CN1559358A - 肉、奶牛b超活体取卵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肉、奶牛B超活体取卵方法,属生物技术领域。本方法的吸卵真空泵的压力为50-90mmHg,吸卵液为含0.5-1%,青-链霉素和5-10IU肝素的磷酸缓冲液,洗卵液为含5-12%,BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液-Hepes液;采卵频率为1次/4天/头;穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡;取1-3级的卵母细胞分装、备用;对7-8岁的供体经产牛按程序注射等量的外源性FSH,总量为30- 55μg;对≥14岁的老年牛按程序肌肉注射总量为150-200μg的外源性FSH,以提高卵母细胞发育潜能。本发明的优点在于,从活体可重复、无损伤获取卵母细胞;≥2mm直径卵泡作为穿刺对象和每4天1次的取卵频率保证了卵母细胞的质量和发育同步性;用外源性FSH诱导可提高卵母细胞的发育潜能;本方法的取卵效果佳。
Description
技术领域:
本发明提供一种肉、奶牛B超活体取卵方法,属生物技术领域。
背景技术:
活体取卵是一项可反复从活体获取卵母细胞的技术。该技术能够扩大卵的来源,结合卵母细胞体外成熟培养(IVM)、体外受精(IVF)和早期胚胎培养(IVC)可产生大量可移植胚胎,克服从屠宰卵巢采集卵母细胞的缺点(如卵巢的收集耗时,从卵巢收集到运至实验室的间隔时间不确定,供体牛缺乏激素、健康和遗传背景资料,无法从有遗传价值的活体上获得更多的后代等),还可作为生殖生物学领域基础研究(如卵巢功能、精子功能、内分泌特性及转基因等)的手段。
1970年Steptoe等人首先在人上采用内窥镜(Endoscope)取卵获得成功,随后个别大动物也相继采用这种方法取得卵母细胞。但此法操作复杂,费时,费力,对机体的损伤较大,已逐渐淘汰。因此,B超取卵方法受到了广泛重视。
国外虽然有B超活体取卵的报道,但就技术而言,还不够成熟和实用,可操作性不强。我国尚未见类似方法的报道。发明者将本发明的方法和结果在相关文献数据库中进行搜索比较,未发现有任何相同记载。
发明内容:
本发明的目的是基于前人的基础研究,提供一种适合我国的肉、奶牛B超活体取卵方法,采集的卵母细胞通过体外胚胎生产程序,生产优质肉、奶牛体外胚胎,在畜牧业中得到应用,也为相关研究提供种质材料。
为了实现本发明的目的,本发明提供了如下技术方案:
1.仪器和设备:型超声波诊断仪(Aloka 500v),7.0MHz扇形阴道探头,B超图象打印机,吸卵真空泵,自动衡温器(FHK-V型),50ml塑料收集管,17-ga 55cm单腔取卵针和胚胎滤器。
2.溶液和培养基
(1)吸卵液:含0.5-1%青-链霉素和5-10IU肝素的磷酸缓冲液(PBS)。
(2)洗卵液:含5-12%BCS的PBS和改良的基础培养液-Hepes液。
3.取卵方法
(1)术前准备
调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg),收集管中注入5ml左右吸卵液,置衡温器中,衡温器温度调至39℃。用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口,收集管塞的另一接口与真空泵相连。动物站立保定,清除直肠粪便,消毒外阴,用2-4ml 20%利多卡因(Lidocain)进行荐尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉,待尾根松软后进行操作。
(2)卵巢及卵泡的观察
操作人员一手握住B超探头柄部,将其轻缓插入阴道穹隆处,另一手伸入直肠,从直肠握住卵巢,将其置于探头上,移动卵巢,通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小,区分卵泡和黄体,详细记录卵泡的数目和大小。在B超屏幕上,卵巢呈弱回声结构,轮廓清晰;卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区,轮廓清楚。
(3)取卵
移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于显示屏取卵线上,吸卵针内吸满吸卵液,将其插入探头背部的穿刺针固定筒中,针头刺破阴道壁和卵泡壁,同时,用脚踏开关控制真空泵,吸取卵泡内容物至收集管中。重复穿刺几个卵泡后,要及时抽出穿刺针,从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管,以防被凝固的血液堵塞,冲洗液一同收至收集管中。采集的卵泡直径为≥2mm。取卵频率为1次/4天/头。
4、卵母细胞的检出和分类
将采集的卵泡液立即用洗卵液(200ml)稀释,倒入胚胎滤器中,反复洗涤3-4次,最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中,在解剖镜下检出卵母细胞。卵母细胞分为4级:1级:卵母细胞质均匀,至少有5层以上颗粒细胞,且致密地排列于卵母细胞周围;2级:卵母细胞质均匀,有3-5层颗粒细胞;3级:卵母细胞质比较均匀,有2层颗粒细胞;4级:卵母细胞均质度较差或半裸卵或完全裸卵。将1-3级卵母细胞分状,用于体外培养。
5、取卵年龄及取卵前的处理
取卵年龄为初情期-14岁以上(丧失妊娠能力但遗传背景优秀)的牛。取卵前可不作任何处理,在自然生理状态下取卵,也可在取卵间隔注射外源性FSH以提高卵母细胞的发育潜能。外源性FSH的注射方法是:经产牛在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的FSH,总量为30-55μg;老年牛在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射FSH,总量为150-200μg。
本发明的优点在于,从活体可重复、无损伤获取卵母细胞;≥2mm直径卵泡作为穿刺对象和每4天1次的取卵频率保证了卵母细胞的质量和发育同步性;用外源性FSH诱导可提高卵母细胞的发育潜能;操作程序和参数控制了取卵的效果。
