CN1569253A

CN1569253A - 一种组织器官修复材料的制备方法

Info

Publication number: CN1569253A
Application number: CN 200410034113
Authority: CN
Inventors: 林峰; 王小红; 颜永年; 熊卓; 吴任东; 张人佶; 卢清萍
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2004-04-23
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2005-01-26

Abstract

一种组织器官修复材料的制备方法，涉及一种组织和复杂器官修复材料的制备方法。本发明以PHBHHx为主要原料，制得膜状、单管、多管或网管状材料；通过复合PLLA、PLGA、PCL、PU等可降解高分子材料以及药物、生长因子、细胞等成分，可制备一种能同时满足多种组织与复杂器官修复所需求的具有良好的抗凝血性、生物相容性、较高的机械强度和韧性、降解速率与血管和复杂器官生长速率相匹配等多方面性能的组织器官修复材料。

Description

一种组织器官修复材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物组织修复材料，尤其涉及一种复杂器官修复材料的制备方法。

背景技术

人体有多种管道系统经常因损伤、狭窄等原因需要进行修复或保持功能稳定。以血管为例，当血管由于动脉硬化、血管老化或破损等原因而不能正常工作时，需要进行血管移植。由于异体器官强烈的排异反应、来源少、价格昂贵等原因，使人造血管的研究越来越受到重视。早在上世纪40年代，有人就开始研究生物体血管的移植，当时限于条件，只能采用硬质塑料管代替血管植入生物体内，由于严重的凝血反应，实验没有一例成功。1952年Voorhees在一次实验中偶然发现植入生物体内的真丝缝线上覆盖有一层内皮细胞，他设想假定植入生物体内的织物也发生同样的现象，就能避免血液和植入物的直接接触而防止凝血现象的产生。目前人造血管使用最多的原料是聚酯、聚四氟乙烯纤维。内径大于10mm的人造血管一般用机织物或针织物制成的波纹状管子。管壁保持适当的紧密程度和孔洞，使周围组织能附在血管外壁并通过管壁向内生长，并使血管内壁覆盖一层内皮细胞。内径在6mm-10mm的人造血管一般用具有微孔效应的生物惰性材料聚四氟乙烯组成，不需要覆盖内皮细胞来防止凝血现象。直径在6mm以下的人造窄腔血管因闭塞等原因，临床上还没有得到应用。

Annis用聚氨酯和丁二醇的共聚物复合内皮细胞。Shinoka用Polyglatin/聚乙二醇酸(PGA)复合从羊颈总动脉或颈外静脉获得的混合细胞成分(包括内皮细胞(ECs)、平滑肌细胞(SMC)与成纤维细胞[Shinoka T，Shum-Tim D，Ma PX，et al.Creation of viable pulmonaryartery autografts through tissue engineering.J Thorac Cardiovasc Surg，1998；115：536-545]。Shum-Tim等用羟基烷烃的聚合物(Poly hydroxyalkanoate，PHA)的一类(即聚辛酸加10％的聚己酸)作支架材料，构建了内层以有孔的PGA支架网作为种子细胞的载体，外层用无孔的PHA作支撑的厚度为1.5mm的幼羊腹主动脉[Shum-Tim D，Stock U，Hrkach J，et al.Tissue engineering of autolgouis aorta using a new biodegradablepolymer.Ann Thorac Surg，1999；68：2293-2305]。Niklason等以PGA为支架复合SMC和ECs，用搏动性灌注系统培育小口径的组织工程血管[Niklason LE，Gao J，Abott WM，et al.Functional arteries grown in vitro.Science，1999；284：489-493]。Weinberg和Bell等以动物胶原蛋白为基质材料，培养SMC、ECs及成纤维细胞制备全生物化组织工程血管。由于血管对抗凝血性、机械强度等的特殊要求，以上组织工程血管都存在着一定的局限性，目前难以推广应用。

