CN1556210A

CN1556210A - 人蛋白磷酸酶2a点突变的肺癌相关性抗原基因

Info

Publication number: CN1556210A
Application number: CNA2004100005571A
Authority: CN
Inventors: 王秦秦; 马丽菊; 李继梅; 唐睿珠; 李海红
Original assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF KUNMING MEDICAL SCHOOL
Current assignee: FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF KUNMING MEDICAL SCHOOL
Priority date: 2004-01-01
Filing date: 2004-01-01
Publication date: 2004-12-22

Abstract

人蛋白磷酸酶2Aα突变的肺癌相关基因序列及制备方法。本发明用特异性单克隆抗体N35对小细胞肺癌细胞H128cDNA表达文库进行免疫学筛选，获得了多核苷酸序列SEQ ID NO：1碱基的C－A点突变的cDNA片段；与GenBank数据库同源性比较，片段的序列与人蛋白磷酸化酶2A催化亚单位α异构体有97％的同源性。对相关蛋白的氨基酸序列分析，提出了多肽链氨基酸序列SEQ ID NO：2，所编码多肽链氨基酸发生了由精氨酸到色氨酸的改变。本发明还提出了制备该DNA序列的方法。为寻找新的肺癌相关基因奠定了基础，为阐明肺癌的发病机制提供了新的线索，为探索肺癌的免疫诊断、免疫治疗和基因治疗的靶点提供了新的思路。

Description

人蛋白磷酸酶2A点突变的肺癌相关性抗原基因

(技术领域)

本发明涉及肺癌相关抗原突变基因序列，特别涉及突变型的人蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)α催化亚基的编码基因。

(背景技术)

肺癌是当前人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和死亡率在国内外均呈明显上升趋势，但目前仍缺乏有效的治疗手段。现在认为，肿瘤是一多基因改变的恶性疾病，其发生、发展与一系列肿瘤相关基因结构、功能变化和调控关系异常密切相关，是一多阶段、多步骤、多基因参与的过程。蛋白磷酸酶是指具有催化已经磷酸化的蛋白分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，它们与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化与去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。正如蛋白激酶催化的磷酸化由于底物不同，有的表现为活性增高，有的表现为活性降低一样，蛋白磷酸酶所催化的去磷酸化反应也对于不同的底物有不同的反应。蛋白磷酸酶的分类是根据它所作用的氨基酸残基决定的，包括蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶两大类。蛋白磷酸酶2A是主要的细胞蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶中的一个。它具有包括代谢、DNA修复、转录、RNA裂解、翻译、细胞周期进程、形态的发生、发展和转化等在内的多种活性。在体内PP2A不同的异源三聚体形式是由广泛存在的一个36KDa的催化亚基(PP2Ac)和65Kda的结构亚基(PR65/A)的核心异二聚体及其不同的调节B亚基组成的(Groves MR，Hanlon N，Turowski P，et al.The Structure of theProtein Phosphatase 2A PR/ASubunit Reveals the Conformation of Its 15Tandemly Repeated HEAT Motifs.Cell，1999，96：99-110)。有资料表明，PP2Aα与正常心脏的发育(Heller FA，Xue C，FisherA，et al.Expression and mapping of protein phosphatase 2A alpha in the developingrat heart.Pediatr Res，1998，43(1)：68-76)。造血细胞分化的调节有密切关系。在酵母，PP2Aα的突变引起有丝分裂的缺损和细胞周期表型的显著改变，在小鼠肝细胞癌中其mRNA表达增加(Sasaki K，Ikeda K，Nagai M，et al.Protein phosphatase 2A alphainvolvement in granulocytic differentiation of HL-60 cells.Hematol Oncol，1993，11(1)：1-5、)。在人的PP2Acα亚基的活性中心，天冬氨酸和组氨酸的突变使PP2Acα亚基的催化活性显著下降(Myles T，Schmidt K，Evans DRH，et al.Active-sitemutations impairing the catalytic function of the catalytic subunit of humanprotein phosphatase 2A permit baculovirus-mediated overexpression in insectcells.Biochem.J.，2001，357：225-232)。但目前未见人蛋白磷酸酶2Aα催化亚基突变型的编码基因在人肺癌细胞发现和克隆的报道。

(发明内容)

