CN1556729A - 结合相光聚合溶胶-凝胶柱和相关的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了分离柱(11)和制造分离柱(11)的方法。该分离柱(11)包括分离通道(13)和在通道(13)中的分离介质(15)。分离介质(13)包括多孔基体，和多孔基体包括载体和静止相。该载体包括金属有机聚合物，如光聚合物，和静止相包括结合相。分离介质(15)能够用于分离被分析物的样品。

Description

结合相光聚合溶胶-凝胶柱和相关的方法
本发明的背景
[0001]本发明一般地涉及分离柱，和特别地涉及结合相(a bondedphase)光聚合溶胶-凝胶柱。
[0002]毛细管电色谱法(CEC)已经被认为是非常有希望的分析分离技术，它兼顾了毛细管区带电泳(CZE)的效率与液相色谱的选择性。虽然CEC已经用于许多不同领域，但是填充柱制备和低的探测灵敏度使这一技术面临挑战。含有小的硅石填充物的毛细管柱已经成为CEC的主要依靠。填充柱的一个缺点是具有控制的孔径、长度和高的机械稳定性的多孔熔结玻璃料(frit)的制造。对熔结玻璃料制造问题作出响应，表面官能化的开口毛细管柱和整体毛细管已作为填充毛细管柱的变型而开发。整体毛细管柱已经受到很多的关注，因为在渗透性和表面电荷的控制中所获得的优点。
[0003]在CEC技术中的主要挑战是含有低浓度的被分析物的样品的检测。在低浓度下的敏感性的缺乏归因于小的样品容积和在线检测的短的光程长度。在样品注入之前富含目标被分析物的专用样品制备历程常常是为了获得许多现实世界分析的必要敏感性所需要的。历程如溶剂-溶剂萃取和固相萃取常常是非常乏味的和耗时的。
[0004]这些历程的替代是在线预浓缩。在气相色谱中，这一目标通过让气流通过冷柱(随后加热)来实现。在高效液相色谱(HPLC)中，这一工艺通常利用梯度HPLC来进行，其中对于第一种溶剂与对于后继的溶剂相比，被分析物更加强烈地保留在柱上。在线的预浓缩也享受着在电泳分离中的一些成功。例如，在毛细管电泳(CE)中，这些包括等速电泳，样品堆积，清扫，和动态pH交点的使用。在CZE，F.E.P.Mikkers，F.M.Everaerts，P.E.M.Verheggen，J.Chromatogr.169(1979)，pp.1-10和R.L.Chien，D.S.Burgi，Anal.Chem.64(1992)pp.489A-496A说明了在样品和背景溶液区段之间电场强度的变化能够聚集(即，堆积)带电荷的物质。在动电学色谱分析，J.P.Quirino，S.Terabe，Science，282(1998)pp.465-68和J.P.Quirino，S.Terabe，Anal.Chem.71(8)(1999)pp.1638-44中已经显示胶束能够用于浓缩(即清扫)中性和带电荷的物质。
[0005]在使用颗粒(例如，十八烷基硅石)填充柱的CEC中，已经报道了与在梯度高效液相色谱法中类似的聚集效应。这些聚集效应通过使用(1)分步梯度洗脱，(2)在非洗脱溶剂中的样品的制备，或在样品注入之后水栓的注射，来实现。M.R.Taylor，P.Teale，D.Westwood，D.Perrett，Anal.Chem.69(1997)pp.2554-58最先于1997年报道了分步梯度在甾族样品的预浓缩中的应用。D.A.Stead，R.G.Reid，R.B.Taylor，J.Chromatogr.A 798(1998)pp.259-67利用使用非洗脱样品基体(matrix)的预浓缩来实现了甾族化合物的混合物的检测灵敏度的17倍增加。Y.Zhang，J.Zhu，L.Zhang，W.Zhang，Anal.Chem.72(2000)pp.5744-47也使用非洗脱溶剂分别将苯偶姻和乙基苯基-N-甲基-乙内酰脲预浓缩134和219的因数。C.M.Yang，Z.El Rassi，Electrophoresis 20(1999)pp.2337-42报道了通过使用在长栓塞的样品之后所注射的短栓塞的水，对杀虫剂的稀释样品的预浓缩。M.J.Hilhorst，G.W.Somsen，G.J.de Jong，Chromatographia 53(2001)pp.190-96说明了通过使用非洗脱基体和分步梯度洗脱，对在结构上相关的甾族化合物的预浓缩。报道在敏感性上获得了7到9倍的增加。类似地，T.Tegeler，Z.El Rassi，Anal.Chem.73(14)(2001)pp.3365-72最近刚刚报道了通过联合使用非洗脱基体和分步梯度洗脱，在氨基甲酸酯类杀虫剂的混合物中被分析物的预浓缩。最高允许样品栓塞长度是～20cm和对于虫螨威(carbofuran)实现了500倍的敏感性提高。Zhang和同事通过将场增强的样品注射与溶剂梯度洗脱相结合而实现了检测灵敏度的进一步提高。他们说明了在带正电荷的被分析物，propatenene，的峰高度上的17,000倍增加。
[0006]希望提供具有改进特性和容易制造的分离柱。
本发明的概述
[0007]分离柱包括分离通道和在通道中的分离介质。该介质包括多孔基体，和该多孔基体包括载体和静止相。该载体包括金属有机聚合物，和该静止相包括结合相(a bonded phase)。聚合物可以是光聚合物。在优选实施方案中，多孔基体不含有色谱分析的颗粒。多孔基体可用于在没有色谱分析颗粒的情况下预浓缩和分离被分析物。该分离柱允许浓缩和分离出比有色谱分析颗粒的分离柱更大体积的被分析物。
[0008]提供了制备整体单段(monolith)的方法。提供了分离柱。混合物被引入到分离柱中。混合物包括金属有机化合物。混合物经过辐射而利用光引发聚合反应来形成固体多孔基体。偶联剂被引入该柱中。因此，在柱中形成了结合相多孔基体。在优选实施方案中，多孔基体是非熔结玻璃料(fritless)和不含有色谱分析的颗粒。没有色谱分析颗粒的非熔结玻璃料式分离介质的制备比制备具有熔结玻璃料或色谱分析颗粒的分离介质更简单。多孔基体可用于预浓缩和分离被分析物。
[0009]制备多孔基体的光化学途径具有许多优点：(1)短的制备时间，(2)孔隙大小的控制，(3)多孔基体的键接(placement)和长度的控制，(4)高的机械强度，和(5)导致开裂的高温的避免。结合相的优点是改变在色谱分离中各种条件的数量的能力。
[0010]提供了分离被分析物的样品的方法。提供了包括分离通道和在通道中的分离介质的分离柱。该介质包括多孔基体，和该多孔基体包括载体和静止相。该载体包括金属有机聚合物，如光聚合物，和静止相包括结合相。在优选实施方案中，多孔基体不含有色谱分析的颗粒。在溶液中携带的被分析物样品被引入通过该柱。该介质将被分析物浓缩在柱上。溶液被引起流过该柱，因此分离并洗脱该被分析物。该介质既预浓缩又分离该被分析物。除了由介质所发挥的作用之外，预浓缩能够进一步通过溶剂梯度或样品堆积来增强。
附图的简述
[0011]在结合附图阅读下面的详细说明之后，本发明的以上和其它特征和方面将变得更清楚，其中：
[0012]图1是根据本发明的实施方案的分离柱的示意性纵视图；
[0013]图2A和2B是使用本发明的实施方案的两个代表性的电色谱，显示了(a)一根柱和(b)另一根柱的吸收率/保留时间的曲线；
[0014]图3是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
[0015]图4A和4B是本发明的实施方案的SEM显微照片；
[0016]图5A和5B是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了不同被分析物的吸收率/保留时间的曲线；
[0017]图6是使用本发明的实施方案的代表性电色谱，显示了吸收率/保留时间的曲线；
[0018]图7(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0019]图8(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0020]图9(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0021]图10是显示使用本发明的实施方案的峰高比的对数对样品中水的百分比的曲线的图示；
[0022]图11(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0023]图12A，12B和12C是显示使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0024]图13(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0025]图14(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0026]图15(a，b，c，d，e，和f)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0027]图16(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0028]图17(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0029]图18A和18B是本发明的实施方案的SEM显微照片；
[0030]图19(a，b，c，d，e，和f)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0031]图20(a和b)是显示使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0032]图21是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；
[0033]图22是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱；和
[0034]图23是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。
[0035]为了描述的简单起见，同样的符号用于在本申请中同样或相似的部分。
实施方案的详细说明
