CN1609600A - 内参比纳米pH传感器的制备方法及用于细胞内pH无创监测 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器的制备方法及用于活细胞内pH的无创伤监测，旨在合成一种同时包埋有参比染料和敏感染料的性能稳定的纳米pH传感器，实现细胞内pH动态变化的无创伤监测。其制备方法为：将油相环己烷、表面活性剂曲拉通TritonX－100和助表面活性剂正己醇按体积比4.2∶1∶1混合均匀，加水作为分散相，得油包水微乳液；加入敏感和参比染料混合液，搅拌；加等体积的硅烷化试剂正硅酸乙酯TEOS和催化剂氨水，反应完成后丙酮破乳，无水乙醇和超纯水离心洗涤，得具有内参比的硅壳荧光纳米传感器。其用于活细胞内pH的无创伤监测，是通过纳米传感器内的敏感染料与参比染料的荧光比值变化直观反映胞内pH的变化，实现细胞内pH变化的动态监测。
Description
技术领域：
本发明涉及纳米材料领域，具体涉及一种具有内参比的纳米pH传感器的制备方法及其应用于细胞内pH变化的实时监测。
背景技术：
许多重要的生命活动如细胞生长与分化、钙调节、细胞凋亡等都密切与细胞内的pH相关，由于细胞的大小在几个微米到几十微米之间，测量细胞内的pH变化需要发展小型的传感器，较早发展的纳米和微米级别的光纤、光电极需要穿透细胞才能检测细胞内的pH，但同时也会对细胞造成伤害，引起细胞生理变化而干扰pH的测量。发展非侵入式的、高灵敏、响应迅速的实时检测方法是对传感器发展的新要求，应运而生的PEBBLES传感器制备过程复杂，包埋的敏感染料也局限于亲脂性染料，而且传感器借助微量注射、基因枪传递的方法进入细胞需要昂贵的仪器并需专业人员操作。而新发展的脂质体传感器虽然容易进入细胞，但是支撑材料与细胞膜融合后，将包裹的敏感染料释放到胞质中会造成对细胞的毒害，而且敏感染料易受到背景荧光信号的干扰造成测量的误差。由于激发光源的波动、光漂白、光纤的传输变化、样品的光散射等都容易造成测量信号的变化，因此包埋单一敏感染料的传感器通过荧光信号的变化也不能准确地反映pH的变化，因此上述传感器难以满足对细胞内pH的变化实现非侵入式、高灵敏、准确、实时的动态监测。
发明内容：
针对上述传感器的缺陷，克服细胞穿刺或染料泄漏或光信号波动带来的测量不准确性，本发明所要解决的技术问题是合成一种同时包埋有参比染料和敏感染料的性能稳定的纳米pH传感器，实现活细胞内pH动态变化的无创伤监测。
为此，本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器的制备方法，其特征在于制备工艺流程为：将油相环己烷、表面活性剂曲拉通X-100(TritonX-100)和助表面活性剂正己醇按体积比4.2∶1∶1混合均匀，加入适量水作为分散相，搅拌至溶液呈澄清透亮的油包水微乳液；加入敏感染料和参比染料混合液，搅拌均匀；加入等体积的硅烷化试剂正硅酸乙酯(TEOS)和催化剂氨水，反应持续24h。反应完成后丙酮破乳，无水乙醇和超纯水离心洗涤，得到同时包埋敏感染料和参比染料的硅壳荧光纳米传感器，即具有内参比的硅壳荧光纳米传感器。
所述的敏感染料通过如下方法制备：pH敏感染料优选异硫氰酸荧光素FITC，将异硫氰酸荧光素FITC溶液与氨基硅烷化试剂γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)等摩尔混合，室温避光条件下反应过夜，得到产物γ-氨基丙基三乙氧基硅烷-异硫氰酸荧光素APTES-FITC作为制备荧光纳米传感器的敏感染料
所述的参比染料为对pH变化不敏感的联钌吡啶Rubpy。
利用与敏感染料异硫氰酸荧光素FITC连接的氨基硅烷化试剂APTES的水解共价交联到正硅酸乙酯水解形成的网络结构中，同时利用参比染料联钌吡啶Rubpy所带的正电荷而静电吸引嵌合到该网络结构中，实现同时包埋敏感染料和参比染料到硅壳荧光纳米传感器中。
所述的具有内参比的硅壳荧光纳米传感器用于活细胞内pH的无创伤监测，其具体步骤为：将体外培养的细胞与纳米pH传感器共培育，纳米传感器易于被细胞吞噬而无创伤地进入细胞，胞内的H+穿过二氧化硅外壳的网络结构与包埋其内的染料发生作用，敏感染料与参比染料的荧光比值发生变化，通过纳米传感器内的敏感染料与参比染料的荧光比值变化直观反映胞内pH的变化，实现细胞内pH变化的动态监测。
