CN1630662A - 兔出血性疾病疫苗及抗原 - Google Patents

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Abstract

使用一种基于李痘病毒(PPV)的病毒载体可在植物中获得兔出血性疾病病毒(RHDV)的VP60结构抗原或其片段，该载体包含一个启动子、一个重组DNA序列以及一个克隆载体，该重组DNA序列包含有PPV病毒基因组的全长cDNA和编码RHDV的VP60蛋白或其片段的DNA序列，该序列插入于该PPV病毒编码NIb和CP蛋白的核苷酸序列之间。所获得的抗原能够在兔中诱导抗RHDV的致死侵袭的保护，并且可被用作抗兔出血性疾病病毒的重组亚基疫苗。

Description

兔出血性疾病疫苗及抗原
发明领域
本发明涉及到在植物中进行的对来自兔出血性疾病病毒的结构抗原VP60或其片段的生产以及这些抗原作为一种抗兔出血性疾病病毒的重组亚基疫苗的应用，这些抗原的生产使用一种基于李痘病毒的病毒载体。
发明背景
兔出血性疾病(RHD)是成年动物的一种急性致死的感染。被感染的兔通常在感染后48到72小时内死于坏死性肝炎。该疾病的致病物兔出血性疾病病毒(RHDV)为嵌杯状病毒科的一个成员(Ohlinger etal.，1990.J.Virol 64，3331-3336；Parra & Prieto，1990.J Virol64，4013-4015)。
由于目前没有允许所述的病毒进行复制的容许稳定细胞系，等抗RHD的现有疫苗产生自经实验感染RHDV的SPF兔的脾脏或肝脏等。近年来，VP60，RHDV的主要结构蛋白，已经在多种异源系统中进行了生产(Bárcena et al.，2000.J.Virol 74，1114-1123；Bertagnoliet al.，1996.J Virol 70，5061-5066；Boga et al.，1994.J GenVirol 75，2409-2413；Boga et al.，1997.J Gen Virol 78，2315-2318；Fischer et al.，1997.Vaccine 15，90-96；Laurentet al.，1994.J Virol 68，6794-6798；Marín et al.，1995.VirusResearch 39，119-128；Nagesha et al.，1995，Arch Virol 140，1095-1108；Plana-Durán et al.，1996.Arch Virol 141，1423-36；Sibilia et al.，1995.J Virol 69，5812-5815)，包括在转基因植物中进行的生产(
Figure A0181813300041
et al.，1999.J Virol 73，4452-4455)。在所有的情况下，所获得的重组的VP60蛋白质经显示能够保护兔免受RHDV的致死性侵袭。
目前，植物实验着眼于开发用于产生目的生物疫苗的新系统。植物提供了多个相对于其它表达系统的优势。特别地，它们提供了一种安全、简便并且经济的手段用于在无需昂贵的扩大设备的情况下获得目的蛋白，并且它们可以替代被消耗的传统作物。特别具有利益的是通过植物进行的具有药学价值的蛋白和可被用作为亚基疫苗的蛋白质的生产。
在植物中生产目的分子主要有两种策略：(i)对植物核基因组的遗传转化以产生转基因植物，以及(ii)对植物病毒基因组的操作(Arntzen，1997.Nat Biotechnol 15，221-222)。后一策略提供的优势允许植物在其发育周期的特定点产生相对较大量的所需产物，并且病毒原种可在不经植物传代的情况下长时间保持。
一些系统已被开发用于通过DNA基因组病毒和RNA基因组病毒表达异源蛋白(Scholthof et al.，1996.Ann Rev Phytopathol 34，299-323)。在本发明的开发中，我们使用了一种PPV-NK表达载体。这种载体构建自一种李痘病毒PPV(Fernández-Fernández，DoctoralDissertation “Plum pox virus as an expression vector inplants.”Department of Molecular Biology.College of Sciences.University of Madrid(April 1999))并且该载体是西班牙专利申请No.P9900698(Fernández-Fernández et al.，1999)的对象，该申请描述了一种重组DNA的构建，该DNA包含有PPV病毒基因组的cDNA，一个插入于NIb和CP蛋白的编码序列之间的外源序列，以及两种限制性酶(NaeI和KpnI)的识别靶点，并且该载体可用于一种异源蛋白表达载体在植物体内的构建。
该PPV病毒为感染植物的马铃薯y病毒组的一个成员。螺旋状的PPV毒粒由一个被2,000以上个拷贝的单壳体蛋白(CP)包围的信使RNA分子组成(Riechmann et al.，1992.J Gen Virol 73，1-16)。该RNA分子在其5’-末端共价连接有一种称作VPg的病毒蛋白并在3’-末端具有一个聚腺苷酸尾。该多病毒基因组的表达策略包括翻译成为一种大型多蛋白，该蛋白由病毒蛋白酶进行加工以得到最终的病毒蛋白产物。
