CN1563076A

CN1563076A - 一种用于治疗性功能障碍的α－MSH类似物及制备方法

Info

Publication number: CN1563076A
Application number: CN 200410030758
Authority: CN
Inventors: 李晓鹏; 周涛; 李明
Original assignee: XINAN BIOENGINEERING INDUSTRIALIZATION INTERMEDIATE TEST BASE CO Ltd
Current assignee: XINAN BIOENGINEERING INDUSTRIALIZATION INTERMEDIATE TEST BASE CO Ltd
Priority date: 2004-04-02
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2005-01-12

Abstract

本发明公开了一种用于治疗性功能障碍的α－MSH类似物AC－Nle－cyclo(－Asp－His－D－Phe－Arg－Trg－Lys)－OH(SEQ ID NO：1)多肽及其C端为酰氨化的衍生物(SEQ ID NO：2)，公开了合成上述多肽的方法，含有上述多肽的用于治疗性功能障碍的药物组合物及其制备方法，以及该药物组合物在治疗性功能障碍疾病，包括男性性功能障碍如勃起功能障碍和女性性功能障碍的用途。

Description

一种用于治疗性功能障碍的α-MSH类似物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗性功能障碍的α-MSH类似物和该类似物C端为酰氨化的衍生物以及这些类似物的制备方法，还涉及含有上述多肽的用于治疗性功能障碍的药物组合物。

背景技术

性功能障碍，包括男性性功能障碍和女性性功能障碍，是影响面很广的医学病症。性功能障碍的病因有精神型、器质型以及混合型。紧张、抑郁、器质性疾病如循环系统疾病、神经系统损伤、动脉硬化、糖尿病、高血压和高胆固醇等均会导致会导致性功能障碍。

在临床治疗上，根据不同的病因主要采取药物治疗和辅助器械治疗。现在常用的药物有西地那非、瓦地那非等，这些药物均是PDE5抑制剂，它致使环腺苷酸(cAMP)在体内维持及升高致勃起所需浓度。这些药物是通过扩张动脉血管和降低静脉排出量作用的。治疗性功能障碍还可以通过向阴茎海绵体注射罂粟碱和尿道给药等方式治疗。辅助器械常用负压吸引装置等。然而这些治疗措施并不理想，急需找到一种新的治疗方法。

α-MSH(a-促黑素细胞激素)是一种具有如下化学式的线状十三肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val。它是一种能使黑素细胞产生黑素体的激素，能控制生物体皮肤和毛发的颜色。现大量研究已证实它的受体分子在食欲和性唤起中起着重要的作用(Wessells H.et al.，J Urology 160：389-393(1998))。其中与性唤起相关联是中心4肽序列：His-Phe-Arg-Trp(Hadley M.E.et al，PigmentCell Res.，vol.9：213-234(1996))。在许多的相关研究中，如促黑细胞素和促肾上腺皮质激素，His-Phe-Arg-Trp是核心序列。

促肾上腺皮质激素的受体是MC1-R到MC5-R。其中MC3-R和MC4-R被认为在人的脑部表达。大量研究认为His-Phe-Arg-Trp引起勃起的机理与中枢神经系统有关，它与MC3-R和/或MC4-R相结合(Haskell-Luevano C.et al.，Journal of Medical Chemistry，vol.40：2133-39(1997)；Schioth H.B.et al.，British Joural of Pharmacology，vol.124：75-82(1998))。

本发明的申请人通过长期大量的研究发现了一种α-MSH的类似物以及其C端为酰氨的衍生物，它能够有效治疗性功能障碍，因此为性功能障碍疾病提供了一种新的治疗药物和治疗方法。

发明内容

本发明一方面提供一种用于治疗性功能障碍的α-MSH类似物多肽，该多肽是包含Ac-Nle-cyclo(-Asp-His-D-Phe-Arg-Trg-Lys)-OH(SEQ ID NO：1)的多肽或其类似物或衍生物；该多肽优选的衍生物是C端为酰氨的衍生物Ac-Nle-cyclo(-Asp-His-D-Phe-Arg-Trg-Lys)-NH2(SEQ ID NO：2)

