CN1643142A - 鉴定控制分化的基因的方法 - Google Patents

Abstract

描述了负责基于表达克隆的细胞分化的遗传因子的鉴定方法。为确定那一种遗传因子导致细胞从起始细胞类型分化成靶细胞类型，获得了一种cDNA文库，将其包装在表达载体中并转化入起始细胞类型的细胞。表达载体还优选包括一种标记基因系统，所述系统在靶细胞类型的组织类型中可操作的组织特异性启动子的控制下。然后培养转化的细胞直到细胞分化开始，然后筛选或选择培养物以鉴定分化成靶细胞类型的细胞。通过检测分化细胞中的cDNA插入物可鉴定负责分化过程的遗传因子。

Description

鉴定控制分化的基因的方法

相关申请的相互参照

本发明要求2002年3月15日提交的美国临时专利申请序列号60/365,359的优先权。

关于联邦资助研究或开发的声明

不适用。

发明背景

现代细胞生物学包括多种在体外操作活生物体的各种细胞的技术。一种特别重要且使人感兴趣的细胞培养是干细胞。干细胞是未分化的或仅部分分化的细胞，它具有分化成多种祖细胞类型的能力。术语“干细胞”可用来指一种细胞类型，这种类型在较大生物体中是一类细胞类型的祖先，如造血干细胞，或可指所有未分化的干细胞，至少在理论上，这种细胞能够分化入整个生物体的身体的任何组织。已从各种组织和在很多不同动物中进行了干细胞培养。

最近已经能够产生、培养和保持灵长类胚胎干细胞的培养物，包括人胚胎干细胞。例如，参见授予Thomson的美国专利5,843,780和6,200,806。灵长类胚胎干细胞是最初由取自胚胎的细胞产生的、在培养物中无限存活的干细胞培养物，并由能够分化成灵长类身体的主要组织类型的细胞构成。灵长类胚胎干细胞可在培养物中保持未分化状态，或者可开始分化过程，通过此过程细胞指定用于一种或另一种发育的细胞谱系。通常，干细胞分化成不同组织类型开始于胚胎样小体的形成，这使得胚胎样小体中的干细胞开始分化成胚胎样小体的不同部位中的不同细胞类型。事实上，使人胚胎干细胞维持在未分化状态需要小心注意培养条件，如果培养条件不正确，细胞将会自发开始不受控制的分化。

干细胞的发育所赋予的一个备受瞩目的研究领域是开始试图了解那种基因或因子使未分化的细胞开始分化成定向细胞谱系。理论上，当干细胞大部分起始分化时，一个遗传因子打开或关闭从而使干细胞开始表达一些基因而不是其它基因，从而定向到一种特定细胞谱系。鉴定负责这种起始分化步骤的遗传因子并非是无关紧要的问题。然而在科学上，这种研究对于了解活生物体的最初发育是重要的。

可能在干细胞和造成分化第一个步骤的细胞之间进行比较RNA分析，并鉴定在子代细胞中产生了何种在干细胞中未产生的RNA。采用比较RNA表达研究可能知道，当细胞定向到特定谱系时，与其产生的未分化的干细胞相比，哪个基因被打开。然而，具有被打开的基因目录对于从作为该过程的结果被打开的大量基因中区别引发该过程的一个或多个基因没有帮助。事实上，采用比较RNA分析来识别引发分化过程的基因将十分困难或不实用，这是因为无需大量产生胞内因子，如转录因子，以在细胞分化中有发生变化的作用。还没有已被证实用来鉴定负责原代细胞分化的因子的方法。

发明概述

本发明总结了负责细胞由起始细胞类型分化成靶细胞类型的细胞因子的鉴定方法。该方法开始于通过使用cDNA文库随机克隆表达的基因，所述cDNA来自靶细胞类型。所述cDNA基因被转移到对起始细胞类型的细胞有效的表达载体。所述表达载体被转移到起始细胞，然后培养细胞以使其分化成靶细胞类型。鉴定那些已经分化成所需靶细胞类型的细胞，优选使用可选择标记。然后从分化的细胞回收DNA，并分析该DNA以确定那种插入的cDNA造成了向靶细胞类型的分化。用这种方法就可鉴定出负责特定单细胞分化的细胞因子。