发明概述
总体上，本发明涉及到提供一种抗兔出血性疾病病毒的重组疫苗的问题，特别是生产一种可被用作为抗所述的疾病的疫苗的抗原。
本发明所提供的解决方案基于RHDV VP60结构抗原或其片段在植物中的生产，该生产使用一种基于PPV病毒的病毒载体，具体来说是一种PPV-NK表达载体。这些抗原的产生在实施例1中阐示，而所获得的这些抗原在兔体内诱导抗RHDV的致死性侵袭的保护的能力在实施例2中阐示。
基于PPV病毒的载体的应用所遵循的表达策略基于一种多蛋白的产生，该多蛋白随后经病毒蛋白酶的加工而产生最终的病毒蛋白产物，该载体的应用所提供的优势在于所有的蛋白，包括异源蛋白以相同的量进行合成，并且积累水平上的差异完全取决于它们在被感染的植物体内或者植物细胞内的稳定性。
因此，本发明的一个主题是一种方法，该方法用于RHDV VP60结构抗原或其片段在可被PPV病毒感染的植物体内或者植物细胞内的生产；这包括了构建基于PPV病毒的RHDV VP60结构抗原或其片段的表达载体的步骤，该载体包含有编码RHDV VP60抗原或其片段的核苷酸序列，该序列插入于编码PPV病毒的NIb和CP蛋白的核苷酸序列之间。RHDV VP60抗原或其片段的这种基于PPV病毒的表达载体也是本发明的另一个主题。
本发明的另一个额外的主题是一种可被PPV病毒感染的植物题或者植物细胞，该PPV病毒包含所述的基于PPV病毒的RHDV VP60抗原或其片段的表达载体。
本发明的另一个主题为一种抗兔出血性疾病的重组亚基疫苗，该疫苗包含所述的在植物中使用所述的基于PPV病毒的表达载体而获得的RHDV VP60抗原或其片段。所述的重组亚基疫苗的生产过程为本发明的另一个主题。
附图简述
图1所示为使用抗RHDV60蛋白多克隆血清进行的对来自于Nicotiana clevelandii植物的提取物的蛋白印迹测试，该植物被接种以PPV-NK-VP60(泳道1-15)或者野生型的PPV(泳道16)。在泳道3、5、8和14的植物无症状(数据未出示)。在泳道3和8中的条带可能是由于相邻孔内的溢出所致，所使用的分子量标记(BioRad)在该板边侧显示。
发明详述
本发明提供了RHDV VP60抗原或其片段的一种基于PPV病毒的表达载体，称之为本发明的表达载体，该载体包含：
-一个启动子
-一个重组DNA序列，该序列包含有PPV基因组的全长cDNA以及一个编码RHDV VP60蛋白或其片段的DNA序列，该序列插入于编码PPV的蛋白质NIb与CP的核苷酸序列之间，以及
-一种克隆载体
在本说明书中所使用的术语“RHDV VP60抗原(或者蛋白)或其片段”指的是一种蛋白质，该蛋白质包括来自任何一种分离株RHDV的全部或者部分的VP60，该VP60能够与T细胞受体或者抗体进行特异性的结合。在一个特定的实施方案中，所述的蛋白能够激发接受该蛋白给药的动物体内的免疫应答。术语“全长”指的是一种完整基因组序列，并且RHDV VP60的变体在能够激发该免疫应答的情况下被包含于在该定义中，这些变体因氨基酸的添加、取代或者缺失而有别于天然蛋白。
启动子
启动子或者转录启动子序列为一种定位于5’-末端并且直接在PPV病毒的cDNA的1号核苷酸之前的DNA序列，RNA聚合酶同其相结合以起始RNA转录。所述的启动子可能为：
-一种用于cDNA通过相应的RNA聚合酶进行体外转录的适当的启动子，例如噬菌体启动子，如T7噬菌体；或者
-植物中的某种功能基因的启动子，适用于病毒RNA的体内转录，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。
重组DNA序列
重组DNA序列存在于本发明的表达载体中，该DNA序列包含一个PPV病毒基因组的全长cDNA以及一个编码RHDV VP60蛋白或其片段的DNA序列，该序列插入于编码PPV病毒的NIb与CP蛋白质的核苷酸序列之间，以使由所述的RHDV VP60蛋白或其片段的编码序列所编码的产物在相应的宿主中通过形成PPV多蛋白中所述的NIb和CP蛋白之间的部分而表达，同时在病毒蛋白质中不产生任何变化，从而对病毒功能造成尽可能小的干扰。天然的蛋白酶NIa负责将RHDV VP60蛋白或者片段同病毒产物的其余部分相分离。
通过对PPV病毒的全长cDNA克隆进行操作可获得重组DNA序列，该重组DNA序列包含一个PPV病毒基因组的全长cDNA以及一个编码RHDV VP60蛋白或其片段的DNA序列，该序列插入于编码PPV的蛋白质NIb与CP的核苷酸序列之间，所述的PPV病毒全长cDNA根据西班牙专利申请号No.P9800623的描述通过对PPV基因组进行反转录而获得。
为辅助编码RHDV VP60蛋白或者其片段的DNA序列在PPV病毒的cDNA适当位置的插入，来自PPV病毒的全长cDNA克隆可通过传统的遗传工程技术进行操作从而向NIb和CP病毒蛋白的编码核酸序列之间引入一个核苷酸序列，该序列由以下元件组成，这些元件按照以下的次序可操作地连接(根据编码链的5’→3’方向)：
a)一种核苷酸外源序列，该序列选自：
i)一种18个核苷酸的外源序列，该序列组成了NIb蛋白的编码序列的最后18个核苷酸并且该序列编码了来自PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的前6个氨基酸，以及
