CN1556379A - 光纤连续激发显微荧光光谱成像仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光纤连续激发显微荧光光谱成像仪，包括在光路上依次连接的显微镜用自动线性可变单色照明装置、荧光显微镜、图像适配器和CCD摄像器件，在电路上通过数据线依次连接在所述CCD摄像器件与显微镜用自动线性可变单色照明装置之间的图像采集卡和计算机，以及在电路上通过数据线与所述计算机连接的图像显示器；显微镜用自动线性可变单色照明装置，用于为荧光显微镜提供波长连续可调的单色激发光，由在光路上依次设置的光源、聚光系统、光谱单色器、透紫外纯石英光纤和光纤连接端面，以及功能控制器组成。本发明可找到试样上任何点的最佳激发波长，对具体对象获得定性、定量和定位分析结果；可在一台荧光显微镜上同时实现显微荧光图像分析和显微荧光光谱分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种光谱成像仪，尤其是连续可调的显微荧光光谱成像仪，属于物理光学领域。
背景技术
在传统的显微荧光图像系统中，荧光显微镜形成被观察试样的放大荧光图像；这种荧光图像是通过荧光激发光源和滤光片组选择的一种波长激发光照射试样使之发射荧光形成的。如要试样在不同波长照射下激发不同波长的荧光，则需要配置不同的滤光片组。因为荧光显微镜结构上的原因或经济上的原因(滤光片组价格较高)，通常一般落射荧光显微镜上只配置2至3组滤光片组，因而只能提供2至3种不同波长范围的激发光(一般为紫外、蓝光和绿光三种)；高档显微镜可提供4至5种甚至更多的滤光片组，不过这些滤光片组的价格可能就会达到显微镜本身的价值甚至更高。此外，即使配置多组滤光片组，也只能达到有级调光，不可能获得激发波长在需要范围内可连续改变的无级调光效果；而现代生物、医学、药物、新材料研究、临床检验和生产中会遇到越来越多的需要不同最佳激发光波长的荧光物质，或不知最佳激发波长的试样、或可在不同激发波长发射不同荧光的试样。因此，研发可提供连续可调的显微荧光光谱图像系统十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服上述现有技术的不足，提供一种激发波长在需要范围内可连续改变的光纤连续激发显微荧光光谱成像仪。
为解决上述技术问题，本发明的光纤连续激发显微荧光光谱成像仪，包括在光路上依次连接的显微镜用自动线性可变单色照明装置、荧光显微镜、图像适配器和CCD摄像器件，在电路上通过数据线依次连接在所述CCD摄像器件与显微镜用自动线性可变单色照明装置之间的图像采集卡和计算机，以及在电路上通过数据线与所述计算机连接的图像显示器；
所述的显微镜用自动线性可变单色照明装置，用于为荧光显微镜提供波长连续可调的单色激发光，由在光路上依次设置的光源、聚光系统、光谱单色器、透紫外纯石英光纤和光纤连接端面，以及功能控制器组成；所述的光源，用于产生所述光谱单色器所需的光通量；所述的聚光系统用于将所述光源产生的复合光光束聚焦，在所述光谱单色器的入缝处得到一个很小的点光源；所述的光谱单色器用于产生单色光，光谱单色器内设置有反射凹面镜、聚光凹面镜和由步进电机控制的可转动的光栅，光谱单色器的相对孔径f/#＝3.1，聚光凹面镜焦距为120mm，光栅为1200l/mm光栅，光栅用于将经入缝入射的各种不同波长的光分离，并调节经出缝射出的光束的波长值，所述出缝处的光束的波长与所述光栅的转角的正弦值呈线性关系；所述的透紫外纯石英光纤的一端通过光纤连接端面与所述光谱单色器的出缝连接，用于将在出缝处的单色光耦合到光纤并输出，另一端通过光纤连接端面与所述的荧光显微镜软性连接；所述的功能控制器，由微处理器、通过数据线分别与微处理器连接的数字显示器、输入键盘、电机驱动装置和通信接口以及通过数据线与所述电机驱动装置连接的步进电机组成，所述的微处理器、数字显示器、电机驱动装置和步进电机还分别与电源连接；所述的微处理器内部存储有控制软件，用于实现参数设置、移动到指定波长及双波长扫描功能，所述电机驱动装置在微控制器的控制下通过驱动步进电机带动光栅转动，所述的通信接口用于与外部设备和网络进行数据交换；
