CN1563972A - 一种集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于芯片毛细管电泳过程中新测试原理而建立起的新的电化学检测方法及装置,先利用芯片毛细管专用高压电源监控分离管道和加样管道是否畅通,然后在分离管道上加较长时间的高压,将工作电极活化;在管道通畅且电极处理好之后,将工作电极夹在与三维调节器配套的光纤夹上,在体视显微镜下将工作电极的前端放置在微管道的。通过精密的三维调节装置将超微圆盘碳纤维工作电极放置在微管道的内部,实现了对非电活性和电活性物质的高效分离检测。突破了原有电化学测试技术的检测范围,既能检测电活性物质,而且又能检测非电活性物质。通过正确控制特殊部位的电位和工作电极的位置,对无机、有机样品进行高效分离和高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明是一种集成于芯片毛细管电泳的新型电化学检测技术及专用装置,具体地说,是在集成电化学技术和芯片毛细管电泳分离技术的过程中,通过精确控制电化学工作电极的位置,对样品进行高效分离和高灵敏度检测。
背景技术
目前分析科学的研究前沿热点之一就是微全分析系统。传统的分析仪器和手段都需要大量的人力物力,整个过程自动化程度非常低,同时试剂和能源的消耗量较大,这些都给分析科学在今后的发展造成了不利影响。在此背景之下,微全分析系统的研究应运而生。微全分析系统可以将实验室整个分析流程如样品处理、样品过滤、样品分离和样品检测等集成在一小块芯片上进行,可以实现整个分析流程的自动化和微型化,为今后分析仪器成为消费型产品走入千家万户奠定了基础。
目前的微全分析系统的研究中热点较多,其中一个重要的热点就是集成于芯片的高灵敏度检测技术。目前成功商品化的检测方法是激光诱导荧光检测方法,其能够在柱检测通过激光能够受激发出荧光的物质,灵敏度极高,分离效率也较高。但是所检测的物质通常必须衍生化,同时使用激光的成本较高。这样进一步的商品化已经难以实现。相比而言,电化学检测技术是一种高灵敏度、易于微型化的检测技术。电化学检测方法的原理研究基础深厚,比较成熟,仪器商品化程度比较高,微型化的程度也比较高,其完全可能在未来成为被大众接受的检测方法。
但是,目前发展的三种电化学检测方法各有优缺点。安培法可以检测有电活性的物质,灵敏度相对较高,但是工作电极容易被污染;电导法可以检测影响溶液电导的物质,通用性较好,但是灵敏度不高;电位法可以检测特定的物质,选择性比较高,但相对来说应用范围较窄。另一个关键性的问题是工作电极的精确定位,由于管道的微型化,这已成为一个普遍问题。
因此,在芯片中集成新型的低成本、高灵敏度、通用型的电化学检测方法,是将微全分析系统早日商品化并走向千家万户的必经之路。
发明内容
本发明使用简单的仪器设备,克服了现有技术的一些缺点。通过精确控制电化学工作电极的位置,实现了恒电位下对非电活性物质的高灵敏度检测,同时保持了对电活性物质的高灵敏度检测;还提供了一种方便和有效地监控电渗流的方法,非常有利于微全分析系统的商品化应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
微流控芯片固定在芯片支持平台上,将电化学工作电极固定在三维调节器上,然后将缓冲液注入电化学检测池;用真空泵使芯片的加样和分离管道都充满缓冲液;将分离高压电极、分离接地电极、加样高压电极、加样接地电极、电化学参比电极、电化学对电极放在检测位置固定;将各电极连接在所用的电化学仪和芯片毛细管电泳用高压电源上,首先利用芯片毛细管专用高压电源监控分离管道和加样管道是否畅通,然后在分离管道上加较长时间的高压,同时将工作电极活化;其中铂电极用来作为微管道的分离高压、加样高压、分离接地和加样接地电极,在管道通畅且电极处理好之后,将工作电极夹在与三维调节器配套的光纤夹上,在体视显微镜下将工作电极的前端放置在微管道的。其特征是通过精密的三维调节装置将超微圆盘碳纤维工作电极放置在微管道的内部,实现了对非电活性和电活性物质的高效分离检测。工作电极放在微管道的内部出口内大约30-100微米。尤其是50微米左右。
整个装置由一个集成微型三维调节器的芯片支持平台构成,同时包括微流控芯片、一台芯片毛细管专用高压电源、一个真空泵、一个超声清洗仪、一个红外灯、若干根铂电极、一个体视显微镜、微电极玻璃拉制仪等组成。将微流控芯片固定在芯片支持平台上。将做好的超微圆盘工作电极夹在与三维调节器配套的光纤夹上,用真空硅脂防漏,注意在工作电极和管道口之间保持一定的距离。在检测池中加好缓冲液后,用真空泵使缓冲液充满管道。首先利用芯片毛细管专用高压电源监控分离管道和加样管道是否畅通,然后在分离管道上加较长时间的高压,同时将工作电极活化。在管道通畅且电极处理好之后,在体视显微镜下将超微圆盘工作电极的前端放置在微管道的出口内大约50微米。
