酰壳多糖和经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖在10∶1(+/-)的电荷比就已与pDNA形成稳定的复合物。但是，分别用6％乙醛和葡萄糖支化的脱乙酰壳多糖寡聚物要形成稳定的复合物则需要高达60∶1(+/-)的电荷比。
实施例9
使用含有支化脱乙酰壳多糖和pDNA的制剂进行的基因表达研究
如实施例8所述制备由支化脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc形成的复合物。在转染前24小时，将人肾上皮细胞系293(ATCC，Rockville，MD，美国)以70％铺满接种在96孔组织培养平板上(Costar，Cambridge，UK)。以100000个细胞/平方厘米的密度将人肺上皮细胞Calu-3接种在96孔组织培养平板(Costar)上，培养14天，在转染前获得分化的细胞。在转染前，清洗细胞，然后每孔加入50微升(相当于0.33微克的pLuc)的复合物制剂。培养5小时后，除去该制剂，加入0.2毫升新鲜的培养基。试验时间超过两天的，每两天换一次培养基。在指定的时间点上，用PBS(pH7.4)清洗细胞，用裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)裂解，用照明计(Mediators PhL，Vienna，Austria)测量荧光素酶基因表达。根据萤火虫荧光素酶(Sigma，St.Louise，MO)制得的标准曲线测定表达的荧光素酶的量。采用BCA试验(Pierce，Rockford，IL)分析各样品中的总蛋白含量，并使用BSA(牛血清清蛋白)作为参比蛋白进行定量。在微平板读数器(Multiscan MCC/340，Labsystem Oy，Helsinki，Finland)上测量540纳米波长的吸光度。用平均值±一个标准值计算荧光素酶基因表达(皮克荧光素酶/微克总细胞蛋白)，n＝3-6。
图8显示用支化脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc形成的复合物转染293细胞72小时后该细胞中支化分子对荧光素酶基因表达的影响。转染效率的顺序依次为7％三聚体AAM＞6％葡萄糖＞6％乙醛＞未支化的脱乙酰壳多糖寡聚物。
图9显示用三聚体支化脱乙酰壳多糖寡聚物与pLuc之间形成的复合物转染(A)293细胞和(B)Calu-3细胞72小时后，三聚体支化的程度对荧光素酶基因表达的影响。在293细胞中，效率的顺序依次为PEI≈7％三聚体＞23％三聚体＞未支化脱乙酰壳多糖寡聚物＞40％三聚体。令人惊讶的是，在Calu-3细胞中获得另一顺序的效率：7％三聚体＞23％三聚体＞PEI＞未支化的脱乙酰壳多糖寡聚物＞40％三聚体。使用40％支化程度的寡聚物所获得的低转染效率可解释为在此高程度的支化下形成的复合物不稳定。
图10显示用经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物转染后，(A)293细胞和(B)Calu-3细胞中荧光素酶基因表达的时间-过程研究。令人惊讶的是，在293细胞系中，与PEI相比，观察到基于经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖的pLuc复合物快速启动基因表达。此外，在Calu-3细胞系中，经7％三聚体AAM支化的脱乙酰壳多糖寡聚物获得的荧光素酶基因表达是PEI的10倍。
                               参考文献
Artursson P，Lindmark T，Davis SS和Illum L(1994)，“脱乙酰壳多糖对肠上皮细胞(Caco-2)单层的渗透性的影响”(Effect of chitosan on thepermeability of monolayers of intestinal epithelial cells(Caco-2))，Pharm Res11：1358-1361。
Boussif O，Lezoualch F，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B和Behr JP(1995)，“用于将基因和寡核苷酸转移到培养中的细胞的多用途载体：聚氮丙啶”(A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cellsin culture and in vivo：Polyetylenimine)，Proceedings of the National Academy ofSciences USA，92：7297-7301。
Bragonzi A，Dina G，Villa A，Calori G，Biffi A，Bordignon C，Assael BM和Conese M(2000)，“非病毒阳离子性载体/DNA复合物在肺中的生物分布和转基因表达”(Biodistribution and transgene expression with nonviral cationicvector/DNA complexes in the lungs)，Gene Cher，7：1753-1760。
Casu B，Colombo M，Compagnoni T，Naggi A，Pivari E，Torri G(1986)，“具有N-乙酰基-葡糖胺寡糖侧链的支化脱乙酰壳多糖”(Branched chitosanswith N-acetyl-glucosamine oligosaccharide side-chains)，R.A.A.Muzzarelli，L.Jeauniaux，G.W.Gooday(编辑)Chitin in Nature&Technology，Plenum Press，New York，1986，第309-315页。
Deshpande D，Blezinger P，Pillai R，Duguid J，Freimark B和Rolland A(1998)，“用于肺部基因治疗的阳离子脂质基的系统的靶标特异性优化”(Target specific optimization of cationic lipid-based systems for pulmonary genetherapy)，Pharm Res，15：1340-1347。
