CN1618405A - 一种收集鼻咽细胞和分泌物用于诊断病毒性上呼吸道感染和筛查鼻咽癌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种收集鼻咽细胞和分泌物的方法，以及该方法用于诊断病毒性呼吸道感染和检查鼻咽癌的用途。

Description

一种收集鼻咽细胞和分泌物用 于诊断病毒性上呼吸道感染和筛查鼻咽癌的方法

技术领域

本申请要求2003年8月26日申请的序列号为60/497801的美国临时专利申请作为优先权。

侵入性医疗诊断包括将医疗器械通过自然开口或皮肤或粘膜插入到病人体内，带有或不带有体液、脱落的细胞、血液或组织的获取。

本发明包括非侵入性的细胞获取，例如脱落的上呼吸道上皮细胞，或者外来的或宿主的，良性的或恶性的其它类型的细胞，这些细胞存在于上呼吸道分泌物中，包括用于医疗诊断和科学研究的病毒、分子和大分子。本发明进一步提供了将生物活性剂输送到鼻、鼻咽和口咽部位的有效方法。

背景技术

传统地，上呼吸道病毒感染的诊断基于临床病史和检查，并不包括实验室研究，因为这种研究具有很长的转变(turn-around)时间，对病人的处理几乎不产生影响。

然而近来，基于抗体和核酸的实验室研究已经显著地缩短了实验室研究的转变时间，由此能够积极地影响临床处理，尤其是对检疫和分组病人的决定。近来的SARS(严重急性呼吸道综合征)的流行加强了对快速诊断方法的需要。

大多数病毒上呼吸道疾病的侵入点是眼、鼻和口；病毒经常在鼻咽，有时候在结膜或可能在鼻泪系统获得最初的立足点。随着易受感染的宿主被感染，病毒的复制在宿主的上皮细胞内发生，从而导致在分泌物中释放出更多的有传染性的病毒颗粒。被感染的上皮细胞常常从上皮层分离，并能够被收集，以用于病毒的鉴定。通过活性分泌物或排泄物或由于病毒感染细胞的死亡，病毒颗粒也分散到细胞外空间。用于检测病毒或被病毒感染的细胞的方法包括病毒培养、直接免疫荧光显微镜检术、各种免疫测定和基于核酸的诊断测试。

尽管在那些采取有效的宫颈细胞学筛选程序的国家，宫颈癌的发生率大大减小，但鼻咽癌的发生率并没有受到影响，这是因为没有有效的方法，非侵入性或最小侵入性获取用于剥脱性细胞学癌症筛选的细胞。

现有技术

当前获取病毒感染的上呼吸道上皮细胞的金标准方法是通过鼻咽吸引术。该方法包括将无菌电解溶液通过塑料插管输注到鼻咽部，并且使用负压通过抽吸液体回收到存水瓶(trap bottle)中。由于这个过程不舒服或疼痛，因此病人不喜欢该过程，由于它导致打喷嚏和咳嗽，从而引起感染疾病的危险，所以工作人员不喜欢它。该技术的变化包括无电解溶液输注的抽吸，和用专有的鼻咽洗涤收集装置冲洗。

例如，美国专利5643202描述了一种用于灌洗和收集鼻咽分泌物的独立的人工装置。该装置价格昂贵，并且该方法产生刺激打喷嚏和咳嗽的风险。

在一些不使用上述装置的设施中使用的类似方法包括将10-15ml的生理盐水推注到一个鼻孔中和收集从另一个鼻孔中出来的液体。对病人来说感到不舒适，并且对工作人员有潜在的危险，如上文所述。

其它获取鼻咽样品的更低效的方法包括将棉球药签通过鼻插入到鼻咽部(鼻咽药签取样)，鼻药签取样(nose swab)，鼻灌洗，咽喉药签取样，漱口和唾液收集。

因此所有的上述方法都有缺点，这些缺点导致临床样品不适当(inadequate)，病人不舒服或对医疗人员产生危险，这将在下文详细描述。

不适当的临床样品

由于实验室测试结果对临床医生有用，测试的灵敏性(疾病存在时为阳性)和特异性(疾病不存在时为阴性)必须很高。该标准受一些因素的影响，这些因素包括获取典型样品的能力和所使用的实验室技术。因此不适当的临床样品对实验室测试的总灵敏性和特异性造成危害。

在病毒性上呼吸道感染的情况下，诊断材料常常被病毒感染，例如脱落的上呼吸道纤毛柱状上皮细胞，或细胞外病毒颗粒，壳体蛋白质或核酸。由于通过放置在鼻咽表面的插管冲洗而直接获取这种细胞，因此用于收集该类型样品的金标准过程是鼻咽抽吸。

鼻咽药签取样也直接从鼻咽获取物质。然而附着在药签上和可以随后回收用于诊断测试的细胞数量是有限的。

鼻药签取样包括前鼻腔的擦拭，鼻咽较短，表明只能损害样品质量以减少病人的不舒服。常常这仅仅是用于儿童的选择，除非大量服用镇静剂，否则这些儿童将不会充分配合鼻咽抽吸或擦洗。

唾液和咽喉药签取样代表相似的折衷方案。如果操作适当，咽喉药签取样可以允许少量的鼻咽细胞回收。这是因为脱落的鼻咽细胞逐渐通过咽喉进入胃肠道。然而唾液是不能令人满意的，因为多数的唾液来自三对唾腺(腮腺，下颌下腺和舌下腺)，它们将内容物排入前口腔。人吐出的唾液不与咽喉后部的分泌物接触。来自咽喉后部的痰和分泌物与唾液不同，通常不能出现，除非病人有过多的来自下呼吸道或鼻咽和咽喉后部的分泌物。咽喉漱洗可以使漱液接触咽喉后部的分泌物。然而，软腭在多数个体中是有作用的，由此防止漱液回流到鼻咽。漱洗也可以导致咳嗽(见下文)。通过漱洗回收的细胞数量因此受到限制，并进一步通过漱液稀释。

近来，导致严重急性呼吸道综合征(SARS)的SARS-CoV冠状病毒已经从泪腺分泌物(眼泪)中被收集。然而，不同的机构报告不能将病毒从包括眼泪的各种来自眼睛的样品中分离，这表明眼科医生进行眼泪的获取不是一种病毒学诊断的有效方法。另外，获取眼泪用于SARS的诊断需要眼科医生的服务和暴露于潜在的感染病人，并需要使用在许多健康护理中心不能获得的特别装置。

病人的不舒服

除了唾液收集之外，所有的现有方法包括病人轻微到显著的不舒服，从轻微的刺激到疼痛。一些方法，例如鼻咽抽吸，不能在儿童或不合作的不镇静的病人中实施。

对医疗人员的产生的危险

上述的许多方法导致鼻部的刺痛，从而导致打喷嚏。由于突然将液体抽吸到喉部，漱洗常常导致咳嗽。喷嚏和咳嗽通过有害的刺激物的强力喷出保护病人。然而，这些活动也产生了带有传染性有机体的气溶胶，其对收集这些样品的医疗人员产生真正的威胁。甚至眼泪的获取也包括潜在的感染源病人和实施该过程的医疗人员之间的密切接触。尽管类似流感A的疾病能够通过医疗人员的免疫而在一定程度被防止，但是像SARS这样的疾病和其它突发传染疾病，其没有可获得的疫苗并导致高死亡率，会产生严重的风险。

鼻咽癌没有可获得的细胞或分子的筛选，因为难以获得或索取鼻咽样品用于癌症筛选。诊断通过使用内窥镜显像和活组织检查而实施。

发明简述

本发明允许通过将生理标准盐溶液引进到结膜囊而获取脱落的鼻咽细胞和分泌物，然后收集冲洗液和通过鼻泪腺管、鼻和鼻咽排入口咽中的再水合分泌物。通常，病人能够收集咽部的冲洗液并将它吐入样品容器中，而不吞进去。然后该样品可以进行处理，以用于临床实验诊断或科学研究。

本发明集中了几个优点，例如对所有三个上呼吸道病毒病原体进入的入口进行取样(眼，鼻和口)，自身获取而不威胁医疗人员；通过污染的气溶胶污染医院或门诊环境或医院其它病人或工作人员的风险减小；病人的不舒服减轻；鼻咽物质的合适产量；并且不会由于冲洗液而产生过分分泌物稀释。当作为试剂盒的一部分使用时，该方法可以在病人自己家里或在隔离或检疫机构中执行。由于本发明没有不舒服或副作用，因此可以更容易地重复，或者立刻收集更多的样品以用于其它研究，或者在以后的时间，用于长期研究，例如研究在疾病发展或响应治疗期间病毒负荷的变化。

本发明也提供了启动程序以用于筛选流行鼻咽癌的地方的鼻咽癌的方法。本发明也提供了作为整体将生物活性剂通过胃肠系统输送到眼睛、上呼吸道和身体的有效方法。

定义

“核糖核酸酶”表示任何一种广泛分布的切割RNA的类型的酶。

“脱氧核糖核酸酶”表示关于DNA的核酸内切酶。核酸内切酶是在特定位置通过切断链而切割核酸的酶。一些对RNA和DNA都起作用。

“医院传染”表示在医院或健康护理机构中传染病从一个病人传染到另一个病人。

“聚合酶链反应(PCR)”表示用于制备多拷贝DNA序列的体外技术。它使用重复的热循环，其包括双链DNA的变性，适当的寡核苷引物的退火，通过聚合酶引物的延伸。

“RT-PCR(反转录酶聚合酶链反应)”是PCR的一种类型，其中初始的模板是RNA，反转录酶用于制造DNA模板。一些热稳定聚合酶具有明显的反转录酶活动；然而，更普通的是执行明确的反转录，使反转录酶失活或提纯产物，然后分别进行传统的PCR。