具有内参比的硅壳荧光纳米传感器用于活细胞内pH的无创伤监测，其特征在于：所述的纳米pH传感器呈球形，尺寸为40±5nm，在水溶液中具有良好的分散性，易于被细胞吞噬而无创伤进入细胞。
本发明具有如下优点：
其一是本发明的硅壳荧光纳米pH传感器尺寸在40nm左右，大小均一，在水溶液中的分散性好，与细胞作用时易于被细胞吞噬而可以无创伤地进入细胞，免除了其他类型传感器或穿透或用基因枪等注射方式进入细胞而引发的细胞损伤变化。
其二是本发明的硅壳荧光纳米pH传感器结构是以二氧化硅为外壳的染料包埋其内的核壳型纳米颗粒，二氧化硅的外壳理化性能稳定，具有生物相容性，而且可以避免染料的泄漏而带来的测量不准确以及对细胞的毒害作用，同时包埋其内的染料抗光漂白性能大大增加，提高了测量的可靠性。
其三是用同时包埋参比染料和敏感染料的纳米颗粒用作pH传感器，通过敏感染料荧光信号与参比染料荧光信号的比值反映胞内pH的变化，可以避免激发光源的波动、光漂白、光纤的传输变化、样品的光散射等造成的测量误差。
本发明的纳米pH传感器可以实现无创胞内pH的定量分析，为研究细胞正常功能和病理状态下的生命活动提供了一种准确而灵敏的方法与工具，为阐释细胞pH变化与细胞许多重要生命活动如细胞生长与分化、钙调节、细胞凋亡之间的关系提供了一种研究手段。
附图说明：
现结合附图对本发明做出说明。
图1为本发明的硅壳荧光纳米传感器的原子力扫描形貌图。
制备的纳米颗粒直径在40nm左右，呈典型的球形，在水中具有良好的分散性，易于被细胞吞噬。
图2为本发明的硅壳荧光纳米传感器在pH缓冲液中的响应曲线。
图中1代表在pH9.18的缓冲液中荧光纳米传感器的响应曲线
2代表在pH7.2的缓冲液中荧光纳米传感器的响应曲线
3代表在pH4.49的缓冲液中荧光纳米传感器的响应曲线
520nm处的荧光峰为敏感染料异硫氰酸荧光素FITC的特征峰，595nm处的荧光峰为参比染料联钌吡啶Rubpy的特征峰。两种染料能同时包埋在纳米颗粒中，而且敏感染料异硫氰酸荧光素FITC具有良好的pH响应，随着缓冲液的pH降低而荧光值显著下降，而参比染料则对pH不敏感，荧光强度基本保持不变，因此用异硫氰酸荧光素FITC的荧光强度与联钌吡啶Rubpy的荧光强度的比值作为测量信号可以更为科学和准确地反映pH的变化。
图3本发明的硅壳荧光纳米传感器对pH响应的标准曲线。
图4为本发明的硅壳荧光纳米传感器用于巨噬细胞内pH的监测。
其中A为细胞内纳米颗粒的异硫氰酸荧光素FITC的荧光成像图，
B为细胞内纳米颗粒的联钌吡啶Rubpy荧光成像图，
C为细胞透射光成像图，
D为A和B的叠加图。
图4-1为对照，即没有加入药物氯喹处理时小鼠巨噬细胞内荧光的分布，此时IFITC/IRubpy＝0.4823，根据标准曲线计算得知溶酶体内pH4.75)
4-2为加入药物氯喹处理5min时小鼠巨噬细胞内荧光的分布，此时IFITC/IRubpy＝0.7553，根据标准曲线计算得知溶酶体内pH升至6.50
4-3为加入药物氯喹处理15min时小鼠巨噬细胞内荧光的分布，此时IFITC/IRubpy＝0.7865，根据标准曲线计算得知溶酶体内pH升至6.70
4-4为加入药物氯喹处理20min时小鼠巨噬细胞内荧光的分布，此时IFITC/IRubpy＝0.7943，根据标准曲线计算得知溶酶体内pH升至6.75
4-5为加入药物氯喹处理25min时小鼠巨噬细胞内荧光的分布，此时IFITC/IRubpy＝0.8145，根据标准曲线计算得知溶酶体内pH升至6.88
4-6为加入药物氯喹处理40min时小鼠巨噬细胞内荧光的分布，此时IFITC/IRubpy＝0.8083，根据标准曲线计算得知溶酶体内pH波动到6.84
图5为本发明的硅壳荧光纳米传感器用于肝癌细胞内pH的动态监测。
图中4为加入0.1mmol/L琥珀酸后肝癌细胞内pH的变化情况
5为加入1mmol/L琥珀酸后肝癌细胞内pH的变化情况
6为加入3mmol/L琥珀酸后肝癌细胞内pH的变化情况
7为加入4mmol/L琥珀酸后肝癌细胞内pH的变化情况
8为加入5mmol/L琥珀酸后肝癌细胞内pH的变化情况
9为加入10mmol/L琥珀酸后肝癌细胞内pH的变化情况
具体实施方式：
实施例一，制备具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器：
