CN1622823A - 通过分离和渗滤纯化红血细胞 - Google Patents

Abstract

通过分离全血，如通过离心纯化红血细胞，形成红血细胞组分和液体组分。全血可以去纤维化或在分离之前处理预防凝血。优选地，全血是小牛血液。然后，将红血细胞渗滤纯化红血细胞。然后，溶解纯化的红血细胞形成纯化的红血细胞的溶解物。纯化的红血细胞和纯化的红血细胞的溶解物适用于生产血红蛋白血取代物。

Description

通过分离和渗滤纯化红血细胞

发明背景

发展基于红血细胞氧载体的重点已经集中在用于药剂治疗的氧递送，如输血和血液产品的生产。基于红血细胞的氧载体可以用于预防或治疗失血(例如，由于急性出血或在外科手术过程中)，由于贫血(例如，恶性贫血或镰刀型细胞贫血)，或由于休克(例如，容量缺陷休克，过敏性休克，败血性休克或变应性休克)导致的低氧。

现存的基于红血细胞的氧载体包括高氟化学物，合成的红血细胞类似物，脂质体包囊的红血蛋白，化学修饰的红血蛋白，和基于红血蛋白的氧载体，其中红血细胞分子是交联的。基于红血细胞的氧载体的制备包括几个纯化步骤。为了从整个血液中除去血浆蛋白质，利用微过滤的方法洗涤整个血液的细胞。细胞洗涤操作从小牛整个血液中利用渗滤，通过0.2um的微过滤膜，与等渗盐/柠檬酸溶液除去血浆蛋白质。渗滤是连续的过滤操作，其中在过滤滞留物中加入盐/柠檬酸溶液来维持再循环箱中的一个体积。通过滤纸在循环血液溶液中再循环，将含有血浆蛋白质的过滤物丢弃。

利用过滤洗涤血液溶液导致加工时间非常可变，其不利地影响产物流通量。另外，细胞洗涤过程的时间的延长可以导致生物负担的不可接受水平的增长和导致细胞溶解，从而降低过程中的产量。

发明概述

本发明通常涉及纯化用于制造血液取代物的血液细胞的方法。该方法包括分离全血，从而形成红血细胞组分和液体组分。将红血细胞组分渗滤从而形成纯化的红血细胞。然后，可以进一步加工纯化的红血细胞，分离红血细胞分子。

在一个实施方案中，本发明涉及形成用于红血细胞血液取代物的纯化的红血细胞的溶解物。该方法包括，分离全血，从而形成红血细胞组分和液体组分。渗滤红血细胞组分形成纯化的红血细胞。溶解纯化的红血细胞形成纯化的红血细胞的溶解物。

在另一个实施方案中，该方法分包括通过离心分离去纤维化的小牛全血，从而形成红血细胞组分和液体组分。渗滤红血细胞组分从而形成纯化的红血细胞。机械地溶解纯化的红血细胞。

本发明有许多优点。例如，将全血分离成血液细胞组分和液体组分，使得到的红血细胞组分中除去了许多潜在的膜污染物，允许更有效地加工红血细胞组分。具体地说，分离全血形成红血细胞组分和液体组分，然后渗滤红血细胞组分可以缩短通过渗滤或只通过离心得到纯化的红血细胞需要的时间长度。通常，将渗滤红血细胞组分从而形成纯化的红血细胞的需要的时间长度归一化；红血细胞组分的渗滤时期约接近渗滤悬浮的红血细胞的相对纯化的样品需要的时间。得到纯化的血液细胞需要的时间的缩短是用整个血液和脱纤维化的整个血液达到的。降低的或归一化的细胞洗涤方法的时间降低了生物负担和细胞溶解物的不可接受的水平的增长的潜力。依次，不可接受的生物负担和细胞溶解的水平的增长的降低提高了方法的产量。

附图的简要说明

附图是适用于进行本发明的方法的图示。

发明的详细描述

本发明的前面的和其他的目的，特征和优点将在本发明的下面的更具体的优选实施方案的说明中明了，如附图中所述的。附图不一定是按比例的，重点是在于说明本发明的原则。

本发明通常涉及通过分离全血生成红血细胞组分和液体组分来纯化红血细胞的方法。相信潜在的膜污染物可以从得到的红血细胞组分中分离。包括基本的污染物部分和分级分离全血形成的液体部分是从红血细胞组分中分离的，并且然后对红血细胞组分进行渗滤。