3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物[Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，PHBHHx]是一种由细菌合成的胞内聚酯，在细菌细胞内以颗粒状内含物形式存在。PHBHHx既具备与以石油化工原料得到的塑料相似的热塑性，力学性能，又具备生物可降解性，被认为是一种很有前途的“新型生物可降解材料”，倍受人们的重视。目前PHBHHx已被用于成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞等培养的支架材料[Yang XS，Zhao K，Chen GQ.Effect of surfacetreatment on the biocompatibility of microbial polyhydroxyalkanoates.Biomaterials，2002；23：1391-1397；Zhao K，Deng Y，Chen JC，Chen GQ.Polyhydroxyalkanoate(PHA)scaffolds with good mechanical properties and biocompatibility.Biomaterials，2003；24：1041-1045]，其力学强度、生物相容性比其它聚酯类(PLLA，PLGA，PHB等)要好，但降解速率很慢。目前还没有一种材料能同时满足小直径血管与复杂器官的微细血管所需求的良好的抗凝血性、较高的机械强度和韧性、降解速率与血管生长速率相匹配的多方面性能的组织器官修复材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织器官修复材料的制备方法，尤其是管道状修复材料及其制备方法。选择主要原料为PHBHHx并复合聚乳酸(PLLA)、乳酸与乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、羟基丁酸与羟基戊酸共聚物(PHBV)等生物可降解高分子以及药物、生长因子、细胞等成分，制备一种能同时满足多种组织与复杂器官修复所需求的具有良好的抗凝血性、生物相容性、较高的机械强度和韧性、降解速率与血管和复杂器官生长速率相匹配等多方面性能的组织器官修复材料。

本发明的技术方案如下：

一种组织器官修复材料的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)分子量10万～30万的3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚物与分子量为10万～30万的PLLA、PLGA、PHBV或PCL的高分子材料按重量比10～1∶1～10加入到有机溶剂氯仿、1，4-二氧六环或二甲基亚砜中，配制成浓度为1～10％的高分子溶液；

2)在制备的上述溶液中加入占高分子材料重量比为0-100％的致孔剂，所述的制孔剂采用NaCI、NH₄HCO₃、(NH₄)₂CO₃或重量比为1～10∶1的NaCI与NH₄HCO₃、(NH₄)₂CO₃的混合物；

3)膜状或管状支架材料制备：将步骤1)或2)中制备的液体倒在玻璃器皿中，流延成膜；或采用快速成形、缝织法、缠绕法、编制方法制备各种形状和结构的框架支持物，或用金属丝、塑料丝、电线及其编成的纺锤体或可溶性的组织器官管道网状体作为支持物，在其上涂覆或浇注由步骤2)制备的溶液，自然凉干、冻干或加热使其溶剂挥发，将支持物抽掉或将其溶解掉，即制得单管、多管或网管状支架材料；

4)将步骤3)制得的含有致孔剂的膜状或管状支架材料在蒸馏水中浸泡，除去致孔剂，冻干，得到膜状或管状组织修复材料。

在上述步骤1)中的溶液中可加入占高分子材料重量比为小于10％的紫杉醇、或占高分子材料重量比为1～200％的羟基磷灰石或磷酸钙。

在本发明的上述技术方案中，由步骤3)或步骤4)制得的组织修复材料可采用等离子喷涂、吸附或化学交联方法复合多肽、生长因子、胶原、壳聚糖、明胶或胶原/壳聚糖材料，或在所制得的组织修复材料内外涂抹或注射组织器官细胞、骨髓细胞或干细胞的悬浮液，以进一步增加材料的生物相容性和提高修复速度。

本发明将所制得的组织修复材料还可在浓度为0.1～1％的肝素钠、右旋糖苷、羧基化硫酸酯化壳聚糖、水蛙素、磷脂酶抑制剂或环氧酶抑制剂的水溶液与丙酮按体积比为1∶1的混合液中浸泡4～6h，直接凉干或依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚后凉干，增加材料的抗凝血性能。