第一步，首先配置敏感染料和参比染料的溶液：将0.1mol/L的饱和异硫氰酸荧光素FITC溶液与氨基硅烷化试剂γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)等摩尔混合，室温避光条件下反应过夜，将得到的产物FITC-APTES(80μL)和0.1mol/L的联钌吡啶溶液(10μL)混合均匀，待用。
第二步，将环己烷(7.5mL)、表面活性剂曲拉通X-100(TritonX-100，1.8mL)和助表面活性剂正己醇(1.8mL)混合均匀，加入310μL水作为分散相，搅拌至溶液呈澄清透亮的油包水微乳液，加入第一步制备的敏感染料和参比染料混合液，搅拌均匀，加入硅烷化试剂正硅酸乙酯(TEOS)200μL和催化剂氨水200μL，反应持续24h。微乳液中的FITC-APTES水解共价交联到TEOS水解后形成的网络结构中，而联钌吡啶Rubpy则利用其所带的正电荷而被静电吸引嵌合在网络结构的内部，这样达到将两种染料同时包埋到纳米颗粒中的目的。反应完成后丙酮破乳，用无水乙醇和超纯水分别离心洗涤4次，得到同时包埋敏感染料和参比染料的硅壳荧光纳米传感器(具有内参比的硅壳荧光纳米传感器)，生成的纳米传感器如图1所示的纳米颗粒型材料，从图1照片可见纳米传感器呈球形，大小均匀，尺寸在40nm左右，分散性好。同时纳米传感器中的敏感染料异硫氰酸荧光素具有对pH良好的响应性能，而参比染料联钌吡啶则对pH的变化不敏感，如图2所示。
实施例二，具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器用于巨噬细胞内pH的无创伤监测
第一步，绘制纳米传感器对pH响应的标准曲线，具体过程为：将5μL纳米颗粒加入到不同pH的200μL缓冲液中，反应5min后，将溶液滴到固定在激光共聚焦显微镜载物台上的载玻片上，记录纳米颗粒内敏感染料异硫氰酸荧光素FITC和参比染料联钌吡啶Rubpy各自的相对荧光强度，计算两者的荧光比值(IFITC/IRubpy)，实验重复三次。以pH为横坐标、IFITC/IRubpy为纵坐标绘制纳米颗粒对PH的响应曲线，如图3，纳米传感器对pH响应的线性范围是4-7.5，由于正常生理条件下细胞质和细胞器内的pH变化刚好在pH5-7的范围，因此本发明的纳米传感器非常适合细胞内pH的测量。
第二步，将无菌培养的小鼠迅速处死，在不破坏其内脏器官和血管的前提下，收集腹水细胞进行体外培养(37℃，5％CO2)4h后，去掉未贴壁的中性粒细胞和白细胞，换新鲜培养基，继续培养过夜。
第三步，将预先超声均匀的8μL纳米传感器悬浮液，用1mL无血清培基稀释分散，然后与第一步培育好的巨噬细胞于37℃下共培育30min，弃培养基，观察前用冷的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)润洗细胞三次，去掉未被细胞吞噬的培养基中多余的纳米传感器以及非特异性吸附在巨噬细胞表面的纳米传感器。由于纳米传感器的尺寸在40nm左右，巨噬细胞很容易通过溶酶体途径将传感器内吞到细胞内，将纳米pH传感器无创伤的导入细胞。
第四步，药物处理细胞诱导胞内pH变化并进行动态监测。将第三步培育的细胞固定到激光共聚焦显微镜载物台上，选定一个细胞或一个代表性的视野，将仪器各项参数调到与绘制标准曲线时的相同，然后记录异硫氰酸荧光素FITC与联钌吡啶Rubpy的荧光比值IFITC/IRubpy(对照组)。加入氯喹(终浓度200μmol/L)后于不同时间段观察细胞内纳米颗粒的荧光强弱变化，记录荧光比值IFITC/IRuby。溶酶体内是一个酸性环境，pH值在4.5-5之间，预先与巨噬细胞培育的荧光纳米传感器主要通过溶酶体途径内化，因此溶酶体中含有较多的纳米传感器，在溶酶体酸性条件下的纳米传感器内敏感染料异硫氰酸荧光素FITC荧光被熄灭，而传感器内的参比染料联钌吡啶Rubpy对pH不敏感，因此对照组中的IFITC/IRubpy比值低，如图4-1。氯喹加入后扩散进入细胞作用于溶酶体引起pH升高，纳米传感器内异硫氰酸荧光素的荧光恢复，因此IFITC/IRubpy比值在加入氯喹后升高，如图4所示，当加入药物20min后IFITC/IRubpy比值达到饱和，不再升高。通过敏感染料与参比染料的荧光比值变化可以准确反映出细胞内pH加入药物前后的变化，实现胞内pH的无损伤动态监测。