“酶免疫测定(EIA)”表示基于抗原-抗体反应特异性的诊断系统(常常包装成可携带的试剂盒)，使用酶对底物的催化活性作为信号放大和检测抗原-抗体反应的方法。

“微卫星”是广泛分布于整个基因组的可变长度的二或三核苷酸的重复短序列。

“端粒”是染色体的末端。

“端粒酶”是一种DNA聚合酶，其带有选择性从端粒延长寡核苷酸的异常能力。该酶包含基本的159个残基的RNA序列，其提供用于复制富含G的端粒序列的模板。

“启动子”是DNA区域，在开始将DNA转录到RNA之前RNA聚合酶结合到该区域。

附图的简要说明

在附图中：

图1描述了从眼睛到鼻的灌洗液的流动方向。

图2描述了液体进入泪囊的入口部位。

图3描述了鼻腔和鼻泪管的下部开口的内部解剖。

图4描述了用于收集CURTI样品的英文版本的病人说明图表。

图5列出了在一系列感染流感A的病人中的CURTI结果。

附图的详细描述

图1描述了生理盐水从结膜囊排到鼻腔的路径。

图2显示了右眼的图像。眼睑打开以显示正常朝内的泪腺孔，其中每个眼睑上有一个泪腺孔。它们位于眼睑(实箭头)的中间方向(靠近鼻梁)的小乳突的顶部(类似乳头的突出)。

图3显示了鼻腔和鼻泪腺管的开口处的内部解剖。结膜囊中的过量液体(眼泪或冲洗液)通过鼻泪管排出，而不会溢出，除非它超出导流能力。通过眼睑中(内)端的泪腺乳突顶部的双向成对(上部和下部)的泪腺孔，眨眼将灌洗液泵送到泪囊中，进入与泪囊相连的短泪腺小管(cannaliculi)。然后液体进入单通道鼻泪管和向下通过该管道的下部开口，并进入鼻腔，在下管道的底部，鼻孔后部两厘米处。随着病人半倾斜，液体回流到后鼻腔，进入鼻咽和湿润鼻咽粘膜，从而释放分泌物。然后鼻咽分泌物和眼泪或冲洗液向下进入口咽，引起咽喉后部的液体感觉。当这发生时，病人将产生吞咽液体的欲望。引导病人将液体吐到样品容器中而不是吞咽它。对咸味有完整感觉的病人，在没有其它最近摄取的物质的优势味觉的情况下，当它被吐出时通常能够鉴别液体(如果生理盐水用作冲洗液)的咸味。

图4是给病人的英文版本的说明注解，以帮助它们收集CURTI样品。

洗手，半斜靠在长椅或床上。

轻轻地按摩两个泪囊(见图中由“x”表示的位置)。

使用一滴无菌的标准盐眼药水(假设)滴入每个泪囊(眼睛)，就像使用眼药水一样。由于其会溢出，不要使用太多。你可以轻轻地再次按摩泪囊。眨眼将帮助液体进入你的泪囊。不要强制闭上你的眼睑，因为这将导致液体溢出。

应用的盐溶液将通过鼻泪管到达鼻(由图中的虚箭头表示)，然后通过鼻和鼻咽进入口咽。不要吞咽该液体。在咽喉中收集该液体。最好不立即把它吐出，而是继续应用更多眼药水，直到吞咽的欲望不可抗拒。这保证了样品不混合太多的唾液。