所述的荧光显微镜将单色激发光向下投射到试样，并收集试样各处发出的荧光形成显微荧光图像，荧光显微镜中的反射镜是对波长值不敏感的中性半透明半反射镜片；
所述的图像适配器将荧光显微镜形成的显微荧光图像成像到所述的CCD摄像器件；
所述的CCD摄像器件将显微荧光图像的光信号转换成相应的模拟电信号；
所述的图像采集卡将显微荧光图像的模拟电信号转换成数字电信号，输出至所述的计算机，计算机对显微荧光图像的数字电信号进行处理后输出至所述的图像显示器显示，计算机还对其显微荧光图像的电信号的传输、存储进行操作控制。
作为上述技术方案的进一改进，显微镜用自动线性可变单色照明装置的光源可以是100瓦的超高压汞灯，也可以是100瓦的超高压氙灯。
所述的荧光显微镜是落射式荧光显微镜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)可获得试样显微荧光光谱图像上任一点在不同激发波长时的荧光强度变化谱线，因而可找到该试样上任何点的最佳激发波长，对具体对象获得定性、定量和定位分析结果；(2)荧光显微镜中，采用对波长值不敏感的中性半透明半反射镜片取代只对特定波长具有透射/反射特性的二向色反射镜，可对250～680nm全波长范围适用，不需更换二向色反射镜；(3)可省掉激发滤光片组；(4)单色光谱范围可扩展到紫外；(5)可在250～680nm波长范围内提供连续可调的任意波长、可直接耦入落射式荧光显微镜的不同波长激发光；(6)可实现波长反复扫描、定波长缴发、波长步进等荧光缴发功能；(7)在一台荧光显微镜上同时实现显微荧光图像分析(获取图像信息)和显微荧光光谱分析(获取成分和含量信息)。
附图说明
图1是显微镜用自动线性可变单色照明装置与显微镜的连接示意图。
图2是显微镜用自动线性可变单色照明装置的光纤圆形开口连接端面示意图。
图3是显微镜用自动线性可变单色照明装置的光纤及其连接端面示意图。
图4是显微镜用自动线性可变单色照明装置的光纤矩形开口连接端面示意图。
图5是显微镜用自动线性可变单色照明装置的功能控制器的原理方框图。
图6是本发明的原理方框图。
附图标记：
1、光源 2、聚光系统 3、入缝 4、聚光凹面镜
5、光栅 6、反射凹面镜 7、出缝 8、光纤连接端面
9、透紫外纯石英光纤 10、光纤连接端面 11、荧光显微镜 12、光谱单色器
13、耦合成像透镜
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
如果要满足自动波长选择而不是手动滤光片组切换的话，首先必须得到单色光。在此采用光栅色散型分光光谱单色器来得到单色光。但是由于要将单色光作为显微镜的照明光源，它必须具有足够大的光通量才能观测到标本或者标本所发射的荧光，这可以通过两个途径来实现：一是无限增大光源(汞灯或者氙灯)的功率；其二是采用较大的相对孔径f/#，从而更多地收集入射光能量。增大光源功率涉及到散热和光学元件的选择等一系列问题，不能无限增大，而且通常荧光显微镜的光源就是100W的超高压汞灯(HBO)，因此我们采用了第二种增大光通量的途径，重新设计并生产的光谱单色仪的f/#＝3.1，光栅1200l/mm，聚光凹面镜焦距为120mm。实验证明，该单色器可基本满足照明要求。
光谱单色仪如何与显微镜的连接，一种是直接刚性机械连接，一种是采用光纤的软性连接。由于刚性连接需增加相应的光学系统，而且使得仪器体积庞大笨重，故考虑使用光纤如图3所示的灵活连接。将光纤一端的连接端面固定在光谱单色仪的出缝，该光纤连接端面有矩形的开口，如图4所示；另一端的光纤连接端面具有圆形开口，如图2所示，通过设置在其内的耦合成像透镜与显微镜连接，从而实现光纤的软性连接。
图6所示的本发明的光纤连续激发显微荧光光谱成像仪总体框图，包括在光路上依次连接的显微镜用自动线性可变单色照明装置、荧光显微镜、图像适配器和CCD摄像器件，在电路上通过数据线依次连接在所述CCD摄像器件与显微镜用自动线性可变单色照明装置之间的图像采集卡和计算机，以及在电路上通过数据线与所述计算机连接的图像显示器。