ii)一种21个核苷酸的外源序列，该序列编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽；
b)一种核苷酸序列，该序列具有第一种限制性酶的单一的识别位点；
c)由至少3个任意类型的核苷酸组成的第二个间隔序列，以便促进该限制性酶的锚定以及增强其效率；以及
d)一种核苷酸序列，该序列具有第二种限制性酶的单一的识别位点。
根据这一建构，在PPV病毒的NIb和CP蛋白的顺反子之间具有两个核苷酸序列，该序列编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽，并且在这两个核苷酸序列之间具有第一种限制性酶的靶点以及第二种限制性酶的靶点，它们均为单一位点。该外源七肽可以是，例如，七肽NVVVHGA，其为PPV的NIa蛋白酶的一个位于PPV的NIb和CP蛋白之间的识别位点。
在一个特定的实施方案中，所述的PPV的NIa蛋白酶的外源识别序列由以下的组合形成(i)18个核苷酸的外源序列，该核苷酸序列构成编码NIb蛋白的最后18个核苷酸并且编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的前6个氨基酸，以及(ii)第一种限制性酶的识别序列的前3个核苷酸，它们编码了所述的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的最后一个氨基酸，而编码所述的PPV的NIa蛋白酶的识别序列的其它核苷酸序列如下形成(i)紧邻于编码CP蛋白的核苷酸序列的18个核苷酸，它们原本对应于编码PPV的NIb蛋白的羧基末端的最后6个氨基酸的最后18个核苷酸，该序列组合于(ii)CP蛋白编码序列的前3个核苷酸，它们编码了所述的PPV的NI a蛋白酶的识别七肽的最后一个氨基酸。
在另一个特定的实施方案中，所述的PPV的NIa蛋白酶的识别序列由所述的21个氨基酸的外源序列形成，该外源序列编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽，而编码所述的PPV的NIa蛋白酶的识别序列的另一个核苷酸序列如下形成(i)紧邻于编码CP蛋白的核苷酸序列的18个核苷酸序列，该序列原本对应于编码PPV的NIb蛋白的羧基末端的最后6个氨基酸的最后18个核苷酸，该序列组合于(ii)CP蛋白编码序列的前3个核苷酸，它们编码了所述的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的最后一个氨基酸。
在本发明的一个特定的和优选的实施方案中，编码PPV的NIa蛋白酶的两种识别序列的核苷酸序列是不同的，并且它们在一个或者多个核苷酸上有所差异，其目的在于防止或者减少同源序列之间的可能的重组现象，该现象可导致编码异源蛋白的核苷酸序列的丢失。在一个特定的实施方案中，所述的核苷酸序列编码位于NIb和CP蛋白之间的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽，并且它们在各个三联体中至少有一个核苷酸的差异。
两种限制性酶识别靶点或者序列向PPV病毒的全长cDNA克隆中的引入允许了编码RHDV VP60蛋白或其片段的的克隆。一般情况下，所述的第一种和第二种限制性酶可为任何限制性酶。在一个特定的实施方案中，第一种限制性酶的靶点为NaeI酶的靶点，该靶点紧邻于编码PPV的NIb蛋白的羧基末端的序列。在另一个特定的实施方案中，第二种限制性酶的靶点为不同于所述的第一种限制性酶的靶点，例如KpnI酶的靶点。
为获得鉴定为pUC18-NK和pICPPV-NK的克隆而进行的对PPV病毒的cDNA全长克隆的操作在先前有所描述(上文给出的Fernández-Fernández，1999)。
克隆载体
克隆载体为一种DNA分子，该分子具有复制起点并因此而能够在适当的细胞中复制。
本发明的表达载体的获得
本发明的表达载体可通过一种过程而获得，该过程包括以限制性酶消化来自PPV病毒的全长cDNA(经操作处理以向编码PPV病毒的NIb和CP蛋白的核苷酸之间引入前述的核苷酸序列a)-d))，该限制性酶的识别位点位于所述的被操作的cDNA克隆之中，该过程还包括将编码RHDV VP60或其片段的序列进行连接并且将所述的PPV的重组DNA序列插入一种克隆载体之中，该重组DNA序列含有RHDV VP60或其片段，该序列任选处于一种适当的启动子的控制之下。
实施例1描述了一种基于PPV病毒的RHDV VP60抗原的表达载体的构建。
本发明还在本发明的一个进一步的程序中提供了一种方法，该方法用于在可被PPV感染的植物体内或者植物细胞内获得RHDV VP60蛋白或其片段，该方法包括：
1)以本发明的表达载体对所述易感于PPV感染的植物体或者植物细胞进行接种；
2)在所述的植物体或者植物细胞内表达处于病毒多蛋白中的所述的RHDV VP60蛋白或其片段；并且，任选，
3)通过对所述的多蛋白进行蛋白水解加工而从病毒多蛋白中分离所述的RHDV VP60蛋白或其片段。
下文给出了一些可被PPV感染的植物种类的非限制性示例清单：
1. 核果：扁桃、P.amygdalo-persica、杏、欧洲甜樱桃、樱桃李、欧洲酸樱桃、P.cistena、欧洲李、圆叶樱桃、梅、桃、黑刺李、毛樱桃、榆叶梅。