[0036]图1是根据本发明的实施方案的分离柱的纵向剖视图。该分离柱11包括在管12内的分离通道13和在通道13中的分离介质15。该分离柱11可以是毛细管或平面片，并且该分离通道13可以包括检测窗口。该分离介质15填充该通道13的至少一段。该介质15是均匀的和优选不具有熔结玻璃料或色谱分析的颗粒。该介质15可以附着于通道13的通道壁17上。优选，该介质15可以以共价键键接于该通道壁17上。
[0037]管12能够具有许多不同的横截面，如圆形横截面。另外地，管12能够具有细长的横截面。这些和其它横截面对于管12是可能的并且是在本发明的范围内。管12可以是典型地由熔凝硅石制造的圆形毛细管。毛细管的内径(i.d.)可以是约10μm到约1000μm，优选约75μm到约500μm。管12可以是平面片或限定空间，如由两个片所限定而成的柱。
[0038]该介质15包括多孔基体，和该多孔基体包括载体和静止相。该载体包括金属有机聚合物，如光聚合物，和静止相包括结合相。聚合物的前体可以金属醇盐，如硅烷。该金属可以是铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌，或锆。该前体可以包括感光的基团，如甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，该前体可以是甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
[0039]不同的官能化或衍生化单体可用于制备具有不同物理性能如孔隙大小、聚合物电荷密度和疏水性的多孔基体。利用不同孔隙产生剂(porogens)控制孔隙形状和尺寸能够获得具有宽的孔隙尺寸分布(即孔隙尺寸梯度)的多孔基体。具有孔径尺寸梯度的多孔基体能够用作毛细管电泳和毛细管电色谱法中的“分子分类器”。多孔基体能够分离尺寸结构或化学性质不同的大分子的混合物(例如，DNA片段)。另外，分离柱11能够为反转相，尺寸排阻，亲合性，离子交换色谱分析等等而设计。
[0040]多孔基体可以是从单体的混合物制备的混合相多孔基体。例如，该单体可以包括甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷，和双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷。该混合相多孔基体可具有不同的性能，如疏水性。
[0041]多孔基体的性能也能够通过结合相的使用来改变。结合相是以共价键键接于载体颗粒上或键接于柱管料的内壁上的静止相。例如，该结合相可以包括键接于金属有机聚合物的表面上的官能团。该官能团可以是任何官能团，如疏水性或亲水性基团，带电荷的或无电荷的基团，或有机或无机基团。该官能团能够改变多孔基体的性能，如疏水性，电荷，保留系数，相互作用的类型，或多孔基体的手征性。该结合相多孔基体可用于正常相，反相，离子交换，亲合性，疏水性相互作用，尺寸排阻，或手性色谱分析。
[0042]结合相能够增强被分析物的分离的拆分和能够在某种程度上使聚合物的表面减活。该减活可以减少由于游离羟基的离子化产生的现有负电荷所引起的表面活性。该结合相多孔基体则能够支持在柱中的电渗流(EOF)。
[0043]该结合相多孔基体对于被分析物具有亲和性并能够用于预浓缩和分离被分析物的样品。被分析物的亲合性可由被分析物的保留系数k来表述。该保留系数k等于
该保留系数，k，也可以表示为
k = t R - t 0 t 0 - - - ( 2 )
其中tR是被分析物的迁移时间，和t0是“未保留”被分析物的迁移时间。该保留系数受到溶剂的性质，被分析物的性质，柱的长度，多孔基体的渗透性，多孔基体的疏水性，键接于金属有机聚合物上的官能团，和多孔基体的详细形态的影响。
[0044]该分离柱11可以用于分析或半制备性工作。亚毫克到毫克量的被分析物的分离对于在分离柱11上的预浓缩而变得可能。例如，超过约100-nL的处于mM水平的被分析物浓度下的样品溶液能够注入到该柱中，但没有超负载的明显证据。
[0045]提供了在分离柱11中制备整体单段的方法。提供了分离柱。该分离柱可以是典型地由熔凝硅石制成的圆形毛细管。毛细管的内径(i.d.)可以是约10μm到约1000μm，优选约75μm到约500μm。
[0046]包括金属有机化合物的混合物被引入该分离柱中。混合物经由光引发的聚合反应形成固体多孔基体。混合物可以包括金属有机单体，孔隙产生剂，和光引发剂。该金属有机单体可以是金属醇盐，如硅烷，或金属醇盐的混合物。该金属可以是铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌，或锆。金属醇盐可以包括感光的基团，如甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，该前体可以是甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知为甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。在另一个实施方案中，该前体可以是甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和另一种前体，如双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷或双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷的混合物。
[0047]该金属有机单体可以被加入到酸或碱催化剂中以进行前体的水解。该催化剂将烷氧基转化为羟基。例如，硅烷可以进行下列水解反应而形成全水解的硅烷：
                    (3)
该水解反应可以在部分水解的硅烷，Si(OR)4-n(OH)n上停止。该金属有机单体和该催化剂可以搅拌大约零分钟到大约二十四小时。
[0048]孔隙产生剂或孔隙产生剂的混合物可以与金属有机单体和催化剂混合，和混合物可以搅拌大约零分钟到大约二十四小时。在这一时间中，该金属有机单体可以进行缩合反应而形成二聚物，三聚物，和其它低聚物。例如，部分水解的硅烷可以进行下列缩合反应：
             (4)
较大的低聚物可以通过提高反应的温度来形成。
[0049]该孔隙产生剂提供分子模板而在基体内形成孔隙。例如，该孔隙产生剂可以是溶剂，如甲苯或己烷和甲苯的1∶1混合物，聚合物，或无机盐，如氯化钠粉末或硫酸钠。聚合物孔隙产生剂可以是聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯，由D.Horak，J.Labsky，J.Pilar，M.Bleha，Z.Peizbauer，F.Svec，Polymer 34(16)(1993)pp.3481-89进行了报道。该孔隙产生剂可以可控地选择以便在基体15中形成孔隙。基体的孔隙度可以通过所使用的化学品(即孔隙产生剂)的类型以及它在反应溶液中的体积或浓度来控制。例如，单体与孔隙产生剂的克分子或体积比可以经过选择以在混合物中形成孔隙。通过调节单体和孔隙产生剂的摩尔比率，基体的物理性能(例如，孔隙尺寸)可以得到控制。
[0050]该光引发剂或在单体上的光活性基团如甲基丙烯酸酯吸收光来催化金属有机化合物的聚合反应。在一个实施方案中，该光引发剂可以是Irgacure 1800，可以从Ciba Geigy，Tarrytown，New York商购。
[0051]如果该分离柱具有对光源不透明的外涂层，则涂层首先被除去以制造辐射窗口。涂层的长度将决定了在分离柱中所形成的多孔基体的长度。
[0052]混合物被引入该分离柱中。例如，混合物可以通过使用注射器而流过该分离柱。分离柱的末端可以密封。
[0053]混合物被辐射，因此在分离柱中形成均匀的分离介质。例如，该分离柱可以在一段短时间如大约五分钟暴露于辐射。辐射的波长取决于用于该反应中的光引发剂或光活性基团的类型。该辐射可以包括可见光或紫外光。例如，365nm波长的辐射可用于光引发剂Irgacure 1800。该光活性基团甲基丙烯酸酯可以在300nm或365nm的波长下光聚合，如分别在C.Yu，F.Svec，J.M.J.Frechet，Electrophoresis 21(1)(2000)pp.120-27和H.-G.Woo，L.-Y.Hong，S.-Y.Kim，S.-H.Park，S.-J.Song，H.-S.Ham，Bull.Korean Chem.Soc.16(1995)pp.1056-59中所报道。
[0054]当混合物暴露于辐射时发生光化反应。在单体上的光引发剂或光活性基团吸收光来催化金属有机化合物的聚合反应。
[0055]制备多孔基体的光化学途径具有许多优点：(1)短的制备时间，(2)孔隙大小的控制，(3)多孔基体的键接和长度的控制，(4)高的机械强度，和(5)导致开裂的高温的避免。
[0056]该分离介质优选不具有熔结玻璃料或色谱分析的颗粒，因此分离介质的制备比用熔结玻璃料或色谱分析颗粒制备普通的分离介质更容易。
[0057]任选，有机溶剂可以被引入到分离柱中。例如，该有机溶剂可以是乙醇。多孔基体可以使用有机溶剂被洗净任何未反应的物质，孔隙产生剂，和光引发剂。溶剂可以通过使用注射器或其它器具而流过该分离柱。
[0058]偶联剂被引入该柱中而形成结合相多孔基体。偶联剂可具有单官能度，双官能度，或三官能度。偶联剂可以是有机偶联剂，如卤代芳族或酰卤。例如，氰化钠和氯化铵能够与金属有机聚合物上的酮起反应，或卤代芳族或酰卤能够进行缩合反应。偶联剂可以包括官能团和金属。该金属可以是铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌和锆。例如，硅烷偶联剂可以是有机氯硅烷，有机烷氧基硅烷，有机氨基硅烷，或其它反应性硅烷。该硅烷偶联剂可用于金属有机聚合物的表面羟基被官能团的衍生化中。例如，该金属有机聚合物和硅烷偶联剂，如包括官能团R’的有机氯硅烷可以进行下列反应而形成结合相多孔基体：
  (5)
该温度不需要升高以提高该反应速率；该反应可以在室温下进行。反应的时间将取决于官能团而变化。例如，增加的反应时间将对于较大官能团导致相塌陷。当官能团彼此太接近和彼此屏蔽时会发生相塌陷，据此减少了在表面上活性基团的数目。
[0059]任选，有机溶剂可以被引入到包括结合相多孔基体的柱中。例如，该有机溶剂可以是甲苯，吡啶，或三乙胺。任何未反应的硅烷偶联剂和该反应的副产物，如盐酸或醇，可以通过将有机溶剂引入到柱中而从结合相多孔基体中除去。溶剂可以通过使用注射器或其它器具而流过该分离柱。