本发明的目的是利用特异性识别恶性肿瘤细胞蛋白组分的抗人肺癌单克隆抗体N-35，对构建于表达载体λgt11中的肺癌细胞cDNA文库进行原核系统表达的免疫学筛选，并对所获得的相关抗原编码基因进行克隆和鉴定，以期为肺癌的基因诊断和生物治疗提供候选靶抗原和靶基因。

本发明的主要特征在于具有多核苷酸序列SEQ ID NO：1碱基序列C-A的点突变。

其特征在于多核苷酸序列SEQ ID NO：1与GenBank数据库同源性比较，所获序列与人蛋白磷酸化酶2A催化亚单位α异构体有97％的同源性。

其特征在于蛋白的氨基酸序列基本上与SEQ ID NO：2提出的氨基酸序列相同，即多核苷酸序列碱基C-A的点突变，所编码多肽链氨基酸的序列发生了精氨酸-色氨酸的改变。

本发明的制备方法包括从重组分子中筛选出目的基因或特定的DNA片段，其特征在于以单克隆抗体N-35为免疫探针，对构建于表达载体的肺癌细胞cDNA文库进行免疫学筛选。

上述肺癌细胞cDNA文库可以用人小细胞肺癌细胞H128cDNA文库或选择其它肺癌细胞cDNA文库。

上述构建肺癌细胞cDNA文库的表达载体为λgt11噬菌体或质粒。

并且是用大肠杆菌E.coli.Y1090为宿主菌。

上述制备方法中，N-35单抗与含有基因序列的片段重组的噬菌体在宿主菌体内增殖后表达产物可用免疫印迹反应(Western Blot)识别，细胞之免疫印迹反应表达产物达最大量时间约为4个小时。

本发明选用的抗人肺癌单克隆抗体N-35在前期工作中已被证明，它与各型肺癌有较高的反应阳性率，与正常人组织和淋巴细胞无反应，与人胚肺和各器官组织基本无反应。进一步对N35识别的肺癌相关蛋白特异性的研究表明，该蛋白系一糖蛋白，不存在于正常人心脏及肺组织蛋白组分中，而以不同分子量形式分布与云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82、人宫颈癌细胞系Hela、人肝癌细胞系HepG-2及人乳腺癌细胞系PMC细胞蛋白中，它有可能是一种只存在于肿瘤细胞并与其增殖活动密切相关的重要的肿瘤细胞生长调节蛋白(王秦秦姜平李继梅等N-35肺癌相关蛋白的特性癌症2000 19(9)。859-863)。因此，用该单抗筛选出的抗原应为肿瘤相关性抗原，在该基因碱基序列上发生了由C-A的点突变，其基因序列与人类蛋白磷酸酶2(原称蛋白磷酸酶2A)的催化亚单位(α亚基)基因的同源性达97％

对肿瘤抗原基因的克隆，可从分子水平上了解肿瘤发生的机制。进一步可将该基因在原核系统或真核系统表达以获大量的肿瘤抗原，在此基础上可进行肿瘤抗原分子结构和功能的研究，制备肿瘤疫苗。另外还可用该抗原大规模生产单克隆抗体，用于临床诊断和治疗，以及对肿瘤患者进行血清学的早期诊断。克隆未知基因的一个重要手段是用免疫学方法筛选cDNA表达文库，它的主要优点是不需了解蛋白质和核苷酸序列及蛋白质的生物学功能。通过cDNA文库获得抗原基因大体有以下几个步骤：筛选文库→获得克隆→测序→表达并检测和验证生物学功能。筛选cDNA文库也有一定的限制因素，首先抗体应能与变性抗原结合，即Western blot结果为阳性。其次抗体所识别的位点应为蛋白，而非糖基，因为cDNA文库表达系统多为原核系统，不含糖基化修饰。另外，免疫学方法筛选文库的一大难题是真假阳性克隆的鉴别问题，在这方面尚无可供查阅的文献资料。我们采用Western blot对筛选出的阳性和阴性克隆进行鉴别，获得了与筛库相一致的结果，并且N-35与宿主菌大肠杆菌Y1090的菌体蛋白成分没有交叉反应，说明这种方法是切实可行的。此次发明获得了肺癌相关性抗原的cDNA基因片段。依据对目前发明背景的分析，我们认为，PP2Aα的突变可能与人类肿瘤的发生相关。