Erbacher P，Zou S，Bettinger T，Steffan AM和Remy JS(1998)，“用于基因送递的脱乙酰壳多糖基的载体/DNA复合物：生物物理学特征和转染能力”(Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery：biophysicalcharacteristics and transfection ability)，Pharmaceutical Research，15：1332-1339。
FajacI，Briand P，Monsigny M和Midoux P(1999)，“糖介导的糖基化多赖氨酸的摄取和基因转移到正常的和囊性纤维化气管上皮细胞”(Sugar-mediated uptake of glycosylated polylysines and gene transfer into normal andcystic fibrosis airway epithelial cells)，Human Gene Therapy，10：395-406。
Felgner JH，Kumar R，Sridhar CN，Wheeler CJ，Tsai YJ，Border R，Ramsey P，Martin M和Felgner PL(1994)，“用一系列新颖的阳离子脂质制剂进行的增强的基因送递及机理研究”(Enhanced gene delivery and mechanism studieswith a novel series of cationic lipid formulations)，Journalof BiologicalChemistry，269：2550-2561。
Ferrari S，Moro E，Pettenazzo A，Behr J，Zacchello F和Scarpa M(1997)，“ExGen 500是一将基因送递到体内和体外的肺上皮细胞的有效载体”(ExGen500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and invivo)，Gene Therapy，4：1100-1106。
Fischer D，Bieber T，Li Y，Elsasser HP和Kissel T(1999)，“一种新颖的基于低分子量、分支聚氮丙啶的送递DNA的非病毒载体：分子量对转染效率和细胞毒性的影响”(A novel non-viral vector for DNA delivery based on lowmolecular weight，branched polyethylenimine：effect of molecular weight ontransfection efficiency and cytotoxicity)，Phare Res，16：1273-1279。
Florea B，Thanou，M.，Geldof，M.，Meaney，C，Junginger，H.E.和Borchard，G.(2001)，“修饰的脱乙酰壳多糖寡糖和聚氮丙啶作为转染剂用于囊性纤维化的基因治疗”(Modified chitosan oligosaccharides and polyethylenimine astransfection agents for gene therapy in cystic fibrosis)，Journal
Gautam A，Densmore CL，Golunski E，Xu B和Waldrep JC(2001)，“使用PEI-DNA复合物通过气溶胶基因治疗而在小鼠气管上皮细胞中转基因的表达”(Transgene expression in mouse airway epithelium by aerosol gene therapywith PEI-DNA complexes)，Mol Ther，3：551-556。
Gautam A，Densmore CL，Xu B和Waldrep JC(2000)，“给予PEI-DNA气溶胶后小鼠肺中增强的基因表达”(Enhanced gene expression in mouse lungafter PEI-DNA aerosol delivery)，Mol Ther 2：63-70。
Gebhart CL和Kabanov AV(2001)，“polypexes作为基因转移剂的评估”(Evaluation of polyplexes as gene transfer agents)，J Control Release 73：401-416。
Godbey WT，Wu KK和Mikos AG(1999)，“尺寸的关系：分子量影响聚(氮丙啶)作为基因送递载体的效率”(Size matters：Molecular weight affectsthe efficiency of poly(ethylenimine)as a gene delivery vehicle)，J Biomed MaterRes 45：268-275。
Godbey WT，Wu KK和Mikos AG(2001)，“聚(氮丙啶)介导的基因送递影响内皮细胞的功能和活性”(Poly(ethylenimine)-mediated gene deliveryaffects endothelial cell function and viability)，Biomaterials 22：471-480。
Griesenbach U，Chonn A，Cassady R，Hannam V，Ackerley C，Post M，Tanswell AK，Olek K，O′Brodovich H和Tsui LC(1998)，“气管内和静脉内给予脂质体-DNA复合物以进行囊性纤维化肺基因治疗的比较”(Comparisonbetween intratracheal and intravenous administration of liposome-DNA complexesfor cystic fibrosis lung gene therapy)，Gene Ther 5：181-188。
Hoffman J，LarmO，Scholander E(1983)，“将肝磷脂和其他粘多糖共价偶联到含有伯氨基的物质上的新方法”(A new method for covalent coupling ofheparin and other glycosaminoglycans to substances containing primary aminogroups)，Carbohydr.Res.117：328-331。
