CN1559358A - 肉、奶牛b超活体取卵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肉、奶牛B超活体取卵方法，属生物技术领域。本方法的吸卵真空泵的压力为50－90mmHg，吸卵液为含0.5－1％，青－链霉素和5－10IU肝素的磷酸缓冲液，洗卵液为含5－12％，BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液－Hepes液；采卵频率为1次/4天/头；穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡；取1－3级的卵母细胞分装、备用；对7－8岁的供体经产牛按程序注射等量的外源性FSH，总量为30－ 55μg；对≥14岁的老年牛按程序肌肉注射总量为150－200μg的外源性FSH，以提高卵母细胞发育潜能。本发明的优点在于，从活体可重复、无损伤获取卵母细胞；≥2mm直径卵泡作为穿刺对象和每4天1次的取卵频率保证了卵母细胞的质量和发育同步性；用外源性FSH诱导可提高卵母细胞的发育潜能；本方法的取卵效果佳。
Description
技术领域：
本发明提供一种肉、奶牛B超活体取卵方法，属生物技术领域。
背景技术：
活体取卵是一项可反复从活体获取卵母细胞的技术。该技术能够扩大卵的来源，结合卵母细胞体外成熟培养(IVM)、体外受精(IVF)和早期胚胎培养(IVC)可产生大量可移植胚胎，克服从屠宰卵巢采集卵母细胞的缺点(如卵巢的收集耗时，从卵巢收集到运至实验室的间隔时间不确定，供体牛缺乏激素、健康和遗传背景资料，无法从有遗传价值的活体上获得更多的后代等)，还可作为生殖生物学领域基础研究(如卵巢功能、精子功能、内分泌特性及转基因等)的手段。
1970年Steptoe等人首先在人上采用内窥镜(Endoscope)取卵获得成功，随后个别大动物也相继采用这种方法取得卵母细胞。但此法操作复杂，费时，费力，对机体的损伤较大，已逐渐淘汰。因此，B超取卵方法受到了广泛重视。
国外虽然有B超活体取卵的报道，但就技术而言，还不够成熟和实用，可操作性不强。我国尚未见类似方法的报道。发明者将本发明的方法和结果在相关文献数据库中进行搜索比较，未发现有任何相同记载。
发明内容：
本发明的目的是基于前人的基础研究，提供一种适合我国的肉、奶牛B超活体取卵方法，采集的卵母细胞通过体外胚胎生产程序，生产优质肉、奶牛体外胚胎，在畜牧业中得到应用，也为相关研究提供种质材料。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
1.仪器和设备：型超声波诊断仪(Aloka 500v)，7.0MHz扇形阴道探头，B超图象打印机，吸卵真空泵，自动衡温器(FHK-V型)，50ml塑料收集管，17-ga 55cm单腔取卵针和胚胎滤器。
2.溶液和培养基
(1)吸卵液：含0.5-1％青-链霉素和5-10IU肝素的磷酸缓冲液(PBS)。
(2)洗卵液：含5-12％BCS的PBS和改良的基础培养液-Hepes液。
3.取卵方法
(1)术前准备
调试设备至工作状态(吸卵真空泵的压力为50-90mmHg)，收集管中注入5ml左右吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃。用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连。动物站立保定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml 20％利多卡因(Lidocain)进行荐尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作。
(2)卵巢及卵泡的观察
操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小。在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚。
(3)取卵
移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中。重复穿刺几个卵泡后，要及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中。采集的卵泡直径为≥2mm。取卵频率为1次/4天/头。
4、卵母细胞的检出和分类
将采集的卵泡液立即用洗卵液(200ml)稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出卵母细胞。卵母细胞分为4级：1级：卵母细胞质均匀，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围；2级：卵母细胞质均匀，有3-5层颗粒细胞；3级：卵母细胞质比较均匀，有2层颗粒细胞；4级：卵母细胞均质度较差或半裸卵或完全裸卵。将1-3级卵母细胞分状，用于体外培养。
5、取卵年龄及取卵前的处理
取卵年龄为初情期-14岁以上(丧失妊娠能力但遗传背景优秀)的牛。取卵前可不作任何处理，在自然生理状态下取卵，也可在取卵间隔注射外源性FSH以提高卵母细胞的发育潜能。外源性FSH的注射方法是：经产牛在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的FSH，总量为30-55μg；老年牛在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射FSH，总量为150-200μg。
本发明的优点在于，从活体可重复、无损伤获取卵母细胞；≥2mm直径卵泡作为穿刺对象和每4天1次的取卵频率保证了卵母细胞的质量和发育同步性；用外源性FSH诱导可提高卵母细胞的发育潜能；操作程序和参数控制了取卵的效果。