[0060]该分离柱可以在将柱用于分离之前用分离溶液调理。分离溶液可以包括缓冲剂，如含水乙酸铵，和洗脱溶剂，如乙腈。
[0061]提供了分离被分析物的样品的方法。样品溶液中的被分析物的样品被引入通过分离柱11。被分析物包括中性物质，如多环芳族烃，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物，和带电荷的物质，如肽。样品溶液可以包括缓冲剂，如含水乙酸铵，和洗脱溶剂，如乙腈。
[0062]该分离柱11包括分离通道13和在通道13中的均匀的分离介质15。该分离柱11可以是毛细管或平面结构。该分离介质15优选不具有熔结玻璃料或色谱分析的颗粒。均匀的分离介质的使用是有利的，因为，在一些应用中，色谱分析的颗粒(即非均匀的分离相)的使用会引入不需要的变宽(即拆分度不足)。该分离介质15可能包括含有基本上相同的多孔均匀静止相的两区段，而且两区段可以被另一个区段分开，如具有不同的孔隙尺寸或表面电荷的整体单段(monolith)。优选，该分离介质15是连续的。
[0063]分离介质15包括多孔基体，和多孔基体包括载体和静止相。该载体包括金属有机光聚合物，和该静止相包括结合相。该分离介质15将被分析物浓缩在柱上。样品可以通过对柱11施加压力或电压来引入。例如，该压力可以在一段时间(两秒至1920秒钟)中是0.5psi或20psi，或约40V/cm的电场强度施加一段时间。例如，大于约两厘米的注射栓塞长度可以注入到该柱11中。
[0064]被分析物利用柱11来浓缩。预浓缩的程度纯粹地取决于保留系数，即k值。该保留系数受到溶剂的性质，被分析物的性质，和分离介质的详细形态的影响。而且，该流速几乎不影响预浓缩的程度。
[0065]多孔基体的高孔隙度的性质导致了对于被分析物的高质量转移速率，它促进该预浓缩效果。高质量转移速率起因于被分析物对于多孔结构的结合部位的增强的可达到性。因为高质量转移速率，被分析物-多孔基体相互作用的动力学(即被分析物在移动相和静止相之间的分配)不是该分离中的速率限制步骤。高质量转移速率使得该分离方法区别于先前形式的色谱分离。对于这一分离方法，因为高质量转移速率，有可能注入和浓缩更大体积的样品溶液，与含有正常的色谱分析材料的柱相比而言。
[0066]总的预浓缩效果与保留系数成正比，其中较长的注射栓塞长度(例如，大于约25mm)导致具有低k值的被分析物的严重的峰加宽。这一行为暗示了在峰形状折中之前，各被分析物的样品栓塞的最大长度。该保留系数能够通过改变结合相来改变。
[0067]在线预浓缩的主要优点是它降低了给定的被分析物的检测极限。另一个优点是预浓缩可用于为被分析物清洗掉在样品基体中见到的可能的干扰性物质。
[0068]让分离溶液流过柱11，因此分离并洗脱该被分析物。该分离溶液可通过对柱11施加电压或压力而被引起流动。例如，该压力可以在一段时间(两秒至1920秒钟)中是0.5psi或20psi，或300V/cm的电场强度施加一段时间。分离溶液可以包括缓冲剂，如含水乙酸铵，和洗脱溶剂，如乙腈。在一个实施方案中，该分离溶液与样品溶液相同。
[0069]结合相多孔基体用于从溶液中萃取被分析物以及为被分析物的色谱分离提供静止相。正是这一萃取器-分离器联合，使得这一方法更有效力。例如，样品溶液的超过约两厘米栓塞能够装载到毛细管中并使用与该样品溶液相同的分离溶液来浓缩。
[0070]在一个实施方案中，该被分析物可以通过进行正常相，反相，离子交换，亲合性，疏水性相互作用，尺寸排阻，或手性色谱分析来分离。
[0071]在另一个实施方案中，除了由多孔基体所发挥的效果，溶剂梯度可用来进一步增强被分析物的预浓缩。在这一实施方案中，样品可以溶于溶液中，后者具有比在分离溶液中更高浓度的缓冲剂(例如，水)。缓冲剂在样品溶液中的较高浓度会提高样品对静止相的亲合性。当使用溶剂梯度时，栓塞长度能够长于柱的长度。例如，91.2cm栓塞的注入，它是毛细管的总长度的三倍以上，是可能的，而仅仅在拆分率上有轻微损失。在梯度条件下获得的峰高度的改进能够是大于一千倍。
[0072]对于中性被分析物，现有在多孔基体上使用梯度的两种途径。第一种途径是提高在分离溶液和样品溶液之间的有机溶剂比率。第二种途径是通过提高水在分离溶液中的百分比，同时维持在分离溶液和样品溶液之间有机溶剂的合理百分比，来提高在分离中的保留系数k。分析对于第一种途径是更快的，而拆分率对于第二种途径是更好的。
[0073]在本发明的另一个实施方案中，除了由多孔基体所发挥的效果，样品堆积可用来进一步增强被分析物的预浓缩。样品堆积是带电荷的被分析物的聚集，当该被分析物经过分开高和低电场强度的区域的浓度边界时。高的电场区域是含有更多洗脱溶剂的较低导电性样品溶液，而低电场区域是较高导电性分离溶液。该洗脱溶剂，如乙腈，具有比缓冲剂如乙酸铵水溶液更低的导电性。因此，较高浓度的洗脱溶剂导致降低样品基体导电性。
[0074]该分离柱是用分离溶液制得。当被分析物被引入该分离柱中和施加电压时，样品溶液中的被分析物在柱的进口快速地加速移向早已在柱中存在的分离溶液(较低电场强度)，而穿越在样品溶液和分离溶液之间的边界时，他们减慢速度并堆积在界面上的窄区段中。
[0075]样品堆积基本上是由在浓度边界上电泳速度的变化所引起。电泳速度是电泳迁移率和电场强度的乘积。当电泳速度在浓度边界处降低时发生聚集(样品堆积)。样品堆积也通过使用等速电泳的基本原理和科尔劳施(Kohlrausch)定律来解释。
[0076]现有在多孔基体上进行样品堆积的两种途径。第一种途径是提高有机溶剂如乙腈的百分比。第二种途径是降低缓冲组分在样品溶液中的浓度。提高乙腈或其它合适有机溶剂的百分比尤其可用于含有高浓度盐的真实样品。脱盐，例如通过透渗析，因此是制备供注射用的较低导电性溶液所不需要的。当脱蛋白质是样品制备的一部分时，有机溶剂的使用也用于生物样品。
[0077]本发明利用下列实施例更详细地进行描述。下列实施例仅仅为了进一步说明和公开本发明而给出，不应该认为限制本发明。
实施例1
[0078]原料和化学品。熔凝硅石毛细管(75μm i.d.×365μm o.d.)是从Polymicro Technologies，Phoenix，Arizona商购的。甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)是从Gelest，Tullytown，Pennsylvania和Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin商购的并且在没有提纯的情况下使用。HPLC-级甲苯，菲，芘，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物是从Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin购得。Irgacure 1800是从Ciba，Tarrytown，New York获得。
[0079]安装仪器。使用带有UV吸光检测器的Beckman P/ACE2000毛细管电泳仪来进行全部CEC实验。X1-1500 UV cross-linker，可从Spectronics Corp.，Westbury，New York获得，装有主要地365nm波长的六只15W黑光灯管，用于辐射该反应溶液。在从Eindhoven，Netherlands获得的Philips SEM 505扫描电子显微镜上进行扫描电子显微镜(SEM)分析。
[0080]聚合反应程序。通过将375μl的MPTMS添加到100μl的0.12N HCl中，刚好在使用之前制备单体贮备溶液。这一溶液在室温下搅拌大约三十分钟而获得透明、单相的溶液。将合适量的甲苯(孔隙产生剂)加入到该单体贮备溶液中，如在下表1中所示。
             表1
    毛细管柱     ％甲苯(v/v)
    A     90
    B     80
    C     75
    D     73
    E     65
    F     50
光引发剂，Irgacure 1800，首先被添加到该甲苯中，按照甲苯/单体贮备溶液的总重量的5％。这一光引发剂溶液然后被加到相应量的单体贮备溶液中，并在室温下搅拌三十分钟而获得黄色，单相的溶液。为了最大程度地减少甲苯的蒸发，该溶液是在具有聚硅酮封盖的管形瓶中制备，在溶液的填充过程中经由该封盖将毛细管插入。
[0081]通过使用位于毛细表面的45°角的刀片，除去在30v长的毛细管上的聚酰亚胺涂层的15cm细条。毛细管的机械稳定性是显著地优良的，尽管有聚酰亚胺涂层的细条的除去。辐射光仅仅通过该15cm细条进入毛细管。在毛细管中没有形成整体单段，其中聚酰亚胺涂层(“掩蔽层”)完整无损。
[0082]通过使用0.5ml一次性注射器，在用溶液装填该毛细管之前将大约0.2ml的反应溶液冲洗通过该毛细管以便彻底地湿润壁面。这导致整体单段粘结于毛细血管壁上。不需要毛细血管壁的特殊预处理来将整体单段粘结于壁上。填充好的毛细管在UV cross-linker中使用365nm光进行辐射(9×105mJ/cm2)五分钟而形成多孔基体。
[0083]在辐射后，该毛细管利用手持注射器用乙醇洗涤，以除去未反应的试剂或孔隙产生剂。因为该整体单段是高度渗透性的，不需要高压来驱动液体通过该毛细管。一旦未反应的试剂被除去，该整体单段变成不透明的并且无需借助显微镜就能清楚地透过该毛细管看见。多孔基体的均匀性是在100X放大倍数下证实。紧接着在整体单段区段之后用发烟硫酸烧除聚酰亚胺涂层而形成检测窗口。
[0084]一旦制造之后，该毛细管成功地安装在盒中，没有任何损害。使用注射器和手持钳子，该毛细管用分离缓冲液调理大约五分钟。一次在该仪器中，毛细管进一步通过用分离缓冲液加压漂洗(20psi)来调理或通过在5kV或10kV下电动力学调理三十分钟。
[0085]表征。SEM用于研究分离柱的形态。毛细管被小心地切开以暴露该整体单段。毛细管的切开段用金进行溅射，之后进行SEM分析。
[0086]被分析物分离。在移动相中制备被分析物，以防止在CEC实验过程中的梯度效应。该移动相是由各种比率(v/v)的50mM乙酸铵，水，和乙腈组成。新样品溶液用于每一次注射，以维持在样品溶液和移动相中相同浓度的乙腈。