轻轻地将它吐到预备的样品瓶中，你的唾液应当尝起来是咸的。

多次重复步骤3-5直到它提供2ml的样品，或直到眼药水被用完。关闭样品瓶上的盖。

警告护理人员样品收集完毕。

注意：在眼药水的应用和液体集中在咽喉中的感觉之间有5分钟的时间延迟。另外，当用完眼药水后，液体将继续在咽喉中收集1-2分钟。也请在样品容器中收集。

小结：使用眼药水，眨眼，将收集在咽喉中的液体吐到预备的容器中。

图5A显示了当感染常见的流感A的病人在短的延迟时间(在24小时以内)之后进行评价的CURTI表现(通过DIF)。CURTI的阳性被定义成通过病毒培养的流感A病毒的阳性鉴定或通过DIF的流感A感染的上皮细胞的阳性鉴定。仅仅50％的病人CURTI是阳性，因为并非所有的样品都培养出病毒；一些病人不能实施CURTI，也就是小于10岁的儿童(图5B)；由病人的免疫系统产生的流感A的快速消灭是由于实施CURTI的延迟造成的。流感A爆发后，许多或多数由于患流感A而住院的病人是年幼的儿童或年老的病人。由于判断和接收的延迟，一些病人接近于要清除这些病毒，或者随着流感A感染的诊断已经开始产生抗病毒剂。在CURTI的实施中的进一步延迟可以解释一些CURTI的“假阴性”结果。其它可能的原因包括阻止结膜灌洗液进入鼻的解剖学异常，细节的疏忽，或对现有的病毒鉴定的实验方法不敏感。

本发明优选实施方案的详细描述

解剖学

泪囊位于眼睛的中间眼角，中间眼睑韧带和一些闭合眼睑的肌肉纤维(眼轮匝肌的眼睑纤维)的深处。它是鼻泪管的平头上端的扩张，通过两个短cannaliculi(小管)连接到结膜囊(眼睑和眼睛之间的空间)。能够容易地看到结膜囊中的泪腺cannaliculi的开口或孔位于上下眼睑的中间方向两个小乳头的顶部，被称为泪腺乳头(图2)。泪囊的下端继续作为带有粘膜褶皱的厚壁管，从而允许眼泪单通道向下流入鼻部。该管是鼻泪管。它大约2cm长，沿着前鼻腔的外壁向下和向外倾斜，通向被称为下管道的凹穴。

当过量的眼泪进入结膜囊时，由于增加的分泌物，眼泪不会正常地溢出，这是因为眼睑边缘，其由于迈博姆腺(Meibomian gland)的油性分泌物而阻止了水。作为代替，眨眼发生并帮助眼泪排入到泪囊中。这种情况的发生是因为在眨眼期间，泪腺孔朝内面对泪湖，该空间正好在该孔以内。同时，闭合眼睑的肌肉也拉开由于其弹性而通常折叠的泪囊。眼泪通过该作用而被吸入泪囊。当眼睑打开和肌肉放松时，泪囊返回到它的初始折叠状态。它所容纳的物质被泵送到鼻泪管中，由此进入鼻中。在泪囊管中的粘膜折叠起到阀的作用，阻止眼泪回流。这样，阀和泵系统引导过量的眼泪从结膜囊经过鼻泪囊和鼻泪管进入鼻中。当眼泪进入鼻中时，它滴回到鼻咽，除非它从鼻中流出。进入鼻咽之后，眼泪和鼻以及鼻咽中的分泌物混合并引起液体在咽喉中集中的感觉。儿童也许会本能地吞咽它。成人能够被指导着避免吞咽它，而是把它吐出来。这些过程形成了本发明的解剖学基础。

CURTI的方法(结膜-上呼吸道灌洗)

为了收集鼻咽细胞(脱落的上皮细胞，和迁移到分泌物中的免疫细胞)，或其它存在于鼻咽中的物质，例如病毒或癌细胞，本发明利用了前面描述的解剖学性质。我们使用无菌生理盐溶液来产生过量的人造眼泪，这些眼泪灌洗鼻咽，由此产生对能够吐出的带有混合细胞和分泌物的液体的收集。其它的方法包括通过局部的眼药水、引发情绪和刺激性的烟或气来刺激眼泪分泌物。在本发明的方法中，盐水没有产生不愉快的感觉，因为它与眼睛一样处于同样的室温，同样的渗透度和PH值，并且不包含防腐剂和其它刺激眼睛的化学制品。由于这种原因，生理盐水不会导致病人“弄糟”眼睛(强制闭上眼睛)，因此防止了冲洗液溢出到脸颊上。冲洗液的量也完全由病人来控制。

为了成功地实施本发明，病人需要如下理解该方法：

1.该方法能够由病人自己实施。病人可以坐在或半斜躺在舒服和安全的椅子或床上，并且在天花板上没有明亮的光线照射的房间中。

2.当病人的脸朝着天花板坐着时，将预备的无菌生理盐水滴注到双眼中，以避免溢出。

3.一次一只眼睛只滴一滴。

4.然后病人应当保持他/她的头部朝前(竖直或半竖直)以帮助液体排到泪囊中。

5.病人不应当强制闭上眼睛，因为如果它们强制闭上，溶液将从眼睛中淌出。

6.双眼应当正常眨动一小段时间，直到液体在眼中的感觉几乎消失。

7.接着，病人应当重复生理盐水眼药水的使用和眨眼，直到2-5ml的生理盐水被用完。

8.开始使用眼药水一或两分钟后，病人将感觉到液体进入鼻中，该迟滞期是可预期的。

9.病人应当稍微向后倾斜头部，以便于当液体进入鼻腔时液体能排入咽喉后部。

10.吸气动作将有助于液体回流。

11.当足够的液体已经集中到咽喉后部，即并非液体一进入咽喉的时候，病人应当将液体吐到预备的无菌、无RNAse(核糖核酸酶)和无DNAse(脱氧核糖核酸酶)的样品容器中。该延迟的吐出保证了唾液对样品的最小稀释。