参见附图，其中显示的是仪器10，是适用于实施本发明的方法的仪器的一个实施方案。在器皿12中收集全血。适用于本发明中使用的全血可以是新鲜收集的，或从其他现有的来源收集的，如从血液库中支出的人血液。另外，尽管优选地，全血在使用这一方法之前没有冷冻，但全血可以维持在冷冻和/或液体的状态中。适当的全血源的例子包括，人小牛，绵羊，猪和其他脊椎动物，和转基因产生的红血蛋白，如BIO/TECHNOLOGY，12：55-59(1994)中所述的转基因Hb，该文献通过在此引述而全文合并于本文。可以从活的或新鲜屠宰的动物供体收集全血。Rausch等人公开的美国专利号，5,084,558中叙述了收集小牛血液的一个方法，该文献通过在此引述而合并于本文。

在一个实施方案中，通过适当的方法在器皿12中将全血去纤维化。去纤维化可以如Gawryl等人2001年2月28日递交的美国申请号09/795,821中所述来完成，该文献通过在此引述而全文合并于本文。去纤维化血液启动了凝血级联，人工除去了血液凝块的形成中包括的纤维素分子。去纤维化可以通过化学或机械的方法来诱导。化学凝血试剂在本文中确定为诱导凝血的物质。例如，胶原诱导凝血，以致当有外来的伤口时，纤维凝血块将终止血液流动。将血液与胶原人工接触将导致纤维素凝血块的形成，可以除去产生去纤维化血液。其他凝血试剂的例子是组织萃取物，组织因子，组织促凝血酶原激酶，阴离子磷脂，钙，阴性带电荷物质(例如，玻璃，高岭土，一些合成的塑料，纤维)。优选的凝血试剂是胶原。通过从去纤维化的全血分离血液细胞得到的液体部分通常称为“血清”。

全血可以与凝血试剂接触一个足以基本引起血液中的所有纤维素转变成纤维素凝血块的时期。通过纤维素分子明显终止多聚化的点可以确定适当的时间。如本文中确定为去纤维化的化学去纤维化是与化学凝血试剂接触而诱导的，是在适当的温度下进行的，优选地温度范围是约4℃到约40℃。

在另一个实施方案中，机械激化如搅拌也可以用于启动凝血级联。整个血液可以搅拌直到纤维多聚化明显终止。除去积累的纤维素完成去纤维化。通过激化血液溶液诱导的如去纤维化的本文定义的机械去纤维化是在适当的温度中进行的，优选地温度范围是在约4℃到约40℃。

在或选的实施方案中，全血可以被处理来防止凝血。例如，全血可以用抗凝血试剂如柠檬酸钠，肝素，乙二胺四乙酸(EDTA)和草酸钠来处理，利用的浓度足以抑制整个血液的凝固。在一个实施方案中，将5L的柠檬酸钠(34g/l)加入15L的新鲜收集的整个血液产生了整个血液溶液中的最后浓度为8.5g/l的柠檬酸。在另一个实施方案中，在新鲜分离的整个血液中加入EDTA，产生最后的浓度0.18％。通过用抗凝血试剂处理的整个血液分离血液细胞得到的液体组分通常称为“血浆”。

同样可能的对已经被柠檬酸化的血液去纤维素化，如通过用二价阳离子饱和柠檬酸化的血液，然后，去纤维化溶液，方法相似于非柠檬酸化的血液的加工方法。优选的的二价阳离子是钙。

当血液已经处理诱导凝血时，通过适当的方法从全血除去纤维素凝血块。图中显示了适当的方法的例子。诱导纤维素和纤维素凝血块的整个血液是从器皿12，通过14系和滤器16来进行的。60网的筛选器是适当的滤器的例子。或者，替代适用滤器，奶酪布或聚丙烯滤器也可以用于除去大的碎片，包括纤维素凝血块。在滤器16中收集纤维素凝血块，全血的残留物被送往器皿18。

当用抗凝血剂处理血液时，处理的血液可以在离心器27中，通过14系，滤器16，器皿18，系20，泵22，滤器24和滤器26来进行。但是，处理的血液也可以通过14线，滤器16，器皿18，20线，泵22，滤器24和滤器26来进行。抗凝血处理的全血通过滤器16和滤器14和26，可用于除去处理的全血中存在的任何大的碎片。

如图中所示，全血(经过或没有经过诱导凝血处理)是通过泵22从器皿18经过线20，通过第一个滤器24和第二个滤器26离心27来进行的。在一个实施方案中，第一个滤器24和第二个滤器26是聚丙烯滤器。在特别优选的实施方案中，第一个滤器24具有约800um的渗透性，第二个滤器具有约50um的渗透性。当整个血液已经处理启动凝血级联时，通过第一个滤器24和第二个滤器26基本除去所有的纤维因子完成了去纤维化步骤。

在滤器26后，全血，去纤维化或没有的，进行了分离，形成红血细胞组分和液体组分。“分离”也本文中也称为“分级分离”，包括来自血清或血浆的红血细胞的分离形成分开的液体组分，优选地是血清或血浆。如本文所用，分离技术基本上是通过密度来分离的，如通过离心，如从根据大小如渗滤的分离来区别。