糖基化异常是肿瘤细胞恶性转化过程中较早发生的一种改变，与瘤细胞接触抑制消失、远处转移、免疫逃逸等有直接关系.肿瘤细胞表面糖蛋白的异常糖基化已成为当今探讨肿瘤恶性生长分子机制的重要内容。已知N-35相关蛋白是一糖蛋白，而PP2A是一个体内广泛存在的涉及很多重要生理功能的磷酸酶，是否该酶的糖基化会导致细胞的生物学功能发生根本改变有待进一步研究了解。

(附图说明)

图1N-35与阳性噬菌斑的免疫印迹反应(Western Blot)。

图2阳性噬菌斑的PCR鉴定。

图3PP2A点突变肺癌相关基因的多核苷酸序列SEQ ID NO：1。

图4PP2A点突变转变为多肽链氨基酸序列SEQ ID NO：2。

(实施方式)

获得本发明所述序列包括以下步骤：

1.材料

1.1细胞株：云南个旧肺腺癌GLC-82细胞及杂交瘤P35细胞，(记载文献云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82的建立及特性分析.中华肿瘤杂志，1985，7(2)：81-83)

1.2抗人肺癌单克隆抗体N35：由本实验室自制(记载文献抗人肺癌单克隆抗体研制及免疫组化分析543例.中华肿瘤杂志，1992，14(6)：473)

1.3构建于λgt11载体中的人小细胞肺癌细胞H128cDNA文库及其宿主菌(大肠杆菌Y1090)。(上海肿瘤研究所提供)

2步骤

2.1N-35抗体与宿主菌Y1090菌体蛋白的免疫反应，检测在N-35中是否存在抗大肠杆菌抗体。

(1)制备大肠杆菌裂解液；(2)将该裂解液点于硝酸纤维素膜上，室温空气中干燥后用5％脱脂奶/PBS摇床室温下封闭2h；(3)加一抗(100μg/ml)，室温下摇床摇2h；(4)PBS-T洗膜3次，10min/次；(5)加二抗(1∶10000)，室温摇床摇1h；(6)洗膜同前；(7)加ECL后曝光。

经dot blot，N35不与宿主菌菌体成分反应，说明用该抗体筛选文库可得到较低的阳性本底，并且不需要预先用大肠杆菌裂解液吸收其中的抗大肠杆菌抗体。

2.2用单抗N-35对构建在载体λgt11载体中的人小细胞肺癌细胞H128cDNA文库进行免疫筛选，将获得的阳性克隆进一步亚克隆。

将重组子感染大肠杆菌后加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG铺于90mm平板，将硝酸纤维素膜(NC膜)贴于噬斑上提取表达蛋白，标记定位后用3％BSA/PBS中封闭，4℃过夜，加单抗N-35室温下反应4h，洗膜后与1∶16000羊抗鼠IgG-HRPO室温反应1h，洗膜后加ECL曝光。取出所获阳性克隆于SM缓冲液中。第二轮筛选前先测定阳性克隆的滴度，据此按前述方法感染宿主菌后铺板继续筛选，直至3次亚克隆后每一平板中的克隆均为100％阳性。

本发明将整个文库以5000个/平皿的密度铺于10个平板上进行筛选。第一次初筛未得到阳性克隆，第二次才出现阳性斑。反复初筛两次共10×10⁴个克隆，获得阳性克隆42个。从其中取出一个噬斑进行第二轮筛选。将其铺在一块LB平板上，影印双份NC膜后检测均为一致的阳性斑点。第三轮筛选继续从其中取出3个克隆铺板，每个克隆各影印2张膜，结果全都显示为阳性。再分别从前述3个平皿上各取1个噬斑进行第四轮筛选，影印双份NC膜结果仍是全阳。如此经过3次亚克隆均为100％阳性。而作为阴性对照的、末加一抗和二抗的膜均无斑点显影。