所制得的管状组织修复材料若作为内支架，可在其管壁上打出园形、扁形、方形、梯形或网格状孔，可进一步提高其降解速率。

用本发明所提供的方法制备的组织器官修复材料能同时满足多种组织与复杂器官修复所需求的良好的抗凝血性、生物相容性、较高的机械强度和韧性、其降解速率与血管和复杂器官生长速率相匹配的等多方面性能要求。

具体实施方式

实施例1：

将1g PHBHHx(Mw：1,000,00Da)溶于100mL丙酮中60℃下回流1h。然后将分子量为10万的PHBHHx丙酮溶液离心(5000g，20min)，以除去不溶性颗粒。往悬浮液中加入甲醇得到高纯度的PHBHHx沉淀物。将纯化后的PHBHHx与PLGA按1∶10比例溶于氯仿中，配成1％的聚合物溶液。然后将该溶液倒在平板上制成3mm厚的膜状材料；

将0.1％的肝素钠水溶液，与丙酮按1∶1(V/V)混溶。将制备的膜状材料在该溶液中浸泡4h，直接凉干。由此制备的膜状材料可用于心血管系统的修复或修补。也可用于血管吻合或血管狭窄时的内支架。

实施例2：

将纯化后的分子量为20万的PHBHHx与PLGA按10∶1比例溶于氯仿中，充分搅拌并静止除去气泡。在上述制备的溶液中加入占高分子材料重量比为100％的NaCI致孔剂，然后倒在聚四氟乙烯平板上流延成薄膜。

将上述制得的薄膜在蒸馏水中浸泡1天，除去致孔剂，冻干，得组织修复材料。

将1％的右旋糖苷水溶液与丙酮按1∶1(V/V)混溶。将上述(2)制备的薄膜在溶液中浸泡6h，依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚后凉干。由此制备的膜状可用于心血管系统的修复或修补。

分别在上述制备的薄膜材料内外层微孔中复合骨髓细胞，用于血管修复效果更佳。

实施例3：

将纯化后的分子量为30万的PHBHHx与PLLA按10∶1比例溶于氯仿中，配成2％的高分子溶液，再加入摩尔比为1％的紫杉醇及10％的NaCI，充分搅拌并静止除去气泡。然后涂附在塑料线外围成管状支架。

将0.1％的羧基化硫酸酯化壳聚糖与丙酮按1∶1(V/V)混溶。将上述制备的管状支架在溶液中浸泡4h，直接凉干或依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚后凉干。由此制备的管状材料可用于心血管系统的修复或修补。

将上述制备的管状材料分别在内外层(或管内、外膜上)复合骨髓细胞后与损伤血管连接。也可作为血管吻合或血管狭窄时的内支架。

实施例4：

将蔗糖和右旋糖酐按5∶1比例混合，加热至100℃，加入2滴蒸馏水，拔成直径为丝3mm的糖芯。用快速成形机在低温下，将分子量为20万的PHBHHx与PLGA(2∶1)的1，4-二氧六环混合溶液，以离散-堆积的原理，低温下在糖芯外形成一层PHBHHx与PLGA的凝固液，冻干。

将上述制得的样品放入蒸馏水中，溶解掉其中的糖芯，得管状多孔管状血管胚体。

实施例5：

将纯化后的分子量为10万的PHBHHx与PLGA按1∶10比例溶于氯仿中，配成5％的聚合物溶液，加入摩尔比为1％的紫杉醇，充分搅拌并静止除去气泡。然后塑料线外围成管状支架。

将10％的磷脂酶抑制剂与丙酮按1∶1(V/V)混溶。将上述制备的管状支架在溶液中浸泡6h，依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚后凉干。由此制备的管状材料可用于心血管系统的修复或修补。也可在支架壁上打园形孔用于血管吻合或血管狭窄时的内支架。

实施例6：

将纯化后的分子量为30万的PHBHHx与PLLA按10∶1比例溶于氯仿中，配成1％的高分子溶液。各加入摩尔比为1％的紫杉醇及1％的NH₄HCO₃颗粒。先在聚四氟乙烯板上流延成直径为1mm的膜，60℃下将溶剂挥发掉。