如本文所用，“液体组分”包括从全血分离得到的液体，和已经去纤维化的全血的分离得到的液体。在一个实施方案中，液体组分是“血清”，例如从分离去纤维化的全血得到的液体组分。在另一个实施方案中，液体组分是“血浆”，如从分离已经处理防止凝血的全血得到的液体组分。在一个实施方案中，已经用抗凝血剂如柠檬酸钠或肝素处理全血。

在一个实施方案中，在滤器26后，去纤维化或没有去纤维化的全血在离心器27中进行了分离。通常，在离心过程中，全血与G-动力在约1,000和约12,000XG之间的范围内接触，目的是分离全血，从而形成血液细胞组分(血液细胞成分)和液体组分。通常，离心是在约30秒到约4分钟之间的范围内的时间段中进行的。优选地，离心是在约8,000-10,000XG中进行了约3分钟。在分离步骤中的全血的温度通常是在约4到约15℃之间的范围。

在一个实施方案中，红血细胞组分包括全血中的红血细胞和白血细胞，液体组分包括全血的血小板。同样，优选地，红血细胞组分包括全血的大多数红血细胞(RBCs)(例如，至少约90％，或至少约95％，或至少约99％)。

液体组分是基本从红血细胞组分中除去的。通常，液体组分是在离心的同时从红血细胞组分中除去的。在一个实施方案中，液体组分同时在离心过程中利用例如管式碗离心，以连续的饲喂方式连续地除去。在另一个实施方案中，管式碗离心可以批量的方式来使用。在另一个实施方案中，液体组分通过从红血细胞组分中丢弃液体组分，在分离红血细胞组分和液体组分后从红血细胞组分中移去的。

红血细胞组分涉及图中的离心器27到器皿28。红血细胞组分悬浮于器皿28的适当的溶液中(例如，渗滤缓冲液)。适当的等渗溶液是本领域已知的，包括溶液如具有一个pH和渗透摩尔浓度的柠檬酸/盐溶液，这一溶液中没有捕获红血细胞的细胞膜，替代了整个血液的液体部分。优选的等渗溶液具有中性pH和等渗摩尔浓度，在285-315mOsm之间。适当的溶液的一个例子是等渗柠檬酸/盐缓冲液(柠檬酸钠水合物-6.0g/L，氯化钠-8.0g/L)。在或选的实施方案中，红血细胞组分可以再悬浮于任意的适当的等渗溶液，例如5％的葡聚糖中。红血细胞组分可以约20到约200g/L浓度再悬浮。

在一个实施方案中，红血细胞组分悬浮于等渗溶液的体积中，以致恢复了得到红血细胞组分的全血的原始体积。以后将再悬浮的血液细胞组分称为“血液溶液”。

血液溶液维持在适当的温度和器皿28中。优选地，血液溶液维持的温度范围约4℃和约5℃之间。血液溶液的温度在器皿28中是通过在循环适当的培养基如乙二醇，通过瓶子30和器皿28来维持的。通过瓶子30再循环培养基是通过线32，储存器34，泵36，38和冷冻器或冷冻单位40来维持的。

然后，过滤血液溶液，从而纯化红血细胞。优选地，血液溶液是通过渗滤来过滤的。在一个实施方案中，渗滤是通过指导血液溶液从器皿28到线42，和泵44到渗滤单元46来进行的。渗滤单元46包括入口48，滞留出口50和渗透物出口52。膜54从从渗滤单元46的渗透组分58分开了渗滤单元46的滞留物部分56。优选地，膜54具有一个渗透极限，范围是在约0.01um到约5um之间。在一个实施方案中，血液溶液穿过膜渗滤，具有一个渗透极限，范围是在0.2um到约2.0um之间。或选的适当的渗滤器包括微孔膜，孔大小将从基本上更小的血液溶液成分分离RBC，如0.1um到0.5um的滤器(例如，0.2um空的纤维滤器，Microgon Krosflo II微过滤柱，Laguna Hills，CA)。在一个特别优选的实施方案中，膜54具有一个渗透极限范围是在约0.1到约2um。

渗滤单元46中的血液溶液的液体成分的部分从滞留部分56到渗透部分58通过膜54，从而纯化滞留部分56的红血细胞。血液溶液的成分如血浆，或在直径中明显比RBC更小的成分通过渗滤壁形成滤过物。