本发明的一个目的是提供一种鉴定负责原代细胞分化的因子的方法。

本发明的一个特征是可以鉴定负责从人胚胎干细胞开始的细胞分化最初阶段的遗传因子。

通过以下详述将了解本发明的其它目的、优点和特征。

附图简述

图1和2例举了适合用于本发明方法的载体。

发明详述

本发明试图鉴定负责未分化细胞最初分化成分化或部分分化细胞的基因或遗传因子。这里描述的方法还可用来鉴定使最初分化的细胞进一步分化成体内各种细胞谱系的基因或遗传因子。所述方法，这里称为表达克隆(expression cloning)，采用置于表达载体并被插入感兴趣的未分化细胞的基因表达文库。然后使未分化的细胞分化。然后鉴定已经分化成有特殊兴趣的细胞类型的那些细胞。靶细胞一旦被鉴定，就可使用常规的DN鉴定技术来鉴别使分化的细胞分化成感兴趣的细胞类型的cDNA种类。

本发明可鉴定负责细胞分化的第一阶段的遗传因子，即鉴定那些使大多数未分化的细胞、多能干细胞开始分化入身体各种组织的过程的因子。尤其是使用人干细胞，有可有使用此方法确定哪种遗传因子引起干细胞开始分化成各种最终形成人体的所有细胞的细胞谱系。由于本方法的技术和细节可以用于人胚胎干细胞，可预计该方法可用于培养物中许多细胞类型的多个分化阶段，从一开始的未分化的细胞到最终分化的靶细胞类型。术语“人未分化的干细胞”在这里指具有人胚胎干细胞发育潜能的细胞，特别包括衍生自其它来源的细胞，如人胚胎种系细胞和衍生自成熟或成体的干细胞。

因此，本发明的方法开始于选择起始细胞类型，如未分化的细胞类型，和靶细胞类型，如经历从干细胞到一些其它细胞类型的前体的分化步骤的细胞。出于举例的目的，假定靶细胞类型是定向到神经细胞谱系的细胞，但其它未分化的细胞类型在这里是指神经前体细胞。

所述方法的下一步是从细胞中选择表达基因的文库。有两种方法可实现此目的，建立文库或使用参考文库。通常，当需要收集指导基因表达的核酸时，可以使用或建立所述组织、细胞或生物体的cDNA文库。cDNA文库通常由mRNA制成，所述mRNA存在于靶细胞类型谱系的细胞中，且最适合由靶细胞类型本身制成。其它选择是使用参考文库收集。例如，正在美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes ofHealth)的指导下进行合作科学研究以建立称为哺乳动物基因收集(MGC)的基因收集。MGC是一种限定的基因表达文库，它将克服使用由单个实验或研究制成的mRNA文库的一些限制。MGC将包括小鼠和人cDNA文库的全长转录物的克隆、标识符和序列。使用参考文库的克隆组可确保克隆是全长的，并避免与实验创建的mRNA文库有关的两个常见问题。这两个问题是，mRNA文库有助于重复表达在用来建立文库的细胞中表达高丰度基因以及文库中的克隆通常不是全长的。通常，由于能够更好的代表cDNA种类和全长的克隆成员，预计使用表达基因的参考文库通常将更加有效和优选。使用参考文库还可以鉴定克隆或基因的亚组，优选地检测所需的基因种类，如转录调节物，优选于其它基因或者限制必需产生的克隆的数目。因此，仍以神经前体细胞为例，用任一方法建立了cDNA文库以代表mRNA种类，所述mRNA种类存在于最终分化的神经细胞、神经前体细胞或定位在这两者之间谱系内的任何细胞中。

尽管本方法可用来检测负责分化的基因，它也可反方向使用。如果起始细胞是分化的细胞而靶细胞是未分化的干细胞，所述方法可用来鉴定控制细胞状态为干细胞的基因。

然后将cDNA文库种类克隆入能够在灵长类未分化干细胞中表达的表达载体。当其关闭时，许多哺乳动物基因表达载体在干细胞中无法良好工作。因此，对表达载体的选择是一个临界参数，这将在下面详细讨论。

表达载体不仅包括在转染的干细胞中表达的cDNA种类，而且包括可用来检测成功转化体的标记基因系统。需要这种标记系统来鉴定来自干细胞培养物的已经历所需分化步骤的细胞，这可从下面的讨论中了解。标记基因系统可包括可筛选的标记，它可用来筛选转化体细胞，或可选择标记，该标记是选择转化体的选择剂并可鉴定表达标记基因的转化体细胞。对于可筛选标记，如绿色荧光蛋白基因，该基因可在表达细胞上发出荧光，筛选细胞培养物用于检测表型如细胞荧光的表达。对于可选择标记，如抗生素抗性基因，将细胞培养物暴露于选择剂，如抗生素，该选择剂对表达可选择标记基因的细胞以外的所有细胞有毒性，而表达该基因的细胞表现出抗生素抗性。使用这种标记系统是基因转化操作中的常规方法，且标记的许多其它类型和例子是本领域已知的。