2. 草本植物
a)藜科：Chenopodium capitatum、菊叶香藜、球花藜、C.quinoa
b)菊科：绒樱菊、粘毛千里光、欧洲千里光、百日草
c)唇形科：宝盖草、L.purpureum、Galeopsis segetum
d)蝶形花科：Vicia sativa ssp.angustifolia、豌豆
e)西番莲科：Passiflora foetida
f)毛茛科：田野毛茛、R.sardous
g)玄参科：Linaria cymbalaria
h)茄科：假酸浆、Nicotiana affinis、N.auriculata、N.clevelandii、N.debneyi、N.exigua、N.gigantea、N.glutinosa、N.knightiana、N.langsdorfii、N.longiflofa、N.maritima、N.megalosiphon、N.noctiflora、N.nudicaulis、N.paniculata、白花丹叶烟草、烟草、Solanum cornatum、S.luteum、S.miniatum、龙葵、S.nudiflorum、S.rostratum、S.sinaicum、S.sodomaeum、S.villosum、Petunia hyvrida、Physalis  floridana。
以本发明的表达载体对易感于PPV感染的植物或者植物细胞进行的接种可通过任何传统方法实现，例如机械手段或者使用Helios“基因枪”方法(BioRad)，或者以任何其它适用于基因物质向植物内的转移的技术。
在本发明的方法的另一个特定的实施方案中可能使用本发明的一种表达载体，在该载体中，含有编码RHDV VP60或其片段的重组DNA序列处于适当的启动子之下以进行DNA的体外转录，在该情况下使用一种适当的RNA聚合酶来获得该RNA转录物，例如来自T7细菌噬菌体的RNA聚合酶。
如果需要，RHDV VP60蛋白或其片段一旦通过对病毒多蛋白的蛋白水解加工而从中分离便可从培养基中分离，如果需要可以通过传统的方法纯化。
如果完整的植物被用于RHDV VP60蛋白或其片段的产生，本发明的表达载体在优选的情况下应缺失经蚜虫转播的能力以防止所述的重组载体向其它植物的传播。这可通过使昆虫转播所必需的病毒成分失活而实现。例如，在马铃薯y病毒的CP蛋白的氨基末端区域有对于通过蚜虫进行的病毒传播十分关键的氨基酸三联体DAG(天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸)。被称为NAT(非蚜虫传播)的PPV病毒的天然突变体已被描述(Maisset al.，1992.J Gen Virol 73，709-713；López-Moyaet al.，1995.J Gen.Virol 76，2293-2297)。这些突变体在CP蛋白的氨基末端具有15个氨基酸的缺失，包括了将甘氨酸从DAG三联体中去除，该氨基酸对于蚜虫的传播十分关键。来自PPV的完整cDNA具有一种称为pGPPV-NAT的构建体，该构建体中具有一个等价于NAT突变体中的突变(Fernández-Fernández et al.，1998.FEBS Lett.427，229-235)，通过该构建体可合成在植物中感染的转录本，其感染特征与野生转录本相同。在一个特定的实施方案中，为进行本发明的表达载体的大规模应用，所述的载体携带该突变，这将使该载体具有生物安全性。
因此，在特定的实施方案中，存在于本发明的表达载体中的来自PPV的cDNA序列具有一种NAT型的缺失以防止蚜虫将该重组病毒载体向其它植物传播。
一个示例型的非限定实施例描述了来自RHDV的VP60在Nicotiana clevelandii植物中的生产(实施例1)，该植物经表达载体pICPPV-VP60的感染。
本发明还提供了可被PPV感染的植物细胞，这些细胞含有本发明的能够表达RHDV VP60蛋白或其片段的一种表达载体。
本发明还提供了一些可被PPV所感染的植物，这些植物经本发明的表达载体进行接种，该表达载体能够表达并且积累RHDV VP60蛋白或其片段。
通过本发明的方法所获得的结构抗原RHDV VP60或其片段能够在兔体内诱导抵抗RHDV的致死负荷的保护，如实施例2所示。
因此，本发明提供了一种抵抗兔出血性疾病病毒的重组亚基疫苗，该亚基疫苗从此为本发明的疫苗，该疫苗包含有一种治疗有效量的通过本发明的方法过程而获得的RHDV VP60结构抗原或者其片段，该疫苗任选可同一种佐剂和/或一种稀释剂组合。
在一种特定的实施方案中，本发明的疫苗含有佐剂，例如由Marcol-52、Simulsol-5100和Montanide-888的混合物组成的油性佐剂。
本发明的疫苗可以以任何适当的给药方式给予宿主，如兔。在一种特定的实施方案中，将本发明的疫苗给予所述动物是通过胃肠外途径，例如皮下注射而实现的。在另一种特定的实施方案中，将本发明的疫苗给予所述动物是通过口服途径实现的。
本发明的疫苗可以通过包括以下步骤的方法获得：(a)通过本发明的加工过程获得RHDV VP60结构抗原或者其片段，(b)分离一种提取物，该提取物包括含有所述RHDV VP60结构抗原或者其片段的抗原相，并任选(c)将所述抗原相与佐剂和/或稀释剂混合。