本发明的另一方面提供制备本发明用于治疗性功能障碍的α-MSH类似物多肽及其类似物或衍生物的方法，优选是固相化学合成方法。

本发明进一步提供一种用于治疗性功能障碍的药物组合物，其包含至少一种α-MSH类似物多肽及药学上可接受的药用载体，该α-MSH类似物多肽选自包含SEQ ID NO：1的多肽或其类似物或其衍生物。

本发明进一步提供制备本发明用于治疗性功能障碍的药物组合物的方法，将本发明的选自包含SEQ ID NO：1的多肽或其类似物或其衍生物与药学上可接受的药用载体混合。

本发明进一步提供包含SEQ ID NO：1的多肽及其类似物或衍生物在制备用于治疗性功能障碍的药物组合物的用途，这里指的性功能障碍包括男性性功能障碍和女性性功能障碍。

在本发明中，“SEQ ID NO：1类似物”被定义为，与SEQ ID NO：1相比较，具有一个或几个氨基酸取代，删除，转换或增加的分子。

“SEQ ID NO：1衍生物”被定义为如下一种分子，它具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1类似物氨基酸序列，但是另外还具有化学修饰的一个或几个氨基酸侧链基团，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基。

用于本发明的多肽可通过固相化学合成法合成。多肽的固相化学合成法是本领域熟知的，可以在一般教科书的范围内找到，例如J.M.Stewart and J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2^nded.，Pierce Chemical Co.，Rockford，I11.(1984)、Dugas和Penney1981；Merrifield 1962；Stewart和Young 1969。多肽合成后用HPLC纯化，纯度达到95％以上，为白色粉末。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。

适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾胶，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液等。

剂型中还可含有其它常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等等。

本发明的多肽溶液鼻喷剂溶液以药学上可接受的盐的形式存在，可以是盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐等，最优选乙酸盐；乙酸盐浓度范围10mM至100mM，优选地10mM乙酸盐。本发明的多肽稳定的PH范围为4-7，最优选地PH6.0～6.5。本发明多肽的最佳保存条件为0.9％生理盐水中。本多肽浓度保存范围为0.1mg/ml-10mg/ml，优选地为3mg/ml。

本发明提供的溶液鼻喷剂溶液药学组分包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括赋形剂和添加剂，如稳定剂、保护剂和促吸收剂等。本发明涉及的赋形剂可以是明胶、羟基纤维素、氯化钠和聚乙二醇，优选地为氯化钠；本发明涉及的保护剂可以是EDTA和苯甲烷铵，优选地为苯甲烷铵；本发明多肽的促吸收剂可以是聚山梨酯-80、氮酮、羧甲基纤维素、9-十二烷基醚等，优选地为氮酮。

优选地，含有本发明多肽的鼻喷剂的药学组分为：0.9％氯化钠，10mM乙酸钠，pH值6.0，0.01％苯甲烷铵，0.5％氮酮，SEQ ID NO：11mg/ml。用于治疗男性(或女性)性功能障碍时，用药用鼻喷雾泵每次100μl喷入鼻腔

若有特殊治疗要求，本发明的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种相伴使用有利于治疗。

本发明的药物组合物中多肽的用量可以在一个较大范围内变动，这取决于一些已知的因素，诸如病情严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径。例如，本发明药物组合物的鼻内给药范围在1μg/kg到75μg/kg。

本发明的申请人通过大量研究发现：用Nle置换具有氧化侧链的Me t氨基酸使之与α-MSH比较更加稳定；用D-Phe置换L-Phe使之活性增强；将Asp和Lys环化后，经过试验，SEQ ID NO：1及其C端为酰氨的衍生物在原有的基础上更加稳定。