通过滞留物出口50和线60回到器皿28涉及血液溶液的纯化的红血细胞。通过阀62到线64可以收集纯化的红血细胞用于进一步加工。膜渗透液体成分含有全血(例如，血浆或血清)和渗滤缓冲液的任何残留的液体部分。透过膜54的液体成分可能涉及从渗滤单元46的渗透部分58通过66线，和从器皿68收集。通过器皿28和渗滤单元46的血液溶液的再循环可以在线42或线60中的取样处(未表示出)取样。

优选地，当渗滤血液溶液洗涤红血细胞时，一个液体，如等渗溶液涉及从器皿70到线72，到器皿28中的血液溶液，稀释了血液溶液的浓度。在一个实施方案中，血液溶液稀释到一个浓度，范围在约25％到约75％的最初的红血细胞的悬浮浓度，该百分数是对体积的。然后，在渗滤过程中的浓度可以将体积降低回原始浓度或更高。通常，将液体加入悬浮的红血细胞中，然后除去至少一部分的液体的方法称为“细胞洗涤”。优选地，等渗溶液包括离子溶液，或是水溶液。适当的等渗溶液如上所述。在一个或选的实施方案中，血液通过一系列顺序(或逆顺序)的稀释和浓缩步骤洗涤，其中血液溶液是加入至少一个等渗溶液稀释的，并且是通过流过滤器浓缩的，从而形成透析的血液溶液。

血液溶液的红血细胞通常如上所述洗涤，从保留在红血细胞组分中的残留的细胞外血浆蛋白质如血清白蛋白或抗体(例如，免疫球蛋白(IgG))来分离红血细胞。结果是血液溶液中的微过滤膜渗透种类的量(包括膜可渗透的血浆蛋白质)的量降低了。

当污染了红血细胞的血浆或血清蛋白质的水平已经基本降低时，通常认为细胞洗涤是完全的(通常至少约90％的血浆或血清蛋白质在洗涤之前存在于红血细胞组分中)。其他洗涤可以进一步从RBCs中分离细胞外血浆蛋白质。例如，具有6个体积的等渗溶液的去纤维化可能足以从血液溶液中除去至少约99％的IgG。

本发明的方法降低了可以减慢制造过程的潜在的膜污染物的存在。例如，如果在具有0.1到5um的渗透性的膜表面积累的话，小的纤维素分子可能是问题，可能污染膜滤纸，所以封闭孔。一个污染物可能是问题的狭窄的范围是0.2到0.4um。但是，如实施例4所示，纤维素单独不说明全部的潜在的膜污染物。正如实施例4所示，在3个实验中的2个中，去纤维化的整个血液具有大于100分钟的细胞洗涤过程的时间。但是，从相同体积的去纤维化血液产生的和在等渗缓冲液中稀释到原始体积的红血细胞组分具有45分钟或更少的细胞洗涤时间。

另外，去纤维化可以导致一些红血细胞溶解。已经裂解的红血细胞，白血细胞或血小板可以黏附于滤纸上。确信，从液体组分中分级分离整个血液和分离红血细胞组分除去了明显的这样的潜在的污染物的部分，从而将渗滤需要的时间归一化，或“洗涤”红血细胞纯化他们用于制造血取代物。

为了从纯化的红血细胞制备红血蛋白血液取代物，已洗涤的血液溶液的纯化的红血细胞可以进一步加工分离血球蛋白分子。得到的一洗涤的血液溶液可以用于来自血液细胞和血小板的洗涤血液溶液中如通过离心分离红血液细胞的方法中。可以理解，从其他血液细胞成分分离红血细胞的本领域通常已知的方法是可以利用的。例如，本发明的一个实施方案通过沉降分离了红血细胞，其中分离的方法不捕获RBC的明显量，如少于约5％的RBC的细胞膜，然后从其他血液成分中分离红血细胞。

在从其他已洗涤的红血细胞组分的成分中分离红血细胞后，溶解RBC，导致了产生血球蛋白(Hb)溶液。溶解的方法包括机械溶解，化学溶解，低渗或等渗的溶解或其他已知的溶解方法，在没有损坏Hb的能力的情况下运输和释放氧来释放血球蛋白。

在溶解后，然后将溶解的红血细胞相超滤除去更大的细胞碎片，如分子量在约100,000道尔顿的蛋白质。然后，血球蛋白从过滤物的非Hb成分中分离。

超滤的方法和通过pH梯度和层析从非Hb成分分离Hb的方法另外在通过在此引述而全文合并与本文的美国专利5,691,452中有叙述。

优选地，在聚合化之前图氧化Hb洗脱物形成脱氧化Hb溶液，进一步加工成基于血球蛋白的氧载体。在一个优选的实施方案中，脱氧化基本脱氧化Hb，而没有明显减少Hb洗脱物中的Hb运输和释放氧的能力，如将在氧化血球蛋白(met Hb)的形成中发生的。或者，可以通过用选自包括N-乙基-L-半胱氨酸(NAC)，半胱氨酸，二硫酸钠或抗坏血酸的组的还原剂可以脱氧化血球蛋白溶液。脱氧化的适当的方法在1995年7月7日递交的美国专利号5,895,810中叙述了脱氧化的适当的方法，该专利全文通过在此引述而合并与本文。