附图说明：
图1为B超屏幕显示图象。
图2为B超屏幕显示示意图。图中：1-腹腔、2-卵泡、3-穿刺针、4-穿刺线
具体实施方式：
本发明实施过程中：分别取吸卵真空泵的压力为50、75、90mmHg，吸卵液为含0.5、0.75、1％青-链霉素和5、7、10IU肝素的磷酸缓冲液，洗卵液为含5、9、12％BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液-Hepes液；采卵频率为1次/4天/头；穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡；收集的卵母细胞采用4级分类，取1-3级的卵母细胞分装、备用；对7-8岁的供体经产牛按程序在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的外源性FSH，总量为30、45、55μg；对≥14岁的老年牛按程序在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射150、175、200μg外源性FSH以提高卵母细胞发育潜能。本发明经术前准备、卵巢及卵泡观察、取卵、卵母细胞检出和分类等步骤后，得到如下效果。
1.不同年龄牛B超活体取卵的效果
利用青年牛(初情期)、经产牛(7-8岁)和老年牛(14岁，丧失自然繁殖能力)进行B超活体取卵和胚胎生产，效果显示：青年牛的平均卵泡数多于经产牛和老年牛(p＜0.05)，经产牛多于老年牛(p＜0.05)；青年牛和经产牛的平均卵母细胞数和平均可用卵母细胞(COC)数大于老年牛；卵母细胞的回收率和COC回收率在各年龄组之间无显著差异(p＞0.05)；青年牛的卵裂率高于经产牛和老年牛(p＜0.05)；青年牛的囊胚率和平均囊胚数高于经产牛(p＜0.05)和老年牛(p＜0.01)，经产牛高于老年牛(p＜0.01)。见表1。
表1.不同年龄活体取卵效果比较
| 动物项目 | 年龄 |
| 青年牛 经产牛 老年牛(n＝3) (n＝3) (n＝2) | |
| 取卵次数(次) | 21 21 21 |
| 平均卵泡数1(个) | 14.3a 11.6b 8.9c |
| 平均卵母细胞数2(枚) | 7.3a 6.1a 4.2b |
| 平均COC数4(枚) | 6.6a 5.0a 3.3b |
| 卵母细胞回收率5(％) | 51.2a 43.2a 47.7a |
| COC回收率(％) | 46.0a 43.4a 36.5a |
| 卵裂率7(％) | 78.3a 62.3b 57.2b |
| 囊胚率8(％) | 45.5a 30.5b 13.8d |
| 平均囊胚数9(枚) | 4.3a 2.2b 0.4d |
1＝总卵泡数/总取卵次数；2＝总卵母细胞数/总取卵次数；3COC为一级、二级和三级卵母细胞的总数。
4＝总COC数/总取卵次数；5＝总卵数/总卵泡数；6＝COC数/总卵泡数；7＝卵裂数/总COC数；8＝囊胚数/总COC数；
9＝囊胚数/总取卵次数。ab，ac，bcp＜0.05，ad，bdp＜0.01。
2.外源性FSH诱导后对B超活体取卵效果的提高
给肉、奶牛注射不同计量的外源性FSH，提高取卵效果。结果显示：注射FSH后，平均卵母细胞数、COC数、卵母细胞回收率和COC回收率经产牛52.5μgFSH组低于17.5μgFSH组和对照组，老年牛175μgFSH组低于对照组(p＜0.05)；卵裂率和囊胚率经产牛52.5μgFSH组高于17.5μgFSH组和对照组，老年牛175μgFSH组高于对照组(p＜0.05)；平均囊胚数经产牛各组见无差异(p＞0.05)，老年牛175μgFSH组高于对照组(p＜0.05)。见表2。
表2.FSH对经产牛和老年牛活体取卵效果的影响
| 动物项目 | 经产牛 | 老年牛 |
| 对照组 17.5μg 52.5μgFSH组 FSH组(n＝3) (n＝3) (n＝3) | 对照组 175μgFSH组(n＝2) (n＝2) | |
| 取卵次数(次) | 24 24 24 | 16 16 |
| 平均卵泡数(个) | 12.2a 11.8a 11.4a | 9.1c 8.5c |
| 平均卵母细胞数(枚) | 6.3b 5.5a 3.7b | 4.1c 2.4d |
| 平均COC数(枚) | 5.2a 4.7a 3.5b | 3.1c 2.1d |
| 卵母细胞回收率(％) | 52.0a 46.4a 32.2b | 45.2c 27.9d |
| COC回收率(％) | 42.6a 39.5a 30.9b | 34.2c 25.0d |
| 卵裂率(％) | 53.2a 61.2a 82.4b | 35.4c 50.0d |
| 囊胚率(％) | 33.3a 30.6a 40.5b | 14.0c 32.3d |
| 平均囊胚数(枚) | 1.4a 1.3a 1.3a | 0.4c 0.7d |
ab，cdp＜0.05
Claims (1)
1、肉、奶牛B超活体取卵方法，包括术前准备、卵巢及卵泡观察、取卵、卵母细胞检出和分类步骤，其特征在于：
(1)吸卵真空泵的压力为50-90mmHg，吸卵液为含0.5-1％青-链霉素和5-10IU肝素的磷酸缓冲液，洗卵液为含5-12％BCS的磷酸缓冲液和改良的基础培养液-Hepes液；
(2)采卵频率为1次/4天/头；
(3)穿刺对象为所有直径≥2mm的卵泡；收集的卵母细胞采用4级分类，取1-3级的卵母细胞分装、备用；
(4)对7-8岁的供体经产牛按程序在间隔3天里每天分2次肌肉注射等量的外源性FSH，总量为30-55μg；对≥14岁的老年牛按程序在取卵前4天每天按总量4∶3∶2∶1的比例肌肉注射总量为150-200μg的外源性FSH，以提高卵母细胞发育潜能。
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