12.应特别强调要求病人不要吞下液体。

13.当用完预备的生理盐水后，液体将继续进入鼻和咽喉后部一或两分钟。该液体也应当被收集到样品容器中。

其它对病人的指导应当包括，在该程序之前避免强味觉的食物和饮料，同样应当避免吸烟。这帮助病人感觉到唾液的咸味。另外，它要求病人首先用水漱口，彻底地洗手，从而它们能够轻轻地按摩泪囊部位(眼睛的内眼角)，以帮助它对液体开放。

因为通常需要先使用眼药水，本发明被推荐用于成人和儿童。没有事先经历的年幼儿童在该程序之前需要重复练习和训练。对于多数的病人，以病人的语言作详细的文字说明就足够了(图4)。

样品容器，样品保存和运输

用于收集样品的容器最好是无菌广口瓶，盖上带有O形圈以使它在拧上之后防止渗漏。它应当不含有RNAse和DNAse。瓶上靠近底部的线或刻纹表示样品量，当收集液体的弯月形液面到达所述线或刻纹时，样品就足够了。

取决于找到的分析物、细胞或病原体，在实验室进行处理之前，样品最好保持在室温或4℃。为了包括细胞培养物中的病毒培养在内的病毒研究，重要的是通过将一小部分试样(大约200微升)转移到病毒转运介质中，从而适当地保存病毒和防止细菌的繁殖。为了提取不稳定的分子，例如mRNA(信使RNA)，溶解缓冲液应当在最早的合适时间加入到试样中，一般在收集迅速地放置到4℃的冰箱隔间中的样品几小时之内。为了防止将培育出细菌的试样中口内共生有机体生长过度，其它的化学制剂，例如抗生素，可以添加到其中。如果样品将要用于细胞学检查，例如酒精或福尔马林这样的固定剂可以添加到其中。

还应当遵守通常的预防措施，这些措施包括：拧紧帽盖、装入袋中以防止泄漏和邮递员以及实验室工作人员的损坏，正确的鉴定和给样品瓶贴标签。

质量的控制和保证

因为它与唾液混合，因此样品与唾液类似，是发白且多泡沫的。对于鼻腔和鼻咽化脓感染的病人，样品呈微黄色或淡绿色。血液污染一般不会出现，如果它存在，应当注意。对于对咸味有完整感觉的病人，和那些在该程序之前用水漱口的病人，唾液应当有一些咸味。实际上，鼻咽有咸味的味蕾(个人的观察)。尝到唾液中的盐分是保证质量的观察结果，应当询问每一个病人，尽管它不存在并不必然表示样品的不适当。表明样品适当的其它观察结果包括病人叙述液体进入鼻和咽喉，以及液体成功地吐到容器中。其它保证质量的方法在下面列出。

因此确保样品适当的方法包括：

1.报告咽喉或唾液中的咸味，或感觉到液体通过鼻进入咽喉，这是样品适当的表示。用于CURTI的眼药水中如果含有防腐剂或指示剂(例如荧光素)，它们通常将产生苦味。如果用葡萄糖水代替生理盐水，病人将感受到甜味。然而包含代谢碳水化合物的溶液应当避免，因为它们可能引起细菌生长。这些味觉感受能够用于保证质量的观察结果。

2.眼药水中指示剂溶液的内含物。一个例子是荧光素，通过在Wood’s光线下(长紫外线或紫外线A，波长320-380nm)观察样品，它的存在能够容易地被发觉。眼科医生常规地在病人的眼睛上使用荧光素(眼药水或带)，以探测角膜溃疡。

3.测量唾液的PH值。在健康人体中，唾液的PH值与细胞外液体相同，都大约为7.4。标准盐水的PH值为7.0(中性)。然而，它能够被牙龋齿、食物和饮料、药物和其它因素影响。测量该程序之前和之后的PH值能够表示是否存在由于生理盐水的滴注导致病人唾液的pH任何变化，一个可测量的变化，例如从7.4到7.1的变化，这就说明样品适当。