同样优选的是，所述标记系统受控于对靶细胞的细胞类型特异的组织特异性启动子。例如，如果用可选择抗生素抗性基因来识别负责分化成神经前体细胞的基因，所述抗生素抗性基因或许在组织特异性启动子的控制下，该启动子只表达它在神经细胞中所控制的基因。这样，只有当转化入标记的细胞分化成靶细胞类型时该标记才被表达。

因此，所述方法如下。产生cDNA文库并克隆入表达载体系统。将该表达载体(包括cDNA文库和标记系统)转化入该细胞类型的细胞。然后培养起始细胞类型的培养物。优选该培养物不含适合细胞分化的其它条件。事实上，优选该步骤的细胞培养物有利于细胞保持未分化状态。这样，只有当插入并表达的cDNA存在时才会分化的细胞将实际上发生分化。分化的细胞可用多种方法检测。一种方法仅检测与所需分化步骤一致的细胞形态变化。优选的方法是使用标记系统，该标记系统包含在用于此目的的表达载体中。该标记系统用来检测然后表达标记系统的细胞，表明驱动标记系统的组织特异性启动子已经开始驱动表达。这说明细胞已经分化成靶细胞。此时，应该确定被转化入这种特定细胞的cDNA种类或负责从起始细胞类型分化成靶细胞类型的细胞。现在有必要鉴定这是何种cDNA。

接下来的步骤通过PCR反应最容易进行。表达载体前面已经描述过，这样围绕cDNA区段的载体中5’和3’侧翼区是已知的。因此可从分化的细胞回收DNA，并在回收的DNA上进行PCR，PCR引物选自cDNA插入物的任一侧上表达载体中的侧翼区。PCR产物是从一个引物延伸到另一个引物的扩增的DNA，该延伸越过cDNA插入物。通过测序PCR反应产物的DNA，可确定引起细胞分化的cDNA插入物的DNA序列。假设细胞仅被一种表达载体转化，这表明当此单一cDNA编码的蛋白质在未分化的细胞中表达时，可使该细胞向靶细胞类型分化。换言之，该方法可鉴定负责细胞谱系分化的一个步骤的单个遗传因子。

注意到该方法需要筛选多个克隆以发现与分化事件有关的克隆。由于筛选大量克隆很繁重，再需注意的是，使用良好定义的文库会使整个过程更有效。在实验室制备的文库中，全长克隆的数目是可以改变的。由于筛选在这里是相对稀少的事件，越是将文库限制在仅包括感兴趣的基因，搜索感兴趣基因就越短。用非随机文库或定义文库就可以从文库成员数目为可管理数目的文库开始。例如，目前认为人类基因组仅含有约50,000个开发阅读框。例如，如果更加严格地限制文库中的克隆为仅包括参与转录控制的种类，数目可进一步减少。

如前所述，这种表达克隆技术需要使用在未分化细胞类型中工作的克隆载体。关于人胚胎干细胞的研究，发现适合在人胚胎干细胞中表达外源基因的表达载体并非是无关紧要的任务。大多数在哺乳动物细胞中有用的表达载体不以任何合理的效率程度在人胚胎干细胞中工作。已经发现两种可以在人胚胎干细胞中表达外源基因的表达载体。这两种载体是基于EB病毒的表达载体和慢病毒表达载体。

EB病毒(EBV)表达载体是基于市售的表达载体。EBV含有一个约172kb的基因组并以一种多拷贝的环状附加体维持于转化的细胞染色体之外。该附加体随细胞复制并精确分配到子细胞中。已经发现EBV载体能够将含有插入的DNA构建物的附加体转移到人胚胎干细胞中，它然后在转化的干细胞中精确地表达。基于EBV的表达载体的其它信息收录在本申请文件的附录1中。

慢病毒载体基于包括人免疫缺陷病毒(HIV)在内的逆转录病毒家族。已经证实慢病毒载体对于转化人胚胎干细胞有效。所述慢病毒基因组含有所有逆转录病毒所共有的结构基因(gag、pol和env)，此外还含有两个调节基因(tat和rev)和四个辅助基因(vpr、vif、vpu和nef)。这四个辅助基因在复制和体内发病机制中发挥作用并可从慢病毒载体中除去，尽管其中一些对一些细胞类型的表达载体功能有益。在考虑用于本发明所述方法的慢病毒载体中，质粒载体被用来在包装细胞系中表达gag、pol、tat和rev，但基因的完整拷贝被从转移到入细胞系的实际转移表达载体中除去。逆转录病毒的向性主要由env蛋白决定，该蛋白结合特定的细胞表面受体。因此，缺少合适细胞表面受体的细胞难以被慢病毒转化。为了将最广的可能向性授于表达载体，用水泡性口炎病毒(VSV)G糖蛋白对慢病毒载体进行假型处理。VSV-G与细胞膜的磷脂组分直接相互作用，从而通过与细胞膜融合而介导病毒进入细胞。VSV-G可替代逆转录病毒中的env蛋白以产生具有非常广的向性的杂交假型病毒颗粒。表达载体可衍生自含有HIV的顺式作用序列的载体用于包装、逆转录和整合。这些序列包括5’LTR、前导序列和5’剪切供体位点，gag基因约360个碱基对，以及防止gag序列翻译的限制性内切酶移码突变，含有Rev效应元件(RRE)以用于核输出的env基因的700个碱基对，3’剪切受体位点和HIV 3’LTR。为降低病毒序列对受控于内部启动子的基因表达的可能的干扰效应，所有载体还包含3’HIV LTR的U3区域的400个碱基对缺失。在随后的基因组整合中，由于这种序列在逆转录期间被拷贝到5’LTR，5’LTR启动子/增强子在整合入宿主基因组之后被非功能化。经过这种修饰的载体有时被称为自失活。