本发明多肽的主要优点在于提高了生物活性，增强了在体内的稳定性，使有效剂量降低，从而避免引起副作用。

具体实施方式

实施例1：固相合成法合成SEQ ID NO：1多肽

SEQ ID NO：1的多肽由标准的固相合成法合成，多肽以乙酸盐的形式存在。

(1)在固相反应器(美国CS生化公司，CS736型)中加入2.0克P-HMPA-AM(0.8毫摩尔/克)树脂(吉尔生化有限公司)，用两份20毫升二甲基甲酰氨洗涤，每次2分钟。(2)加入20毫升二甲基甲酰氨机械震荡10分钟，在反应器加入三倍的氨基酸衍生物Fmoc-Lys(Dnp)-OH(美国CS生化公司)和2.1毫升HOBt(吉尔生化有限公司)，震荡2-3小时。(3)水合茚三酮检测为阴性。(4)用4份二甲基甲酰氨20毫升洗涤产物，每次2分钟。(5)加入20毫升20％哌啶/二甲基甲酰氨震荡1分钟，再加入20毫升20％哌啶/二甲基甲酰氨震荡反应30分钟。(6)用4份二甲基甲酰氨20毫升洗涤产物，每次2分种。(7)用两份15毫升二氯甲烷洗涤，每次1分钟。(8)除去保护基Fmoc后，加入三倍于树脂的氨基酸链接Fmoc-Trp(Boc)-OH(吉尔生化有限公司)和相同数量的HBTU(吉尔生化有限公司)，在20毫升二甲基甲酰氨中反应3小时。(9)水合茚三酮检测为阴性。(10)重复3到9步骤，依次链接剩下的氨基酸衍生物。在最后一个Fmoc-Nle-OH(SIGMA)链接上后，仍然用20％哌啶/二甲基甲酰氨除去保护基Fmoc。(11)用2倍的1∶1乙酸酐吡啶混合物在二氯甲烷中乙酰化。(12)充分干燥反应产物，除去Lys和Asp的保护基后，加入二甲基甲酰氨和二苯磷酰基叠氮化物(SIGMA)，0℃搅拌该混合物，12℃下搅拌反应过夜。(13)环化后，用4份20毫升二甲基甲酰氨洗涤，每次1分钟。(14)2份15毫升二氯甲烷洗涤，每次2分钟。(15)用标准三氟乙酸/二氯甲烷方法，并加入适量的硫基试剂裂解。

最终产物用乙醚沉淀，过滤。过滤产物用C18 HPLC纯化，层析缓冲A液为5％乙腈和0.1％三氟乙酸，缓冲B液为80％乙腈和0.1％三氟乙酸，梯度0％-75％，12个柱体积。HPLC纯化后用离子交换柱纯化，层析缓冲A液为40毫摩尔乙酸盐、PH值为6.2，缓冲B液为40毫摩尔乙酸盐、PH值为6.2、0.8摩尔氯化钠，梯度0％-100％，8个柱体积。