显微镜用自动线性可变单色照明装置用于为荧光显微镜提供波长连续可调的单色激发光，包括如图1所示的光源1、聚光系统2、光谱单色器12、透紫外纯石英光纤9和光纤连接端面8、10，以及图5所示的功能控制器。其中，光谱单色器12由入缝3、反射凹面镜6、光栅5、聚光凹面镜4、出缝7组成；光纤连接端面10内设置有耦合成像透镜13。
光源1可以采用100瓦的超高压汞灯，也可以采用100瓦的超高压氙灯，以产生光谱单色器12所需的足够的光通量。聚光系统2可由2个凸透镜构成，用于将光源1产生的复合光光束聚焦，在入缝3处得到一个很小的点光源，聚焦后的复合光光束经入缝3射入光谱单色器12内。
光谱单色器12用于产生单色光，光谱单色器12内设置有反射凹面镜6、聚光凹面镜4和由步进电机控制的可转动的光栅5，光谱单色器12的f/#＝3.1，光栅5为1200l/mm光栅，聚光凹面镜4的焦距为120mm，出缝7处的光束的波长与所述光栅5的转角的正弦呈线性关系。
透紫外纯石英光纤9的一端通过光纤连接端面8与光谱单色器12的出缝7连接，用于将在出缝7处的单色光耦合到光纤9并输出，光纤连接端面8有矩形的开口；另一端光纤连接端面10圆形的开口，与所述的荧光显微镜软性连接，光纤连接端面10内设置有耦合成像透镜13，耦合成像透镜13用于将光纤传输的单色光耦合到荧光显微镜。
图5所示的功能控制器，由微处理器、通过数据线分别与微处理器连接的数字显示器、输入键盘、电机驱动装置和通信接口以及通过数据线与所述电机驱动装置连接的步进电机组成，微处理器、数字显示器、电机驱动装置和步进电机还分别与电源连接。微处理器内存储有控制软件，用于实现参数设置、移动到指定波长及双波长扫描等功能。电机驱动装置在微控制器的控制下通过驱动步进电机带动光栅5转动，以实现光谱单色器12内单色光波长的自动线性可变。通信接口用于与外部设备和网络进行数据交换。
功能控制器的面板上有复位、移动到指定波长扫描、扫描、功能设置选项等按键，可以实现定波长扫描、双波扫描波长、步进移动等功能，可以设置扫描速度、停留间隔时间、步进方向、显示模式等参数。获取某个指定波长的单色光既可通过控制器与计算机通信控制，也可以直接从控制器上输入指令。
图2、3、4所示的石英光纤及其连接端口，透紫外纯石英光纤9的一端通过矩形开口连接端面8与光谱单色器12的出缝7连接，用于将在出缝7处的单色光耦合到光纤9并输出；另一端通过圆形开口连接端面10与所述的荧光显微镜软性连接，光纤连接端面10内设置有耦合成像透镜13，耦合成像透镜13用于将光纤传输的单色光耦合到荧光显微镜。
显微镜用自动线性可变单色照明装置的工作原理如下，光源1超高压汞灯或(超高压氙灯)发出的光，经过聚光系统2，在光谱单色器12的入缝3处得到一个很小的点光源，光谱单色器12的聚光凹面镜4、光栅5、反射凹面镜6一起组成光栅色散型分光系统，在出缝7处得到单色光。波长的调整是由在微处理器控制下的步进电机带动光栅5转动来完成的，由于光栅色散在成像谱面上是按照波长均匀分布的，出缝处光的波长与光栅5的转角的正弦值是线性关系，因此只要调整步进电机的转动步数，就可以线性可变地得到不同波长的单色光。单色光是通过固定在出缝7处的光纤连接端面8中的透紫外纯石英光纤9输出的。
显微镜用自动线性可变单色照明装置与显微镜11连接时，需将荧光显微镜11的灯室取下，使光纤连接端面10通过其中的耦合成像物镜13和荧光显微镜物镜后成像在略大于显微镜工作距离的地方，再微微移动光纤端面，尽量使单色光照明均匀。试样可以通过目镜观察或者CCD光电转换和图像采集系统获得数字化图像。
在250nm～680nm之间，光栅色散系统使得所获得的单色光的波长随步进电机的转动步数线性变化，因此，单色光的线性可变调整可通过在微处理器控制下设置步进电机的转动步数来实现的。获取某个指定波长的单色光既可通过控制器与计算机通信控制，也可以直接从控制器上输入指令。控制器具有复位、定波长扫描、双波长扫描、步进移动等功能，可以设置扫描速度、停留间隔时间、步进方向、显示模式等参数。