慢病毒载体可感染非分裂细胞，这是对此目的被认为是重要的。慢病毒载体感染非分化细胞的能力是通过gag、pol和vpr基因的基因产物介导的。最近鉴别了另一种与核输入有关的元件是存在于pol编码区内的顺式决定子，称为中央嘌呤束(central purine tract)(cPPT)。由于这个原因，cPPT区域将被掺入本发明的慢病毒载体中用于本发明。由于慢病毒随机整合入基因组，整合位置效应有助于在整合后不久载体的转录沉默和表达多样性和还有助于表达的消失。

为构建实际的慢病毒载体，我们从作为礼物来自Robert Hawley，American RedCross，Rockville，Md的慢病毒载体pSIN-EF-EGFP开始。为修饰载体以用于人胚胎干细胞，修饰该载体以减小构建物的大小并使重组更加有效。为简化亚序列克隆步骤，用BamHI消化从载体中除去GFP盒，并重新结合载体，重新连接载体，重新连接的载体称为pSIN-EF-del。为减小载体的大小，从NcoI位点(8990)到HpaI位点(202)删去1909个碱基对以制备称为pSIN-EF-del2的载体。这将载体的大小从10659个碱基对减小到8750个碱基对。然后将GATEWAY(Invitrogen，Life Sciences，Carlsbad，CA)载体转化盒B加入原始载体中4082个碱基对处的SmaI位点以制备称为pSIN-EF-de12-GATEWAY的载体。该载体现在被用来将单个克隆、克隆组或整个文库直接转移到用于过度表达研究的慢病毒载体。该载体在图1中说明且其序列包含在SEQ：ID：NO：1中。

已推进了基于EBV的载体的发展。EBV载体获自威斯康星大学(the Universityof Wisconsin)的William Sugden实验室。为修饰所得载体(p2300)以用于人胚胎干细胞，将启动子由CMV启动子变换成EF1α启动子。此外，加入多接头以制备易于用常规的连接介导的克隆(ligation-mediated cloning)步骤操作的载体。此外，在载体中加入GATEWAY盒以使载体与重组系统相容。

为产生这些变化，我们从用下面的引物JS1和JS2扩增绿色荧光蛋白(GFP)的基因开始，所述引物含有多个限制性位点。PCR产物用NotI和ClaI消化并克隆入p2300的NotI/ClaI位点。所得质粒称为pJMS001。然后用下面的引物JS5和JS7扩增EF1α启动子，产物用SmaI和EcoRI消化，所得片段连接入pJMS001的NruI/EcoRI位点。所得质粒称为pJMS002。pJMS002然后用EcoRI和BamHI切割，用T4-DNA聚合酶平端。GATEWAY盒B被连接入该质粒，得到称为pJMS002-GATEWAY的质粒。这种载体适合用于本文所述的方法，它在图2中说明，其序列示于SEQ：ID：NO：2。

引物列表

JSI：GCATCGATTTCGAAGAATTCCACCGGTCGCCACCATGGTG

JS2：AAAAGGAAAAGCGGCCGCCTCGAGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCC

JS5：CGGCCCGGGGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC

JS7：GGCGAATTCGAACTCGAGACCACGTGTTCACGACACC

                    序列表

<110>J.A.汤姆森(Thomson，James)

<120>鉴定控制分化的基因的方法

<130>960296.98822

<140>10/000,000

<141>2003-03-14

<150>60/365,359

<151>2002-03-15

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>10463

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：载体

<400>1

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 60

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 120

tcttatcatg tctggatcaa ctggataact caagctaacc aaaatcatcc caaacttccc 180

accccatacc ctattaccac tgccaattac ctgtggtttc atttactcta aacctgtgat 240

tcctctgaat tattttcatt ttaaagaaat tgtatttgtt aaatatgtac tacaaactta 300

gtagttggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat atccttgatc tgtggatcta 360

ccacacacaa ggctacttcc ctgattagca gaactacaca ccagggccag gggtcagata 420

tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt gagccagata aggtagaaga 480

ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg agcctgcatg ggatggatga 540

cccggagaga gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc ctagcatttc atcacgtggc 600

ccgagagctg catccggagt acttcaagaa ctgctgatat cgagcttgct acaagggact 660

ttccgctggg gactttccag ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt ggcgagccct 720

cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 780

tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 840

tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 900

ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga acagggactt 960

gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg 1020

cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg 1080

ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa ttagatcgcg 1140

atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa aacatatagt 1200

atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct ggcctgttag aaacatcaga 1260

aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact  1320

tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga tagagataaa  1380

agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaccaccgc  1440

acagcaagcg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac aattggagaa  1500

gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg  1560

caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg  1620

ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc aatgacgctg acggtacagg  1680

ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg  1740

cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagaatcc  1800

tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg gatttggggt tgctctggaa  1860

aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tctctggaac  1920

agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct  1980

taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat  2040

tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt  2100

atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg tttaagaata gtttttgctg  2160

tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc  2220

tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag  2280

acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcgccac aaatggcagt  2340

attcatccac aattttaaaa gaaagggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat  2400

agtagacata atagcaacag acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat  2460

tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag cagagatcca ctttggatcg ataagctttg  2520

caaagatgga taaagtttta aacagagagg aatctttgca gctaatggac cttctaggtc  2580

ttgaaaggag tgggaattgg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca  2640

gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc  2700

ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga  2760

gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc  2820

agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc  2880

ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg ctgcagtacg tgattcttga tcccgagctt  2940

cgggttggaa gtgggtggga gagttcgagg ccttgcgctt aaggagcccc ttcgcctcgt  3000

gcttgagttg aggcctggcc tgggcgctgg ggccgccgcg tgcgaatctg gtggcacctt  3060

cgcgcctgtc tcgctgcttt cgataagtct ctagccattt aaaatttttg atgacctgct  3120

gcgacgcttt ttttctggca agatagtctt gtaaatgcgg gccaagatct gcacactggt  3180

atttcggttt ttggggccgc gggcggcgac ggggcccgtg cgtcccagcg cacatgttcg  3240

gcgaggcggg gcctgcgagc gcggccaccg agaatcggac gggggtagtc tcaagctggc  3300

cggcctgctc tggtgcctgg cctcgcgccg ccgtgtatcg ccccgccctg ggcggcaagg  3360

ctggcccggt cggcaccagt tgcgtgagcg gaaagatggc cgcttcccgg ccctgctgca  3420

gggagctcaa aatggaggac gcggcgctcg ggagagcggg cgggtgagtc acccacacaa  3480

aggaaaaggg cctttccgtc ctcagccgtc gcttcatgtg actccacgga gtaccgggcg  3540

ccgtccaggc acctcgatta gttctcgagc ttttggagta cgtcgtcttt aggttggggg  3600

gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac actgagtggg tggagactga agttaggcca  3660

gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa tttgcccttt ttgagtttgg atcttggttc  3720

attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt ttttttcttc catttcaggt gtcgtgagga  3780

attcgatatc aagcttatcg atagatctgt cgactaaatt ctgcagtcga cggtaccgcg  3840

ggatcaacaa gtttgtacaa aaaagctgaa cgagaaacgt aaaatgatat aaatatcaat  3900

atattaaatt agattttgca taaaaaacag actacataat actgtaaaac acaacatatc  3960

cagtcactat ggcggccgca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt  4020

ataatgtgtg gattttgagt taggatccgg cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa  4080

tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac  4140

attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata 4200

ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc 4260

acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg 4320

agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa 4380

cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt 4440

cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga 4500

atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg 4560

ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg 4620

acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg 4680

tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaaa 4740

gatctggatc cggcttacta aaagccagat aacagtatgc gtatttgcgc gctgattttt 4800

gcggtataag aatatatact gatatgtata cccgaagtat gtcaaaaaga ggtgtgctat 4860

gaagcagcgt attacagtga cagttgacag cgacagctat cagttgctca aggcatatat 4920

gatgtcaata tctccggtct ggtaagcaca accatgcaga atgaagcccg tcgtctgcgt 4980

gccgaacgct ggaaagcgga aaatcaggaa gggatggctg aggtcgcccg gtttattgaa 5040

atgaacggct cttttgctga cgagaacagg gactggtgaa atgcagttta aggtttacac 5100

ctataaaaga gagagccgtt atcgtctgtt tgtggatgta cagagtgata ttattgacac 5160

gcccgggcga cggatggtga tccccctggc cagtgcacgt ctgctgtcag ataaagtctc 5220

ccgtgaactt tacccggtgg tgcatatcgg ggatgaaagc tggcgcatga tgaccaccga 5280

tatggccagt gtgccggtct ccgttatcgg ggaagaagtg gctgatctca gccaccgcga 5340

aaatgacatc aaaaacgcca ttaacctgat gttctgggga atataaatgt caggctccct 5400

tatacacagc cagtctgcag gtcgaccata gtgactggat atgttgtgtt ttacagtatt 5460

atgtagtctg ttttttatgc aaaatctaat ttaatatatt gatatttata tcattttacg 5520

tttctcgttc agctttcttg tacaaagtgg ttgatcccgg gatccctcga gacctagaaa 5580

aacatggagc aatcacaagt agcaatacag cagctaccaa tgctgattgt gcctggctag 5640

aagcacaaga ggaggaggag gtgggttttc cagtcacacc tcaggtacct ttaagaccaa 5700

tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag 5760

ggctaattca ctcccaacga agacaagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt 5820

tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 5880

aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 5940

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat 6000

gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagaggc 6060

cttgacatta taatagattt agcaggaatt gaactaggag tggagcacac aggcaaagct 6120

gcagaagtac ttggaagaag ccaccagaga tactcacgat tctgcacata cctggctaat 6180

cccagatcct aaggattaca ttaagtttac taacatttat ataatgattt atagtttaaa 6240

gtataaactt atctaattta ctattctgac agatattaat taatcctcaa atatcataag 6300

agatgattac tattatcccc atttaacaca agaggaaact gagagggaaa gatgttgaag 6360

taattttccc acaattacag catccgttag ttacgactct atgatcttct gacacaaatt 6420

ccatttactc ctcaccctat gactcagtcg aatatatcaa agttatggac attatgctaa 6480

gtaacaaatt acccttttat atagtaaata ctgagtagat tgagagaaga aattgtttgc 6540

aaacctgaat agcttcaaga agaagagaag tgaggataag aataacagtt gtcatttaac 6600

aagttttaac aagtaacttg gttagaaagg gattcaaatg cataaagcaa gggataaatt 6660

tttctggcaa caagactata caatataacc ttaaatatga cttcaaataa ttgttggaac 6720

ttgataaaac taattaaata ttattgaaga ttatcaatat tataaatgta atttactttt 6780

aaaaagggaa catagaaatg tgtatcatta gagtagaaaa caatccttat tatcacaatt 6840

tgtcaaaaca agtttgttat taacacaagt agaatactgc attcaattaa gttgactgca 6900

gattttgtgt tttgttaaaa ttagaaagag ataacaacaa tttgaattat tgaaagtaac 6960

atgtaaatag ttctacatac gttcttttga catcttgttc aatcattgat cgaagttctt 7020

tatcttggaa gaatttgttc caaagactct gaaataagga aaacaatcta ttatatagtc 7080

tcacaccttt gttttacttt tagtgatttc aatttaataa tgtaaatggt taaaatttat 7140

tcttctctga gatcatttca cattgcagat agaaaacctg agactggggt aatttttatt 7200

aaaatctaat ttaatctcag aaacacatct ttattctaac atcaattttt ccagtttgat 7260

attatcatat aaagtcagcc ttcctcatct gcaggttcca caacaaaaat ccaaccaact 7320

gtggatcaaa aatattggga aaaaattaaa aatagcaata caacaataaa aaaatacaaa 7380

tcagaaaaac agcacagtat aacaacttta tttagcattt acaatctatt aggtattata 7440

agtaatctag aattaattcc gtgtattcta tagtgtcacc taaatcgtat gtgtatgata 7500

cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt tctaacgaca atatgtacaa gcctaattgt 7560

gtagcatctg gcttactgaa gcagacccta tcatctctct cgtaaactgc cgtcagagtc 7620

ggtttggttg gacgaacctt ctgagtttct ggtaacgccg tcccgcaccc ggaaatggtc 7680

agcgaaccaa tcagcagggt catcgctagc cagatcctct acgccggacg catcgtggcc 7740

ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg 7800

gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca 7860

ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg 7920

gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag 7980

ggagagcgtc gaatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 8040

gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 8100

cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 8160

atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt 8220

catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 8280

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 8340

ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 8400

cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 8460

ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 8520

tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 8580

cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 8640

actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 8700

aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 8760

tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 8820

ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 8880

tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 8940

gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 9000

gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 9060

tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 9120

gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat g180

ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 9240

gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 9300

aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 9360

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 9420

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 9480

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 9540

gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 9600

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 9660

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 9720

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 9780

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 9840

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 9900

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 9960

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 10020

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 10080

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 10140

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 10200

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 10260

ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 10320

gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 10380

ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 10440

cccagttccg cccattctcc gcc                                         10463

<210>2

<211>9249

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：载体

<400>2

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcggg ggtgaggctc cggtgcccgt cgtgaggctc 240

cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg 300

ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt 360

cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt 420

cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg 480

tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc 540

cacctggctc cagtacgtga ttcttgatcc cgagctggag ccaggggcgg gccttgcgct 600

ttaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc 660

gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 720

taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 780

ggccaggatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt 840

gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga 900

cgggggtcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc 960

cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag 1020

cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct 1080

cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaagg ggcctttccg tcctcagccg 1140

tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat tagttctgga 1200

gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc 1260

acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg 1320

aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa 1380

gtttttttct tccatttcag gtgtcaagaa cacatggtct cgagttcatc aacaagtttg 1440

tacaaaaaag ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt aaattagatt 1500

ttgcataaaa aacagactac ataatactgt aaaacacaac atatccagtc actatggcgg 1560

ccgcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat gtgtggattt 1620

tgagttagga tccggcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca 1680

ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc 1740

agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa 1800

agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc 1860

tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg 1920

atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct 1980

ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt 2040

gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct 2100

cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact 2160

tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc 2220

cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta 2280

atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaaagatct ggatccggct 2340

tactaaaagc cagataacag tatgcgtatt tgcgcgctga tttttgcggt ataagaatat 2400

atactgatat gtatacccga agtatgtcaa aaagaggtgt gctatgaagc agcgtattac 2460

agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt gctcaaggca tatatgatgt caatatctcc 2520

ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa gcccgtcgtc tgcgtgccga acgctggaaa 2580

gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc gcccggttta ttgaaatgaa cggctctttt 2640

gctgacgaga acagggactg gtgaaatgca gtttaaggtt tacacctata aaagagagag 2700

ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt gacacgcccg ggcgacggat 2760

ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg aactttaccc 2820

ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc accgatatgg ccagtgtgcc 2880

ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg acatcaaaaa 2940

cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc tcccttatac acagccagtc 3000

tgcaggtcga ccatagtgac tggatatgtt gtgttttaca gtattatgta gtctgttttt 3060

tatgcaaaat ctaatttaat atattgatat ttatatcatt ttacgtttct cgttcagctt 3120

tcttgtacaa agtggttgat tccctcgagg cggccgcggg cgccagtgtg ctggaattaa 3180

ttcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac 3240

ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 3300

ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 3360

aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 3420

tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac tgcaggtcga gcatgcatct 3480

agggcggcca attccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 3540

tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg 3600

gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 3660

cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 3720

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 3780

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 3840

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 3900

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 3960

atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 4020

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca 4080

acccacaagg agacgacctt ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg 4140

cgacgacgtc ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac 4200

gcgccacacc gtcgacccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt 4260

cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt 4320

ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc 4380

gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct 4440

ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga 4500

ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg 4560

cgccggggtg cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg 4620

gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga gtgcccgaag gaccgcgcga cctggtgcat 4680

gacccgcaag cccggtgcct gacgcccgcc ccacgacccg cagcgcccga ccgaaaggag 4740

cgcacgaccc catggctccg accgaagccg acccgggcgg ccccgccgac cccgcacccg 4800

cccccgaggc ccaccgactc tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 4860