Hudde T，Rayner SA，Comer RM，Weber M，Isaacs JD，Waldmann H，LarkinDF和George AJ(1999)，“活性聚酰胺型胺树状聚体，一种将基因转移到角膜内皮细胞的非病毒载体”(Activated polyamidoaminc dendrimers，a non-viralvector for gene transfer to the corneal endothelium)，Gene Ther 6：939-943。
Illum L(1998)，“脱乙酰壳多糖及其作为药物赋形剂的用途”(Chitosanand its use as a pharmaceutical excipient)，Plzarm Res 15：1326-1331。
Kollen W，Midoux P，Erbacher P，Yip A，Roche AC，Monsigny M，Glick MC和Scanlin T(1996)，“葡糖酰化和糖基化多赖氨酸作为将基因转移到囊性纤维化气管上皮细胞的载体”(Gluconoylated and glycosylated polylysine asvectors for gene transfer into cystic fibrosis airway epithelial cells)，Human GeneTherapy 7：1577-1586。
Kollen W，Mulberg AE，Wei X，Sugita M，Raghuram V，Wang J，Foskett J，Glick M和Scanlin T(1999)，“使用乳糖基化多赖氨酸作为载体，将囊性纤维化跨膜转导调节eDNA高效转移到培养中的囊性纤维化气管细胞中”(High-efficiency transfer of cystic fibrosis transmembrane conductance regulatorcDNA into cystic fibrosis airway cells in culture using lactosylated polylysine as avector)，Human Gene Therapy 10：615-622。
Koping-Hoggard M，Melnikova，Y.，Varum K.M.，Lindman，B.和Artursson，P.(2001)，“作为基因送递系统的脱乙酰壳多糖polyplexes，基于超分子形状的结构-活性关系的表征”(Chitosan polyplexes as a gene delivery system，Characterization of structure-activity relationships from supramolecular shape.Submitted)。
Koping-Hoggard M，Tubulekas I，Guan H，Edwards K，Nilsson M，Varum K和Artursson P(2001)，“脱乙酰壳多糖作为非病毒基因送递系统，与聚氮丙啶的体外以及体内给予肺后的结构-性能关系和特征比较”(Chitosan as anonviral gene delivery system.Structure-property relationships and characteristicscompared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo)，Gene Ther 8：1108-1121。
Kurita K.(2001)，“多糖壳多糖的受控功能化”(Controlled functionalizationof the polysaccharide chitin)，Prog.Polym.Sci.26：1921-1971。
Ledley FD(1996)，“肉体基因治疗的药物途径”(Pharmaceutical approachto somatic gene therapy)，Pharm Res 13：1595-1614。
LiS和Huang L(1997)，“经由静脉内给予阳离子脂质-精蛋白-DNA(LPD)复合物进行的体内基因转移”(In vivo gene transfer via intravenousadministration of cationic lipid-protamine-DNA(LPD)complexes“，Gene Then4：891-900。
LiS，Tan Y，Viroonchatapan E，Pitt BR和Huang L(2000)，“通过抗-PECAM抗体将靶定基因送递到肺部内皮细胞”(Targeted gene delivery topulmonary endothelium by anti-PECAM antibody)，Am JPhysiol Lung Cell MolPhysiol 278：L504-511。
Luo D和Saltzman WM(2000)，“合成的DNA送递系统”，(SyntheticDNA delivery systems)，Nat Biotechnol 18：33-37。
MacLaughlin FC，Mumper RJ，Wang J，Tagliaferri JM，Gill I，Hinchcliffe M和Rolland AP(1998)，“脱乙酰壳多糖和解聚的脱乙酰壳多糖寡聚物作为浓缩载体，用于体内质粒送递”(Chitosan and depolymerized chitosan oligomersas condensing carriers for in vivo plasmid delivery[In Process Citation])，JControlled Release 56：259-272。
Mumper RJ，Duguid JG，Anwer K，Barron MK，Nitta H和Rolland AP(1996)，“聚乙烯衍生物作为新颖的交互式聚合物，用于向肌肉进行受控的基因送递”(Polyvinyl derivatives as novel interactive polymers for controlledgene delivery to muscle)，Phare Res 13：701-709。