附图说明:
图1为B超屏幕显示图象。
图2为B超屏幕显示示意图。图中:1-腹腔、2-卵泡、3-穿刺针、4-穿刺线
具体实施方式:
本发明实施过程中:分别取吸卵真空泵的压力为50、75、90mmHg,吸卵液为含0.5、0.75、1%青-链霉素和5、7、10IU肝素的磷酸缓冲液,洗卵液为含5、9、12%BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液-Hepes液;采卵频率为1次/4天/头;穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡;收集的卵母细胞采用4级分类,取1-3级的卵母细胞分装、备用;对7-8岁的供体经产牛按程序在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的外源性FSH,总量为30、45、55μg;对≥14岁的老年牛按程序在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射150、175、200μg外源性FSH以提高卵母细胞发育潜能。本发明经术前准备、卵巢及卵泡观察、取卵、卵母细胞检出和分类等步骤后,得到如下效果。
1.不同年龄牛B超活体取卵的效果
利用青年牛(初情期)、经产牛(7-8岁)和老年牛(14岁,丧失自然繁殖能力)进行B超活体取卵和胚胎生产,效果显示:青年牛的平均卵泡数多于经产牛和老年牛(p<0.05),经产牛多于老年牛(p<0.05);青年牛和经产牛的平均卵母细胞数和平均可用卵母细胞(COC)数大于老年牛;卵母细胞的回收率和COC回收率在各年龄组之间无显著差异(p>0.05);青年牛的卵裂率高于经产牛和老年牛(p<0.05);青年牛的囊胚率和平均囊胚数高于经产牛(p<0.05)和老年牛(p<0.01),经产牛高于老年牛(p<0.01)。见表1。
表1.不同年龄活体取卵效果比较
动物项目 | 年龄 |
青年牛 经产牛 老年牛(n=3) (n=3) (n=2) | |
取卵次数(次) | 21 21 21 |
平均卵泡数1(个) | 14.3a 11.6b 8.9c |
平均卵母细胞数2(枚) | 7.3a 6.1a 4.2b |
平均COC数4(枚) | 6.6a 5.0a 3.3b |
卵母细胞回收率5(%) | 51.2a 43.2a 47.7a |
COC回收率(%) | 46.0a 43.4a 36.5a |
卵裂率7(%) | 78.3a 62.3b 57.2b |
囊胚率8(%) | 45.5a 30.5b 13.8d |
平均囊胚数9(枚) | 4.3a 2.2b 0.4d |
1=总卵泡数/总取卵次数;2=总卵母细胞数/总取卵次数;3COC为一级、二级和三级卵母细胞的总数。
4=总COC数/总取卵次数;5=总卵数/总卵泡数;6=COC数/总卵泡数;7=卵裂数/总COC数;8=囊胚数/总COC数;
9=囊胚数/总取卵次数。ab,ac,bcp<0.05,ad,bdp<0.01。
2.外源性FSH诱导后对B超活体取卵效果的提高
给肉、奶牛注射不同计量的外源性FSH,提高取卵效果。结果显示:注射FSH后,平均卵母细胞数、COC数、卵母细胞回收率和COC回收率经产牛52.5μgFSH组低于17.5μgFSH组和对照组,老年牛175μgFSH组低于对照组(p<0.05);卵裂率和囊胚率经产牛52.5μgFSH组高于17.5μgFSH组和对照组,老年牛175μgFSH组高于对照组(p<0.05);平均囊胚数经产牛各组见无差异(p>0.05),老年牛175μgFSH组高于对照组(p<0.05)。见表2。
表2.FSH对经产牛和老年牛活体取卵效果的影响
动物项目 | 经产牛 | 老年牛 |
对照组 17.5μg 52.5μgFSH组 FSH组(n=3) (n=3) (n=3) | 对照组 175μgFSH组(n=2) (n=2) | |
取卵次数(次) | 24 24 24 | 16 16 |
平均卵泡数(个) | 12.2a 11.8a 11.4a | 9.1c 8.5c |
平均卵母细胞数(枚) | 6.3b 5.5a 3.7b | 4.1c 2.4d |
平均COC数(枚) | 5.2a 4.7a 3.5b | 3.1c 2.1d |
卵母细胞回收率(%) | 52.0a 46.4a 32.2b | 45.2c 27.9d |
COC回收率(%) | 42.6a 39.5a 30.9b | 34.2c 25.0d |
卵裂率(%) | 53.2a 61.2a 82.4b | 35.4c 50.0d |
囊胚率(%) | 33.3a 30.6a 40.5b | 14.0c 32.3d |
平均囊胚数(枚) | 1.4a 1.3a 1.3a | 0.4c 0.7d |
ab,cdp<0.05
Claims (1)
1、肉、奶牛B超活体取卵方法,包括术前准备、卵巢及卵泡观察、取卵、卵母细胞检出和分类步骤,其特征在于:
(1)吸卵真空泵的压力为50-90mmHg,吸卵液为含0.5-1%青-链霉素和5-10IU肝素的磷酸缓冲液,洗卵液为含5-12%BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液-Hepes液;
(2)采卵频率为1次/4天/头;
(3)穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡;收集的卵母细胞采用4级分类,取1-3级的卵母细胞分装、备用;
(4)对7-8岁的供体经产牛按程序在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的外源性FSH,总量为30-55μg;对≥14岁的老年牛按程序在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射总量为150-200μg的外源性FSH,以提高卵母细胞发育潜能。
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