[0087]图2A是显示柱B的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离是用50mM乙酸铵/水/乙腈(1/3/6)溶液来进行。样品溶液在0.5psi压力下注入达到三秒钟，和在20℃的温度下用1kV的外加电压进行分离和然后在214nm下检测。分离的洗脱顺序是(1)硫脲，(2)四氢呋喃，(3)萘，(4)菲，(5)荧蒽，(6)芘，(7)1，2-苯并蒽，和(8)1，2，5，6-苯并蒽(bienzanthracene)。
[0088]图2B是显示柱D的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离是用50mM乙酸铵/水/乙腈(1/4/5)溶液来进行。样品溶液在0.5psi压力下注入达到三秒钟，和在20℃的温度下用15kV的外加电压进行分离和然后在200nm下检测。分离的洗脱顺序是(1)苯，(2)甲苯，(3)乙烯苯，(4)丙基苯，(5)丁基苯，和(6)己基苯。
[0089]柱的洗脱顺序类似于利用比小分子量或较高亲水性的被分析物更迟洗脱的较大分子量或较高疏水性的被分析物来进行的反相色谱的洗脱顺序。在两图中的被分析物的洗脱是在低于七分钟内进行。气泡形成不是CEC实验中的问题，为此典型的操作电流是在3和10μA之间。
[0090]对于典型的毛细管柱D，对于硫脲，较少保留的化合物，实现了高达100,000板/m的效率。在三天的时间中(n＝33)对于硫脲(0.65％RSD)，萘(1.10％RSD)，菲(1.14％RSD)，和芘(1.14％RSD)观察到洗脱时间的小变化。
[0091]图3是显示柱D的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离是用50mM乙酸铵/水/乙腈(1/3/6)溶液来进行。样品溶液在0.5psi压力下注入达到三秒钟，和在20℃的温度下用1kV的外加电压进行分离和然后在214nm下检测。硫脲，萘，菲，和芘的样品是在仅仅20psi(仪器的最高界限)的施加的压力下在110分钟中被分离。峰拖尾对于芘是最严重的，因为它与多孔基体的强相互作用，但对于硫脲没有观察到拖尾，因为硫脲在柱上较低停留。
[0092]图4A是在75μm-i.d.毛细管柱中用80％(v/v)甲苯(毛细管B)形成的金属有机光聚合物的横截面的扫描电子显微照片。该显微照片显示了1μm球形结构的互连网络，在其中散布了微米级尺寸的大孔(大到5μm)。
[0093]图4B是在75μm-i.d.毛细管柱中用50％(v/v)甲苯形成的金属有机光聚合物的横截面的扫描电子显微照片。与图4A中示出的多孔基体相反，在图4B中示出的结构是具有2μm或更低直径的大孔的致密的光聚合物。因此，在图4B中的基体是较低渗透性的，和产生相当大的回压。在接近200psi的压力下没有液体被驱动穿过该柱。
[0094]多孔基体的渗透性是通过多孔基体的线速度来决定，它与渗透性成正比，如在达西定律(Darcy’s law)中所述。多孔基体的渗透性与大孔尺寸的关系高度取决于用于制备光聚合物的孔隙产生剂的体积和类型。对于用90％(v/v)甲苯制得的柱(柱A)，线速度是12.3cm/分钟，和80％(v/v)柱(柱B)具有3.3cm/分钟的线速度而用73％(v/v)甲苯制得的柱(柱D)具有0.6cm/分钟的线速度。这些线速度数据提示了大孔随着降低孔隙产生剂浓度而减少。这一行为与在文献中报道的一致。
实施例2
[0095]按照在实施例1中所述来制备分离柱。1∶1己烷/甲苯的混合物用于该孔隙产生剂。该分离柱具有与用80/20甲苯/反应溶液制得的分离柱的分离性能类似的分离性能。获得了对于硫脲的68,000板/m(RSD 7.0％，n＝5)的柱效率和3.7cm/分钟的电渗流(EOF)速度。
实施例3
[0096]375μl的MPTMS和100μl的0.12M盐酸的混合物在室温下搅拌三十分钟。27份的这一混合物与73份的甲苯混合而得到200μl的最终溶液。添加相当于最终溶液的5wt％的光引发剂Irgacure 1800，和所获得的溶胶-凝胶溶液在使用之前搅拌五分钟。75μm i.d.×365μmo.d.熔凝硅石毛细管用该溶胶-凝胶溶液填充，然后该分离柱在Spectrolinker X1-1500中暴露于365nm的UV光来进行光聚合。多孔基体的聚合反应长度可通过在五分钟的辐射之前除去毛细管的聚酰亚胺涂层的15cm细条来控制。未反应的试剂用乙醇冲洗掉。毛细管的总长度是25.6cm(从进口到检测器窗口为18.8cm)。在使用之前所获得的柱用该分离溶液进行调理。
[0097]全部电泳实验用Beckman P/ACE 2000来进行。该毛细管然后恒温在20℃。注射通过使用压力(即，0.5psi和20psi)或电压(1kV到10kV)和在两秒到1920秒之间改变持续时间来进行。检测是在214或254nm下进行。数据分析是用从Galactic Industries Corporation，Salem，New Hampshire获得的GRAMS/32版本4.02来进行。
[0098]图5A和5B是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。这些图说明了，在含有小分子，硫脲，三种多环芳族烃(PAHs)，和8种烷基苯基酮的混合物的CEC分离中，随着注入的栓塞长度的增加，检测灵敏度提高。为了消除溶剂梯度影响，样品是在该分离溶液中制备。样品和分离溶液是50mM乙酸铵/水/乙腈(1/4/5)。在图5A中，栓塞长度是0.1mm，6.8mm，13.7mm，27.4mm，和34.2mm。0.1mm栓塞长度属于0.5psi的施加的压力，而全部其它栓塞长度属于20psi的施加的压力。分离的外加电压是20kV，和该吸收率是在214nm下测量。柱的洗脱顺序是(1)12.5μM硫脲，(2)51.0μM萘，(3)1.0μM菲，和(4)123μM芘。
[0099]在图5B中，该柱是按照与前面所述的柱同样的方式制备，只是该柱通过(3，3，3-三氟丙基)三氯硅烷在室温下的三十分钟的连续流动和随后用甲苯漂洗来进行后改性。栓塞长度是0.7mm，7.2mm，10.7mm，17.9mm，和28.6mm。外加电压是15kV，和该吸收率是在254nm下测量。柱的洗脱顺序是(1)5μm硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。这些烷基苯基酮中的每一种的浓度是在分离溶液中0.1μg/mL。
[00100]对于在图5A中示出的PAH混合物，以0.1mm栓塞长度的典型注射几乎看不见峰，但是当栓塞长度从6.8mm提高到34.2mm时峰高度提高。因此，该分离柱，本发明的实施方案，允许比典型分离柱更长的栓塞长度的注射。类似地，对于在图5中示出的烷基苯基酮混合物，当栓塞长度从0.7mm增加到57.3mm时峰高度提高。随着栓塞长度的增加，全部四个峰都显示更多的变宽，但是后面的洗脱峰则在较小程度上比前面的洗脱峰更对称。这一行为与在典型的色谱分离中观察到的不同，在典型的色谱分离中，后面的洗脱峰因为分散效应而不如前面的峰对称。这些结果显示，在注射过程中被分析物在多孔基体的进口处积聚，其中较多保留性的物质比较少保留性的物质更有效地定位。
[00101]在图5A中，与0.1mm的典型注射相比27.4mm注射的峰高度分别对于萘，菲，和芘是50，125和127倍。在27.4mm注射中的样品溶液是在典型的0.1mm注射中的样品的10倍稀释液。
实施例4
[00102]按照在实施例3中所述来制备分离柱。样品和分离溶液是50mM乙酸铵/水/乙腈(1/3/6)。样品在1kV下注入。外加电压是15kV，和该吸收率是在214nm下检测。图6是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。在分离溶液中39.0mM的萘被注射五秒钟，由信号a表示，和在分离溶液中的3.9mM的萘被注射八十五秒，由信号b表示。通过控制样品的十倍稀释液的注射时间，两电色谱的矫正峰面积(峰面积/迁移时间)彼此变得更靠近。在a和b两线中电泳图谱的矫正峰面积分别是0.0023(％RSD＝0.02％，n＝3)和0.0025(％RSD＝0.00，n＝3)任意单位/分钟。进行对比，使得每一轮注射的萘分子的量是相同的。
[00103]预浓缩是通过稀释样品的较长时间注射的稍高峰高度和对于两实验的几乎相同的矫正峰宽(峰宽/迁移时间)来证实。在信号a和b中电色谱的峰高度分别是0.0869(％RSD＝0.36％，n＝3)和0.0937(％RSD＝0.06％，n＝3)任意单位。在a和b两信号中电色谱的峰宽度分别是0.0253(％RSD＝0.07％，n＝3)和0.0249(％RSD＝0.01％，n＝3)任意单位/分钟。在b线上迁移时间的变化是由较长注射时间所引起，这使得样品栓塞的中心更靠近检测器窗口。
实施例5
[00104]575μl的MPTMS和100μl的0.12M盐酸的混合物在室温下搅拌三十分钟。20份的这一混合物与80份的甲苯混合而得到200μl的最终溶液。添加相当于最终溶液的总体积的10％的光引发剂，和所获得的溶胶-凝胶溶液在使用之前搅拌五分钟。如以上在实施例3中所述来制备分离柱。未反应的试剂用甲苯冲洗掉。多孔基体的表面通过五氟苯基三氯硅烷在室温下经由毛细管的四十五分钟的连续流动和随后用甲苯漂洗来改性。
[00105]图7(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。分离溶液是50mM磷酸/水/乙腈(1/5/4)。外加电压是15kV，和该吸收率是在214nm下检测。图7(a)显示了试验肽的在0.1mm栓塞长度的0.5psi注射，和图7(b)显示了试验肽的在12mm栓塞长度的0.5psi注射。试验肽，它们是带电荷的被分析物，是(1)血管舒缓激肽，(2)血管紧张素II，(3)三肽I，(4)三肽II，和(5)蛋氨酸脑啡肽。肽的浓度是16.7μg/ml。肽的阴极引导速度是由电泳和电渗流效应来支配。该肽在分离溶液的pH(pH＝2)下具有净正电荷。与0.1mm栓塞长度的典型注射相比更长时间的注射的峰高度的改进分别对于血管舒缓激肽，血管紧张素II，三肽I，三肽II，和蛋氨酸脑啡肽是21，19，16，18和22倍。这一结果说明了这一方法对于带电荷的被分析物的有用性。
实施例6