Mumper RJ，Wang J，Klakamp SL，Nitta H，Anwer K，Tagliaferri F和RollandAP(1998)，“用于增强大鼠骨骼肌中的质粒分布和表达的保护性交互式非浓缩(PINC)聚合物”(Protective interactive noncondensing(PINC)polymersfor enhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle)，J ControlRelease 52：191-203。
Ottoy(1996)Carbohydrate Polymers 31：253-261。
Plank C，Tang MX，Wolfe AR和Szoka FC，Jr.(1999)，“用于基因送递的分支阳离子肽：各种类型和数量的阳离子残基在DNA polyplexes的形成和体外活性的作用”(Branched cationic peptides for gene delivery：role of type andnumber of cationic residues in formation and in vitro activity of DNApolyplexes)，[排版错误出现在Hum Gene Ther 1999年9月1日；10(13)：2272]。
Hum Gene Ther 10：319-332。
Putnam D，Gentry CA，Pack DW和Langer R(2001)，“通过一侧链末端的独特的平衡而得到具有低细胞毒性的基于聚合物的基因送递”(Polymer-based gene delivery with low cytotoxicity by a unique balance of side-chaintermini)，Proc Natl Acad Sci USA 98：1200-1205。
Roy K，Mao HQ，Huang SK和Leong KW(1999)，“口服脱乙酰壳多糖-DNA纳米颗粒的基因送递在花生敏感的鼠模型中产生免疫保护”(Oral genedelivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in amurine model ofpeanut allergy)，Nat Med 4：387-391。
Saeki Y，Matsumoto N，Nakano Y，Mori M，Awai K和Kaneda Y(1997)，“与HVJ(Sendai病毒)偶联的阳离子脂质体的开发和表征：用于体外和体内基因送递的阳离子脂质的相互作用”(Development and characterization ofcationic liposomes conjugated with HVJ(Sendai virus)：reciprocal effect ofcationic lipid for in vitro and in vivo gene transfer)，Hum Gene Ther 8：2133-2141。
Sato T，Ishii T和Okahata Y(2001)，“脱乙酰壳多糖介导的体外基因送递，pH、血清和脱乙酰壳多糖的分子量对转染效率的影响”(In vitro genedelivery mediated by chitosan.effect of pH，serum，and molecular mass of chitosanon the transfection efficiency)，Biomaterials 22：2075-2080。
Song YK，Liu F，Chu S和Liu D(1997)，“通过静脉内给予的阳离子脂质体介导的体内基因转移的表征”(Characterization of cationic liposome-mediated gene transfer in vivo by intravenous administration)，Hum Gene Ther 8：1585-1594。
C.Tanford(1961)，“大分子的物理化学”(Physical chemistry ofmacromolecules)，John Wiley和Sons，New York，8b和33a章)。
Thanou M，Florea BI，Geldof M，Junginger HE，Borchard G.(2002)，“四级化的脱乙酰壳多糖寡聚物作为上皮细胞系的新的基因送递载体”
(Quarternized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial celllines)，Biomaterials23：153-159。
Tommeraas K，Varum KM，Christensen BE和Smidsrod O(2001)，“用亚硝酸对脱乙酰壳多糖进行解聚所得的寡糖的制备和表征”(Preparation andcharacterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation ofchitosans)，Carbohydr Res 333：137-144。
Tommeraas，K.，M.Kping-Hgg rd，K.M.Varum，B.E.Christensen，P.Artursson和O.Smidsrod(2002)，“具有寡糖支链的脱乙酰壳多糖的制备和表征”(Preparation and characterisation of chitosans with oligosaccharidebranches)，Submitted Carbohydrate Research。
Varum KM，Anthonsen MW，Grasdalen H和Smidsrod O(1991)，“采用高电场NMR光谱对部分N-去乙酰化的壳多糖(脱乙酰壳多糖)测定N-乙酰化程度和N乙酰基的分布”(Determination ofthe degree of N-acetylation andthe distribution of N-acetyl groups in partially N-deacetylated chitins(chitosans)by high-field n.m.r.spectroscopy)，Carbohydr Res 211：17-23。