实施例2：固相合成法合成SEQ ID NO：2的多肽

(1)在反应器(美国CS生化公司，CS736型)中加入2.0克P-MBHA树脂(0.7毫摩尔/克)(吉尔生化有限公司)和20毫升二甲基甲酰氨，机械震荡10分钟后加入三倍的Boc-Lys(2-C1-Z)(吉尔生化有限公司)和相同量的HOBt，在室温机械震荡反应3小时。(2)水合茚三酮检测。如果检测结果为阳性再反应1小时，如果仍为阳性用相当于树脂2倍的乙酸酐/吡啶/二氯甲烷(1∶1∶2 V/V)，室温下反应30分钟，去除多余的氨基。(3)水合茚三酮检测阴性。(4)用2份20毫升二氯甲烷洗涤产物每次1分钟。(5)用30毫升50％三氟乙酸/二氯甲烷裂解除去保护基Boc，第一次处理5分钟，第二次20分钟。(6)用2份20毫升二氯甲烷洗涤产物每次1分钟。(7)用两份30毫升7％的二异丙乙胺/二氯甲烷中和产物，每次摇动2分钟。(8)用4份20毫升二氯甲烷洗涤产物，每次1分钟，(9)加入过量的3倍的Boc氨基酸衍生物(4.2毫摩尔)、2.4毫升1摩尔的HOBt(吉尔生化有限公司)和2.4毫升的1摩尔DDC(吉尔生化有限公司)，在20毫升二氯甲烷中将该混合物在室温下震荡3小时，进行偶联反应。(10)完成偶联后(水合茚三酮阴性)用三份30毫升二氯甲烷洗涤产物，每次2分钟。(11)用两份40毫升二甲基甲酰氨洗涤，每次2分钟。(12)重复3-11步骤，依次链接剩下的氨基酸衍生物，在最后一个Boc-Nle-OH(SIGMA)链接上后，仍然用50％三氟乙酸/二氯甲烷除去保护基Boc。用二氯甲烷和二甲基甲酰氨洗涤产物，(13)洗涤产物用2倍的1∶1乙酸酐吡啶混合物在二氯甲烷中乙酰化，充分干燥反应产物。(14)除去Lys和Asp的保护基后，加入二甲基甲酰氨和二苯磷酰基叠氮化物(SIGMA)，0℃搅拌该混合物，12℃下搅拌过夜。(15)环化后洗涤产物。(16)用标准LoW-HighHF方法裂解，加入5毫升氟化氢、二甲基硫醚和对甲苯酚，三种试剂的比例为25∶65∶10，0℃反应2小时。将氟化氢蒸发后又加入10毫升氟化氢、对甲苯酚和对甲硫酚(FLUKA)，三种试剂比例为95∶3.75∶1.25，0℃反应1小时。将氟化氢蒸发后，最终产物用乙醚沉淀，过滤。

过滤产物用C18 HPLC纯化，层析缓冲A液为5％乙腈和0.1％三氟乙酸，缓冲B液为80％乙腈和0.1％三氟乙酸，梯度0％-75％，12个柱体积。HPLC纯化后用离子交换柱纯化，层析缓冲A液为40毫摩尔乙酸盐、PH值为6.2，缓冲B液为40毫摩尔乙酸盐、PH值为6.2、0.8摩尔氯化钠，梯度0％-100％，8个柱体积。

实施例3：α-MSH类似物SEQ ID NO：1及其C端为酰氨的衍生物SEQ ID NO：2对小鼠性功能的影响。

实验动物为大鼠。实验试剂有SEQ ID NO：1、α-MSH、Ac-[Nle⁴，D-Phe⁷]-α-MSH_1-13NH₂、、Ac-[Nle⁴，D-Phe⁷Lys¹⁰]-α-MSH_4-10NH₂、SEQ ID NO：2(由例1和2提供的方法合成)。

以上五种试剂给药方式为静脉注射，给药剂量为10μg/kg。动物实验共五组大鼠，每组大鼠4只，每组大鼠静脉注射以上五种试剂中的一种。注射后观察0.5小时。注射α-MSH的大鼠勃起率为5％；注射Ac-[Nle⁴，D-Phe]-α-MSH_1-13NH₂的大鼠的勃起率为12％；注射Ac-[Nle⁴，D-Phe，Lys¹⁰]-α-MSH_4-10NH₂的大鼠的勃起率为17％；而注射在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的大鼠勃起率为100％。

从实验结果可知，用Nle置换具有氧化侧链的Met氨基酸、用D-Phe置换L-Phe和将Asp和Lys环化后的α-MSH衍生物活性增强，其中SEQ ID NO：1及其C端为酰氨的衍生物活性最强。