其中铂电极用来作为微管道的分离高压、加样高压、分离接地和加样接地电极,使用的超微圆盘工作电极用直径5-20微米,一般在5-10微米,如8微米左右的碳纤维制作而成。也可采用其它直径为5-20微米的其它如金电极、铂电极、铜电极等。过程如下,在玻璃微电极拉制仪上将玻璃毛细管拉成尖端,在显微镜下将单根碳纤维穿入其尖端后露出大约1毫米长度,用胶水固定,在后面灌入碳粉,用直径为500微米的铜丝塞紧碳粉,用胶水在末端固定。将制成的碳纤维电极在电化学工作站上用阴极电泳漆电镀,然后在170摄氏度下烘20分钟。使用前在显微镜下将碳纤维电极的前端用干净的手术刀切平备用。
该技术的最佳运行参数是:分离电压:200V/cm~500V/cm;工作电极检测电位:+1V-1V(非电活性物质)和0V+2V(电活性物质);运行缓冲液PBS(磷酸盐)溶液用于电活性物质,Tris溶液用于非电活性物质。
本发明的具体效果如下:使用该装置彻底解决了芯片毛细管电泳电化学检测中工作电极与管道口的对准问题,确保了检测检测结果的重现性;更重要的,在保持可以对电活性物质如多巴胺和肾上腺素进行高效分离检测的同时,可以使用该装置可以对非电活性物质如钠离子、钾离子和锂离子等进行检测;另外还可使用该装置对芯片毛细管的状态进行监控,为芯片毛细管电泳在生产上的应用提供了条件;芯片和工作电极可分开更换,可进一步降低成本和消耗。
附图说明
图1为芯片毛细管电泳集成电化学系统的俯视构造示意图。图中:1,带有毛细管的芯片;2,恒电位电化学仪;3,芯片毛细管电泳用高压电源;4,计算机;5,芯片底座;6,整个支持平台的底座;7,分离高压电极;8,分离接地电极;9,加样高压电极;10,加样接地电极;11,电化学工作电极;12,电化学参比电极;13,电化学对电极;14,精密三维调节器;15,带有隔离孔的隔离片;16,电化学检测池。
图2为芯片毛细管电泳集成电化学系统的侧视图。图中:17,电化学检测池的围堰;15,带有隔离孔的隔离片;14,精密三维调节器;6,整个支持平台的底座;5,芯片底座;1,带有毛细管的芯片;18,芯片底座和总底座之间的支架;11,电化学工作电极。
图3为电化学工作电极的放大构造示意图。图中:11-1,碳或其他可作电极材料的纤维;11-2,连接线(铜丝或其它导电材料);11-3,阴极电泳漆;11-4,碳粉;11-5,玻璃管。
图4为本系统的原理图。图中:21,分离高压端;22,分离接地端;11,电化学工作电极;12,电化学参比电极;13,电化学对电极;23,分离通道的反电动势;24,分离通道和接地电极之间的溶液内阻;25,分离通道中高压端到电化学工作电极之间的溶液内阻;26,分离通道电化学工作电极到电化学检测池之间的溶液电阻;27,分离通道和电化学检测池的接点;28,电化学工作电极上的法拉第阻抗;29,电化学工作电极上的充电电容电容;30,电化学检测池中参比电极的溶液内阻;31,电化学检测池中对电极的溶液内阻。
图5为不同浓度PBS进样分离检测的电泳图。
图6为图5中峰面积和进样PBS浓度倒数的关系图。
图7为不同浓度钠离子和锂离子进样分离检测的电泳图。
图8为不同浓度多巴胺和肾上腺素进样分离检测的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实验过程中采用的水均为二次蒸馏水,分离检测的样品均为纯物质。氯化锂、氯化钠、氯化钾、多巴胺和肾上腺素等的母液均用二次蒸馏水配制成10mM的浓度,使用前用分离的运行缓冲液稀释至所需的浓度。分离检测氯化锂、氯化钠和氯化钾可用磷酸盐缓冲液,也可以用Tris缓冲液;分离检测多巴胺和肾上腺素可以用磷酸盐缓冲液。
在图1所示的芯片毛细管电泳集成电化学系统中,实验前先将芯片(1)洗净烘干,然后用双面胶固定在芯片支持平台(5)上,将电化学工作电极(11)固定在三维调节器上(14),隔离片(15)上的隔离孔用真空硅脂填满,然后将缓冲液注入电化学检测池(16);用真空泵使芯片的加样和分离管道都充满缓冲液;将分离高压电极(7)、分离接地电极(8)、加样高压电极(9)、加样接地电极(10)、电化学参比电极(12)、电化学对电极(13)等放在适当的位置固定;将各电极连接在所用的电化学仪(2)和芯片毛细管电泳用高压电源(3)上。电化学仪(2)和芯片毛细管电泳用高压电源(3)均和计算机(4)相连。