Varum，KM，Ottoy，MH和Smidsrod，O(2001)，“脱乙酰壳多糖的酸水解”(Acid hydrolysis of chitosans)，Carbohydr.Polym.46：89-98。
Wolff JA，Malone RW，Williams P，Chong W，Acsadi G，Jani A和Felgner PL(1990)，“直接将基因转入小鼠体内肌肉”(Direct gene transfer into mousemuscle in vivo)，Science 247：1465-1468。
Yalpani M和Hall DH(1984)，“多糖修饰的一些化学和解析方面.3.支链的形成，可溶的脱乙酰壳多糖衍生物”(Some chemical and analytical aspectsof polysaccharide modifications.3.Formation of branchcd-chain，soluble chitosanderivatives)，Macromolecules 17：272-281。

Claims (23)

1.一种组合物，它含有：
a)核酸；和
b)含有共价连接于其氨基的支链基的脱乙酰壳多糖，其中所述支链选白以下基团：具有2个或多个碳原子的烷基、单糖、寡糖或多糖。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖的N-乙酰基-D-葡糖胺残基的分数(FA)为0-0.70、较佳为0-0.35、更佳为0-0.10、最佳为0-0.01。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖的重均聚合度(DPw)是2-2500、较佳是3-250、更佳是4-50。
4.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述脱乙酰壳多糖的1-60％、较佳2-40％、最佳3-20％的D葡糖胺残基携带支链基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述支链在所述氨基与羰基化合物支链基之间形成席夫碱的反应中获得，该反应如下：
Figure A038123480002C1
式中N代表连接于脱乙酰壳多糖的葡糖胺残基的C-2的N原子；R1和R2各自独立表示氢原子，或R1表示氢原子、R2表示任选取代的直链或支链饱和或未饱和的至多达10个碳原子的烃基，或者R1和R2各自独立表示任选取代的直链或支链饱和或未饱和的具有达10个碳原子的烃基；或者该羰基化合物表示单糖、寡糖或多糖；有可能的是，该席夫碱产物被还原，得到下式化合物：
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述羰基化合物是乙醛，
其中R1代表氢原子，R2代表乙基。
7.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述羰基化合物是单糖D-葡萄糖。
8.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4连接的D-葡糖胺残基与在还原端的2，5-脱水-D-甘露糖组成的寡聚物，具有下式：
Figure A038123480003C1
式中n表示非末端残基的数目，为0-100、较佳0-10、最佳0-3，此寡聚物的FA任选在0-0.5的范围内。
9.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4连接的N-乙酰基-D-葡糖胺残基与在还原端的2，5-脱水-D甘露糖形成的寡糖，具有下式：
Figure A038123480003C2
式中n表示非末端残基的数目，为0-100、较佳0-10、最佳0-3。
10.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4连接的N-乙酰基-D-葡糖胺残基与N-乙酰基-D-葡糖胺形成的寡聚物，具有下式：
Figure A038123480004C1
其中H，OH代表还原端的α-或β-端基异构体，中n表示非末端残基的数目，为0-100、较佳0-10、最佳0-3。
11.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述羰基化合物是由1→4连接的D-葡糖胺形成的寡聚物，具有下式：
Figure A038123480004C2
其中，H，OH代表还原端的α-或β-端基异构体，中n表示非末端残基的数目，为0-100、较佳0-10、最佳0-3，此寡聚物的FA任选在0-0.5的范围内。
12.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物基本上具有净正电荷比。
13.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH为3.5-8.0。
14.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述核酸包括编码序列，在所述核酸被导入宿主细胞时该编码序列将表达其功能。
15.如前述任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述核酸选自DNA和RNA分子。
16.一种制备前述任一项权利要求所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)将权利要求1(b)所述的支化脱乙酰壳多糖暴露于水性溶剂中；
(b)将步骤(a)所得的水性溶液与水性溶剂中的所述核酸混合；和
(c)减少步骤(b)所获得的产物溶液的体积，获得所需的组合物浓度。
17.一种向哺乳动物给予核酸的方法，其特征在于，使用前述任一项所述的组合物，将其导入所述哺乳动物中。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，通过肺部、鼻、口腔、颊、舌下、直肠和阴道途径向粘膜组织引入从而向哺乳动物给予所述组合物。
19.如权利要求17所述的方法，通过肠胃外途径，即静脉内、肌肉内、皮内、皮下或心脏内给药向粘膜下组织，或者通过内部器官、血管或手术中暴露的其他机体表面或腔室给予哺乳动物所述组合物。