2.3阳性克隆(噬菌斑)的Western blot鉴定及表达产物达最大量时间的确定。

将阳性噬菌斑与宿主菌按一定比例混合，加入10ml含氨苄青霉素、IPTG的LB培养液中，另设一不加噬菌体的对照管，混匀后以180r/min 37℃摇床培养，3h后开始每过1h自其中取出1ml培养物，共取3h、4h、5h和6h的4个样品，离心，分别取上清及沉淀行SDS-PAGE，转膜封闭，依次加一抗和二抗反应后DAB显色。

经Western blot检测，单抗N-35识别的阳性噬菌斑的表达蛋白与GLC-82细胞上存在的目标蛋白所处的位置一致，宿主菌及阴性噬菌斑则没有能被N-35识别的条带；且表达蛋白主要存在于沉淀中，诱导培养3h后就有融合蛋白表达，但以4h的表达量为最大。

2.4阳性克隆(噬菌斑)的PCR鉴定：

自第三次亚克隆全部阳性的3个噬菌斑培养平板中各取出3个噬斑于SM缓冲液中，4℃过夜备用；λgt11引物序列分别为Lambda A：ATTGGTGGCGACGACTCCTGGA；Lambda B：TTTGACACCAGACCAACTGGTA。在50μl反应体系组成为：ddH₂O 32.25μl；10×PCR buffer5μl；2.5mmol/L dNTPs 4μl；25mmol/L Mgcl2 2μl；25μmol/L引物A 1μl；25μmol/L引物B 1μl；5u/μl Taq酶2.5μl；模板2.5μl/支。在PCR仪扩增，条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环30次；末次72℃延伸10min。扩增结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

经过PCR扩增，来自第三次亚克隆阳性的任意9个噬斑(每个平皿各3个)均扩增出特异性目的条带，且分子量大小一致，约1400bp，而7个噬斑虽也扩增出了特异条带，但其分子量参差不齐，与阳性斑的分子量均有一定的差别。

2.5核苷酸序列测定及其生物信息学分析

用同一个阳性克隆的DNA为模板进行PCR扩增，产物测序均采用ABI PRISM 377型DNA测序仪和PCR扩增引物为引物进行序列测定。所获的DNA序列在美国国立卫生研究院提供的核苷酸数据库中采用NCBI的网上序列分析软件BLAST进行cDNA序列的同源性比较、分析。结果显示，该cDNA序列与人蛋白磷酸酶2(原称蛋白磷酸酶2A)的催化亚单位，α同功型基因有非常好的相关性，其cDNA插入片段长1262bp，与GENEBANK数据库进行同源性比较，在该基因上发生了由C-A的点突变，其同源性约97％。并用Vector NTI软件进行氨基酸序列的测序，所编码肽链氨基酸序列发生了由精氨酸-色氨酸的改变。

Claims

1.人蛋白磷酸酶2Aα(protein phosphatase 2A，PP2A)点突变的肺癌相关基因序列，其特征在于具有多核苷酸序列SEQ ID NO：1碱基的C-A点突变。

2.根据权利要求1所述的人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列，其特征在于多核苷酸序列SEQ ID NO：1与GenBank数据库同源性比较，所获序列与人蛋白磷酸酶2A催化亚单位α异构体有97％的同源性。

3.根据权利要求1所述的人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列，其特征在于它所编码多肽链氨基酸序列为SEQ ID NO：2，该序列发生了由精氨酸到色氨酸的改变。

4.人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列的制备方法，包括从重组分子中筛选出目的基因或特定的DNA片段，其特征在于以单克隆抗体N-35为免疫探针，对构建于表达载体的肺癌细胞cDNA文库进行免疫学筛选。

5.根据权利要求4所述的人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列制备方法，其特征在于肺癌细胞cDNA文库为人小细胞肺癌细胞H128cDNA文库或其它肺癌细胞cDNA文库。

6.根据权利要求4所述的人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列制备方法，其特征在于构建肺癌细胞cDNA文库的表达载体为λgt11噬菌体或质粒。

7.根据权利要求4所述的人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列制备方法，其特征在于选用大肠杆菌E.coli.Y1090为宿主菌。

8.根据权利要求4所述的人蛋白磷酸酶2Aα点突变的肺癌相关基因序列制备方法，其特征在于用N-35单抗与含有基因序列的片段重组的噬菌体在宿主菌体内增殖后表达产物可用免疫印迹反应(Western Blot)识别，细胞之免疫印迹反应表达产物达最大量时间约为4个小时。