脱氧化血球蛋白溶液可以进一步加工成基于氧载体的血球蛋白。如本文定义，“基于血球蛋白的氧载体”是适用于人，哺乳动物，和其他脊椎动物的基于血球蛋白的组合物，能够运输和转移氧到生命的器官和组织中，至少可以维持足够的血管内的癌性压，其中血球蛋白已经从红血细胞中分离。“脊椎动物”包括人，或其他任何在循环系统中利用血液转移氧到组织中的脊椎动物。

“稳定的聚合化血球蛋白”如本文定义，是基于氧载体的组合物的成分，基本不增加或减少分子量的分布，和/或在适当的储存温度的储存时期过程中的高血红蛋白含量约2年或更多。储存一年或更长适当的储存温度在约0℃和约40℃之间。优选的储存温度范围是在0℃到约25℃之间。

适当的低氧环境，或基本无氧的环境定义为在至少两个月的储存时期，优选地至少一年，或更优选地至少月两年的存储时期与基于血球蛋白的样载体结合的氧的积聚的量，这将导致基于高铁血红蛋白的氧载体中高铁血红蛋白浓度至少约15％的重量。氧的积聚的量包括基于血球蛋白的氧载体的原始的氧含量，和除了进入基于血球蛋白的氧载体的包装中的氧渗漏得到的氧以外的包装。

通过这一方法，从RBC回收直到血球蛋白聚合化，血液溶液，RBC和血球蛋白都被维持在足以减少微生物生长，或减少生物负担的条件下，如维持在低于约20℃和在0℃以上的温度的条件下。优选地，温度维持在约15℃或更少。更优选地，温度维持在10±2℃。

在这一方法中，制备稳定聚合的基于血球蛋白的氧载体的方法的成分部分是进行充分的卫生处理产生无菌的产物的。“无菌”特别地是在USP XXII，第71部分，1483-1488页提供的无菌的美国药物要求中，如本领域定义。另外，与该方法的流接触的成分的部分，通常是纤维化的，或用不反应的或污染该方法的层流的物质来分开。这样的物质可以包括不锈钢和其他钢合金，如Hasteloy。

在一个实施方案中，分子内的交联Hb导致了聚合化。硫氢化合物与脱氧Hb的混合的量足够高至能提高聚合过程中分子内的Hb的交联，和足够低至能不明显降低由于高离子强度的Hb分子的分子间的交联。通常，约1mole的硫氢功能基团(-SH)是约0.25mole到约5mole的脱氧Hb之间的氧化稳定所需要的。

或者，在聚合氧化稳定脱氧Hb之前，在聚合反应器中加入适当量的水。在一个实施方案中，适当的水量是将导致产生当在聚合反应器中加入氧化稳定的脱氧Hb时，浓度约10到约100g/lHb的浓度的溶液。优选地，水是氧耗尽的。

在聚合反应器中氧化稳定的脱氧Hb溶液的温度是上升到当与交联剂接触时是氧化稳定的脱氧Hb的聚合化最佳的温度。通常，氧化稳定的脱氧Hb的温度是约25到约45℃，优选地是在聚合化过程中约41到约43℃。加热聚合化反应器的可接受的热转移方法的例子是在瓶子中的热系统，是指导通过瓶子的热乙二醇而加热的。

然后，将氧化稳定脱氧Hb与适当的交联剂接触，接触的温度足以聚合氧化稳定脱氧Hb在约2小时到约6小时的时期中形成聚合的血球蛋白(聚(Hb))的溶液。适当量的交联剂是允许分子内的交联稳定Hb，和允许分子间的交联形成Hb的多聚物，从而增强血管内的滞留的量。通常，适当的交联剂的量是交联剂与Hb的摩尔比例超过约2∶1的量。优选地，交联剂与Hb的摩尔比例是在约20∶1到40∶1之间。

适当的交联剂的例子包括将交联Hb蛋白质的多功能试剂，如戊二醛，琥珀酰二醛，聚氧乙烯和葡聚糖的活化形式，α-羟基乙醛，如甘油乙醛，N马来酰胺-6-氨基己酰基-(2’-硝基，4‘硫酸)-苯基酯，m-马来酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰酯，琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰胺甲基)-环己基-1-羧酸，硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰胺甲基)环己烷-1-羧酸，m-马来酰胺苯甲酸-N-羟基-琥珀酰亚胺酯，m-马来酰胺苯甲酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯，N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙基)氨基苯甲酸，硫代琥珀酰亚胺(4-碘代乙基)氨基苯甲酸，琥珀酰亚胺4-(p-马来亚胺苯基)丁酸，硫代琥珀酰亚胺4-(p-马来亚胺苯基)丁酸，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)羧基二亚胺盐酸，N，N’-苯基二马来亚胺，和属于双亚胺类，乙基二叠氮类，或芳基二卤素类，和其他的化合物。