[00106]与在实施例3中一样制备分离柱。图8(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。图8显示了尿样品的分析结果，掺加0.1mM皮质甾醇(峰1)，0.3mM黄体酮(峰2)和0.2mM可的松(峰3)。四份的掺加或未掺加的尿与六份的乙腈混合和离心处理以除去蛋白质。在注射之前一份的各上层清液与一份的50mM乙酸铵/水/乙腈(1/7/2)混合。图8(a)显示了0.1mm的注射栓塞长度，和图8(b)显示了21.4mm的注射栓塞长度。图8(c)表示了尿空白的21.4mm注射栓塞长度。分离溶液由50mM乙酸铵/水/乙腈(1/5/4)组成。分离的外加电压是17kV，和该吸收率是在254nm下测量。在用乙腈进行蛋白质沉淀后，这些甾族化合物被检测和用样品溶液的21.4mm注射来定量，但是用典型的0.1mm注射来微弱地检测。在空白试验和掺加的试验之间的对比表明，仍然含有其它生物分子的样品基体没有显著地干扰该分离柱的甾族化合物分析。这一结果说明了该技术在生物流体分析中的有用性。
实施例7
[00107]按照在实施例3中所述来制备分离柱。图9(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。1.1cm的样品栓塞长度被注入。该分离溶液是在60％乙腈中5mM乙酸铵，和样品溶液是在60％乙腈(a)，50％乙腈(b)，40％乙腈(c)，30％乙腈(d)，和20％乙腈(e)中的5mM乙酸铵。分离的外加电压是15kV，和该吸收率是在254nm下检测。洗脱顺序是(1)硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。各被分析物的浓度是2nl/ml。
[00108]该保留系数，k，对于乙酰苯(峰2)，丙酰苯(峰3)，丁酰苯(峰4)，戊酰苯(峰5)，己酰苯(峰6)，庚酰苯(峰7)，辛酰苯(峰8)和癸酰苯(峰9)获得的保留系数k分别是0.18，0.25，0.32，0.41，0.53，0.67，0.85和1.33。在这一研究中，硫脲(峰1)用作供k的测定用的基本上未保留的中性溶质。k的值和迁移时间跟随烷基链长度的增加。通常，当水浓度从40％提高到50％，60％，70％和80％时改进了峰形状和拆分，这可分别由a，b，c，d，和e来证实。
实施例8
[00109]该实验条件与在实施例7中相同。图10是曲线的图解表示，显示了峰高度比率(从样品基体中较高浓度的水获得的峰高度除以从与分离溶液的样品基体类似的样品基体获得的峰高度)的对数/样品基体中水的百分比的关系。该数据显示存在一种限度，在该限度上峰高度能够通过提高样品基体中缓冲剂的浓度来改进。预浓缩得到改进，归因于被分析物对多孔基体的增加的吸引。当峰高度比的对数的值是低于1，约1，或大于1时，与使用分离溶液作为样品基体的类似注射相比，在峰高度中分别有降低，无变化，或提高。对于全部的试验APK，当水浓度从40％提高到50％和从50％提高到60％时，峰高度得到改进。当水的百分比从60％提高到70％或更高时峰高度没有改进，但是，当水的百分比从60％提高到70％时两种最低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)除外。峰高度对于在80％水基体中的较高k值被分析物(庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯)则变恶化。峰高度的降低的原因是高k值被分析物在高度含水样品基体中的溶解度的减少。矫正的峰面积，它是对于辛酰苯和癸酰苯所负载的样品的量的量度，是在80％水基体中比所用其它样品基体降低了10％到60％。为了避免溶解度问题，在接下来的实验上的试验APK是在具有至少30％乙腈的基体中制备的。
实施例9
[00110]如以上在实施例3中所述来制备分离柱。图11(a，b，和c)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵。栓塞长度是：对于在60％乙腈中的5mM乙酸铵的样品溶液来说的0.2cm(a)；对于用于a的同样样品溶液来说的2.74cm(b)，和对于在30％乙腈中5mM乙酸铵的样品溶液来说的2.74cm(c)。其它条件和峰的鉴别与在实施例7中相同。
[00111]该梯度条件，如在图11(c)中所示，显示改良的拆分和峰形状。在图11中所示的在梯度条件下峰高度的改进(c)对于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯分别是36，35，38，41，42，38，32和24倍。所测量的峰高度的％RSD(n＝5)是在0.9％到2.5％范围。迁移时间的％RSD(n＝5)是在0.3％到0.5％范围。该程序因此在单个柱中可再现。
实施例10
[00112]图12A，12B和12C是显示使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。栓塞长度是：对于在40％乙腈中的5mM乙酸铵的样品溶液来说的2.74cm(图12A)；对于在30％乙腈中5mM乙酸铵的样品溶液来说的2.74cm(图12B)，和对于与图12B中相同的样品溶液来说的5.48cm(图12C)。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵(图12A)和在50％乙腈中5mM乙酸铵(图12B和12C)。其它条件和峰的鉴别与在实施例7中相同。
[00113]在图12B中的k值比在图12A中的高，因为在分离溶液中的水的高百分率。被分析物分子在高百分比的水下更吸引到PSG相上。分配常数K(在PSG相中溶质的摩尔数除以在分离溶液中溶质的摩尔数)，它与k值成正比，随着提高在分离溶液中水的浓度而增大。在图12B中，对于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯的k值分别是0.29，0.47，0.65，0.92，1.28，1.76，2.37和4.25。为了保持该梯度效应恒定，在分离溶液和样品基体之间的有机溶剂比率的百分比被保持与图12A和12B同样的值。因为仍然未知的原因，在图12B中的结果显示，对于具有较低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)，与图12A相比在峰高度上有轻微的提高。对于其它试验溶质，在峰高度上有一些下降。
[00114]图12C说明了对于5.48cm的较长注射栓塞和在分离溶液中较高百分比的水所遇到的情况。峰高度的改进对于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯和癸酰苯分别是31，33，55，44，44，37，29和19倍。与图11(c)中一样，峰高度的改进没有跟随k，与在非梯度条件中不同。在峰高度上的改进可以与在分离溶液和样品基体之间的较高百分比的有机溶剂所获得的那些相当(图11，c)。应该指出，在图11中(c)注射栓塞比在图12C中短两倍。
实施例11
[00115]图13(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。栓塞长度是0.22mm(a)和19.5cm(b)。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵。样品溶液是：在60％乙腈中(a)和在36％乙腈中(b)的5mM乙酸铵。样品浓度是11-53μg/ml(a)和1.1-5.3μg/ml(b)。外加电压是30kV，和该吸收率是在214nm下检测。洗脱顺序是硫脲(峰1)，萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)，和benz(e)acephenanthylene(峰5)。
[00116]溶剂梯度改进了四种PAH的检测，如在图13中所示(b)。在分离溶液中高百分比的乙腈(60％)，更短的PSG长度(10cm)，和高的电场强度(781.3V/cm)用于更快速的分析时间。图13(a)是在分离溶液中制备的样品的0.22mm典型注射。图13(b)是使用梯度的19.5cm注射，其中样品处于36％乙腈基体中，这在样品溶液和分离溶液之间提供高百分比的有机溶剂。长于19.5cm的栓塞会引起萘峰的变宽。有益的是应该指出，注射长度长于从进口到检测器窗口的长度(18.8cm)。在样品注射过程中实际上观察到快速洗脱硫脲区段。硫脲区段因此是在分离电压开始时的检测窗口。
[00117]对于萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)和benz(e)acephenanthylene(峰5)在峰高度上的改进分别是346，437，409和315倍。在图13中的样品浓度(b)比在图13中(a)低10倍。对于萘，菲和芘，以上所述的值是比前面所报导的在非梯度条件下的值分别好了6.9，3.5和3.2倍。
实施例12
[00118]图14(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。栓塞长度是0.23mm(a)，7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)。该分离溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸铵。样品溶液是：在60％乙腈中(a)和在40％乙腈中(b，c，d和e)的5mM乙酸铵。样品浓度是9-50μg/ml(a)，0.9-5μg/ml(b，c，d和e)。外加电压是22kV，和该吸收率是在254nm下检测。该洗脱顺序是硫脲(峰1)，癸酰苯(峰2)，和芘(峰3)。
[00119]癸酰苯(峰2)和芘(峰3)的峰高度随着增加栓塞长度而提高。该注射是从0.23mm(a)提高到7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)，这对应于总毛细管长度的0.1％，30％，89％，178％，和356％。多孔基体的高孔隙度或低流动阻力使得有可能以相当容易的方式引入更大长度的样品溶液。长于91.2cm注射仍然是可能的。然而，它没有进行，归因于拆分能力的损失，正如在图14(e)中所观察的。在d或e中的电色谱被认为是在CEC中的第一个示范，显示样品注射长于总毛细管长度。所注射的样品的体积也大于1μl。在a和e中获得的峰高度的对比提示了对于癸酰苯和芘而言在峰高度上分别改进1118倍和1104倍。这些值是通过在CEC中使用简单的在线预浓缩技术，对于中性被分析物的最高所报道的敏感性改进。被分析物与多孔基体的强相互作用和多孔基体的固有的快速质量转移特性使得可以观察到此类突出的预浓缩效应。