4.在实验室中，诊断材料的存在表明样品是适当的。当染色适当的荧光标记的抗体时，诊断材料可以是包含荧光细胞核的柱状细胞。诊断材料也可以是癌症的分子标记或细胞学非典型癌细胞。鳞状细胞将大量存在，因为它们通常存在于唾液中，但并不重要。另一方面，柱状细胞通常很稀少，它们的缺少并不证明样品的不适当。

CURTI的改进

一些病人也许不能自己实施整个CURTI程序。这些病人将需要医疗或护理人员的帮助。这通常意味着当需要时为他们握住容纳生理盐水的注射器(或瓶)和/或样品瓶，为他们使用眼药水，帮助他们坐起来吐出液体，将样品容器放置靠近病人的口，确保病人正确地进行该程序，确保足够的样品被收集，确保样品不溢出，和确保样品容器在该程序之后完全封闭。需要这些形式的帮助的病人包括轻微精神缺陷的病人和卧床的年老病人。其它可能需要这些帮助的病人可能包括年幼的儿童，视觉损失的病人，严重受伤或生病的病人，或者那些不能完全使用一个或两个上肢的病人。

甚至在这些情况下，只要有可能，即使需要帮助，CURTI也胜过鼻咽冲洗或其它方法，因为病人发现它比鼻咽抽吸更温和。病人也不打喷嚏和咳嗽，并且更可能同意重复另外的收集或接下来的研究。

全套试剂盒

因此本发明最好以试剂盒的形式来进行实施，该试剂盒包括：带有或不带有指示剂的瓶装的眼药水(有有效期)，带有表示足够容量的标记和印有病人姓名的标签的防漏样品容器，容纳样品和任何泄漏的防漏塑料袋，说明手册，和适当的添加剂(收集之后加入其中)。如果该试剂盒在病人家中使用，询问姓名和联系信息、简单的病历、病人是否尝到咸味(如果用于质量保证测量)以及收集的时间和日期这些问题的适当调查表；也包括关于怎样和在什么地方提交样品，以及返回地址等更多的说明。

实施例

1.用于SARS诊断的鼻咽样品的收集

在2003的春天，香港发生了SARS的爆发，在爆发的末期，本发明第一次测试了四个最近住院的SARS病人。

所有这四个病人都用药签进行鼻和咽喉的取样，以通过RT-PCR进行SARS的分子诊断。因为害怕从病人感染SARS，所以没有实施鼻咽抽吸。通过后来的血清转化成SARS冠状病毒或通过肝组织活检(RT-PCR)该病毒呈阳性，这些病人被确认感染了SARS。

这些鼻和咽喉的药签取样中没有任何一个呈阳性。另外大便也被收集用于RT-PCR，因为已经开始知道相当数量的SARS病人在大便中分泌SARS冠状病毒。然而，在这四个人中没有一例呈阳性。

在这四个病人中实施了CURTI。两个病人呈阳性。因此本发明与咽喉和鼻的药签取样相比提供了更好的样品。它不会使医疗人员面对感染致命病毒的额外风险，因为由病人自己实施整个程序。与血清转化相比，通过RT-PCR的SARS的分子诊断提供了更早期的SARS特异诊断。

2.用于流感诊断的鼻咽样品的收集

流感A病毒是RNA病毒，其自然宿主是水禽。当它感染鸡时，死亡率极高。人类和猪也容易受到感染。猪作为鸟类和人类流感A病毒种类之间的病毒重组的“混合载体”是公知的。重组产生了新的抗原变化的流感A病毒。当人类遭遇它们时，它们的免疫系统记忆不会认出这些新的病毒，因此花更长的时间来响应和给了病毒足够的时间导致临床疾病，并自身传播到更多的易感宿主。由于流感A传染性很高，只需要少到仅仅三个病毒颗粒就可以导致感染，并且由于它常常通过液滴和气溶胶传播，因此经常在公共机构和医院中爆发。快速的诊断，从而导致感染病人的检疫和隔离，依赖于可靠地收集临床样品。

本发明提供了一种高产量、舒适和安全(对于医疗人员来说)的样品收集方法，以用于流感A传染病的实验室诊断。收集的样品能够被任何通常使用的方法检验，包括护理点的酶免疫测定(EIA)，BD Directigen^TM FluA，比较慢但可广泛获得的直接荧光免疫显微镜法(DIF)，病毒培养，和日益快速且到目前为止最灵敏和特异的RT-PCR方法。

在部分公布的通过DIF诊断感染了流感A的52个病人的分组中(参考文献11)，在24小时内通过相同的DIF实验方法对CURTI样品重新检验，26个被发现呈阳性(图5)。

在荧光显微镜下，已与荧光素标记的流感A特异抗体进行预培养的样品条带显示了亮绿荧光的细胞核和有纤毛的柱状上皮细胞的被感染细胞质。细胞核是椭圆形的并且位于细胞的底部。在上述两种情况下，这些细胞存在足够的数量，以允许在杂质和更大的无自身荧光的鳞状细胞中容易地辨认。另外，细胞残骸不会过多到足够使病毒感染细胞难以辨认。

3.用于其它上呼吸道病毒性疾病诊断的鼻咽样品的收集，例如流感B、副流感、肺炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸性合胞病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒。

Directigen^TM Flu B测试是类似于Directigen^TM Flu A测试的护理点(point-of-care)抗原测定系统。它特异地鉴定流感B，并且作为Directigen^TM FluA+B与Directigen^TM Flu A一起销售。Directigen^TM RSV测试鉴定呼吸性合胞病毒。其它上呼吸病毒的类似测试正在发展或处于计划阶段。所有这些能容易地结合到本发明中，以最大化病人的舒适感、样品质量和对工作人员的安全性。

4.将本发明试剂盒与核酸扩增组合，例如PCR-EIA或RT-PCR。

核酸扩增很快成为扩增病毒“特征”而不产生完全传染病毒的附加风险的优选方法。另外，它与其它任何基于抗原的测试相比具有显著的灵敏度。由于实时定量PCR提供的自动控制，核酸扩增的整个过程不超过一小时。另外，该技术允许测量在样品中病毒的浓度。

大多数收集鼻咽物质的方法是使用大量的灌洗液，或取决于获取药签取样细胞的溶液。因此获得病毒的数量不反映存在病毒的真实数量，尽管该技术标准化，但有意义的结果仍然通过病人之间的比较而形成。本发明提供了少量的灌洗液，其冲洗出病毒感染的细胞，导致预先存在的粘液(分泌物)的湿润或再水合以及它们引起的释放。因此在CURTI样品中探测到的病毒数量更接近于存在于鼻咽分泌物中的初始病毒负荷。

我们已经发展了核酸扩增的更灵敏的方法，PCR-EIA。该方法提供了使用酶免疫测定的PCR产品的进一步的信号放大层。

5.用于筛选鼻咽癌的鼻咽分泌物的收集。

鼻咽癌在世界上的某些地方很普遍，包括中国南方。它是由转化的鼻咽上皮细胞的无性繁殖引起的，这些细胞具有永生化、不受控制的细胞繁殖、入侵和能够转移到更远部位的能力。许多病例具有EBV(埃-巴二氏病毒)感染的残留迹象，这表明该病毒是初始的转化事件(transforming event)。因为鼻咽位于头部的中央，病人难以看到和接触到，起源于那里的肿瘤一开始几乎不产生不舒服的感觉。多数病例发展到后期，不能治疗的阶段。

直到现在，还没有有效不采用侵入性和昂贵和鼻咽内窥镜检查筛选这些病人的方法。本发明提供了一种舒适和可靠的方法，以收集脱落的鼻咽细胞或用于检查的分子/病毒标记。这些样品将需要立刻处理或固定，以提供分子标记或形态细节的最佳保存以用于显微镜观察。

本发明也提供了样品，以用于分子筛选以及鼻咽癌和其它影响鼻腔、鼻咽和口咽的恶性肿瘤的诊断，其使用微卫星、端粒和端粒酶相关的标记、启动子超甲基化作用、全基因组去甲基化作用、肿瘤抑制基因失活作用、肿瘤基因激活作用、基因和其它标记的表达或抑制的不同模式、化学形状、粘膜分泌物lgA特异性和病毒标记(例如埃-巴二氏病毒抗原和核酸)。

6.CURTI作为疫苗输送的方法。

一些疫苗通过肠胃外输送(不通过口)。其它例如口服的脊髓灰质炎疫苗(Sabine疫苗)，通过肠内输送(通过口)。该减活(削弱)口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)由Dr.Albert Sabin在1961年研制。沙克疫苗是灭活的(死亡的)脊髓灰质炎疫苗(IPV)-由Dr.Jonas Salk在1955年研制，OPV超越沙克疫苗的优点在于IPV必须由受过训练的健康工作人员注射。OPV的其它好处包括更长的持续免疫和粘膜免疫，因为脊髓灰质炎病毒通过口进入身体。

所以CURTI是给药减活疫苗以针对上呼吸病毒性疾病的优选方法，该疾病通常通过上呼吸道，包括眼睛，而进入身体。输送可以通过使病人处于脸朝上位置和将包含疫苗的液体滴入眼睛而执行。