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 4920

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 4980

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 5040

catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctcg 5100

accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac 5160

tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgcctgg 5220

ccggggtccc ccggaaactc ggccgtggtg accatgcagg aaaaggacaa gcagcgaaaa 5280

ttcacgcccc cttgggaggt ggcggcatat gcaaaggata gcactcccac tctactactg 5340

ggtatcatat gctgactgta tatgcatgag gatagcatat gctacccgga tacagattag 5400

gatagcatat actacccaga tatagattag gatagcatat gctacccaga tatagattag 5460

gatagcctat gctacccaga tataaattag gatagcatat actacccaga tatagattag 5520

gatagcatat gctacccaga tatagattag gatagcctat gctacccaga tatagattag 5580

gatagcatat gctacccaga tatagattag gatagcatat gctatccaga tatttgggta 5640

gtatatgcta cccagatata aattaggata gcatatacta ccctaatctc tattaggata 5700

gcatatgcta cccggataca gattaggata gcatatacta cccagatata gattaggata 5760

gcatatgcta cccagatata gattaggata gcctatgcta cccagatata aattaggata 5820

gcatatacta cccagatata gattaggata gcatatgcta cccagatata gattaggata 5880

gcctatgcta cccagatata gattaggata gcatatgcta tccagatatt tgggtagtat 5940

atgctaccca tggcaacatt agcccaccgt gctctcagcg acctcgtgaa tatgaggacc 6000

aacaaccctg tgcttggcgc tcaggcgcaa gtgtgtgtaa tttgtcctcc agatcgcagc 6060

aatcgcgccc ctatcttggc ccgcccacct acttatgcag gtattccccg gggtgccatt 6120

agtggttttg tgggcaagtg gtttgaccgc agtggttagc ggggttacaa tcagccaagt 6180

tattacaccc ttattttaca gtccaaaacc gcagggcggc gtgtgggggc tgacgcgtgc 6240

ccccactcca caatttcaaa aaaaagagtg gccacttgtc tttgtttatg ggccccattg 6300

gcgtggagcc ccgtttaatt ttcgggggtg ttagagacaa ccagtggagt ccgctgctgt 6360

cggcgtccac tctctttccc cttgttacaa atagagtgta acaacatggt tcacctgtct 6420

tggtccctgc ctgggacaca tcttaataac cccagtatca tattgcacta ggattatgtg 6480

ttgcccatag ccataaattc gtgtgagatg gacatccagt ctttacggct tgtccccacc 6540

ccatggattt ctattgttaa agatattcag aatgtttcat tcctacacta gtatttattg 6600

cccaaggggt ttgtgagggt tatattggtg tcatagcaca atgccaccac tgaacccccc 6660

gtccaaattt tattctgggg gcgtcacctg aaaccttgtt ttcgagcacc tcacatacac 6720

cttactgttc acaactcagc agttattcta ttagctaaac gaaggagaat gaagaagcag 6780

gcgaagattc aggagagttc actgcccgct ccttgatctt cagccactgc ccttgtgact 6840

aaaatggttc actaccctcg tggaatcctg accccatgta aataaaaccg tgacagctca 6900

tggggtggga gatatcgctg ttccttagga cccttttact aaccctaatt cgatagcata 6960

tgcttcccgt tgggtaacat atgctattga attagggtta gtctggatag tatatactac 7020

tacccgggaa gcatatgcta cccgtttagg gttataccgt cgacctctag ctagagcttg 7080

gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 7140

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 7200

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 7260

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 7320

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 7380

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 7440

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 7500

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 7560

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 7620

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 7680

ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 7740

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 7800

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 7860

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 7920

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 7980

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 8040

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 8100

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 8160

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 8220

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 8280

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 8340

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 8400

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 8460

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 8520

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 8580

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 8640

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 8700

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagtact gcataattct 8760

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 8820

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 8880

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 8940

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 9000

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 9060

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 9120

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 9180

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 9240

cctgacgtc                                                         9249

Claims (12)

1.一种鉴定负责由起始细胞分化成靶细胞的遗传因子的方法，所述方法包括以下步骤：

获得代表在靶细胞类型中表达的基因的cDNA文库；

将所述cDNA文库的拷贝置于将在起始细胞类型中表达的表达载体；

将该表达载体转化入起始细胞类型的细胞；

培养起始细胞类型的细胞直到至少一些细胞分化；

在培养的细胞中鉴定至少一种已分化成靶细胞类型的细胞；以及

在已经分化的细胞中鉴定cDNA以鉴定负责细胞分化的遗传因子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述起始细胞类型是人未分化的干细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自EBV载体和慢病毒载体。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述起始细胞还包括一种在组织特异性启动子控制下的标记系统，该启动子使标记系统在靶细胞类型中特异表达，且其中所述鉴定至少一种细胞的步骤通过鉴定细胞表达标记系统进行。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标记系统是可选择标记。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴定cDNA的步骤通过对从分化细胞回收的DNA进行PCR进行。

7.一种负责从起始细胞分化成靶细胞的遗传因子的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

在靶细胞类型的谱系中，从细胞的mRNA中制备cDNA文库；

将所述cDNA文库的拷贝置于将在起始细胞类型中表达的表达载体；

将该表达载体转化入起始细胞类型的细胞；

培养起始细胞类型的细胞直到至少一些细胞分化；

在培养的细胞中鉴定至少一种已分化成靶细胞类型的细胞；以及

在已经分化的细胞中鉴定cDNA以鉴定负责细胞分化的遗传因子。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述起始细胞类型是人未分化的干细胞。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自EBV载体和慢病毒载体。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述起始细胞包括一种在组织特异性启动子控制下的标记系统，该启动子使标记系统在靶细胞类型中特异表达，且其中所述鉴定至少一种细胞的步骤通过鉴定细胞表达标记系统进行。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述标记系统是可选择标记。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述鉴定cDNA的步骤通过对从分化细胞回收的DNA进行PCR进行。