如果Hb分子的基本部分(至少约50％)是在聚(Hb)中化学结合的，那么聚(Hb)定义为具有明显的分子内交联。

在优选的实施方案中，戊二醛用作交联剂。通常，每kg的氧化稳定的脱氧Hb中利用约10到约70克的戊二醛。更优选地，在5小时的时期加入戊二醛直到每kg的氧化稳定脱氧Hb中加入约29-31g的戊二醛。

当利用的交联剂不是醛时，通常形成的聚(Hb)是稳定的聚(Hb)。当利用的交联剂是醛时，通常形成的聚(Hb)通常是不稳定的直到与适当的还原试剂混合减少了聚(Hb)中的更不稳定的键形成更稳定的键。适当的还原剂的例子包括硼酸钠，氰硼酸钠，连二亚硫酸钠，三甲基胺，t-丁胺，硼酸吗啉，硼酸吡啶。通过超滤或者浓缩聚(Hb)溶液直到聚(Hb)溶液的浓度增加到约75到约85g/l。例如，适当的超滤是30,000道尔顿滤器(例如，MilliporeHelicon^TMCat#CDUF050LT；AmiconCat#540430，Bedford，MA)。

然后，聚(Hb)溶液的pH调整到碱性pH范围，保护还原剂，保护氢气体的形成，可以在随后的还原过程中变性Hb。通常，将聚(Hb)纯化除去非聚合化的血球蛋白。这可以通过渗滤和羟基磷灰石层析来完成(参见例如，1995年7月7日递交的美国专利5,691,453，该专利全文通过在此引述而合并与本文)。在pH调整后，至少一个还原剂，优选地硼酸钠溶液加入聚合步骤。然后，可以储存稳定的聚(Hb)的pH和电解质到形成稳定聚合的血球蛋白基础的氧载体的生理水平，方法是通过用具有适当的pH和生理电解质水平的渗滤溶液渗滤稳定的聚(Hb)。

在1997年11月25日公开的美国专利5,691,452中详细讨论了交联血球蛋白和保护血球蛋白基础的氧载体的适当方法，该专利通过在此引述而全文合并与本文。

可以接受本发明的方法形成的血球蛋白基础的氧载体的脊椎动物包括哺乳动物，如人，非人灵长类动物，狗，猫，大鼠，马，或羊。另外，可以接受所述的血球蛋白基础的氧载体的脊椎动物包括胎儿(新生儿脊椎动物)，出生后的脊椎动物，或出生时的脊椎动物。

本发明的基于血球蛋白的氧载体可以通过直接和/或间接注射血球蛋白基础的氧载体到脊椎动物的循环系统，通过一个或多个注射方法给药到循环系统中。直接注射的方法的例子包括血管内注射，如静脉内和动脉内注射，和心脏内注射。间接注射的方法的例子包括腹膜内注射，皮下注射，以致基于血球蛋白的氧载体将通过淋巴系统运输到循环系统或通过关节或导管的方注射进骨髓。优选地，血球蛋白基础的氧载体是静脉内给药的。

待处理的脊椎动物可以是在输入血球蛋白基础的氧载体之前，过程中，和/或以后是正常的volemic，过度的volemic，或低的volemic。基于血球蛋白的氧载体可以直接通过如顶部负载的方法和通过交换的方法进入循环系统。

基于血球蛋白的氧载体可以治疗地给药，以便在许多不同原因包括贫血，休克和在或通过循环系统的部分中RBC流降低引起的脊椎动物中的氧过少的组织另外，基于血球蛋白的氧载体可以预防性地给药防止在脊椎动物中组织的氧耗尽，这可能是RBC流到组织或通过脊椎动物的循环系统中可能的或期望的降低。治疗性地或预防性地治疗部分动脉的障碍或来自微循环的部分阻隔导致的氧过少的血球蛋白的给药的其他讨论，和其中利用的剂量是1995年3月23日递交的美国专利5,854,209中提供的，该专利通过在此引述而全文合并与本文。

通常，适当的剂量或基于血球蛋白的氧载体的剂量的结合是当在血浆内含有导致脊椎动物血液中总血球蛋白的浓度在约0.1到约10gHb/dl之间的量，如果需要弥补大量的血液损失，则需要更多的量。