因此，尽管已经显示、描述和指出了本发明的基本的新特征，如优选实施例中所述，应当理解列举装置和操作的形式和细节的各种省略、代替和变化可以由本领域的熟练技术人员完成而不超出本发明的精神。例如，可以显而易见地将那些要素和/或方法步骤组合起来，以基本相同的方式执行基本相同的功能，从而获得基本相同的结果，这些也在本发明的范围之内。而且，应当认识到，所示的和/或以本发明任何公开的形式或实施方案描述的方法步骤可以与任何其它公开的、描述的或建议的形式或实施方案结合，以作为一般的设计选择。因此本发明的意图仅仅受到附加的权利要求的范围限定。

参考文献：

McMinn，R.M.H.1994.Head and neck and spine，p.470-472 and p.506-508.In R.M.H.McMinn(ed.)，Last’s anatomy-regional and applied.Churchill Livingstone.New York，N.Y.Tong TR，Lam BH，Ng TK，Lai ST，Tong MK，Chau TN.Conjunctivo-upper respiratory tractirrigation(CURTI)for early SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)diagnosis.Accepted for publication.

Peiris JS，Lai ST，Poon LL，Guan Y，Yam LY，Lim W，Nicholls J，Yee WK，Yan WW，Cheung MT，Cheng VC，Chan KH，Tsang DN，Yung RW，Ng TK，Yuen KY；SARS studygroup.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome.Lancet.2003 Apr 19；361(9366)：1319-25.

Kuiken T，Fouchier RA，Schutten M，Rimmelzwaan GF，van Amerongen G，van Riel D，Laman JD，de Jong T，van Doornum G，Lim W，Ling AE，Chan PK，Tam JS，Zambon MC，Gopal R，Drosten C，van der Werf S，Escriou N，Manuguerra JC，Stohr K，Peiris JS，Osterhaus AD.Newly discovered coronavirus as the primary cause of severe acuterespiratory syndrome.Lancet.2003 Jul26；362(9380)：263-70.

Peiris JS，Chu CM，Cheng VC，Chan KS，Hung IF，Poon LL，Law KI，Tang BS，Hon TY，Chan CS，Chan KH，Ng JS，Zheng BJ，Ng WL，Lai RW，Guan Y，Yuen KY；HKU/UCHSARS Study Group.Clinical progression and viral load in a community outbreak ofcoronavirus-associated SARS pneumonia：a prospective study.Lancet.2003 May24；361(9371)：1767-72.

Musher DM.How contagious are common respiratory tract infections？N Engl J Med.2003Mar 27；348(13)：1256-66.

The Sabin Vaccine Institute.Accession date，13 August 2004.Polio vaccines.[Online.]http://www.sabin.org/vaccine％5Fscience％5Fpolio.htm

Chan WM，Yuen KS，Fan DS，Lam DS，Char PK，Sung JJ.Tears and conjunctivalscrapings for coronavirus in patients with SARS.Br J Ophthalmol.2004 Jul；88(7)：968-9.

Loon SC，Teoh SC，Oon LL，Se-Thoe SY，Ling AE，Leo YS，Leong HN.The severe acuterespiratory syndrome coronavirus in tears.Br J Ophthalmol.2004 Jul；88(7)：861-3.

Tong TR，Lai TS.Accession date，13 August 2004.The severe acute respiratory syndromecoronavirus in tears.[Online.]http://bjo.bmjjournals.com/cgi/eletters/88/7/861.

Tong TR，Tang YW，Lai ST，Ng TK，Yu WC，Lam B，Wong TY，Tsang O.An alternativemethod of procuring nasopharyngeal specimens for SARS coronavirus and influenza virusdetection.Abstract.SARS-FP1.2.Hong Kong SARS Forum and Hospital AuthorityConvention 2004.8-11 May 2004.

Claims (6)

1.一种收集鼻咽样品的方法，其包括以下步骤：1)将病人定位使其脸朝上，2)每次将至少一滴无菌溶液滴入每只眼中，然后保持头部竖直并眨眼几次，3)重复步骤2)直到用完大约2-5mL溶液，和4)让病人将咽喉后部收集的液体吐到样品容器中。

2.权利要求1的方法，其中所使用的无菌溶液是生理盐水或其它等渗溶液。

3.权利要求2的方法，其中所述无菌溶液包括作为标记的荧光素。

4.权利要求1的方法，进一步包括，通过询问病人是否尝到该无菌溶液，如果使用荧光素作为标记，在Wood’s光下观察收集的液体，测试收集液体的盐度，或测试收集液体的PH值，从而评估收集的液体是否包含所述无菌溶液的步骤。

5.一种用于权利要求1所述方法的试剂盒，包含：含有无菌溶液的瓶或注射器，用于样品收集的带有封口的广口容器，防止任何收集的液体从收集容器中泄漏的袋，和保存或处理收集液体的添加剂。

6.权利要求5的试剂盒，其中所述保存或处理收集液体的添加剂选自固定剂、抗生素、裂解缓冲物和病毒转运介质。

Images