[00120]成功的分离已经用PSG在250μm i.d.毛细管中实现(数据未显示)。这一工作产生了牵涉到长的栓塞注射的进行半制备性分离的可能性。在μl范围中的注射体积能够容易地做到。
实施例13
[00121]图15(a，b，c，d，e，和f)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。栓塞长度是0.1mm(a)和1.8cm(b，c，d，e和f)。注射通过使用压力来进行，其中注射时间被固定在1.8cm。该分离溶液是与分离溶液相同(a和b)，在20％乙腈中10mM磷酸(c)，在70％乙腈中10mM磷酸(d)，在40％乙腈中的50mM磷酸(e)，在40％乙腈中的0.05mM磷酸(f)。该分离溶液是在40％乙腈中的10mM磷酸。肽浓度是16.7μg/ml每次，外加电压是12kV，和吸收率检测是在214nm下进行。洗脱顺序是血管舒缓激肽(峰1)，血管紧张素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸脑啡肽(峰5)。
[00122]虽然可以预期与非梯度条件(图15，b)相比在梯度条件下峰形状是更好的(图15，c)，但是通过使用在样品基体中更高浓度的乙腈，所获得的峰形状是更好的(图15，d)。在从样品堆积所形成的图15(d)中观察到更好的峰形状。通过在样品溶液中使用较高浓度的洗脱溶剂的变宽效果(因为较高浓度的洗脱溶剂所引起的反向梯度效应)没有观察到，因为一旦施加电压之后阳离子肽立刻迁移到分离缓冲液中，因此在到达多孔基体之前肽区段(zones)早已存在于分离溶液中。样品堆积也示于图15(f)中，其中在具有与分离溶液相比更低浓度的缓冲组分和类似百分比的乙腈的基体中制备样品。
[00123]在从去堆积形成的图15(c)中观察到所不希望有的的峰形状。去堆积(Destacking)是当被分析物经过分开低和高电场强度的区域的浓度边界时带电荷的被分析物的变宽。低的电场区段是含有更多水的高电导率样品基体。去堆积也示于图15(e)中，其中在具有与分离溶液相比更高浓度的缓冲组分和类似百分比的乙腈的基体中制备样品。
实施例14
[00124]图16(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。注射是使用0.5psi压力的0.1mm(a)和在5kV下的15-s(b)。样品溶液是：在40％乙腈中10mM磷酸(a)和在40％乙腈中0.5μm磷酸(b)。肽浓度是16.7μg/ml每一种(a)和167ng/ml每一种(b)。分离电压是12kV。其它条件与在实施例13中相同。
[00125]在图16中的被分析物(b)是比图16中的那些少浓缩了一百倍。对于血管舒缓激肽(峰1)，血管紧张素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸脑啡肽(峰5)在峰高度上的改进分别是1040，820，810，950和711倍。对于预浓缩程序，峰高度的％RSD(n＝5)是在6.2％-16.2％范围，而迁移时间的％RSD(n＝5)是在0.7％-1.5％范围。借助于内标物的使用应该改进峰高度的可再现性。
[00126]通过将样品溶于低导电率基体(在40％乙腈中0.5μM磷酸)中，随后在检测器端使用负电极的电压进行注射，来进行电场增强的样品注射。当施加电压时，低导电率样品基体借助于电渗流(EOF)进入毛细管，而阳离子肽借助于EOF和电泳流两者进入柱中。仅仅非常小栓塞的样品基体被引入，因为分离溶液的低pH显著地减少EOF，这防止在毛细血管壁上硅烷醇基的解离。在30分钟之后实际上检测未保留的中性溶质(硫脲)。
[00127]在被引入柱中的样品基体区段中的电场大大高于分离区段。这一效应引起了进入毛细管的阳离子肽的高电泳速度。高的被分析物电泳速度引起大量的肽被引入，与在水动力学注射中不同，负载的样品的体积限制了所引入的样品的量。高的被分析物电泳速度也引起在样品基体和分离溶液之间的浓度边界上肽的聚集或预浓缩(样品堆积)。在动电学注射之前水栓的引入(被建议用于利用动电学注射的样品堆积中)没有改进峰高度，因为EOF和被分析物电泳速度的相似方向。进入毛细管的低导电率样品基体也在注射过程中在毛细管的入口端维持电场的增加。
[00128]利用在图16中的条件，在5kV下的最佳动电学注射时间是15秒。比较久的注射导致峰的变宽。在注射之后，利用与在注射中同样的极性来施加分离电压(在检测器侧的负电极)。被分析物运动到阴极和随后以它们在PSG柱上的保留为基础再次预浓缩。该方法被认为对阳离子有选择性，因为阳离子主要被引入毛细管中。所注入的中性物质是在未保留的中性标记物和阳离子之后迁移，因为该EOF是非常缓慢的。在所使用的pH下，全部的被分析物是带阳电荷的或中性。该技术对于其它阳离子样品的适用性也是可能的。
实施例15
[00129]表2列出了用于制备不同的前体贮备溶液的试剂的类型和体积，其中酸催化剂与前体(甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷)的比率会改变或其中前体与共前体反应(形成混合相PSG整体单段)。
                   表2
                     体积(μL)
    溶液     前体1     BTE2     BTO3     HCl4
    A     375     0     0     100
    K     375     200     0     100
    J     575     0     0     100
    M     500     0     75     100
    P     375     200     0     100
1甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷
2双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷
3双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷
40.12M
[00130]改变在反应溶液中前体的浓度或使用用于混合相的形成中的共前体可以改性母体PSG整体单段的化学性质。分别从溶液A和J制备的PSG整体单段，PSG-A和PSG-J，仅仅在前体的体积上不同，该前体用于与含有比A更高体积的前体的J反应。在反应中较高体积的前体会导致在毛细管柱中形成致密的整体单段。PSG整体单段，PSG-K，是用前体和作为共前体的双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷来制备。PSG整体单段，PSG-M和PSG-P，是用前体和不同量的作为共前体的双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷制备的。共前体水解和与前体缩合而形成杂化溶胶(混合相)。
[00131]对于溶液A和J，将合适量的前体添加到100μl的酸催化剂(0.12M HCl)中，和所形成的溶液在室温下(在黑暗中)搅拌15分钟。对于K，M和P，将合适体积的前体添加到100μl的0.12M HCl中，随后添加合适量的双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷；所形成的溶液在室温下(在黑暗中)搅拌15分钟。全部这些溶液在两小时中用于它们的制备。
[00132]重复类似的程序，利用所添加的光引发剂来制备甲苯/前体贮备溶液。被添加到甲苯/前体贮备溶液中的光引发剂的量是10mg光引发剂/每100μl的甲苯/前体贮备溶液。
[00133]该毛细管是按照与前面所述的相同的方法来制备和调理。PSG毛细管柱调理与前面相同。
[00134]测定对于烷基苯基酮(APK)和多环芳族烃(PAH)的两种试验混合物而言的整体单段的分离系数。该分离系数是色谱系统的被分析物分离能力的量度。分离系数，α，是由k2/k1导出，其中k是具体的被分析物的保留系数，以及k2和k1是相邻被分析物的k值。保留系数k＝(tR-t0)/t0是按通常方式测定的，其中tR是被分析物保留时间和t0是未保留的标记物的保留时间，对于标记物我们使用硫脲。表3列出了对于萘和芘的各PSG整体单段的分离系数。
                            表3
  整体单段     KN     kPy     αNpy     Rs(N/Py)
  PSG-A     0.14     0.36     2.57     2.43
  PSG-K     0.23     0.56     2.43     4.09
  PSG-J     0.31     0.79     2.55     4.35
  PSG-M     0.35     0.90     2.57     4.37
  PSG-P     0.25     0.69     2.76     9.03
[00135]α的值是从PSG-K的2.43变化到PSG-P的2.76，其中PSG-P的分离系数稍微地高于另一个整体单段的分离系数。大于1的分离系数预示着被分析物的成功分离。
[00136]图17(a，b，c，d，和e)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。硫脲(T)，萘(N)，菲(PH)和芘(Py)的混合物是在PSG-A(图17，a)，PSG-K(图17，b)，PSG-J(图17，c)，PSG-M(图17，d)，和PSG-P(图17，e)。在全部情况下不同被分析物的峰被充分拆分。
[00137]拆分能力是从以下表达式确定：
R s = N 4 ( α - 1 ) α k ( k + 1 )
其中N是效率(理论塔板数)，α是分离系数，和k是具体的被分析物的保留系数。PSG-A对于萘和芘具有2.43的最低拆分能力，而PSG-J对于相同的两种被分析物具有4.35的拆分能力。与PSG-A相比更高体积的前体用于PSG-J的制备中可导致整体单段的提高的疏水性。在PSG-J上对于萘和芘的保留系数分别是0.31和0.79，和这些值反映了整体单段的疏水性的增加。这些值分别代表了55％和54％的提高。