本发明将在下面的实施例中更进一步和具体地被叙述。

实施例

               实施例1-实验室规模的实验

参考图，在有抗凝固剂(EDTA)的容器中回收小牛全血，并且在2,600rpm(1,200XG)，在4℃，在将全血分开成重相(红血细胞组分，或细胞成分)和轻相(液体组分)的离心机27(Beckman J2-21利用JA-10离心机)中离心30分钟。血液的开始的体积是200ml。分开红血细胞组分和液体组分，在实验室规模的细胞洗涤系统中加工各个相。直接加工液体组分。将红血细胞组分指导到再循环器皿28，并且用等渗柠檬酸/盐缓冲液(柠檬酸钠水合物，6.0g/L，氯化钠8g/L)稀释到它的原始体积。再循环器皿通过在再循环瓶子，30中再循环适当的培养基，保持在围绕再循环器皿的适当的温度中。通过滤器单元，46(Microgon Minikros取样器)分开血液溶液成渗透物和滞留物进行了稀释的红血细胞的分离(例如，血液溶液)。在一个逐步的圆筒中回收渗透物。通过线60直接将滞留物回归到再循环器皿中。通过线42的压力输入压针筒(0-30PSI)和线60的出口压力针筒(0-15PSI)检测压力。用等渗柠檬酸/盐缓冲液，在板凳规模的系统中洗涤细胞成分直到，得到400ml的膜渗透物(2个滞留物体积)，数据概括在表1。

                  表1

样品	回收400ML的渗透物的时间(分钟:秒)
		红血细胞组分	34:58
液体组分	52:20

如表1中可以看到，液体组分含有微过滤膜污染物，因为液体组分的加工是比红血细胞组分的加工慢。

实施例2-实验室规模的实验II

在含有柠檬酸钠抗凝固剂的无菌处理的不锈刚容器中回收小牛血液，并且在第二个离心器类型，CEPA管肠离心机(NewBrunswick Scientific公司，Edison，NJ)进行批量离心生产红血细胞组分和液体组分。在两个饲喂构型中进行离心。在一个构型中，用一个周柱式泵泵入食物，并且在第二个构型中利用虹吸管加入血液。然后，从各个构型中得到的红血细胞组分稀释到小牛血液的原始体积，产生含有等渗柠檬酸/盐缓冲液的血液溶液。作为对照，没有离心的柠檬酸化的整个血液作为分开的样品包括在内。将样品在板凳规模的洗涤仪器中洗涤直到得到三个滞留物体积的渗透物(约600ml)。数据概括在表2。

                       表2

实验设计	血液离心负载方法	回收600ML的渗透物的时间
			离心机#1	周柱泵	36:56
离心机#2	虹吸管	38:08
			柠檬酸对照	没有离心	1:20:53

如表2中可以看到，导致从红血细胞组分中除去液体组分的离心增加了细胞洗涤的速度。

              实施例3-中试规模的实验

从三个动物中合并血液，并且用抗凝固剂如实施例2所述处理。在Westfalia(Northvale，NJ)SA-1或SB-7离心机中离心处理的合并的血液产生了红血细胞组分和液体组分，或直接作为对照洗涤。利用中试规模的洗涤系统洗涤红血细胞组分。

利用泵(Watson-Marlow泵，Wilmington，MA)，通过滤器进行红血细胞的分离。在通过滤器后，通过再循环器皿进行红血细胞的分离，并且用等渗柠檬酸/盐缓冲液稀释。再循环器皿的体积是9.6升。将再循环器皿通过围绕再循环器皿的再循环瓶子再循环乙二醇保持在适当的温度下。利用泵(Waukesha，Delavan，WI)通过滤器(Microgon)进行红血细胞组分/缓冲液混合物分离红血细胞组分/缓冲液混合物成渗透物和滞留物。在地板规模的渗透物回收容器中进行渗透。滞留物直接回到再循环器皿中。利用食物压力针筒和滞留物压力针筒检测压力。总共三个渗滤体积通过保留的细胞。数据概括在表3中。

                   表3

样品	加工时间(分钟)
		柠檬酸整个血液对照(1)	285
柠檬酸整个血液对照(2)	＞400
		红血细胞组分WestfaliaSA-1(1)	88
红血细胞组分WestfaliaSA-1(2)	72
		红血细胞组分WestfaliaSB-7(1)	134
红血细胞组分WestfaliaSB-7(2)	141

如表3可以看到，来自在SA-1或SB-7离心机中的血液离心的红血细胞组分已经大大降低了与柠檬酸整个血液相比的加工时间。当不希望结合理论时，当与SB-7相比，整个血液在SA-1离心机中离心时，细胞洗涤时间大大降低，因为SB-7引起了细胞的明显降解，其基质可以引起微滤器膜污染。