20.如权利要求17所述的方法，前述任一项权利要求所述的组合物使得所述核酸能在所述哺乳动物中发挥其功能。
21.权利要求1-15所述的组合物作为哺乳动物预防性或治疗性药剂的用途。
22.权利要求21所述的组合物在恶性肿瘤、自身免疫疾病、遗传病、致病性感染以及其他病理性疾病的基因治疗、反义治疗或遗传接种以进行预防性或治疗性治疗中的用途。
23.权利要求1-15所述的组合物作为体外或体内诊断剂的用途。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978444A (zh) * 2016-01-15 2017-07-25 江苏命码生物科技有限公司 一种向细胞中导入核酸的方法
CN109364244A (zh) * 2012-10-29 2019-02-22 阿肯色大学评议会 新的黏膜佐剂和递送系统

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040016013A1 (en) * 2002-07-18 2004-01-22 Gonzalo Hortelano Transgenic animals produced using oral administration of a genetic agent coupled to a transporting agent
JPWO2006030730A1 (ja) * 2004-09-15 2008-05-15 大塚製薬株式会社 経粘膜用組成物、及び経粘膜吸収の向上方法
KR100718077B1 (ko) * 2005-09-12 2007-05-14 재단법인서울대학교산학협력재단 만노스화 키토산 유도체 및 이를 이용한 유전자 전달체
US8846102B2 (en) 2006-03-30 2014-09-30 Engene, Inc. Non-viral compositions and methods for transfecting gut cells in vivo
CN100577688C (zh) * 2006-04-19 2010-01-06 中国科学院化学研究所 超支化壳聚糖或超支化乙二醇壳聚糖及其制备方法
WO2008031899A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Fmc Biopolymer As Oligonucleotide non-viral delivery systems
KR100825519B1 (ko) * 2007-01-05 2008-04-25 주식회사 바이오폴리메드 키토산 기재 고분자 접합체 및 그 제조방법
US20100329993A1 (en) 2007-06-29 2010-12-30 Hiroyuki Yoneyama Method of fixing and expressing physiologically active substance
BRPI0817725A2 (pt) 2007-09-28 2017-05-16 Engene Inc composoção, método para concentrar poliplexos quitosano-ácido nucleico, dispersão concentrada de poliplexos quitosano-ácido nucleico, composoção farmacêutica, e, método para laterar o diâmentro de poliplexos quitosano-ácido nucleico
CA2794923A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-07 Engene, Inc. Highly acidic chitosan-nucleic acid polyplex compositions
CA2820236C (en) 2012-06-15 2022-07-19 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Non-viral nanoparticle-based delivery system

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316007B1 (en) * 1995-04-04 2001-11-13 Wound Healing Of Oklahoma Combined physical and immunotherapy for cancer
US6184037B1 (en) * 1996-05-17 2001-02-06 Genemedicine, Inc. Chitosan related compositions and methods for delivery of nucleic acids and oligonucleotides into a cell
JP2000514440A (ja) * 1996-07-09 2000-10-31 ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー 遺伝子輸送システム
GB9713980D0 (en) * 1997-07-03 1997-09-10 Danbiosyst Uk New conjugates

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109364244A (zh) * 2012-10-29 2019-02-22 阿肯色大学评议会 新的黏膜佐剂和递送系统
CN109364244B (zh) * 2012-10-29 2022-04-29 阿肯色大学评议会 黏膜佐剂和递送系统
CN106978444A (zh) * 2016-01-15 2017-07-25 江苏命码生物科技有限公司 一种向细胞中导入核酸的方法
CN106978444B (zh) * 2016-01-15 2021-12-17 江苏命码生物科技有限公司 一种向细胞中导入核酸的方法

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