实施例三，具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器用于肝癌细胞内pH的无创伤监测
第一步，观察细胞内pH之前24h预先培育好肝癌细胞至70％覆盖率，弃培养基。将预先超声均匀的8μL纳米传感器悬浮液，用1mL无血清培基稀释分散，然后加入到培育有肝癌细胞的培养皿中，于37℃下共培育4h，由于纳米传感器的尺寸在40nm左右，肝癌细胞可以将传感器内吞到细胞内，实现纳米pH传感器无创伤的导入肝癌细胞。观察前用冷的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)润洗细胞三次，去掉未被细胞吞噬的培养基中多余的纳米传感器以及非特异性吸附在肝癌细胞表面的纳米传感器，然后加入1mL pH6.5的PBS。
第二步，向第二步制备的肝癌细胞中加入不同浓度的弱有机酸如琥珀酸，弱有机酸能以非离子的形式迅速扩散到细胞内而酸化体外培养的肿瘤细胞，胞内的纳米传感器的荧光相应地发生变化，从而实现胞内的pH动态监测，如图5，低浓度的琥珀酸对细胞pH的影响不大，当浓度增加到4mmol/L时，胞内pH迅速下降，造成细胞内不可逆的永久性的酸化，通过pH的监测可以为癌症治疗提供了一种新的抗癌策略。
Claims (6)
1.一种具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器的制备方法，其特征在于制备工艺流程为：将油相环己烷、表面活性剂曲拉通TritonX-100和助表面活性剂正己醇按体积比4.2∶1∶1混合均匀，加入适量水作为分散相，搅拌至溶液呈澄清透亮的油包水微乳液；加入敏感染料和参比染料混合液，搅拌均匀；加入等体积的硅烷化试剂正硅酸乙酯TEOS和催化剂氨水，反应持续24h。反应完成后丙酮破乳，无水乙醇和超纯水离心洗涤，得到同时包埋敏感染料和参比染料的硅壳荧光纳米传感器，即具有内参比的硅壳荧光纳米传感器。
2.如权利要求1所述的具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器的制备方法，其特征在于：所述的敏感染料通过如下方法制备，pH敏感染料优选异硫氰酸荧光素FITC，将异硫氰酸荧光素FITC溶液与氨基硅烷化试剂γ-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES等摩尔混合，室温避光条件下反应过夜，得到产物γ-氨基丙基三乙氧基硅烷-异硫氰酸荧光素APTES-FITC作为制备荧光纳米传感器的敏感染料。
3.如权利要求1或2所述的具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器的制备方法，其特征在于：所述的参比染料为对pH不敏感的联钌吡啶Rubpy。
4.如权利要求3所述的具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器的制备方法，其特征在于：利用与敏感染料异硫氰酸荧光素FITC连接的氨基硅烷化试剂APTES的水解共价交联到正硅酸乙酯水解形成的网络结构中，同时利用参比染料联钌吡啶Rubpy所带的正电荷而静电吸引嵌合到该网络结构中，实现同时包埋敏感染料和参比染料到硅壳荧光纳米传感器中。
5.一种如权利要求1所述的具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器用于活细胞内pH的无创伤监测，其特征在于：将体外培养的细胞与纳米pH传感器共培育，纳米pH传感器易于被细胞吞噬而无创伤地进入细胞，胞内的H+穿过二氧化硅外壳的网络结构与包埋其内的染料发生作用，敏感染料与参比染料的荧光比值发生变化，通过纳米pH传感器内的敏感染料与参比染料的荧光比值变化直观反映胞内pH的变化，实现细胞内pH变化的动态监测。
6.如权利要求5所述的具有内参比的硅壳荧光纳米pH传感器用于活细胞内pH的无创伤监测，其特征在于：所述的纳米pH传感器呈球形，尺寸为40±5nm，在水溶液中具有良好的分散性，易于被细胞吞噬而无创伤进入细胞。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20071031 Termination date: 20100924 |