实验结果列于表1中。

表1：a-MSH及其类似物在相同剂量下对大鼠勃起率的影响

肽	剂量(μg/kg)	勃起率
肽	剂量(μg/kg)	勃起率	α-MSH	10	5％
Ac-[Nle⁴，D-Phe]-α-MSH_1-13NH₂	10	12％	α-MSH	10	5％
Ac-[Nle⁴，D-Phe]-α-MSH_1-13NH₂	10	12％	Ac-[Nle⁴，D-Phe，Lys¹⁰]-α-MSH_4-10NH₂	10	17％
SEQ ID NO：1	10	100％	Ac-[Nle⁴，D-Phe，Lys¹⁰]-α-MSH_4-10NH₂	10	17％
SEQ ID NO：1	10	100％	SEQ ID NO：2	10	100％

实施例4：制备含有以SEQ ID NO：1多肽为活性成分的鼻喷剂1000ml：加入9克氯化钠，1.36克三水乙酸钠，0.1ml苯甲烷铵，5ml氮酮，SEQ ID NO：1多肽1000mg，补加水至1000ml，调节pH值至6.0，搅拌均匀。

含SEQ ID NO：1多肽活性成分鼻喷剂各组分的终浓度为：0.9％(m/v)氯化钠，10mM乙酸钠，0.01％(v/v)苯甲烷铵，0.5％(v/v)氮酮，SEQ ID NO：1多肽(1mg/ml)。

实施例5：制备含有以SEQ ID NO：2多肽为活性成分的鼻喷剂1000ml：加入9克氯化钠，1.36克三水乙酸钠，0.1ml苯甲烷铵，5ml氮酮，SEQ ID NO：2多肽1000mg，补加水至1000ml，调节pH值至6.0，搅拌均匀。

含SEQ ID NO：2多肽活性成分鼻喷剂各组分的终浓度为：0.9％(m/v)氯化钠，10mM乙酸钠，0.01％(v/v)苯甲烷铵，0.5％(v/v)氮酮，SEQ ID NO：2多肽(1mg/ml).

用于治疗男性(或女性)性功能障碍时，用鼻喷雾泵每次100μl喷入鼻腔。

通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。提供这些实施例，仅为了说明，而不是限制本发明。

Claims

1、一种用于治疗性功能障碍的α-MSH类似物多肽，其特征在于该多肽是包含SEQ ID NO：1的多肽或其类似物或衍生物。

2、根据权利要求1的多肽，其特征在于该多肽具有SEQ ID NO：1。

3、根据权利要求1的多肽，其特征在于该多肽的衍生物是C端酰氨化的衍生物。

4、根据权利要求3的多肽，其特征在于该多肽的衍生物包含SEQ IDNO：2。

5、根据权利要求4的多肽，其特征在于该多肽的衍生物具有SEQ IDNO：2。

6、制备权利要求1-5多肽的方法。

7、根据权利要求6的方法，其特征在于权利要求1-5的多肽是通过固相合成的方法制备的。

8、一种用于治疗性功能障碍的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含至少一种α-MSH类似物多肽及药学上可接受的药用载体，该α-MSH类似物多肽选自包含SEQ ID NO：1的多肽或其类似物或衍生物。

9、根据权利要求8的药物组合物，其特征在于该多肽具有SEQ IDNO：1。

10、根据权利要求8的药物组合物，其特征在于该多肽的衍生物是C端酰氨化的衍生物。

11、根据权利要求10的药物组合物，其特征在于该多肽的衍生物包含SEQ ID NO：2。

12、根据权利要求11的药物组合物，其特征在于该多肽的衍生物具有SEQ ID NO：2。

13、根据权利要求8的药物组合物，其特征在于这里指的性功能障碍包括男性性功能障碍和女性性功能障碍。

14、制备权利要求8-13药物组合物的方法，其特征在于将权利要求1-5的多肽与药学上可接受的药用载体混合。

15、包含SEQ ID NO：1的多肽及其类似物或衍生物在制备用于治疗性功能障碍的药物组合物的用途，这里指的性功能障碍包括男性性功能障碍如勃起功能障碍和女性性功能障碍。

16、根据权利要求15的用途，其特征在于该药物组合物通过多种给药方式治疗性功能障碍，包括皮下或肌肉注射，口服给药如药丸、胶囊，鼻喷剂等。