[00138]共前体，双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷在PSG-M中和双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷在PSG-K和PSG-P中的使用会导致对于萘和芘的拆分能力分别为4.09和9.03，与在母体PSG-A(Rs＝2.43)上的拆分能力相比有了高达73％的提高。萘(0.23)和芘(0.56)的保留系数两者对于这三个整体单段而言都比PSG-A高60％，。
实施例16
[00139]按照与以上在实施例15中对于整体单段PSG-J所述的那样来制备分离柱。对于具有15cm长度的多孔基体，萘和芘的保留系数，分别为kN和kPy，对于用80％甲苯制得的多孔基体分别是0.31和0.79。对于具有10cm长度的类似的多孔基体，kN和kPy分别是0.10和0.24。在长度和kN(r＝0.991)和kPy(r＝0.991)之间有线性关系。15cm，10cm，和5cm多孔基体的分离系数分别地是2.55，2.52和2.40。因此，对于最短的整体单段长度，保持了高的分离系数，而被分析物的洗脱时间显著地减少。降低在毛细管柱中多孔基体的长度会导致试验被分析物的洗脱时间的减少。降低这一长度具有降低萘和芘的保留系数的效果。
实施例17
[00140]如以上在实施例15中所述来制备分离柱。对于用80％甲苯制得的PSG-A，kN是0.14和kPy是0.36，而对于用73％甲苯制得的PSG-A，kN是0.30和kPy是0.74。对于用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-A来说的分离系数分别地是2.57(0.1％RSD)和2.47(0.1％RSD)。对于萘和芘，k的值提高了53％和51％，当73％甲苯用于整体单段的制备时。
[00141]对于PSG-J观察到类似的趋势，其中对于用80％甲苯制得的整体单段，kN是0.31和kPy是0.79。当甲苯的浓度从80％下降到73％时，kN(0.49)和kPy(1.23)值提高了37％和36％。用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-J的分离系数分别地是2.55和2.51。
[00142]当对比用80％和73％甲苯制得的PSG整体单段时，萘和芘的拆分能力差别较大。当孔隙尺寸减少时，这通过使用较低体积的甲苯来实现，随着在相同分离溶液条件下的保留和拆分的增加，PSG表面增大。因此，多孔基体的渗透性影响被分析物的保留。
实施例18
[00143]单体，甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMOS)和硅烷偶联管试剂，五氟苯基二甲基氯硅烷(PFPDM)，五氟苯基三乙氧基硅烷(PFP)，3，3，3-三氟丙基三氯硅烷(C3F3)，正辛基二甲基氯硅烷(C8)，(十三氟-1，1，2，2-四氢辛基)二甲基氯-硅烷(CF13)，和正丙基氨基三乙氧基硅烷(NH2)，是从Sigma Aldrich(Milwaukee，WI)或Gelest(Tullytown，PA)商购并以接收的形式使用。光引发剂，Irgacure1800，是由Ciba(Tarrytown，NY)赠予。全部溶剂属于从Sigma-Aldrich获得的光谱级。具有75m内径×365μm外径的熔凝硅石毛细管是从Polymicro Technologies(Phoenix，AZ)商购的。硫脲，烷基苯基酮，萘，菲，芘，核苷，紫杉酚，紫杉酚衍生物，和肽是从Sigma-Aldrich商购并以接收到的形式使用。
[00144]全部的电色谱是通过使用装有UV吸收率检测器(Beckman Coutler，Inc.，Fullerton，CA)的Beckman P/ACE 2000毛细管电泳(CE)仪器来获得。装有六只365nm低压汞灯管(SpectronicsCorp.，Westbury，NY)的Spectrolinker X1-1500用于光聚合反应。Philips Model 505扫描电子显微镜(SEM)用于分析在毛细管柱中多孔基体的物理结构。为此目的，各柱通过使用Denton Vacuum，LLC DeskII Cold Sputter/Etch装置和碳蒸发附件(Moorestown，NJ)涂有10nm厚度的金/钯。
[00145]用在室温下搅拌15分钟的575μl MPTMOS和100μl0.12M HC1的单体贮备溶液制备金属有机聚合物。通过将60μl的该单体贮备溶液与溶于240μl甲苯中的30mg光引发剂混合来制备80/20甲苯前体溶液(v/v)。所获得的溶液在室温下和在黑暗中搅拌5分钟。制备了具有从外部除去的聚酰亚胺的5或10cm细条的毛细管柱。毛细管的总长度是25.6cm(从进口到检测器窗口为18.8cm)。该检测器窗口，它位于多孔基体之后，通过用发烟硫酸烧除聚酰亚胺来产生。
[00146]在硅烷化反应之前用甲苯漂洗的柱中，在80/20金属有机聚合物上制备结合相。漂洗的柱然后用硅烷偶联剂来处理，利用在手持夹钳中的注射器所产生的该试剂的净溶液的连续流动。在室温下让试剂与聚合物的表面反应15，30，60，70，和90分钟。通过使用注射器用甲苯冲洗，任何未反应的硅烷偶联试剂从结合相多孔基体中除去。下列结合相多孔基体是通过这一程序制得：PSG-PFP，PSG-PFPDM，PSG-C8，PSG-C3F3，PSG-CF13，和PSG-NH2。
[00147]PSG毛细管柱被小心地装入P/ACE盒中。虽然该柱没有聚酰亚胺的完整涂层，但是它仍然维持优良的机械强度。然而，在转移这些毛细管时必须要小心，以防止在安装到毛细管盒中时发生破坏。一旦在盒中，毛细管首先使用注射器用分离溶液调理。在CE仪器中，该柱在20psi下进一步漂洗约2分钟，随后在5kV下动电学调理10分钟。该柱然后恒温在20℃。
[00148]图18a和18b是母体(即未衍生的)多孔基体(图18a)和C8-结合相多孔基体(图18b)的截面扫描电子显微照片。毛细管柱的这些截面扫描图像揭示了1μm直径的互联球形和几乎球形结构的多孔网络。两种结构对于含有一些区域的较高整体单段密度的结合相多孔基体是几乎相同的(在所使用的放大倍数下)。
实施例19
[00149]如以上在实施例18中所述来制备结合相多孔基体。该烷基苯基酮样品溶液是用在50mM乙酸铵(pH 6.5)/水/乙腈(1/3/6)的溶液中的1.42μM乙酰苯，25μM丙酰苯，15μM丁酰苯，20μM戊酰苯，5.5μM己酰苯，16.5μM庚酰苯，15.3μM辛酰苯，和3.5μM癸酰苯制得。使用较低体积的乙腈会导致降低样品的溶解度。分离溶液是1/5/450mM乙酸铵(pH 6.5)/水/乙腈。注射是在1kV下5秒钟，和分离电压是20kV。
[00150]图19(a，b，c，d，e，和f)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。电色谱是在未衍生的多孔基体(a)，和用C3F3(b)，CF13(c)，PFP(d)，C8(e)，和PFPDM(f)衍生化的多孔基体的PSG毛细管柱上硫脲和烷基苯基酮类的分离。峰是硫脲(峰T)，乙酰苯(峰1)，丙酰苯(峰2)，丁酰苯(峰3)，戊酰苯(峰4)，己酰苯(峰5)，庚酰苯(峰6)，辛酰苯(峰7)，和癸酰苯(峰8)。
[00151]五种结合相PSG柱，即PSG-C3F3(b)，PSG-CF13(c)，PSG-PFP(d)，PSG-C8(e)，和PSG-PFPDM(f)，与母体PSG柱(a)的对比揭示了试验被分析物的增强的拆分，特别地对于更加疏水性的被分析物，其中PSG-PFPDM有最高的增强。拆分能力是从以下表达式确定：
R s = N 4 ( α - 1 ) α k ( k + 1 )
其中N是效率(理论塔板数)，α是分离系数，和k是具体的被分析物的保留系数。该分离系数α是由k2/k1给出。保留系数k＝(tR-t0)/t0是按通常方式测定的，其中tR是被分析物保留时间和t0是未保留的标记物的保留时间(对于标记物我们使用硫脲)。乙酰苯(峰1)和己酰苯(峰5)的拆分对于PSG-C3F3，PSG-CF13，PSG-PFP，PSG-C8，和PSG-PFPDM分别地是2.02，2.15，2.64，3.13，和3.71。这一性能是与母体PSG(Rs＝1.86)相比有高达50％的提高。在全部情况下，烷基苯基酮按照增加疏水性的顺序被洗脱：乙酰苯(峰1)，丙酰苯(峰2)，丁酰苯(峰3)，戊酰苯(峰4)，己酰苯(峰5)，庚酰苯(峰6)，辛酰苯(峰7)，和癸酰苯(峰8)。全部的烷基苯基酮是在较高电场强度(＞1000V/cm)下在30分钟内从结合相PSG毛细管柱中洗脱。对于母体PSG柱(a)观察到烷基苯基酮类的最低拆分，而在PSG-PFPDM上对于辛酰苯(在13分钟之后洗脱)(f)和癸酰苯(在25分钟之后洗脱)(未显示)实现了烷基苯基酮类的最高拆分。
[00152]已经报道，以在芳族环的π电子和在结合相的氟原子上的孤对电子(在2p轨道中)之间的库伦相互作用为基础，氟化的结合相与芳族化合物相互作用。这一行为不是氟化结合相，PFP和PFPDM的情况。烷基苯基酮的分离是随着烷基官能团的碳数目增加而提高化合物的疏水性所引起的。洗脱顺序是按照在这些化合物的疏水性上的这一提高顺序。
[00153]PSG-C8显示了烷基苯基酮的良好拆分以及全部八种烷基苯基酮的较短分析时间，其中癸酰苯在20分钟内洗脱(e)。PSG-C8对于烷基苯基酮将高拆分与快速洗脱时间相结合并具有1.76×10-4cm2/Vs的EOF，该值比其它结合相多孔基体的EOF值高15％，但是与未衍生的多孔基体的EOF值相同。
[00154]我们没有观察该PSG柱的气泡或干燥，甚至在用于烷基苯基酮的分离中的高电场强度下。该结合相多孔基体对于高酸性的条件(pH 2-4)比未衍生的多孔基体更加稳定。对于结合相多孔基体中的每一种的电流/电场强度的曲线是直线的(数据未显示)。这一线性提示了焦耳加热(Joule heating)的不存在，它能够导致峰加宽。在每一个分离中，随着提高k值，烷基苯基酮的效率会下降。引起被分析物慢慢地从多孔基体中洗脱出来的扩散效应可以解释该低效率。对于15cm长度的结合相多孔基体能够实现高拆分率，但是需要较长的洗脱时间。在多孔基体的长度和k之间存在线性关系。具有15cm，10cm，和5cm长度的结合相多孔基体的分离系数分别地是2.55，2.52和2.40。