通过本发明的加工过程而对RHDV VP60结构抗原或者其片段的获取包括对易感于PPV或者本发明的表达载体的植物或者植物细胞进行接种，在所述的植物或者植物细胞内对所述的RHDV VP60蛋白或者其片段进行表达，该蛋白或者片段包含于病毒多蛋白中，RHDV VP60抗原或者其片段通过对该多蛋白的蛋白水解过程而从该多蛋白中分离。
含有RHDV VP60结构抗原或者其片段的抗原相的分离可通过传统方法而实现，这些方法包括在液体介质中对所述的植物或者细胞部分进行匀浆，该液体介质的例子如一种含水的液体介质，这些方法还包括为获得所述的抗原相而进行的对细胞碎片的分离，该抗原相含有RHDV VP60结构抗原或者其片段。在一个特定的实施方案中，我们对表达RHDV VP60抗原或者其片段的植物叶片或者细胞在存在一种磷酸盐缓冲液(PBS)的情况下进行了匀浆并且通过离心实现了对细胞碎片的分离。我们获得了一种含有RHDV VP60抗原或者其片段的抗原相，其随后同一种油性佐剂进行了混合。
实施例2描述了经作为抗原来源的本发明的表达载体进行感染的植物的制备、疫苗的制剂化以及所述的抗原进行的兔的免疫以及兔的免受RHDV致死负荷的保护。
实施例1
pICPPV-NK-VP60表达载体的构建
1.1. pICPPV-NK-VP60表达载体的构建
使用一种低错误率的聚合酶(ExpandR High-fidelity，Boehringer Mannheim)通过PCR对编码RHDV VP60结构抗原的序列进行了扩增(从一个含有其pUC-VP60序列的质粒中(Rivera Torres，1998，Alternatives to classic vaccination against myxomatosisand hemorrhagic disease in the European rabbit(Oryctotaguscuniculus).In Molecular Biology，Madrid：University ofMadrid)。在扩增中所使用的寡聚脱氧核糖核苷酸的标识为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2。在扩增之后从琼脂糖凝胶中纯化的PCR产物经T4 DNA聚合酶的处理以使该片段的末端钝化，随后以限制性酶KpnI处理该产物，这是由于在扩增中所使用的标识为SEQ ID No.2的寡聚核苷酸在扩增片段末端产生了一个所述的靶位点。我们使用了中间质粒pUC18-NK(上文给出的Fernández-Fernández，1999)以辅助嵌合体构建过程。以限制性酶NaeI和KpnI对该质粒进行了消化，并且在处理之后以经上述处理的含有VP60基因的PCR产物对该质粒进行连接。所产生的质粒称为pUC18-NK-VP60。通过以XhoI酶作为第三种酶而使用三联体连接将pUC18-NK-VP60质粒的EcoRV-KpnI片段引入pICPPV-NK克隆(上文给出的Fernández-Fernández，1999)以产生完全的嵌合体pICPPV-NK-VP60克隆，该克隆保藏于CECT[见微生物保藏部分]。PPV的完整cDNA基因组定位并克隆于pICPPV-NK中，处于花椰菜花叶病毒的启动子35S的控制之下(López-Moya & García，2000.Virus Research 68，99-107)，这允许了在以DNA直接接种的植物中的体内病毒转录物的产生。
1.2. 植物的接种
将存在于构建自pICPPV克隆的质粒(野生型或者突变体)的全长cDNA稀释至浓度250ng/μg，并且以10μl的该稀释物对这些植物进行接种，每植物接种3片叶，事先以金刚砂(碳化硅)对叶片进行了喷洒。或者，可使用Helios“基因枪”(BioRad)方法进行该植物的接种，该接种所使用的量可低至10ng每植物(López-Moya & García，2000，同上文)。
以pICPPV-NK-VP60克隆进行接种的植物受到了感染，感染的过程和症状类似于经野生型pICPPV克隆进行接种的植物。
1.3. 蛋白印迹分析
来自于感染植物的样品经5mM磷酸钠缓冲液，pH7.5的匀浆后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。根据在(García et al.，1992.Virology 188，697-703)中描述的方案，这些样品被转移至硝酸纤维素膜上并且以一种抗RHDV VP60的多克隆抗体进行孵育。所使用的二抗为山羊抗兔IgG，该抗体同过氧化物酶相偶联(Jackson Immunoresearch Laboratories)。以ECLTM试剂盒对该过氧化物酶反应进行显色(Amersham Pharmacia Biotech)。
蛋白VP60在接种后15天(d.p.i.)易于被蛋白印迹测试检出；最高水平的积累达到了21d.p.i.(图1)。15d.p.i.时，通过以抗VP60抗体进行的蛋白印迹测试不能检测出除完整蛋白外的其它条带(数据未出示)，但是，在21d.p.i.条带在抗VP60蛋白印迹测试中很明显，迁移率对应于约38kDa(植物1)、44kDa(植物9)以及46和33kDa(植物15)的截短蛋白(图1)。尽管我们不能排除这些条带中的一些对应于降解蛋白的可能性，但是有可能大多数所述的条带是嵌合基因组的特定不稳定性的结果。通过对病毒cDNA片段中异源基因的部分缺失的检出而证实了该假设，该cDNA片段通过免疫捕获多聚酶链反应而从被感染组织中扩增(数据未出示)。在任何情况下，完整的RHDV VP60蛋白在多数植物体内是主要的形式，这表明该系统有效地表达具有实用的特定大小蛋白的能力。