将0.1％的水蛙素水溶液与丙酮按1∶1(V/V)混溶。将上述制备的薄膜在溶液中浸泡4h，依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚后凉干。由此制备的膜状材料可用于心血管系统的修复或修补。

在上述制备的材料分别在内外层(或管内、外膜上)种植内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞，增强其抗凝血性和机械强度，用于血管修复效果更佳。

实施例7：

将纯化后的分子量为10万的PHBHHx溶于氯仿中，将甲壳素溶于三氯乙酸/二氯乙烷(3.6∶6.5w/w)溶液中，分别配成2％的高分子溶液。先在聚四氟乙烯板上，或塑料线外围涂覆一层PHBHHx溶液，等溶剂挥发后在PHBHHx外再倒或涂一层甲壳素溶液。

由上述制备的膜干后用丙酮浸炮20min，形成双层外层结构的膜或管后在1％氨水中浸泡30分钟，蒸馏水洗净，制得的双层膜，可用作止血材料或皮肤修复材料。

实施例8：

将有机溶剂1，4-二氧六环中加入分子量30万纯化的PHBHHx和PLGA(重量比为10∶1)，配制成浓度为5％的溶液。将羟基磷灰石溶于少量冰醋酸中，然后按重量比200％加入到PHBHHx和PLGA溶液中。

将溶液倒在容器中，-20℃下冷冻、冻干，制备厚为3mm的块状材料。由此得到的膜状或块状材料可直接用于骨修复材料或用于引导骨、牙再生的可吸收性膜。

实施例9：

将有机溶剂二甲基亚砜中加入分子量30万纯化的PHBHHx和PLGA(重量比为1∶10)，配制成浓度为10％的溶液。将磷酸钙溶于微量盐酸中，然后按重量比1％加入到PHBHHx和PLGA溶液中。

将溶液倒在玻璃器皿中，流延成膜，-4℃下冷冻、冻干。由此得到的膜状材料可直接用于骨修复材料或用于引导骨、牙再生的可吸收性材料。内层吸附骨形成蛋白，冻干后再加一层PHBHHx膜。与软组织接触的致密层具有良好的细胞隔离功能，与骨或牙接触的多孔层起到稳定血凝块的作用，并使骨细胞与膜结合。

实施例10：

将纯化后的PHBHHx与PLLA按10∶1比例溶于氯仿中，配成1％的高分子溶液。将羟基磷灰石溶于少量冰醋酸中，然后按重量比100％加入到PHBHHx与PLLA溶液中。

将一块由电喷丝形成的甲壳素/壳聚糖无纺纤维布放在一容器中，将上述制备的混合物倒在其上，并渗到底部，在-20℃下冻干，制备厚为～1mm的膜状材料。将样品放入含量为0.5％的骨形成蛋白生理盐水悬浮液中，吸附一层骨形成蛋白，再冻干。由此所得的膜状材料可直接用于骨修复材料或作为用于引导骨、牙再生的可吸收性双层膜。

实施例11：

将纯化后分子量为30万的PHBHHx与PCL按1∶10比例溶于氯仿中，配制成浓度为20％的溶液。

在上述制备的溶液中可加入重量比为100％的NaCI与NH₄HCO₃两者的混合物(重量比为1∶1)颗粒(粒径小于10μm)作为致孔剂。

用快速成形仪制备厚为0.1mm的管状材料。可在管状材料的管壁上打孔、切割等制备梯形、网格状内支架。

将上述制得的管状支架在蒸馏水中浸泡2天，除去致孔剂，冻干。由此得到的管状材料可直接用于胆管、食管系统、气管系统、尿路系统、肠道系统、输卵管系统及神经系统等的修复或修补。

实施例12：

将分子量10万的PHBHHx与PCL按重量比10∶1加入到有机溶剂氯仿中，加热并搅拌，配制成浓度为1％的溶液。

用10根细电线编成的纺锤形的支持物，并在其上涂覆由上述制备的溶液，凉干，成一纺锤形支架。

将上述制备的纺锤形支架放入一模具中，并倒入浓度为1％的胶原溶液，冻干，用碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液交联，然后抽掉其中纺锤形的支持物，得一纺锤形器官修复支架，再将表皮细胞生长因子、内皮细胞悬浮液用手搓进支架的孔隙中。由此制备的材料可用于肝、肾、胰腺或肺等复杂器官修复。

实施例13：

将分子量20万的PHBHHx与PHBV按重量比1∶10加入到1，4-二氧六环中，配制成浓度为2％的溶液。在上述制备的溶液中可加入重量比为100％的(NH₄)₂CO₃作为致孔剂。

用过氯乙烯灌注网管系统，固化后将网管系统溶解掉。再在灌注物外围涂覆一层由上述制备的溶液，冻干，得一支架材料。

将上述制备的支架材料放入一模具中，并倒入浓度为1％的胶原/壳聚糖溶液，冻干，25％的氨水浸泡20min，蒸馏水中浸泡1天，冲洗干净。

用丙酮将步骤上述中制备的材料中的过氯乙烯溶解掉。将表皮细胞生长因子与内皮细胞、肝细胞注射在内、外层，用于肝组织修复。

实施例14：

将分子量20万的PHBHHx与PU按重量比10∶1加入到1，4-二氧六环中，配制成浓度为2％的溶液。在溶液中可加入重量比为10％的NH₄HCO₃作为致孔剂。

用电喷丝技术制备一团结构致密的壳聚糖无纺纤维网(2cm×2cm)，无纺纤维网两头削尖，放入一圆柱状模具中，加入上述制备的溶液，-20℃下冷冻、冻干，得一支架材料。

将以上制备得支架材料放入0.2M的醋酸溶液中，浸泡1天，蒸馏水冲洗干净、再冻干。

将上述制备的材料管内复合表皮细胞生长因子、内皮细胞，外层复合肾细胞，用于肾修复。

实施例15：

将分子量20万的PHBHHx与PLGA按重量比1∶1加入到1，4-二氧六环中，配制成浓度为2％的溶液。在溶液中可加入重量比为10％的(NH₄)₂CO₃作为致孔剂。

用编制法将壳聚糖纤维编制成直径1.5cm的纤维束，两头削尖，放入一两头尖的纺锤形模具中，加入上述制备的溶液，-20℃下冷冻、冻干，去掉模具。

将上述制备的材料放入0.2M的醋酸溶液中，浸泡1天，蒸馏水冲洗干净、再冻干。

将所制备的材料内层复合表皮细胞生长因子、内皮细胞，外层复合肺细胞用于肺的修复。

Claims

1.一种组织器官修复材料的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)将分子量10万～30万的3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚物与分子量为10万～30万的PLLA、PLGA、PHBV或PCL的高分子材料按重量比10～1∶1～10加入到有机溶剂氯仿、1，4-二氧六环或二甲基亚砜中，配制成浓度为1～10％的高分子溶液；

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤1)中的溶液中加入占高分子材料重量比为小于10％的紫杉醇、或占高分子材料重量比为1～200％的羟基磷灰石或磷酸钙。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：由步骤3)或步骤4)制得的组织修复材料采用等离子喷涂、吸附或化学交联方法复合多肽、生长因子、胶原、壳聚糖、明胶或胶原/壳聚糖材料。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在所制得的组织修复材料内外涂抹或注射组织器官细胞、骨髓细胞或干细胞的悬浮液。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将所制得的组织修复材料在浓度为0.1～1％的肝素钠、右旋糖苷、羧基化硫酸酯化壳聚糖、水蛙素、磷脂酶抑制剂或环氧酶抑制剂的水溶液与丙酮按体积比为1∶1的混合液中浸泡4～6h，直接凉干或依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚后凉干，增加材料的抗凝血性能。

6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所制得的管状组织修复材料，若作为内支架，可在其管壁上打出园形、扁形、方形、梯形或网格状孔。