实施例20
[00155]表4给出了硅烷化反应时间对于保留系数k，分离系数α，以及PSG-C8对乙酰苯(1)和己酰苯(5)在5cm PSG-C8整体单段上的拆分率Rs的影响。
                          表4
反应时间(min)     k1     k5     α1/5     Rs(1/5)
    0     0.15     0.74     4.91     2.11
    15     0.16     1.37     4.73     2.33
    30     0.14     1.17     8.36     2.46
    60     0.18     1.77     9.85     3.31
    70     0.18     1.67     9.20     2.83
    90     0.15     1.41     9.47     2.69
该分离系数作为至多60分钟的反应时间的函数来提高，其中0和15分钟的分离系数仅仅稍微地不同。大于1的分离系数预示着被分析物的成功分离。对于70和90分钟的较长反应时间，该分离系数会减少。对于增加的反应时间观察到在乙酰苯和己酰苯的拆分上的相同趋势。两种被分析物的拆分率随着在0-60分钟范围的反应时间线性地提高(r＝0.974)。对于以15，30和60分钟反应时间制备的结合相PSG柱的柱-到-柱可再现性(n＝3或4)是好于3％RSD。对于70和90分钟的反应时间减少拆分率。
[00156]结合相的塌陷可以解释对于70和90分钟的反应时间在拆分率上的下降。随着硅烷化反应时间增加，使得更多的正辛基二甲基硅烷键接于金属有机聚合物的羟基上，从而增加在聚合物表面上正辛基二甲基基团的数目。随着更多的结合相键接于聚合物表面上，配位体彼此更接近。从0到60分钟反应时间k1和k5值分别地提高了17％和58％的事实显示聚合物表面变得更加疏水性，即对于烷基苯基酮更加有保持性。
实施例21
[00157]图20(a和b)是使用本发明的实施方案的显示吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱。该电色谱是对于30分钟(a)和90分钟(b)，在5cm PSG-C8整体单段上五到七种烷基苯基酮的分离。分离条件和峰归属与在实施例19中相同。
[00158]图20说明了PSG-C8整体单段的0分钟反应时间(图20，a)和60分钟反应时间(图20，b)对于烷基苯基酮混合物的分离的影响。具有10碳链的癸酰苯的k值是极高的。对于30分钟反应时间k值是23.0而对于60分钟反应时间k值是28.6，有20％的提高。进行空载测量以分析结合相在多孔基体上的表面覆盖度，但是从色谱分析数据能够推断结合相在多孔基体上应该有较高的覆盖度，特别对于反应时间15-60分钟，和因此有更多数量的色谱分析位点用于试验化合物的分离。
实施例22
[00159]该核苷样品混合物由黄嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，鸟嘌呤核苷，和胞嘧啶核苷组成，各自在水中的浓度1mg/mL。分离溶液是50mM磷酸盐(pH8)/水/乙腈(0.5/3.5/6)。注射栓塞长度是0.1mm，和外加电压是-15kV。
[00160]按照以上在实施例18中所述来制备10cm PSG-NH2整体单段。10cm长的多孔基体用正丙基氨基三乙氧基硅烷来衍生化。所获得的整体单段，PSG-NH2，具有胺结合相(pH 9-10)，它在我们的实验条件下带正电荷。正电荷使得EOF发生反转。虽然具有胺基官能团的色谱分析材料已在正常相和离子交换色谱法找到一些用途，在我们的条件下的PSG-NH2用作反相材料。该烷基苯基酮按照相同的顺序洗脱(数据未显示)，与上面描述的其它结合相多孔基体相比。
[00161]图21是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱图。这些峰属于四种核苷，次黄嘌呤核苷(峰1)，尿嘧啶核苷(峰2)，鸟嘌呤核苷(峰3)，和胞嘧啶核苷(峰4)。图21显示了四种核苷的混合物用反转EO的分离F。这些混合物的分离在相同的分离溶液中的毛细管区带电泳中是不可能的。
实施例23
[00162]按照以上在实施例18中所述来制备15cm PSG-PFP整体单段。短链肽，血管紧张素，血管舒缓激肽，血管紧张素II，gly-gly-gly，valtyr-val，和蛋氨酸脑啡肽，用作阳离子被分析物。每一种肽的浓度是16g/mL。分离溶液是50mM乙酸铵(pH 4.3)/水/乙腈(1/4/5)。注射是在0.5psi下30秒，和外加电压是10kV。
[00163]图22是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱图。这些峰归属于五种阳离子肽的分离，血管紧张素(峰1)，血管舒缓激肽(峰2)，血管紧张素II(峰3)，gly-gly-gly(峰4)，val-tyr-val(峰5)，和蛋氨酸脑啡肽(峰6)。图22说明了PSG-PFPDM柱对于四种带正电荷的肽的分离的用途，该分离是在低于15分钟中实现。该阳离子肽是从该柱中洗脱，尽管有整体单段的阴离子属性。结合相基本上在整体单段上产生一层以屏蔽该肽中的离子化羟基的负电荷。因此，在阳离子肽和阴离子的整体单段之间电荷相互作用已经减弱。
实施例24
[00164]按照以上在实施例18中所述来制备15cm PSG-C3Fc整体单段。紫杉酚，浆果赤霉素III，和乙酰基浆果赤霉素各自作为在乙腈中的1mg/mL溶液来制备。分离溶液是50mM乙酸铵(pH 6.5)/水/乙腈(1/4/5)。注射是在0.5psi下5秒，和外加电压是10kV。
[00165]图23是显示了使用本发明的实施方案的吸收率/保留时间的曲线的代表性电色谱图。这些峰是浆果赤霉素III(峰1)，紫杉酚(峰2)，和乙酰基浆果赤霉素(峰3)。图23说明这一混合物的完全分离，它是在8分钟内完成。这一分离说明了结合相PSG柱用于药物的分析的潜力。
[00166]尽管上面已经参考各种实施方案描述了本发明，但应该理解的是在不脱离本发明的范围的前提下可以作一些变化和改进。以上引用的全部参考文献以它们的全部内容被引入这里供参考。

Claims (35)

1.分离柱，包括：
分离通道；和
在通道内的分离介质，
介质包括多孔基体，该多孔基体包括载体和静止相，该载体包括金属有机光聚合物和该静止相包括结合相。
2.权利要求1的柱，其中该分离介质是非熔结玻璃料。
3.权利要求1的柱，其中该结合相包括有机官能团。
4.权利要求1的柱，其中分离通道具有通道壁，和介质附着于通道壁上和并填充该通道的至少一个区段。
5.权利要求1的柱，其中多孔基体是均匀的和不包含色谱分析颗粒。
6.权利要求1的柱，其中光聚合物的前体包括金属醇盐。
7.权利要求6的柱，其中金属醇盐包括金属，和该金属选自铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌和锆。
8.权利要求6的柱，其中金属醇盐包括至少一种光活性基团。
9.权利要求1的柱，其中多孔基体对被分析物有亲和性。
10.权利要求1的柱，其中该分离介质包括均匀相。
11.权利要求1的柱，其中该分离通道是毛细管分离通道或平面结构。
12.在分离柱中制备整体单段的方法，包括：
提供分离柱；
将混合物引入到该柱中，混合物包括金属有机化合物；
辐射该混合物，利用光引发的聚合反应引起混合物形成固体多孔基体，因此在柱中形成载体；和
将偶联剂引入到该柱中，因此在柱中形成结合相多孔基体。
13.权利要求12的方法，其中引入偶联剂包括引入包含官能团的偶联剂和金属。
14.权利要求13的方法，其中该金属选自铝，钡，锑，钙，铬，铜，铒，锗，铁，铅，锂，磷，钾，硅，钽，锡，钛，钒，锌和锆。
15.权利要求12的方法，其中引入偶联剂包括引入有机偶联剂。
16.权利要求12的方法，其中引入偶联剂包括引入选自有机氯硅烷，有机烷氧基硅烷和有机氨基硅烷中的试剂。
17.权利要求12的方法，其中引入偶联剂包括引入具有单官能团，双官能团或三官能团的试剂。
18.权利要求12的方法，进一步包括将有机溶剂引入到包含结合相多孔基体的柱中。
19.权利要求12的方法，其中多孔基体不包含色谱分析颗粒。
20.权利要求12的方法，其中分离介质是非熔结玻璃料。
21.权利要求12的方法，其中混合物包括至少一种金属有机单体，至少一种孔隙产生剂，和光引发剂。
22.权利要求21的方法，其中可控地选择孔隙产生剂以在基体中形成孔隙。
23.权利要求22的方法，进一步包括选择单体与孔隙产生剂的摩尔比率以便在基体中形成孔隙。
24.权利要求12的方法，其中辐射包括用可见光或紫外光辐射混合物。
25.权利要求12的方法，进一步包括将有机溶剂引入到柱中，该柱包括固体多孔基体。
26.权利要求12的方法，其中该提供包括提供毛细管或平面结构。
27.分离被分析物的样品的方法，包括：
提供包括分离通道和在该通道内的分离介质的分离柱，该介质包括多孔基体，该多孔基体包括载体和静止相，该载体包括金属有机光聚合物和该静止相包括结合相；
将在溶液中携带的被分析物样品引入通过该柱，其中该介质将被分析物浓缩在柱上；和
引起该溶液流过该柱，因此分离并洗脱该被分析物。
28.权利要求27的方法，其中该引入包括对柱施加电压或压力。
29.权利要求27的方法，其中该引入包括将在第一种溶液中携带的被分析物样品引入通过该柱，和该引起包括引起第二种溶液流过该柱，其中第一种溶液是与第二种溶液相同的溶液。
30.权利要求27的方法，其中该引入包括将在第一种溶液中携带的被分析物样品引入通过该柱，其中第一种溶液包括洗脱溶剂，和该引起包括引起第二种溶液流过该柱，其中第二种溶液包括洗脱溶剂，和在第一种溶液中的洗脱溶剂的浓度低于在第二种溶液中的洗脱溶剂的浓度。
31.权利要求30的方法，其中该引入包括引入具有大于柱长度的注射栓塞长度的被分析物样品。
32.权利要求27的方法，其中该引入包括引起样品堆积。
33.权利要求27的方法，其中该提供包括提供分离介质，后者包括没有色谱分析颗粒的多孔基体。
34.权利要求27的方法，其中该提供包括提供包括毛细管或平面结构的分离柱。
35.权利要求27的方法，其中该提供包括提供非熔结玻璃料型分离介质。
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