实施例4-去纤维化对有和没有离心的过程的时间的效果

将来自两个奶牛的约4升的血液合并，通过机械搅拌去纤维化。血液含有约400g的血球蛋白。得到的去纤维化血液含有12g/L的血球蛋白。将去纤维化血液离心，得到有约5-10％的血浆残留物的红血细胞组分，或不离心。如实施例3所述洗涤去纤维化红血细胞组分和去纤维化整个血液，另外，回收了5个渗滤体积。两个样品的开始的体积是7升。

                   表4

样品	过程的时间(分钟)
		离心去纤维化血液(1)	37
去纤维化整个血液-对照(1)	28
		离心去纤维化血液(2)	45
去纤维化整个血液-对照(2)	150
		离心去纤维化血液(3)	25
去纤维化整个血液-对照(3)	135

在第一个实验中，如表4所示，去纤维化红血细胞组分和去纤维化整个血液的细胞洗涤速度是非常快的，离心不会提高过程的时间，但是，在实验2和3中，细胞洗涤的速度与去纤维化的整个血液比较是为去纤维化的红血细胞组分而改进的，证明膜污染物没有通过去纤维化而除去。所以，离心提高了整个血液和已经去纤维化的血液的细胞洗涤效率。

等同物

本领域的技术人员将认识到，或能利用不超过常规实验的途径来确定如本文所述的本发明的具体的实施方案的许多等同物。这些和所有其他这样的等同物都打算包括在下面的权利要求中。

Claims (27)

1.一种纯化红血细胞的方法，包括步骤：

a)分离全血，从而形成红血细胞组分和液体组分；和

b)渗滤红血细胞组分从而形成纯化的红血细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中全血是通过在全血中沉降红血细胞而分离的。

3.权利要求2所述的方法，其中红血细胞的沉降是通过离心全血而得到的。

4.权利要求3的方法，其中全血的离心导致红血细胞组分基本包括的都是红血细胞。

5.权利要求1所述的方法，其中全血是通过将全血与在约10XG到约12,000xG之间的范围中的G动力接触而分级分离的。

6.权利要求1所述的方法，其中液体组分是通过在步骤(a)后丢弃，从红血细胞组分中除去的。

7.权利要求1所述的方法，其中液体组分是利用分开液体组分和红血细胞组分同时从红血细胞组分中除去的。

8.权利要求1所述的方法，其中整个血液去纤维化。

9.权利要求8所述的方法，其中整个血液机械地去纤维化。

10.权利要求1所述的方法，其中整个血液用抗凝固剂处理。

11.权利要求10所述的方法，其中抗凝固剂选自包括柠檬酸钠，肝素，乙二胺四乙酸(EDTA)和草酸钠的组。

12.权利要求11所述的方法，其中抗凝固剂是柠檬酸钠。

13.权利要求11所述的方法，其中抗凝固剂是肝素。

14.权利要求1所述的方法，另外包括溶解纯化的红血细胞的步骤。

15.权利要求14所述的方法，其中纯化的红血细胞是机械溶解的。

16.权利要求14所述的方法，其中纯化的红血细胞等渗地溶解。

17.权利要求1所述的方法，其中液体组分包括大多数的整个血液的红血细胞。

18.权利要求17所述的方法，其中红血细胞组分包括全血的大多数的白细胞和血小板。

19.权利要求1所述的方法，其中红血细胞组分是用具有渗透性的膜渗滤的，膜的范围是约0.1um到约5um之间。

20.权利要求1所述的方法，其中全血是小牛全血。

21.一种形成用于血球蛋白血液取代物的纯化的红血细胞溶解物的方法，包括步骤：

c)分开全血，从而形成红血细胞组分和液体组分；

d)渗滤红血细胞组分，从而形成纯化的红血细胞；和

e)溶解纯化的红血细胞，从而形成纯化的红血细胞的溶解物。

22.权利要求21所述的方法，其中全血是机械去纤维化的。

23.权利要求21所述的方法，其中全血是用选自包括柠檬酸钠，肝素，乙二胺四乙酸(EDTA)和草酸钠的抗凝固剂来处理的。

24.权利要求21所述的方法，其中全血是通过离心来分级分离的。

25.权利要求21所述的方法，其中纯化的红血细胞是机械溶解的。

26.权利要求21所述的方法，其中全血是小牛全血。

27.一种形成用于血球蛋白血液取代物的纯化的红血细胞溶解物的方法，包括步骤：

a)通过离心分开去纤维化的小牛全血，从而形成红血细胞组分和液体组分；

b)渗滤红血细胞组分，从而形成纯化的红血细胞；和

c)机械溶解纯化的红血细胞，从而形成纯化的红血细胞的溶解物。