这种新型的构形可以在电化学恒电位模式下对电活性和非电活性物质进行高灵敏度的检测。在图4所描述的原理示意图中,施加分离高压后,由于电化学检测池中电化学参比电极之间的溶液内阻(30)、电化学检测池中对电极之间的溶液内阻(31)以及电化学检测池和分离接地电极之间的溶液内阻(26)和微管道中溶液的内阻相比很小,因此在电化学工作电极和电化学检测池之间产生的电位降可以认为是电化学工作电极和分离通道与电化学检测池的接点(27)之间的电位降。当样品塞通过电化学工作电极到达电化学检测池的时候,溶液电阻的变化将产生作用在工作电极充电电容(29)上的电势降。另一方面,样品中具有氧化还原活性的物质将在工作电极上导致法拉第阻抗和氧化还原电位的变化。
对于非电活性样品,溶液电阻的变化导致溶液中溶解氧还原电位的变化,进而引起电流的变化。因此,在一定的条件下,非电活性物质的测定可以通过测量氧电流的变化得以实现。
我们使用磷酸盐缓冲液对以上原理进行了验证。在运行缓冲液为10mM PBS时,用7mM到15mM的PBS溶液进样,考虑到溶液浓度与电阻之间的关系,工作电极电位的变化可写成:
where
c0=-b/a其中c0和c分别代表运行缓冲液和进样溶液的浓度,A为分离管道的截面面积,L代表电化学工作电极伸入管道的距离,A为PBS的当量电导。所得的电泳图见附图5,将得到的峰电流和浓度的倒数作图得到附图6,符合氧动力学伏安曲线。很明显这种方式也可以用来精确测定芯片毛细管电泳中的电渗流。
接下来我们利用本系统分别对非电活性物质(锂离子和钠离子)和电活性物质(多巴胺和肾上腺素)进行了分离检测,实验的电泳图见图7和图8。图7中锂离子和钠离子的峰高在浓度从200μM到1000μM呈现线性关系,而图8中多巴胺和肾上腺素的峰高在50μM到200μM的浓度范围内也同样呈线性。这两个实验结果说明了新系统的高灵敏度、高分离效率和很强的通用性。
Claims (8)
1.一种集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法,微流控芯片固定在芯片支持平台上,将电化学工作电极固定在三维调节器上,然后将缓冲液注入电化学检测池;用真空泵使芯片的加样和分离管道都充满缓冲液;将分离高压电极、分离接地电极、加样高压电极、加样接地电极、电化学参比电极、电化学对电极放在检测位置固定;将各电极连接在所用的电化学仪和芯片毛细管电泳用高压电源上,其特征是首先利用芯片毛细管专用高压电源监控分离管道和加样管道是否畅通,然后在分离管道上加较长时间的高压,同时将工作电极活化;其中铂电极用来作为微管道的分离高压、加样高压、分离接地和加样接地电极,在管道通畅且电极处理好之后,将工作电极夹在与三维调节器配套的光纤夹上,在体视显微镜下将工作电极的前端放置在微管道的,通过精密的三维调节装置将工作电极放置在微管道的内部,实现了对非电活性和电活性物质的高效分离检测。
2.根据权利要求1所述的集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法,其特征是工作电极放在微管道的内部出口内大约30-100微米。
3.根据权利要求1所述的集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法,其特征是在芯片支持平台上的电化学检测池和三维调节器之间有一个特殊设计的隔离片,在隔离片上有一个隔离孔供电化学工作电极穿过,孔的大小要确保工作电极有一定的活动范围。
4.根据权利要求1所述的集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法,其特征是通过集成的电化学检测系统进行芯片毛细管电泳的恒电位检测,包括电化学工作站、工作电极、作为对电极的铂电极或其它电极、作为参比电极的Ag/AgCl或其它电极。
5.根据权利要求1所述的集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法,其特征是在检测非电活性物质时最佳的检测运行参数是:工作电位:-0.5到+2V;运行缓冲液:电导率与被测物有较大差异的水溶液;在检测电活性物质时最佳的检测运行参数是:工作电位:-0.5到+2V;运行缓冲液:水溶液。
6.根据权利要求1所述的集成于芯片毛细管电泳的电化学检测方法,其特征是电化学检测方法,其特征是工作电极材料采用直径为小于5-20微米的碳纤维材料,也可采用其它直径为5-20微米的其它如金电极、铂电极、铜电极等。
7.一种集成于芯片毛细管电泳的电化学检测装置,其特征是工作电极为单根碳纤维圆盘工作电极,用直径5-10微米的碳纤维,单根碳纤维穿玻璃毛细管尖端后露出大约1毫米长度,用胶水固定,在后面灌入碳粉,用直径为500微米的铜丝塞紧碳粉,用胶水在末端固定,将制成的碳纤维电极,阴极电泳漆电镀,烘干。
8、根据权利要求7所述的集成于芯片毛细管电泳的电化学检测装置,其特征是单根金属纤维圆盘工作电极,采用直径为5-20微米的其它如金电极、铂电极、铜电极。
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