实施例2
抗RHD的重组亚基疫苗
2.1. 疫苗的制剂化
将来自于经野生型PPV或者PPV-NK-VP60[产生自表达载体pICPPV-NK-VP60的嵌合体(病毒)]感染的植物的叶片在PBS中进行匀浆(以1∶1或者1∶2w/v的比例)并且通过离心除去细胞碎片。将抗原相(叶片提取物)同一种油性佐剂以53∶47(v/w)的比例进行混合直至形成双水/油/水乳液，如此而制剂化成疫苗。油相由Marcol-52、Simusol-5100以及Montanide-888的混合物组成。我们制备了4种不同的基于植物的疫苗。我们将一种灭活的商业疫苗(CYLAP HVD，Fort Dodge Veterinaria)同油性佐剂一起使用以作为实验对照，该疫苗可用于防止兔出血热。这些疫苗通过皮下注射而进行胃肠外给药。
2.2. 以来自经PPV-NK-VP60感染的植物的提取物对兔进行的免 疫，以及对RHDV侵袭的保护
我们研究了RHDV VP60蛋白在RHDV的天然宿主兔中的免疫原性，该蛋白以载体pICPPV-NK-VP60在植物中进行表达。在该抗原的第一次给药27天后通过HI测试分析血清样品中特异性抗体的存在(见表1)(该测试包括兔血清中抗RHDV抗体水平的测定，该测定通过人类红血球凝集抑制试验而进行)。组I(经来自于表达完整蛋白VP60的PPV-NK-VP60感染植物的提取物的接种)中，10只兔中的9只表现出具有不同滴度的特异性VP60抗体，其范围介于1/20到1/320之间。在III组(接种所用的提取物除完整VP60蛋白外还积累了一种约44kDa的缺失形式)中也观察到了类似的抗体滴度。组II(接种所用的植物除完整的VP60蛋白外积累一种38kDa的缺失形式)的4只兔中的3只产生了较低的血清学反应(滴度介于1/20到1/40之间)。在经商业疫苗CYLAP HVD(Fort Dodge Veterinaria)接种的动物体内(组V)，抗体反应较高并且更为均一(动物显示出介于1/320到1/640之间的滴度)。正如预期，以来自于野生PPV感染的植物的提取物进行接种的动物(IV组)和没有接种的对照组(VI组)没有显示出抗RHDV的特异性抗体。初始免疫33天后(D33)，对所有的动物均进行了加强。在第67天(D76)通过HI测试的方法分析抗体滴度并且对这些动物接种以致死的RHDV侵袭。对照组(IV和VI)保持阴性，而在其它接种组中血清学的反应提高。以CYLAD HVD和完整VP60蛋白进行接种的组中(组V和I)再次检测出了最高的滴度，随后是以还积累VP60蛋白的缺失形式的植物进行接种的组(组III好于组II)。
侵袭是充分的，这是因为在以野生型PPV病毒感染的植物进行接种的组以及未接种的组中RHDV造成的死亡率为100％，并且在它们的肝脏中检测到了RHDV(表1)。在以毒性RHDV进行的实验性感染期间，除一只外其它所有的对照组IV和VI的动物在侵袭后3天内死亡(另一只此后5天死去)，而在以CYLAD HVD(组V)或者以PPV-NK-VP60感染的植物进行接种(组I、II和III)的动物体中未观察到临床症状。侵袭两周之后，存活的动物被放血并且杀死。总体上，根据HI测试的测定，存活动物体内的抗体滴度在侵袭两周之后变高(表1)。在存活动物的肝脏内未检测到RHDV病毒。因此，我们可以得出结论，以只表达完整形式VP60蛋白或者同时还表达缺失形式的VP60的植物提取物进行接种的动物发展出一种特异性体液免疫应答并且受到保护免于遭受RHDV的致死侵袭。
结论
1.RHDV VP60结构蛋白已经在PPV-NK表达载体中表达，该载体在编码PPV的蛋白NIb和CP的顺反子之间表达了编码所述的目的蛋白的序列。
2.嵌合体PPV-NK-VP60与野生病毒具有相同的感染特征。
3.以来自于经PPV-NK-VP60嵌合体感染的植物的提取物对兔进行的免疫(RHDV天然宿主)在它们体内诱导出一种特异性的并且有效的抗RHDV的抗体反应。这些动物被保护不受RHDV的致死侵袭。
表1抗RHDV及致死侵袭的抗体滴度结果
  组a   动物号No.          HI滴度c              侵袭结果
    D21b     D67   死亡     HI滴度DY+15 肝脏样品中的HA滴度d
组IPPV-NK-VP60(完整VP60，植物2+4+6+7+11+13)     818     1/320     1/2560     S     1/10240     ＜2
    821     1/160     1/2560     S     1/5120     ＜2
    822     1/80     1/640     S     1/2560     ＜2
    823     1/80     1/1280     S     1/5120     ＜2
    826     1/20     1/640     S     1/5120     ＜2
    827     1/20     1/320     S     1/160     ＜2
    831     ＜1/20     1/1280     S     1/2560     ＜2
    834     1/40     1/160     S     1/2560     ＜2
    837     1/80     1/640     S     1/5120     ＜2
    897     1/160     1/5120     S     1/2560     ＜2
组IIPPV-NK-VP60Δ1(完整以及～38kDa的缺失形式的VP60，植物1)     845     1/40     1/320     S     1/5120     ＜2
    846     ＜1/20     1/160     S     1/1280     ＜2
    847     1/40     1/320     S     1/640     ＜2
    848     1/20     1/320     S     1/1280     ＜2
组IIIPPV-NK-VP60Δ9(完整以及～44kDa的缺失形式的VP60，植物9)     839     1/20     1/320     S     1/640     ＜2
    840     1/320     1/1280     S     1/5120     ＜2
    842     1/20     1/640     S     1/10240     ＜2
    844     1/40     1/640     S     1/2560     ＜2
组IVPPV-wt(无插入，植物16)     900     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
    809     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
    813     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
    816     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
组VCYLAP HVD(FortDodge疫苗)     851     1/320     1/5 120     S     1/10240     ＜2
    853     1/320     1/2560     S     1/5120     ＜2
    854     1/640     1/2560     S     1/10240     ＜2
    855     1/320     1/640     S     1/10240     ＜2
组VI对照(未接种)     804     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
    824     ＜1/20     1/20     DY+3     ≥4096
    825     ＜1/20     1/20     DY+3     ≥4096
    863     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
    864     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
    866     ＜1/20     ＜1/20     DY+3     ≥4096
a这些植物根据图1进行编号
b这些兔在第0天(D0)被接种，在第27天被放血(D27)。它们在第33天(D33)被加强接种，在第67天(D67)被再度放血，并且在同一天(DY)被侵袭。存活的动物(S)在侵袭后两周(DY+15)被放血并且宰杀。
cHI测试：抗RHDV的抗体在兔血清中的水平通过人类红血球凝集抑制测试进行检测。在D0这些兔对于RHDV呈血清阴性(HI滴度＜1/20)。
dHA测试：通过人类红血球凝集测定了RHDV的存在。滴度＜2被视为阴性。
微生物的保藏
含有质粒pICPPV-NK-VP60的大肠杆菌DH5α的细胞在2000年八月8日保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，Burjasot，Valencia(西班牙)，其对应于保藏号CECT5348。
序列表：
(1)  常规信息
(1)  申请人
(1)  名称：BOARD OF SCIENTIFIC RESEARCH
(2)  街道：113 Serrano
(3)  城市：马德里
(4)  省份：马德里
(5)  国别：ES
(6)  邮政编码：28006
(7)  电话：91 585 50 00
(8)  传真：91 441 30 77
(1)  申请人：
(1)  名称：FORT DODGE VETERINARIA，S.A.
(2)  街道：Carretera de Camprodón s/n“La Riba”
(3)  城市：Vall de Bianya
(4)  省份：Girona
(5)  国别：ES
(6)  邮政编码：17813
(7)  电话：972 29 00 01
(8)  传真：972 29 01 02
(2)  发明名称：兔出血性疾病疫苗及抗原
(3)  序列数：2
(4)  SEQ.ID.NO.1的信息：
(1)  序列特征：
(1)  长度：18碱基
(2)  类型：核酸
(3)  链数：单链
(4)  拓扑构型：线性
(2)  分子类型：核酸
(xi)  序列描述：SEQ ID.N0.1：
ATGGAGGGCAAAGCCCGC
(2)  SEQ.ID.NO.2的信息：
(2)  序列特征：
(1)  长度：23碱基
(2)  类型：核酸
(3)  链数：单链
(4)  拓扑构型：线性
(2)  分子类型：核酸
(xi)  序列描述：SEQ ID.NO.2：
CAGGTACCGACATAAGAAAAGCC

Claims (17)

1.兔出血性疾病病毒(RHDV)的VP60抗原或其片段的一种表达载体，该载体基于李痘病毒(PPV)，该载体包含：
一个启动子
一个重组DNA序列，该序列包含PPV病毒基因组的全长cDNA以及一个编码RHDV VP60蛋白或其片段的DNA序列，该序列插入于编码PPV病毒的NIb和CP蛋白蛋白质的核苷酸序列之间，以及
一种克隆载体。
2.权利要求1的载体，其中所述的启动子选自适于通过RNA聚合酶进行cDNA的体外转录的启动子以及适于病毒RNA的体内转录的植物中的功能基因的启动子。
3.权利要求2的载体，其中所述的启动子选自T7噬菌体启动子和花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。
4.权利要求1的载体，其中包含一个NAT突变。
5.一种在可被李痘病毒(PPC)感染的植物或者植物细胞中获取兔出血性疾病病毒(RHDV)的VP60蛋白或其片段的方法，该方法包括：
1)以权利要求1-4中任意一项的基于PPV病毒的RHDV VP60蛋白或其片段的表达载体对易感于PPV感染的所述植物或者植物细胞进行接种；
2)在所述的植物或者植物细胞中表达包含于病毒多蛋白中的所述RHDV VP60蛋白或其片段；并且，任选，
3)通过对所述多蛋白的蛋白水解加工而从病毒多蛋白中分离所述RHDV VP60蛋白或其片段。
6.一种易感于李痘病毒(PPV)感染的植物细胞，其中含有权利要求1-4中任意一项的基于PPV病毒的RHDV VP60蛋白或其片段的表达载体。
7.一种易感于李痘病毒(PPV)感染的植物，其中含有权利要求1-4中任意一项的基于PPV病毒的RHDV VP60蛋白或其片段的表达载体，该植物能够表达并且积累RHDV VP60蛋白或其片段。
8.一种抗兔出血性疾病病毒的重组亚基疫苗，该疫苗包含治疗有效量的通过权利要求5的方法获得的RHDV VP60结构抗原或其片段，任选还包含佐剂和/或稀释剂。
9.权利要求8的疫苗，其包含佐剂。
10.权利要求9的疫苗，其中所述的佐剂为一种由Marcol-52、Simusol-5100以及Montanide-888的混合物组成的油性佐剂。
11.权利要求8的疫苗，该疫苗经制备而用于通过胃肠外途径对RHDV的宿主动物进行给药。
12.权利要求11的疫苗，该疫苗经制备而用于通过皮下途径对RHDV的宿主动物进行给药。
13.权利要求8的疫苗，该疫苗经制备而用于通过口服途径对RHDV的宿主动物进行给药。
14.一种用于获得权利要求8的重组亚基疫苗的方法，该方法包括(a)通过权利要求5的方法获得RHDV VP60结构抗原或其片段，(b)分离包含一种抗原相的提取物，该抗原相含有所述的RHDV VP60结构抗原或其片段，并且任选(c)将所述的抗原相与佐剂和/或稀释剂混合。
15.权利要求14的方法，其中所述的包含一种含有所述RHDV VP60结构抗原或其片段的抗原相的提取物的分离包括，在一种液体介质中对表达RHDV VP60结构抗原或其片段的植物或者植物细胞进行匀浆，并且分离细胞碎片。
16.权利要求15的方法，其中匀浆在一种含水的液体介质中进行。
17.权利要求15的方法，其中所述的细胞碎片的分离通过离心而实现。
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