有关医院利用该单色照明装置的显微镜观察用猴肝等染色试片，观察到了粗颗粒型、细颗粒型、鞭毛虫等核型荧光，数字成像后可重现在250～680nm范围内的光谱图像，特别是能够观察到紫外激发荧光。
落射式荧光显微镜用于将单色激发光向下投射到试样，并收集试样各处发出的荧光形成显微荧光图像，荧光显微镜中的反射镜是对波长值不敏感的中性半透明半反射镜片。图像适配器可以由2个凸透镜组成，用于将荧光显微镜形成的显微荧光图像成像到CCD摄像器件。
CCD摄像器件用于将显微荧光图像的光信号转换成相应的模拟电信号。采用可同时接收一个平面上各点的光信号、并转换成相应电信号的面阵CCD光电摄像器件，可形成连续可变波长或若干不同波长激发光下的一系列二维荧光图像，从而实现不同的观测目的。
图像采集卡用于将显微荧光图像的模拟电信号转换成数字电信号，输出至所述的计算机，计算机对显微荧光图像的数字电信号进行处理后输出至所述的图像显示器显示，计算机还对其显微荧光图像的电信号的传输、存储进行操作控制。
Claims (4)
1.一种光纤连续激发显微荧光光谱成像仪，其特征是，它包括在光路上依次连接的显微镜用自动线性可变单色照明装置、荧光显微镜、图像适配器和CCD摄像器件，在电路上通过数据线依次连接在所述CCD摄像器件与显微镜用自动线性可变单色照明装置之间的图像采集卡和计算机，以及在电路上通过数据线与所述计算机连接的图像显示器；
所述的显微镜用自动线性可变单色照明装置，用于为荧光显微镜提供波长连续可调的单色激发光，由在光路上依次设置的光源、聚光系统、光谱单色器、透紫外纯石英光纤和光纤连接端面，以及功能控制器组成；所述的光源，用于产生所述光谱单色器所需的光通量；所述的聚光系统用于将所述光源产生的复合光光束聚焦，在所述光谱单色器的入缝处得到一个很小的点光源；所述的光谱单色器用于产生单色光，光谱单色器内设置有反射凹面镜、聚光凹面镜和由步进电机控制的可转动的光栅，光谱单色器的相对孔径f/#＝3.1，聚光凹面镜焦距为120mm，光栅为1200l/mm光栅，光栅用于将经入缝入射的各种不同波长的光分离，并调节经出缝射出的光束的波长值，所述出缝处的光束的波长与所述光栅的转角的正弦值呈线性关系；所述的透紫外纯石英光纤的一端通过光纤连接端面与所述光谱单色器的出缝连接，用于将在出缝处的单色光耦合到光纤并输出，另一端通过光纤连接端面与所述的荧光显微镜软性连接；所述的功能控制器，由微处理器、通过数据线分别与微处理器连接的数字显示器、输入键盘、电机驱动装置和通信接口以及通过数据线与所述电机驱动装置连接的步进电机组成，所述的微处理器、数字显示器、电机驱动装置和步进电机还分别与电源连接；所述的微处理器内部存储有控制软件，用于实现参数设置、移动到指定波长及双波长扫描功能，所述电机驱动装置在微控制器的控制下通过驱动步进电机带动光栅转动，所述的通信接口用于与外部设备和网络进行数据交换；
所述的荧光显微镜将单色激发光向下投射到试样，并收集试样各处发出的荧光形成显微荧光图像，荧光显微镜中的反射镜是对波长值不敏感的中性半透明半反射镜片；
所述的图像适配器将荧光显微镜形成的显微荧光图像成像到所述的CCD摄像器件；
所述的CCD摄像器件将显微荧光图像的光信号转换成相应的模拟电信号；
所述的图像采集卡将显微荧光图像的模拟电信号转换成数字电信号，输出至所述的计算机，计算机对显微荧光图像的数字电信号进行处理后输出至所述的图像显示器显示，计算机还对其显微荧光图像的电信号的传输、存储进行操作控制。
2.根据权利要求1所述的一种光纤连续激发显微荧光光谱成像仪，其特征是：所述显微镜用自动线性可变单色照明装置的光源是100瓦的超高压汞灯。
3.根据权利要求1所述的一种光纤连续激发显微荧光光谱成像仪，其特征是：所述显微镜用自动线性可变单色照明装置的光源是100瓦的超高压氙灯。
4.根据权利要求1所述的一种光纤连续激发显微荧光光谱成像仪，其特征是：所述的荧光显微镜是落射式荧光显微镜。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
| C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |