CN1543345A - 使用匹美莫司进行选择性免疫调节的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在上皮组织内产生选择性免疫调节以治疗上皮炎症性病变的方法。本发明提供了匹美莫司用于治疗上皮炎症性病变，包括哮喘和炎症性肠病，并使全身副作用减少到最小的用途。

Description

使用匹美莫司进行选择性免疫调节的方法

本申请要求2001年5月9日提交的美国临时申请60/289,843号的优先权，其全部内容在此引入作为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及在特定类型的组织中产生选择性免疫调节的新方法，所述方法用于治疗覆盖体腔内层的组织的炎症在其中发挥重要作用的病变或“上皮炎症性病变”(EID)。这种组织的例子为气道上皮和胃肠道(GI)粘膜。具体地讲，本发明涉及匹美莫司(pimecrolimus)(亦被称为ASM981或ELIDEL^TM)用于治疗病症如哮喘和炎症性肠病的用途，其中匹美莫司作为单独的抗炎药物或作为匹美莫司和其它药物组成的临床有效的组合中的一种组分使用，所述组合在哮喘的情况下为匹美莫司和吸入性或全身性糖皮质激素或支气管扩张剂组成的组合，或在炎症性肠病(IBD)中为匹美莫司和糖皮质激素、5-氨基水杨酸制剂或免疫抑制剂如硫唑嘌呤(AZA)或环孢菌素A(CyA)组成的组合。这种组合可显著地降低糖皮质激素或免疫抑制剂的总剂量，因此可改善副作用的情况。

相关技术描述

许多疾病涉及上皮或各器官系统的内层组织的炎症，所述炎症是这些疾病的病理学的重要部分，包括构成皮肤的上皮组织的炎症以及构成呼吸道或肠道的内层的、可被称作粘膜或粘液膜的紧密相连的上皮组织炎症。这些被称作EID的炎症非常重要，是因为以下几个原因：上皮组织通常以多种方式发挥生物活性，包括参与新陈代谢以及作为内分泌器官和免疫器官，并且它们可以在例如温度调节、粘液分泌、气体交换、液体和电解质的控制及营养素吸收中发挥其它重要的作用。此外，目前也已发现：某些药物对体内任何部位的上皮组织的作用可能明显不同于该药物对身体其它部位的作用。

哮喘

哮喘是EID的一种并且是极其常见的、对男性和女性有同样影响的病变，美国成年人口的约5％具有与哮喘诊断相符的症状和体征。尽管大多数病例在25岁前发病，但哮喘可发生于生命周期的任何时段。

自二十世纪七十年代末期以来，哮喘的全球患病率增长了30％以上。哮喘患病率的最大增长出现于那些近期采用“工业化”生活方式的国家。此外，严重哮喘的重负已不平衡地落到了在社会经济方面处于弱势的市中心居民的身上。哮喘患病率的全面增长或市中心病例的不平衡分布的原因尚不明确。哮喘目前是最常见的寻求医治的原因之一。在美国，仅哮喘就导致每年约1500万门诊患者就医以及每年患者住院治疗近200万天。每年的直接和间接的哮喘护理开支超过60亿美元，其中这些开支的80％以上用于了在医疗保健病友谈心治疗(encounters)或哮喘药物方面的直接消费。

哮喘的确切病因不明，但是已知临床症候群以三个明确的部分为特征：(1)周期性气道阻塞发作，自行缓解或经治疗后缓解；(2)对刺激物的过强的支气管收缩剂样反应，所述刺激物对非哮喘患者没有或几乎没有影响，该现象被称为气道高反应性；和(3)如各种标准所定义的气道炎症。

如支气管镜和活组织检查研究所描述的轻度哮喘的病理学以粘膜的水肿和充血以及具有T_H2表型的淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的粘膜浸润为特点。这些细胞可产生白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)和白介素5(IL-5)，从而营造了一种可促进免疫球蛋白E(IgE，一种重要的变应性效应分子)的合成的微环境。由上皮和或炎性细胞产生的趋化因子的作用是增强并维持气道内的炎性病变，所述趋化因子如嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、调节活化，正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP1alpha)及白介素8(IL-8)。

作为这些炎性损害的结果，气道壁因真基底膜下的III型和IV型胶原蛋白的沉积作用而增厚。在更为严重的慢性哮喘中，气道壁是由于气道腺体和分泌细胞的肥大及增生、气道平滑肌增生和粘膜下胶原蛋白的进一步沉积而增厚。气道上皮的脱落可导致气道裸露。这些改变在轻度间歇性哮喘中呈斑片样出现，并且当疾病渐渐成为慢性且更为严重时，这些改变也变得更加普遍。哮喘患者的气道形态学研究已证实：足够程度的气道壁增厚可增加气流阻力并增强气道反应性。在严重哮喘的情况下，气道壁显著增厚。此外，高粘性的粘液和脱落的气道上皮细胞簇的混合物可导致斑片样(patchy)气道阻塞。

偶发性气道狭窄可导致气道内腔阻塞气流从而引起哮喘发作。尽管目前已非常明确：哮喘时会出现炎性细胞(特别是嗜酸性粒细胞)和肥大细胞的气道浸润，但是这些细胞和导致哮喘性气道阻塞的病理过程的关系还没有被阐明。已假设了三种可能但互不排斥的关系：(1)气道平滑肌收缩；(2)气道上皮增厚；和(3)气道腔区域内存在液体。在这些机制中，由生物活性介质或神经递质的局部释放引起的气道平滑肌收缩是最为普遍接受的对哮喘发作中急性可逆性气道阻塞的解释。目前认为几个对支气管具有活性的介质是引起哮喘患者气道阻塞的物质(参见希氏内科学(CecilTextbook of Medicine)，第21版，Goldman及Bennett编辑，W.B.Saunders出版公司，费城，宾夕法尼亚州，第74章，第387-393页(2000))。

哮喘：主要的炎性病变

在基线时和病变加重期间的哮喘性气道狭窄都是由炎症引起的观点是基于在人类中进行的两种类型的研究。从研究可以发现：和正常个体的支气管肺泡灌洗液相比，哮喘患者的支气管肺泡灌洗液中的炎性细胞(包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)的数量增加。

甚至在基础肺功能正常并且无非周期性哮喘加重的哮喘患者的气道中也已发现嗜酸性粒细胞和其它炎性细胞的数量增多。对于过敏性和非过敏性哮喘患者而言，情况都是如此。用过敏原激发后，在过敏性哮喘患者的支气管肺泡灌洗液中可发现炎性细胞的数量进一步增加。

除支气管肺泡灌洗外，在正常受试者和哮喘患者中还进行了肺活组织检查。和正常受试者相比，哮喘患者的气道厚度增加并且汇集进入肺组织的炎性细胞增多。这种炎症的基础不完全清楚。已经清楚地认定：大约50％的儿童和相比之下比例低得多的成人的哮喘与暴露于过敏原有关。在这些患者中，暴露于过敏原是经速发过敏型反应引起他们的哮喘性炎症的部分原因或主要原因。据推测：这些反应可能处于不完全反应程度，导致持续的轻至中度炎症但没有明显的支气管收缩。

大部分成人哮喘患者和约50％的患哮喘的儿童没有易于确认的针对其哮喘的过敏性组分。但是，基于显示IgE水平增高和哮喘的患病率之间存在相关性的流行病学研究(参见例如Burrows等人，N.Engl.J.Med.，320卷，271-277页(1989))，绝大部分哮喘病例实际上可能具有过敏性组分，所述过敏性组分不容通过标准方法如皮试或检测血中的抗原特异性IgE而识别。

过敏性哮喘已被用作哮喘的常规研究模型，部分是因为通过暴露于过敏源可任意引发哮喘发作。对过敏性哮喘的机理的研究可使现行的哮喘治疗方法的基本原理大体上得以解释。肥大细胞通过暴露于过敏原而被刺激。过敏原特异性IgE经由Fc受体与肥大细胞结合。当过敏原与IgE接触时，肥大细胞即被激活并释放出大量的炎性介质。其机制包括粒状内容物的释放、各种由脂质膜衍生的分子的合成以及在它们的信使RNAs(mRNAs)的转录开始后的大量细胞因子的产生。这样，多种介质因此被释放，其中每种介质对气道炎症都具有一种以上的强烈作用。

血管舒张、血管渗透性增加和内皮对白细胞的粘附性增加使得炎性细胞自体循环汇集入组织中。其中以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞为主。一旦这些新补给的细胞到达肺部，它们将释放它们自身的具有进一步致炎作用的介质。

哮喘性炎症以支气管高反应性为特征并因此不同于出现于其它病症如肺炎中的炎症。哮喘性炎症的长期结果是气道水肿、平滑肌肥大、上皮脱落及支气管对非特异性刺激物如强烈的气味、冷空气、污染物和组胺的高反应性。哮喘性气道炎症可引起副交感神经紧张性增强，导致支气管狭窄。

由上述方案可预计：只影响一种介质的药物不太可能具有真正的益处，完全是因为众多的介质参予了哮喘性炎症的病理过程。例如在过敏性哮喘反应期间明显地有组胺被释放(参见Murray等人，N.Engl.J.Med.，315卷，800-804页(1986))，但抗组胺药物对于过敏性哮喘没有或几乎没有益处(参见Holgate，Clin.Rev.Allergy，12卷，65-78页(1994))。同样也可预计：更广泛地作用于哮喘性炎症的药物较仅仅能作用于支气管收缩本身的药物具有更大的治疗益处(参见Goodman及Gilman，Thepharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill，纽约(1996)，特别是28章)。

哮喘的治疗

哮喘的治疗包括施用两种主要类别的药物，即支气管扩张药和抗炎药。这些药物可通过静脉注射(i.v.)、口服施用，或通过吸入气雾剂将药物局部应用于肺部而施用。下表1列出了可能对治疗哮喘有价值的药物。

在哮喘的治疗所使用的支气管扩张药有若干类，包括β-肾上腺素能激动剂、抗胆碱能药和两种密切相关的药物：茶碱和氨茶碱。优选的用于支气管收缩的治疗方法是吸入β-肾上腺素能激动剂。这些药物对于立即缓解急性严重哮喘是有效的。但是，与为提供症状性的急性控制而采取的时间更为有限的使用方法相比，长期使用β-肾上腺素能激动剂是非常有争议的。长期使用β-肾上腺素能激动剂可能因降低β-肾上腺素能受体的数量而加重支气管高反应性并触发快速脱敏。

在过去，抗胆碱能药物和茶碱或氨茶碱已被用于扩张支气管，但两类药物的效果均有限并且具有显著的副作用。

抗炎药物在哮喘中的使用

以往，有两类抗炎药物用于治疗哮喘：1)糖皮质激素类药物和2)色甘酸钠(INTAL)及与其密切相关的药物萘多罗米钠(TILADE)。

色甘酸没有扩张支气管的能力，但是它能抑制抗原诱导的支气管痉挛，以及抑制被激活的肥大细胞释放组胺和其它自身活性物质。这被认为是由于对各种刺激(包括与细胞结合的IgE和特异性抗原的相互作用)产生响应而使肺部细胞脱粒作用受到抑制。自1971年以来色甘酸钠已在美国被用于哮喘的治疗。但是，尽管已证实色甘酸钠对患有轻至中度哮喘的患者是有用的治疗方法，但还没有证实其在治疗患有较严重哮喘的患者时能减少或避免对全身性糖皮质激素类的需求。

糖皮质激素

糖皮质激素的全身性施用长期以来被用于治疗严重慢性哮喘或哮喘的严重急性发作。近年来，糖皮质激素的气雾剂制剂的研制改善了糖皮质激素治疗的安全性，使其可用于治疗中度哮喘。目前有几种不同种类的糖皮质激素吸入器可以使用，包括那些使用倍氯米松双丙酸酯、醋酸曲氨缩松和9-去氟肤轻松的吸入器。

用于更严重的急性哮喘加重或慢性重度哮喘的治疗时，常常有必要在相当长的时间内使用大剂量的糖皮质激素。例如，用于这些病症时，所需的全身性糖皮质激素的剂量为：泼尼松每日40至60mg，连用5日或5日以上。已知长时间摄入较大剂量时，糖皮质激素可产生严重的副作用。这些副作用包括液体和电解质的平衡改变、体重增加、高血压、对感染的敏感性增强、消化性溃疡、肌病、白内障、骨质疏松症、生长迟缓和精神病症状，包括精神错乱、抑郁症和自杀企图。

表1哮喘治疗中使用的药物

1.抗炎药物

A)糖皮质激素/皮质类固醇

(可被用于治疗哮喘或IBD的肾上腺皮质类固醇及其合成类似物的制剂的非专有名称和部分商品名)

双丙酸阿氯米松(ACLOVATE)	地塞米松磷酸钠(DECADRON PHOSPHATE，HEXAOROL PHOSPHATE)
		安西奈德(CYCLOCORT)	双醋二氟松(FLORONE，MAXIFLOR)
倍氯米松双丙酸酯(BECLOVENT，VANCERIL)	醋酸氟氢可的松(FLORINEF ACETATE)
		倍他米松(CELESTONE)	9-去氟肤轻松(AEROBID，NASALIDE)
苯甲酸倍他米松(BENISONE，UTICORT)	醋酸氟轻松(FLUONID，SYNALAR)
		二丙酸倍他米松(DIPROSONE)	氟轻松(LIDEX)
倍他米松磷酸酯钠(CELESTONEPHOSPHATE)	氟氢缩松(Fluorometholone)(FLUOR-OP，FML)
		倍他米松磷酸酯钠及醋酸倍他米松(CELESTONE SOLUSPAN)	氟氢缩松(Flurandrenolide)(CORDRAN)
戊酸倍他米松(BETA-VAL，VALISONE)	氯氟舒松(HALOG)
		布地萘德(PULMICORT)	甲羟松(HMS LIZUIFILM)
丙酸倍氯他索(TEMOVATE)	甲基泼尼松龙(MEDROL)
		氯氟土龙特戊酸酯(CLODERM)	醋酸甲基泼尼松龙(DEPO-MEDROL，MEDROL ACETATE)
氢化可的松磷酸钠(HYDROCORTONEPHOSPHATE)	甲基泼尼松龙琥珀酸钠(AMETHAPRED，SOLUMEDROL)
		氢化可的松(CORTEF，HYDROCORTONE)	糠酸莫米他松(ELOCON)
醋酸氢化可的松(HYDROCORTONEACETATE)	醋酸对氟米松(HALDRONE)
		丁酸氢化可的松(LOCOID)	泼尼松龙(DELTA-CORTEF)
环戊丙酸氢化可的松(CORTEF)	强的松龙醋酸酯(ECONOPRED)

氢化可的松琥珀酸钠(AHYDROCORT，SOLU CORTEF)	氢泼尼松磷酸钠(HYDELTRASOL)
		戊酸氢化可的松(WESTCORT)	强的松龙叔丁乙酯(HYDELTRA-T.B.A.)
醋酸可的松(CORTONE ACETATE)	强的松(DELTASONE)
		丙缩羟强龙(DESWEN，TRIDESILON)	氟羟强的松龙(ARISTOCORT，KENACORT)
去羟米松(topICORT)	醋酸曲安缩松(KENALOG)
		地塞米松(DECADRON)	氟羟氢泼尼松(ARISTOCORT，KENACORT，DIACETATE)
醋酸地塞米松(DECADRON-LA)	丙酮缩去炎松己酸酯(ARISTOSPAN)

B)非甾体类

色甘酸钠(INTAL)

萘多罗米钠(TILADE)

2.支气管扩张药

A)β2-选择性肾上腺素能激动剂

沙丁胺醇(PROVENTIL，VENTOLIN)	沙美特罗(SEREVENT)
		双甲苯喘定甲磺酸盐(TORNALATE)	特布他林(BRETHAIRE，BRETHINE，BRICANYL)
吡布特罗(MAXAIR，MAXAIRAUTOHALER)

B)甲基黄嘌呤类药物

氨茶碱	茶碱(THEO-DUR)

由于通常所接受的总全身给药剂量较低，所以吸入性糖皮质激素较为安全。但是，吸入性糖皮质激素仍然与儿童生长迟缓、下丘脑-垂体肾上腺轴的抑制、骨吸收、碳水化合物和脂质代谢的变化、白内障、皮肤变薄、紫癜、言语障碍和念珠菌病有关(参见Goodman及Gilman，Thepharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill，纽约(1996)，特别是28章和59章)。

由于在必须摄入治疗哮喘的全身性或甚至是吸入式糖皮质激素的患者中的副作用发生率较高，所以非常期望发现替代疗法，所述替代疗法在这些患者的治疗方案中能完全替代或者至少部分替代糖皮质激素。后者被称作“节约类固醇”(steroid-sparing)作用，并且在患有严重和/或慢性哮喘的患者中，这种糖皮质激素剂量的减少可防止或减轻使用糖皮质激素治疗导致的严重长期的不良后果。

因此，需要治疗哮喘的方法，该方法可克服现有技术中的上述局限性并且尤其可减少由于长期大剂量施用糖皮质激素导致的副作用。特别地，需要使用具有较低的全身性免疫抑制作用但仍可在肺内产生治疗有效的抗炎响应的药物治疗哮喘的方法。这些药物可单独使用，或和其它已知对哮喘治疗有效但在严重或慢性哮喘的治疗中又允许完全去除或明显减少糖皮质激素剂量的药物联合使用。

炎症性肠病(IBD)

IBD也是EID的一个例子，包括溃疡性结肠炎(UC)和局限性肠炎(CD)。这些都是胃肠道的慢性炎症性病变。它们可通过一系列临床、内窥镜和组织学特征而诊断，但是仅凭单一的诊断结果不能对一种疾病或其它疾病进行确定的诊断。而且，一些患者的临床特点介于两种病变之间，被称为患有不确定性结肠炎。

UC的炎症性反应主要局限于粘膜层和粘膜下层，而CD中的炎症开始于粘膜层，在严重情况下可从粘膜层延伸穿透肠壁到达浆膜。UC局限于结肠，结肠切除术对其是有效的疗法。与此相反，尽管小肠末段和结肠是最常见被累及的，但CD可累及胃肠道的任何部分。对发炎部分实施切除术对CD没有疗效，并且可能复发炎症。

CD和UC的发病率和患病率随地理位置而改变，北欧和北美的白种人口的比率最高，其中每种疾病的发病率为约5/100,000而患病率为约50/100,000。中欧和南欧的比率较低，而在南美、亚洲和非洲更低。CD和UC在犹太人中均比在非犹太人中常见。在美国，黑人人口中的IBD的发病率是白人人口发病率的1/5至1/2，但近年来此差距有所缩小。在北欧和北美，UC的发病率已趋于稳定但CD的发病率仍在上升。两种疾病在男性和女性中的发病率是相同的。发病高峰年龄为15岁至25岁，其次，次高峰年龄为55岁至65岁。尽管15岁以前的发病率较低，但两种疾病均可在儿童期出现。

对IBD而言最重要的风险因素是阳性家族史。约15％的IBD患者已影响一级亲属，一级亲属中的发病率是普通人群发病率的30至100倍。被影响个体的一级亲属中发生IBD的终生风险的最佳估计值是3％至9％。患者的一级亲属中发病率的增加和患者配偶中未出现发病率的增加形成对比。双卵双胞胎的同病率与其兄弟姐妹的同病率相同，但是单卵双胞胎对两种疾病的同病率均较高。已绘制出CD的易感位点对应于16号染色体。

在IBD中，固有层被淋巴细胞、巨噬细胞和免疫系统的其它细胞浸润。然而，对可触发免疫应答的抗原的深入研究已发现了一种特异性的微生物病原体。在UC患者的血清中已识别作用不明的抗结肠抗体。IBD可能还与普通的、调节良好的、低级的(因长期暴露于内腔抗原而导致的)肠内固有层的慢性炎症的抑制(或下调)失调有关。

无论何种抗原触发，IBD的发病机理中均涉及激活的固有层T细胞。在CD中，激活的淋巴细胞似乎主要是可产生干扰素(IFN)-γ的Th1淋巴细胞。促炎细胞因子(包括IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)-α)可使免疫反应放大。静脉输注TNF-α的抗体在临床上对CD是有效的。大量中性粒细胞被趋化剂(包括IL-8和白三烯B4)吸引进入发炎的粘膜。IBD中的上皮损伤似乎是由于源自中性粒细胞和巨噬细胞的活性氧以及细胞因子，包括TNF-α和IFN-γ。

当对应于IL-2、IL-10或TGFβ1的基因被剔除或当存在某种T细胞受体突变体时，小鼠会出现结肠炎，而如果引入人HLA-B27基因，则转基大鼠中可出现结肠炎。如果在无菌环境中饲养上诉动物，则不会出现结肠炎(参见希氏内科学(Cecil Textbook of Medicine)，第21版，Goldman及Bennett编辑，W.B.Saunders出版公司，费城，宾夕法尼亚，第135章，第722-729页(2000))。

UC和CD均具有特征性病理表现，但在任何已知病例中的病理表现的特异性可能不足以对它们进行鉴别或将它们与其它疾病区分开来。

在UC中，炎症出现于直肠并沿近轴延伸一定的距离，然后突然终止，在被累及和未被累及粘膜间具有一条清楚的界线。UC的大多数病理发现局限于粘膜层和粘膜下层。活动性UC的标志为粘膜层和粘膜下层中存在中性粒细胞。存在粘液耗竭、粘膜水肿和伴灶性出血的血管充血。

溃疡性结肠炎(UC)

UC的主要症状是腹泻，其通常与便血有关(见表2)，直肠发炎导致排便频繁但排泻量少。便急和大便失禁可严重地限制患者的社会活动能力。其它症状(如贫血和白细胞数量升高)及红细胞沉降率可用于确定严重的疾病和跟踪严重恶化的临床病程。

局限性肠炎(CD)

CD以三种主要形式之一存在：1)回肠和盲肠病(40％的患者)；2)局限于小肠的疾病(30％)；以及3)局限于结肠的疾病(25％)。

CD的主要症状是腹泻、腹痛和体重减轻。实验室结果大部分是贫血和白细胞适度升高，不具有特异性。

              表2 IBD的严重程度的标准

轻度	每日排便少于4次，伴少量出血或无出血，无发热且红细胞沉降率＜20mm/小时
		中度	介于轻度和重度之间
重度	每日排便6次或6次以上，伴出血、发热、贫血且红细胞沉降率＞30mm/小时

IBD的药物治疗

目前IBD的药物疗法可大致分为以下5类：皮质类固醇类、氨基水杨酸类(ASA)、免疫抑制剂、抗生素和以细胞因子为靶点的疗法。

类固醇

皮质类固醇是最常被用于治疗中度至重度IBD的药物。治疗的益处被熟知的由全身性作用和内源性肾上腺功能的抑制而引起的副作用抵消。在UC中，类固醇被用于急性治疗并且对于预防复发既无效也没有必要。在CD中，主要是泼尼松和泼尼松龙被用于一定比例的患者群中的中度至重度反跳作用，而更大比例的患者对治疗无响应。考虑到长期使用类固醇的严重副作用，许多专家目前认为应当尽可能地寻找类固醇的替代疗法。

5-氨基水杨酸制剂

在美国，柳氮磺胺吡啶是最常被处方的ASA类药物。但是，达45％的患者和80％的健康对照受试者报告有涉及磺胺吡啶部分的副作用。不含磺胺吡啶的制剂必须局部施用，如经栓剂施用或以肠溶包衣的形式施用以延迟释放。ASA是轻或中度UC的主要疗法。但是，它们的耐受性不好(低于经直肠施用的皮质类固醇类药物的耐受性)并且在严重UC中未经评价。它们在治疗方案中的主要价值在于延长症状缓解期。在CD中，ASA在活动期病变中的效果不如类固醇，并且对静止期也没有表现出明确的益处。

免疫抑制剂

硫唑嘌呤(AZA)和6-巯基嘌呤通过硫代肌苷酸对新生的嘌呤核苷酸的作用可抑制细胞周期的DNA合成期。在UC中，它们被用于降低复发率并且AZA被认为是类固醇节约剂(参见Kirk等人，Br.Med.J.，Clin.Res.Ed.，284(6325)，1291-1292页(1982))。同样地，在CD中，AZA被用于使症状持续缓解并减少类固醇的使用量，但是却付出了这样的代价：在第一个月中常见恶心、发热、皮疹和白细胞减少，并且3至15％的患者中出现胰腺炎和更严重的过敏反应。此外，还存在发育异常或患结肠癌的风险。

环孢菌素A

近十年来，CyA在重度UC的治疗中引起了引人注目且备受争议的改变(参见Sandborn，炎症性肠病(Inflammatory Bowel Diseases)，第1卷，48-63页(1995))。50至80％的患者从短期治疗中获益，并且环孢菌素A已为40％的静脉注射类固醇无效的患者提供了外科手术的替代疗法。长期使用时，超过40至50％的患者避免了最终的结肠切除术，特别是用AZA维持治疗时。但是，所使用的剂量较大，并且具有肾毒性和机会性感染的风险。在CD中，CyA被认为是AZA的作用延迟发挥期间的“过渡”。它作为类固醇的辅助治疗或作为缓解治疗时无效。停药时似乎常见病情复发并且有必要同时进行AZA治疗。

抗生素

抗生素用于IBD的大多数依据是根据情况而定的。在可使用的有限数量的对照试验中，抗生素(甲硝唑、环丙沙星)已显示出与类固醇在急性CD患者的诱导缓解方面具有相近的疗效。但是，它们似乎对UC的病程几乎没有作用。

以细胞因子为靶点的治疗药物

在临床上已推行将抗体治疗药物用于IBD。抗TNF-α嵌和抗体Infliximab(REMICADE^TM)输注的疗效在对常规治疗具有耐受性的患者和伴有瘘管的中度至重度CD患者中已被充分地得到确定。其作为维持治疗尚处于研究之中。达60％的患者实现了症状的缓解，但是全部患者中高达60％出现了副作用(例如恶心、上呼吸道感染、腹痛和头痛)。16％的患者出现了严重的输液反应，其中大多数发生于第二次输液后，尤其是在产生人抗嵌和抗体的患者群中(13-30％)。人源化抗体和/或抗体片段可能具有较低的免疫原性和较好的耐受性。使用重组人IL-10和IL-11的试验已显示有40％至50％的患者的症状缓解。所有这种以细胞因子为靶点的治疗药物必须通过胃肠外注射或输注施用，而这是一个严重的缺点。

药物组合

上述药物的组合目前被用于IBD的治疗，例如5-ASA+抗生素以治疗CD以及口服5-ASA+5-ASA灌肠+局部氢化可的松用于治疗UC。

             表3IBD的治疗中所使用的药物

5-氨基水杨酸制剂(柳氮磺胺吡啶)

抗生素类药物(甲硝唑和环丙沙星)

皮质类固醇类药物(泼尼松或表1中所列的任何糖皮质激素/皮质类固醇)

环孢菌素A

以细胞因子为靶点的治疗药物(Infliximab)

免疫抑制剂(AZA和6-巯基嘌呤)

目前IBD治疗的副作用情况

所有用于治疗IBD的药物的副作用严重，并且由于IBD的慢性本质及随之产生的对长期使用一种药物或更常见使用药物组合的需求，使得使用这些有毒药物的患者的问题更为严重。

类固醇(全身性和局部性)具有许多副作用，包括对下丘脑-垂体轴的抑制、骨质疏松症和精神病现象。常用的类固醇为地塞米松，但是表1中所列出的任何类固醇均可用于IBD的治疗。5-ASAs可导致厌食、胃不耐受性、恶心、头痛和肾脏问题，它还涉及长期的安全性。免疫抑制的患者除感染的风险增大之外，可遭受肝脏毒性、肾功能损伤以及患肿瘤的风险增大。抗生素与抽搐、中毒性精神病、头晕、抑郁、皮疹和光毒性有关。在较短时间的临床应用期间，用TNF-α进行抑制已显示出与(导致一些与该治疗有关的死亡的)严重感染及败血症有关。

与IBD的现行药物治疗有关的困难和问题概述如下：

●IBD是慢性病变并且常常为需要频繁和/或持续药物治疗的严重病症。

●可以使用一线药物和维持药物，但是由于目前可用的药物仅仅可延缓达到下一次发作的时间，所以需要疗效及较好的耐受性。

●二线药物具有严重的毒性问题，因此不能防止频繁复发以及降低高手术率。

●大多数已知处于开发中的化合物为生物制品，其作为注射剂并非普遍适用于慢性病变的治疗。

●优选有效的经口服施用的药物，并且患者对其的耐受性较好。

和患有哮喘的患者的情形一样，由于在患有IBD而必须服用任何上述药物、尤其是任何糖皮质激素或免疫抑制剂的患者中的副作用的发生率高，所以十分需要发现替代疗法，所述替代疗法可完全替代或至少部分替代这些患者的治疗方案中的糖皮质激素或免疫抑制剂。后者就是所谓的“类固醇节约”作用，并且在患有严重和/或慢性IBD的患者中，这种糖皮质激素或免疫抑制剂剂量的减少可预防或减轻使用这些药物治疗所引起的严重的长期不良后果。

因此，需要治疗IBD的方法，所述方法可克服现有技术中的上述局限性，并且尤其可减少由长期施用大剂量的糖皮质激素或免疫抑制剂所导致的副作用。特别地，需要使用药物治疗IBD的方法，所述药物具有较轻的全身性免疫抑制作用但在胃肠道内仍可产生治疗上有效的抗炎反应。这些药物可以单独使用或和其它已知在IBD的治疗中是有效的、但在严重或慢性IBD的治疗中可完全消除或明显减少糖皮质激素或免疫抑制剂的剂量的药物联合使用。

此处对文献的讨论或引用不应被解释为承认所述文献为本发明的现有技术。

发明概述

本发明的组合物和方法中的活性化合物是匹美莫司，亦即通常所说的ASM981或ELIDEL(在此这些术语可交替使用)。匹美莫司和包含匹美莫司的药物组合物的制备在国际公开WO 01/60345 A2、WO 97/03654、WO 99/01458和WO 01/90110 A1、美国专利6,197,781和6,004,973及欧洲专利EP 0427680 B1中被公开，所有这些专利的全部内容在此引入作为参考。

在包括但不限于哮喘和IBD的EID的治疗中使用匹美莫司使得治疗指数和其它抗炎药物相比得以改善，是因为所述药物的上皮选择性抗炎作用将药物作用集中于例如肺部的气道上皮或胃肠道的粘膜的上皮组织中。匹美莫司的这种出乎意外、预先未知的作用特征使得EID治疗的安全系数显著增强，并且允许使用的匹美莫司的剂量可在提供治疗上有效的药物作用的同时使总的或常见的全身性免疫抑制及副作用最小化。匹美莫司的这种上皮组织选择性作用以往未被识别。这项出乎意外的发现以及(在银屑病患者中进行的匹美莫司临床试验期间所进行的)基因表达研究的结果和在IBD小鼠模型中进行的匹美莫司实验结果提供了本发明的基础。

现已知道匹美莫司的作用是有效地下调各种基因，所述基因的基因产物已知与炎症过程有关或为炎症过程的原因，因此匹美莫司对于治疗身体不同部位的上皮炎症，包括IBD的特征胃肠道粘膜炎症和哮喘的特征气道上皮炎症及其导致的支气管收缩，应当是有效的。匹美莫司的强大的选择性抗炎作用可替代需要使用糖皮质激素的治疗方案中的全部或部分糖皮质激素的剂量并因此产生较轻的总的全身性副作用。因此，加入匹美莫司可减轻或减少治疗方案的严重副作用。

因此，本发明提供了一种在人体中治疗或预防EID如哮喘或IBD、并可使全身性免疫抑制和由此所致的副作用的程度最小化的方法，所述方法包括向需要治疗或预防EID如哮喘或IBD的人体施用一定量的匹美莫司，所述一定量的匹美莫司足以在上皮组织，包括但不限于肺气道上皮组织或胃肠道粘膜中产生明显的治疗作用，但不足以产生全身性免疫抑制或不良副作用。在本发明的一个优选的实施方案中，全身性免疫抑制的程度可通过如下所述的IL-2报道基因分析来测定，例如，在此分析中产生50％抑制(IC₅₀)所需的匹美莫司的浓度为1.5nM。这个浓度远远低于产生临床显著的免疫抑制或不良副作用所需的浓度。所施用的匹美莫司的量将根据患者的个体特征而改变，但通常的剂量为每日10至100mg、优选每日20至80mg，例如每日40、50或60mg，优选每日两次(b.i.d.)等剂量施用。匹美莫司可通过静脉输注、透皮给药、气雾剂吸入或作为片剂、胶囊或混悬液经口服施用或通过栓剂经直肠施用。

此外，该方法还包括向所述人体施用另一种或多种药物和匹美莫司的组合。所述另一种或多种药物可以是一种或多种表1中的哮喘药物；或可以是任何已知或被发现对于哮喘或IBD的治疗有用的一种或多种药物，包括但不限于糖皮质激素、色甘酸钠或α肾上腺素能激动剂；或在IBD的情况下可以是一种或多种目前用于治疗IBD的药物，包括但不限于皮质类固醇、5-氨基水杨酸制剂、抗生素或免疫抑制剂如表3所示的AZA或CyA。

此外，本发明还提供了一种治疗EID如哮喘或IBD的方法，所述方法包括以一定量的匹美莫司替代治疗方案中所需的一部分糖皮质激素或免疫抑制剂，其中所需施用的与匹美莫司联用的糖皮质激素或免疫抑制剂的量显著低于不加匹美莫司时施用的为达到疗效所需的量。因此本发明提供了一个治疗上有效的治疗方案，该方案显著地减少了糖皮质激素或其它免疫抑制剂介导的全身性短期和长期副作用。

此外，可通过局部施用而增大和增强匹美莫司作用的上皮选择性。因此，可将匹美莫司配制成用于治疗哮喘的、通过吸入施用的气雾剂，并且在治疗IBD的情况下可作为灌肠剂以溶液或混悬剂的形式(或栓剂)被施用。

附图简介

图1.在用CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构的SCID(严重联合免疫缺陷病)小鼠中匹美莫司治疗对相对体重(BW)减轻的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始口服匹美莫司(固体分散体，图例括号中所给剂量单位为mg/kg/天)或其安慰剂进行治疗。每日进行治疗。将数据表示为每组小鼠(n＝8，除安慰剂组n＝7)体重相对于第0天体重的百分比的平均值±标准误差。全部得自非转移(PBS)小鼠的数值作为对照(pool)，因为在本研究中其体重的改变与治疗无关。

^*P＜0.05，相对于非转移小鼠。

图2.在用CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构的SCID小鼠中CyA治疗对相对体重(BW)减轻的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后植入含有CyA(以Sandimmun^形式给药，图例括号中所给的对于20g的小鼠剂量单位为mg/kg/天)或其安慰剂的微型渗透泵(Alzet)。将数据表示为每组小鼠(n＝8，除CyA(30)组由于一只小鼠于泵植入术后迅速死亡n＝7)体重相对于第0天体重的百分比的平均值±标准误差。所有转移组小鼠相对于非转移组(PBS)小鼠的体重显著减轻(P＜0.05)。全部得自非转移(PBS)小鼠的数值被作为照，因为在本研究中其体重的改变与治疗无关。

图3.匹美莫司治疗抑制由原CD4⁺CD45RB^HiT细胞转移入SCID小鼠引起的重度结肠炎

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。匹美莫司每日经口服给药，CyA(以Sandimmun^形式)经微型渗透泵给药(显示于箱形图的顶部的所有剂量以mg/kg/天表示)。全部研究于29天后终止，在那时清洗一段结肠并将其固定于福尔马林溶液中、嵌入石蜡、以3μm厚度切片、用H&E(苏木精及曙红)染色并用0(无结肠炎)至8(重度结肠炎)级标准进行评分。最高分为8，非转移小鼠评分为0。箱形图显示了每组(n＝7或8)分数的中位数、平均数和标准偏差。

图4.匹美莫司抑制SCID-IBD模型中的急性期反应

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。匹美莫司每日经口服给药，CyA(以Sandimmun^形式)经微型渗透泵给药。两项研究均于29天后终止，在那时采血并且测定血清中小鼠的一种急性期反应蛋白结合珠蛋白的水平。两项SCID-IBD研究的代表性数据如上所示。数据被表示为每组小鼠(n＝6至8)的平均血清结合珠蛋白(mg/ml)±标准误差。

^**P＜0.01、^*P＜0.05，相对于相应研究中安慰剂治疗组小鼠。

图5.匹美莫司减少用CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构的SCID小鼠的血液和脾中的中性粒细胞的数量

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。匹美莫司每日经口服给药，CyA(以Sandimmun^形式)经微型渗透泵给药。全部研究于29天后终止，在那时采血并摘除脾脏，将其制成细胞悬液并且进行荧光活化细胞分选(FACS)分析，以确定各样本中中性粒细胞的百分比。血和脾细胞悬液中的中性粒细胞是作为抗Ly-6G(通过中性粒细胞表达的脊髓分化抗原)抗体染色阳性细胞、由它们的向前扩散、侧向扩散特征而进行识别的。根据每个样本中的细胞总数和其中中性粒细胞的百分数计算中性粒细胞的数量。将数据表示为每组小鼠(n＝6至8)的平均中性粒细胞数±标准误差。

^*P＜0.05，相对于相应研究中安慰剂治疗组动物计算得出。

图6.匹美莫司或CyA治疗对用CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构的SCID小鼠结肠中的MPO活性的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。匹美莫司每日经口服给药，CyA(以Sandimmun^形式)经微型渗透泵给药。29天后将小鼠处死，割除结肠、清洗并瞬间冰冻用作后期制备和MPO活性的分析。图中的每个柱(动物的详细数量见相关报告)表示：扣除6至8只非转移小鼠的平均背景活性后，6至8只治疗组小鼠相对于6至8只安慰剂治疗组小鼠的平均活性的MPO活性(毫单位/μg蛋白)的计算抑制百分比(％)。

^*P＜0.05，在各相应研究内计算。

图7.匹美莫司用于皮肤炎症时优于CyA和FK506，但具有较少的全身性免疫抑制作用

(左上方图)在剂量为2×90mg/kg时，小鼠过敏性接触性皮炎(ACD)模型口服匹美莫司的疗效较口服CyA的疗效稍高于2倍，ACD大鼠模型口服匹美莫司的疗效较口服CyA的疗效高4倍(12.5mg/kg匹美莫司相当于50mg/kg CyA)。此外，在相同剂量下，大鼠或小鼠ACD模型口服匹美莫司的疗效分别优于FK506的疗效或与其相当(左下)。与其强大的抗炎性相反，匹美莫司在一系列移植或接种模型中与CyA(右上)或FK506(右下)相比均显示出极小的免疫抑制作用。

图8.匹美莫司治疗对用CD4⁺CD45RB^Hi重构的SCID小鼠的血液、脾和MLN(肠系膜淋巴结)中淋巴细胞数量的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。匹美莫司每日经口服给药。全部研究于29天后终止，在那时采血并摘除脾及MLN，制成细胞悬液并且进行FACS分析，以确定各样本中淋巴细胞的百分比。确定各样本中的细胞总数从而可以计算出淋巴细胞的数量。将数据表示为每组小鼠(n＝6至8)的平均淋巴细胞数±标准误差。

^**P＜0.01、^*P＜0.05，相对于相应研究中安慰剂治疗组动物计算。

图9.CyA治疗对SCID-IBD小鼠的血液、脾和MLN中淋巴细胞数量的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。CyA(以Sandimmun^形式)经微型渗透泵给药。全部研究于29天后终止，在那时采血并摘除脾及MLN，制成细胞悬液并且进行FACS分析以确定各样本中淋巴细胞的百分比。确定各样本中的细胞总数从而可以计算淋巴细胞的数量。将数据表示为每组小鼠(n＝6至8)的平均淋巴细胞数±标准误差。

^**P＜0.01、^*P＜0.05，相对于相应研究中安慰剂治疗组动物计算。

图10.匹美莫司(口服100mg/kg/天)延迟治疗对CD4⁺CD45RB^HiT细胞诱导的体重减轻的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于7、14或21天后开始匹美莫司100mg/kg/天口服治疗并持续每日治疗直至第41天。安慰剂制剂治疗开始于7天后。前2周每周1次、随后每两周一次监测BW。将数据表示为每组小鼠(PBS：n＝9；ASM(7天)及ASM(21天)：n＝8；ASM(14天)及安慰剂：n＝7)体重相对于第0天的体重的百分比的平均值±标准误差。PBS指的是非转移小鼠，其体重百分比值被作为对照，因为没有发现与治疗相关的改变。

^**P＜0.01，相对于第41天时的安慰剂治疗组。

图11.匹美莫司(口服100mg/kg/天)延迟治疗对CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构的SCID小鼠的血清结合珠蛋白水平的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于7、14或21天后开始匹美莫司100mg/kg/天口服治疗并持续每日治疗直至第41天。安慰剂制剂治疗开始于7天后。第41天时将小鼠处死，保留血清用于结合珠蛋白分析。将数据表示为每组小鼠(PBS：n＝9；ASM(7天)：n＝8；ASM(14天)、ASM(21天)及安慰剂：n＝7)的平均结合珠蛋白(mg/ml)±标准误差。PBS指的是非转移小鼠，其结合珠蛋白值被作为对照，因为其中没有发现与治疗相关的改变。

^**P＜0.01，相对于第41天时的安慰剂治疗组。

图12.匹美莫司延迟治疗对用CD4⁺CD45RB^Hi重构的SCID小鼠的血液和脾中中性粒细胞数目的影响

用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于7、14或21天后开始匹美莫司100mg/kg/天口服治疗并持续每日治疗直至第41天。安慰剂制剂治疗开始于7天后。第41天时将小鼠处死，去除血液和脾，制成细胞悬液并用相应抗体孵化以通过FACS分析确定中性粒细胞的数目。将数据表示为每组n只(每柱表示n只)小鼠的平均中性粒细胞数±标准误差，其是由每个样本的阳性细胞百分比和细胞总数计算而得。

^*P＜0.05，相对于安慰剂治疗组计算。

发明详述

本发明包括用于在人体中治疗或预防EID如哮喘或IBD、并使全身性副作用最小化的方法，所述全身性副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤，所述方法包括向所述人体施用治疗有效量的匹美莫司，此治疗有效量的匹美莫司足以治疗或预防EID如哮喘或IBD但不足以产生显著的常见全身性免疫抑制作用或不良副作用。在一个实施方案中，此剂量可为5mg/天至100mg/天的口服剂量；在一个更优选的实施方案中，口服剂量可为20至80mg/天；并且在最优选的实施方案中，口服剂量可为30至60mg/天单次或分次给药，优选每日两次的方案。

本发明的另一方面包括用于在人体中治疗或预防IED如哮喘或IBD、并使全身性副作用最小化或减轻的方法，所述全身性副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤，所述方法包括向所述人体施用治疗有效量的匹美莫司，此治疗有效量的匹美莫司足以治疗或预防或改善至少一种EID如哮喘或IBD的症状但不足以产生显著的常见全身性免疫抑制作用或不良副作用，如机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染、或淋巴增生性病变如淋巴瘤或其它恶性肿瘤。在上述方法中匹美莫司的“治疗有效量”优选为对治疗EID有效但没有全身性免疫抑制作用的量，例如在(例如如美国专利5,897,990所述的)IL-2报道基因分析中检验不出对应于IC₅₀的血液浓度的量，所述血液浓度例如＜1.5ng/ml、优选＜1.0ng/ml，更优选≤0.5ng/ml或更低的血液浓度。最佳剂量可根据个体和所治疗的病情稍有改变，但适宜的用于治疗以上所提及病症的成人匹美莫司的总日口服剂量通常为约10至100mg/天、优选20至80mg/天、最优选40至60mg/天，优选每日两次等剂量施用。

本发明的另一方面包括用于在人体中治疗或预防IED如哮喘或IBD、并使全身性副作用最小化或减轻的方法，所述全身性副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤，所述方法包括向所述人体施用治疗有效量的匹美莫司。所述治疗有效量的匹美莫司足以治疗或预防或改善至少一种EID如哮喘或IBD的症状但不足以产生显著的常见全身性免疫抑制作用或不良副作用。在一个实施方案中，此剂量可为以单次或两次或多次分剂量施用的匹美莫司的总日口服剂量，所述总日口服剂量在稳态血清或血液浓度-时间图中于24小时内的曲线下面积(AUC)低于500ng·小时/ml。

用于此处时，术语“AUC”指的是药物的血清或血液浓度相对于时间的曲线下面积，在当患者接受规律给药，例如每日一次(q.d.)或每日两次或两次以上剂量的药物时对其进行评价。AUC可根据给药间隔(意思是两次连续给药间经历的时间，通常为24、12、8或6小时)计算，或可不考虑给药间隔计算稳态期间24小时内的AUC。

本发明的另一方面包括用于在人体中治疗或预防IED如哮喘或IBD、并使全身性副作用最小化或减轻的方法，所述全身性副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤，所述方法包括向所述人体施用治疗有效量的匹美莫司。所述治疗有效量的匹美莫司足以治疗或预防或改善至少一种EID如哮喘或IBD的症状但不足以产生显著的常见全身性免疫抑制作用或不良副作用，如机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤或其它恶性肿瘤。在上述方法中匹美莫司的“治疗有效量”优选为治疗EID有效但没有全身性免疫抑制作用的量，例如可产生高于7ng/ml但低于20ng/ml的最小谷值血清浓度的量。最佳的可产生这些谷值浓度的剂量可根据个体或所治疗的病情稍有改变，但适宜的用于治疗以上所提及病情的匹美莫司的成人总日口服剂量通常为约10至100mg/天、优选20至80mg/天、最优选40至60mg/天，优选以每日两次等剂量施用。

本发明的另一方面包括用于在人体中治疗或预防IED如哮喘或IBD、并使全身性副作用最小化或减轻的方法，所述全身性副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤，所述方法包括向所述人体施用治疗有效量的匹美莫司。所述治疗有效量的匹美莫司足以治疗或预防或改善至少一种EID如哮喘或IBD的症状但不足以产生显著的常见全身性免疫抑制作用或不良副作用。在上述方法中匹美莫司的“治疗有效量”优选为可有效治疗EID但没有全身性免疫抑制的量，例如可产生低于60ng/ml的C_max水平的量。可产生这些C_max水平的最佳剂量可根据个体或所治疗的病情稍有变化，但适宜的用于治疗以上所提及病情的匹美莫司的成人总日口服剂量通常为约10至100mg/天、优选20至80mg/天、最优选40至60mg/天，优选每日两次等剂量施用。

用于此处时，术语“由细菌、病毒或真菌病原体导致的机会性感染”指的是由细菌、病毒或真菌因素导致的、具有完全完整的免疫系统的人通常不会患病但确实可出现于(由于任何原因)免疫系统功能抑制的患者中的任何感染。这些机会性感染的天然或致病病原体在本领域是已知的，包括但不限于单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、卡氏肺囊虫、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、念珠菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及难辨梭状芽孢杆菌。

用于此处时，术语“淋巴增生性病变，或淋巴瘤或其它恶性肿瘤”指的是接受免疫抑制治疗的患者患病风险增加的、多种类型癌症的任何一种癌症，包括但不限于皮肤或软组织淋巴瘤、膀胱癌、白血病、肾或肝脏肿瘤(见希氏内科学，第21版，Goldman及Bennett编辑，W.B.Saunders出版公司，费城，宾夕法尼亚，第1045-1046页(2000))。

用于此处时，术语“C_max”指的是施用一定剂量的药物后产生的最大血药浓度。给药后达到C_max的时间将取决于吸收速度和具体药物的半衰期。

本发明的另一方面包括用于在人体中治疗或预防EID如哮喘或IBD、并可减少或消除对施用糖皮质激素或其它免疫抑制药物的需求的方法。因此，在这种实施方案中，匹美莫司和一种或多种药物的组合可用于在需要这种治疗的患者中治疗或预防EID，其中和表1中列出的药物的组合用于哮喘，和表3中列出的药物的组合用于IBD。匹美莫司的剂量可根据此处公开的任何方法确定。用这种组合可减少糖皮质激素和其它免疫抑制剂的剂量但保持相同的或更好的治疗效果。

本领域技术人员可通过评价患者的临床状态确定糖皮质激素或其它免疫抑制剂的剂量的确切的降低值。在进行该组合治疗时，可首先使用糖皮质激素或其它免疫抑制剂，然后用匹美莫司进行部分取代，或可首先使用匹美莫司然后加入糖皮质激素或其它免疫抑制剂形成组合治疗。在另一个实施方案中，可同时开始使用组合治疗的各成分并且基于患者的临床评价对剂量进行调整。

这种组合的使用可有效治疗EID，但由于对糖皮质激素或其它免疫抑制剂的需求减少，整个组合将具有降低全身性免疫抑制的作用并且可降低产生不良副作用的可能性，所述不良副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤。

本发明的另一方面包括用于在人体中治疗或预防IED如哮喘或IBD、并使全身性副作用最小化或减轻的方法，所述全身性副作用包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤，或其它恶性肿瘤，所述方法包括施用一定量的匹美莫司，所述一定量的匹美莫司足以改善至少一种EID症状但和同样有效剂量的皮质类固醇或其它免疫抑制药物产生的全身性免疫抑制相比可产生较少的全身性免疫抑制。因此，本方法利用了匹美莫司的“治疗窗”作用，该作用是由于匹美莫司对身体上皮组织的增强的活性而出现。因为这种作用，有可能找到匹美莫司的剂量，所述剂量对EID涉及的上皮部位在治疗上是有效的，以使一种或多种EID的症状得以改善、减轻或消除，但与一定剂量的在上皮目标组织中足以产生相同治疗效果的皮质类固醇或免疫抑制剂(例如CyA或他克莫司(tacrolimus，FK506))相比，该剂量可产生较轻的全身性免疫抑制作用。

在本说明书中，具体剂量的皮质类固醇的免疫抑制作用和匹美莫司的免疫抑制作用的比较指的是经口服具有活性的皮质类固醇和口服施用的匹美莫司之间的比较。这是由于吸入或经其它局部方式施用的活性皮质类固醇的局部作用和经口服施用的这类药物的作用存在很大差异。

具体地讲，本方法需要使用一定量的匹美莫司治疗患者，所述的量足以改善至少一种EID的症状或减轻或消除疾病的全部或大部分症状，但与一定剂量的对EID的症状足以产生相同疗效的类固醇及其它免疫抑制药物相比，该量可引起较轻的全身性免疫抑制。在一个优选的实施方案中，将对两种不同的治疗引起的全身性免疫抑制的程度例如通过下述IL-2报道基因分析方法进行测量。

在本方法的一个实施方案中，用匹美莫司对患有EID如哮喘或IBD的患者进行治疗，匹美莫司的剂量水平足以改善至少一种EID症状。该剂量的全身性免疫抑制作用可通过使用下述的IL-2报道基因分析法进行分析。将所述全身性免疫抑制作用与(引起至少一种症状的等效改善所需剂量的)皮质类固醇或其它免疫抑制剂产生的全身性免疫抑制作用进行比较。对匹美莫司的剂量进行选择，以使其产生的全身性免疫抑制作用轻于(对EID症状产生相同作用所需剂量的)皮质类固醇或其它免疫抑制剂产生的全身性免疫抑制作用。

在另一个优选的实施方案中，用匹美莫司对接受维持剂量的用于治疗EID如哮喘或IBD的皮质类固醇和/或免疫抑制剂的患者进行治疗，匹美莫司的剂量水平足以维持对疾病症状的控制并可使皮质类固醇和/或免疫抑制剂的剂量减少，以便使(如例如通过使用下述IL-2报道基因分析法所测量的)匹美莫司和皮质类固醇和/或免疫抑制剂的组合的总的全身性免疫抑制作用低于由先前的高剂量的皮质类固醇和/或免疫抑制剂单独产生的全身性免疫抑制作用。在本方法中匹美莫司对上皮组织的选择性作用被用于产生治疗方案总体的“节约类固醇作用”，并且因此可产生较轻的全身性免疫抑制作用，从而在患者中产生较少且较轻的严重副作用。

用于此处时，术语“EID”指的是覆盖一个或多个体腔内表面的组织的炎症在其中发挥重要作用的任何疾病，这种组织的例子包括但不限于皮肤或呼吸道的上皮和胃肠道的粘膜或粘液膜。

用于此处时，术语“全身性免疫抑制血液浓度”指的是可显示出引起常见全身性免疫抑制作用的匹美莫司的血液浓度，常见全身性免疫抑制作用如移植或组织排斥或特征性的免疫抑制不良副作用，包括但不限于机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染或淋巴增生性病变如淋巴瘤或其它恶性肿瘤。使用常规的临床评价方法，本领域技术人员可容易地对个体患者的所述浓度进行测定。

匹美莫司治疗哮喘

在涉及小鼠和大鼠哮喘模型的研究中，匹美莫司都已显示出在单次和多次攻击模型中可抑制由过敏原导致的气道嗜酸性粒细胞和IL-4细胞因子的产生。

考虑到匹美莫司的抗炎作用及其对气道高反应性的影响、最特别地是其减轻、逆转和预防肺部气道上皮炎症的具体作用，匹美莫司可用于治疗、特别是预防性地治疗气道梗阻和炎症性病变。因此通过持续和规律的长期给药，匹美莫司可用于提供对支气管收缩或梗阻性或炎症性气道病变引起的其它症状性发作的复发的预先保护，或用于这些疾病基础状况的控制、改善或逆转。

考虑到匹美莫司对胃肠道上皮的抗炎作用，它也可用于治疗IBD如UC和CD。

在治疗炎症性病变时，治疗的目的是预防或阻止炎症过程的进展以及使当前的炎症逆转，因此用于本说明书全文中的名词“治疗”应被理解为同时包含预防性和症状性两种治疗方式。

本发明适用的梗阻性或炎症性气道病变包括哮喘、尘肺、慢性阻塞性气道或肺病(COAD或COPD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和过敏原导致的气道炎症(包括季节性过敏性鼻炎和过敏性哮喘)以及其它药物治疗例如阿司匹林或β受体激动剂治疗引起的气道高反应性加重。

本发明适用于任何类型或原因的哮喘的治疗，包括内源性及尤其是外源性哮喘。本发明适用于治疗过敏性(特应性/IgE介导的)哮喘。本发明还适用于治疗非特应性哮喘，包括例如支气管炎、运动诱发性哮喘和职业性哮喘、细菌感染后诱发的哮喘及其它非过敏性哮喘。本发明还适用于治疗哮喘婴儿综合征(早期婴儿哮喘)。

本发明适用于治疗任何类型或起源的尘肺，包括例如铝尘肺、煤肺、石棉肺、石末肺、驼鸟毛尘肺、铁尘肺、矽肺、烟草肺(tobacoosis)及棉肺。

本发明适用于治疗COPD或COAD，包括慢性支气管炎、与之相关的肺气肿或呼吸困难。

本发明还适用于任何类型或起源的支气管炎，包括例如急性、花生仁吸入性、卡他性、慢性、格鲁布性或结核性支气管炎等。

考虑到其抗炎活性，尤其是涉及对嗜酸性粒细胞活化作用的抑制，匹美莫司也可用于治疗与嗜酸性粒细胞相关的病变，例如嗜酸性粒细胞增多；尤其是与嗜酸性粒细胞相关的气道病变，例如肺组织的致病嗜酸性粒细胞浸润，包括影响气道和/或肺部的嗜酸性粒细胞增多症；以及例如由Loffler’s综合征、嗜酸性粒细胞性肺炎、寄生虫感染特别是后生动物属感染引起或伴随其出现的嗜酸性粒细胞相关性气道病变，包括局部嗜酸性粒细胞增多、支气管肺曲菌病(aspergillosis)、结节性多动脉炎(包括变应性肉芽肿病，即Churg-Strauss综合征)、嗜酸性肉芽肿；以及由药物反应引起的影响气道的嗜酸性粒细胞相关性病变。

考虑到匹美莫司和免疫抑制和/或抗炎药物的协同相互作用的能力，它还可用作与这种药物联合使用的联合治疗药物，例如作为这些药物治疗作用的增强剂或作为减少这些药物的所需剂量或潜在副作用的手段。匹美莫司可与其适当地联合施用用于治疗气道炎性病变的药物包括表1中所列出的药物，例如糖皮质激素和皮质类固醇、非甾类抗炎药和支气管扩张剂。匹美莫司可与其适当地联合施用用于治疗IBD的药物包括表3中所列出的药物，尤其是皮质类固醇。适用于这种联合治疗的疾病包括例如任何需要抗炎药物治疗的疾病或病症，例如如上文所列出的疾病或病症。特别地，匹美莫司适合用于上述联合治疗，例如如A中所列的用于抗炎或抗哮喘治疗的目的，例如以实现节约类固醇的作用。

因此根据以上所述，本发明提供了：

A.在有需要的对象中治疗EID，例如如上所述特别是以气道上皮或胃肠道上皮的炎症为特征的疾病的方法，其包括向所述对象施用有效量的匹美莫司，例如，

在有需要的对象中治疗气道高反应性的方法、使支气管扩张的方法、治疗阻塞性或炎症性气道病变的方法，或治疗IBD包括UC或CD的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的匹美莫司。

例如如A所定义的本发明的方法还可以包括联合施用一种或多种例如表1或表3中所列的药物。例如，匹美莫司可与皮质类固醇联合用于接受皮质类固醇治疗的患者以降低皮质类固醇施用的水平。

本发明还提供了匹美莫司在制备用于(例如如上述A所定义的)任何方法中或用于治疗如上所列任何疾病或病症的药物中的用途，例如匹美莫司在制备用于治疗EID如以气道上皮或胃肠道上皮的炎症为特征的病变的药物中的用途，例如匹美莫司在制备用于治疗气道高反应性、用于使支气管扩张、用于治疗阻塞性或炎症性气道病变或用于治疗IBD包括UC和CD的药物中的用途。

此外，本发明提供了匹美莫司在制备以可有效治疗EID并没有全身性免疫抑制作用的量施用于患者的药物，例如用于治疗如上所述的疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了包含匹美莫司、用于例如如上述A所定义的一种方法中或用于治疗以上所列疾病或病症的药物组合物，例如包含匹美莫司、用于治疗EID如以气道上皮或胃肠道上皮的炎症为特征的疾病的药物组合物，例如包含匹美莫司、用于治疗气道高反应性、用于使支气管扩张、用于治疗阻塞性或炎症性气道病变如哮喘或用于治疗IBD包括UC和CD的药物组合物。

此外，本发明提供了包含匹美莫司、用于以可有效治疗EID但没有全身性免疫抑制作用的量向患者施用的例如用于治疗如上所述疾病或病症的药物组合物。

匹美莫司

匹美莫司(亦称为ASM981和ELIDEL)是一种具有抗炎特性的子囊霉素(ascomycin)大环内酯类衍生物，化学名为33-表氯-33-脱氧-子囊霉素。匹美莫司是一种最初被研制用于炎症性皮肤病变如特应性皮炎和银屑病的局部和口服治疗的子囊霉素大环内酯类衍生物。匹美莫司可与大环内酯亲和素-12(macrophilin-12)结合并可抑制钙依赖型磷酸酶，即钙调神经磷酸酶。因此其可抑制T细胞活化并阻断Th1和Th2炎症因子的转录及释放。匹美莫司在皮肤炎症动物模型中局部及全身应用后均表现出高水平的抗炎作用。与CyA及FK506相反，如大鼠中的移植物抗宿主反应、抗绵羊红细胞抗体的形成及肾移植(图7)显示：匹美莫司仅具有较低的削弱全身免疫反应的能力，提示匹美莫司的相对于免疫抑制的抗炎活性的治疗窗增大。未见快速免疫。

匹美莫司主要通过涉及CYP3A酶亚族催化的氧化机制的代谢而消除，所以可被这种酶亚族代谢的化合物之间存在药物-药物相互作用的可能性。反复口服施用不会导致药物在血液或组织中蓄积，也不会被肝脏中药物代谢酶诱导。人体口服匹美莫司的剂量达60mg(或30mg每日两次)、持续28天后耐受性良好。

最近，以1％乳膏形式局部施用匹美莫司用于治疗银屑病、特应性皮炎及接触性皮炎已取得了巨大的成功。在口服治疗患有中至重度蚀斑状银屑病患者的研究中也证实非常成功。匹美莫司属于大环内酯衍生物族，和其它该族成员一样，其可与大环内酯亲和素结合并抑制钙调神经磷酸酶。匹美莫司能阻断T细胞和肥大细胞的活性及炎性细胞因子的合成和释放。美国专利6,197,781和6,004,973及EP 0427680 B1、WO 01/90110 A1和WO 97/03654中公开了匹美莫司及其组合和口服制剂，所有这些专利在此引入作为参考。

“33-表氯-33-脱氧-子囊霉素”(匹美莫司)的结构

匹美莫司已在使用局部制剂治疗炎症性皮肤病变的动物模型和临床试验中得到了成功的检验。

实施例1

匹美莫司在银屑病患者中的基因表达研究

进行了一项使用匹美莫司口服制剂治疗银屑病患者的临床研究。在4周的临床研究期间对口服剂量60mg(30mg每日两次)的匹美莫司作为银屑病的治疗药物进行了评价。受试者包括10位患者，其中8位接受治疗，2位接受安慰剂。初次给药前采集血样以确定基因表达基线，并在使用匹美莫司或安慰剂治疗后第13或14天采集血样，并提交进行基因表达分析以对化合物的作用机制有所了解。临床数据证明：8位匹美莫司治疗患者的银屑病减轻。

匹美莫司口服制剂

本研究中使用的匹美莫司口服制剂按如下所示方法进行配制。匹美莫司的“固体分散体”制剂由匹美莫司(20％)、泊洛沙姆188(10％)和HPMC(70％)组成，美国专利6,004,973和6,197,781公开了此制剂的生产，这两篇专利的全部内容在此引入作为参考。此外，美国专利6,197,781和6,004,973及EP 0427680 B1、WO 01/90110 A1和WO 97/03654中公开了匹美莫司及其组合和口服制剂，所有这些专利在此引入作为参考。

匹美莫司为大环内酯类化合物，以两种假多晶型形式，即水合物(A形式)和无水形式(形式B)存在。两种形式均可被用于制备固体分散产品，在下述口服制剂中使用的是水合物(形式A)。在一个优选的实施方案中，使用了如WO 99/01458所公开的匹美莫司的无水形式(形式B)，其全部内容在此引入作为参考。

本研究中使用的口服制剂为20mg片剂，其含有：

成分	mg/剂
		匹美莫司固体分散物20％	100.0
无水乳糖	98.75
		聚乙烯聚吡咯烷酮XL	50.0
硬脂酸镁	1.25
		总片重	250.0

和20mg活性片剂配对的安慰剂片剂如下配制：

成分	mg/剂
		羟丙基甲基纤维素3CPS(Shin-Etsu)	45.0
泊洛沙姆188	5.0
		无水乳糖	148.75
聚乙烯聚吡咯烷酮XL	50.0
		硬脂酸镁	1.25
总片重	250.0

本研究中使用的剂量为60mg/天，按30mg、每日两次给药。为得到30mg的剂量，可用特殊的刀具(Tablettenteiler NR.96)将20mg片剂分割成两半以获得30mg的匹美莫司或与之相匹配的量的安慰剂。

匹美莫司的药代动力学

在本研究中涉及向人类患者多次口服施用各种剂量的匹美莫司，研究发现最大血药浓度(C_max)和血药浓度-时间曲线下面积(AUC_τ)(可测定具体给药间隔内或24小时期间内的AUC)均呈剂量相关性(见下表4)。20mg q.d.或20mg每日两次给药组的平均C_max和AUC_τ相当。假设在30mg每日两次给药组中早晚给药的AUC_τ是相同的，则计算得出的24小时内稳态平均AUC在第13天为约590ng·h/ml，在第28天为562ng·h/ml。

表4银屑病患者使用匹美莫司多次口服给药后的C_max和AUC_τ一览(为期28天)

剂量组	Cmax，b(ng/ml)平均值±标准偏差			AUCτb(ng·h/ml)平均值±标准偏差
							第1天	第13天	第28天	第1天	第13天	第28天
	5mg q.d.	8.7±2.3	9.7±2.5	9.9±4.8	23.3±13.0	44.5±18.2							35.5±15.8
10mg q.d.							25.9±8.5	21.8±7.9	24±9.2	80.6±31.4	102.8±41.4	90.9±35.4
	20mg q.d.	42.4±10.8	55.3±21.4	58.3±25.4	172.6±56.0	253.0±40.1							257.7±65.9
20mg b.i.d.							41.3±16	54.7±36.3	41.7±16.5	139.9±39.2	259.6±122.6	229.5±90.9
	30mg b.i.d.	49.1±21.6	54.5±27.0	41.1±8.4	205.8±64.0	294.9±60.1							281.0±32.8

本研究中匹美莫司被迅速吸收，全部剂量组和采血日的t_max中位数为0.8至2.0小时。达稳态时间(根据谷浓度进行评价)介于6至13天之间，这与末次给药后记录的50至100小时的长终末半衰期相一致。年龄或体重对匹美莫司的表观清除率没有影响。

本研究中，约400ng·h/ml及更大的AUC_(0-24)与目标上皮组织中显著的临床反应有关。匹美莫司30mg每日两次给药至第13天所检测的24小时内AUC为590ng·h/ml，这与临床状况的极为显著的改善和副作用或全身性免疫抑制的体征最小化，以及未出现不良副作用(如机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤或其它恶性肿瘤)有关。

本研究还确定了谷浓度和临床效果的关系。约7ng/ml及更高的谷浓度与目标上皮组织中显著的临床效果有关。但是，研究期间达到的最高的血液谷浓度中位值，即30mg每日两次给药方案至第21天时的18ng/ml，仍没有引起任何显著的副作用或全身性免疫抑制的症状，如机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤或其它恶性肿瘤。

在本研究中，当给药浓度、C_max和AUC如表4所示时，没有任何患者出现严重不良副作用。具体地讲，在任何剂量、C_max或AUC水平下，在在体格检查、血压、心电图、安全性实验室检查(血清生化)或肾功能(包括血清BUN和肌酐水平)方面均没有发现临床显著改变，并且没有出现常见的全身性免疫抑制或免疫抑制药物的特异性不良副作用，即机会性感染如那些由细菌、病毒或真菌病原体导致的感染，或淋巴增生性病变如淋巴瘤或其它恶性肿瘤。

本说明书中，术语“血药浓度”和“血清药物浓度”可交替使用，均指的是为便于实验室测定而将红细胞和白细胞分离后按照标准实验室操作常规测定的患者血样中药物的浓度。

基因表达研究

从得自研究中的每位患者的血样中提取RNA并用单独的DNA芯片进行检测，从而可以比较每位患者在匹美莫司治疗前后的基因表达。研究的主要目的是确定基因调节的情况以有助于大体上理解匹美莫司用于炎性病变的临床效果和可能的药物副作用。将稳定调节的基因按功能类别进行分类。

基因表达情况

近年来，几种技术的发展已使得随时监测细胞内大量基因转录的表达水平成为可能，这被称为“基因表达谱”。在全部基因组已知的生物体中，有可能对细胞内所有基因的转录进行分析。对于其基因组的知识日益增多的其它生物体例如人类，有可能同时监测大量的细胞内基因(参见例如Schena等人，Science，270卷，467-470页(1995)；Lockhart等人，NatureBiotech.，14卷，1675-1680页(1996)；Blanchard等人，Nature Biotech.，14卷，1649页(1996)；Ashby等人，于1996年10月29日批准的美国专利5,569,588)和蛋白(参见例如McCormack等人，Anal.Chem，69卷，767-776页(1997)；Chait-BT，Nature Biotech.，14卷，1544页(1996))。

这种技术的应用包括例如识别各种生理状态中特别是疾病状态中被上调或下调的基因。转录序列的其它用途还包括信号通路成分的分析及各种药物靶点的确定。这种应用是基于对细胞内丰富的细胞成分例如细胞内mRNA种类以及对细胞生物状态或环境中的任何实质改变所引起的任何变化的了解。这种变化包括具体的药物治疗或治疗方案。

因此，对这些基因表达谱进行测定可提供有关大量(暴露于具体药物其表达不被调节或被下调的)基因的转录活性的即时信息。因此这些资料含有丰富的有关具体药物的性质和作用的信息，此外，这种基因表达谱可通过具体药物的具体治疗而被特异性地测定。

在研究匹美莫司的作用的研究中进行的基因表达谱研究得到了稳定的匹美莫司基因组谱(约160个基因)。研究显示：该化合物可下调血细胞中与大环内酯目标途径(大环内酯亲和素-12)、细胞活化和增殖(组蛋白2，组蛋白3.3，细胞周期蛋白D2)有关的基因的表达，并可显著下调炎性介质(白细胞三烯A4水解酶、前列腺素内过氧化物合酶)的表达。临床上观察到的匹美莫司的疗效也可能是由于对炎症部位趋化作用和细胞迁移所需基因的急剧下调所致，包括白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、P-选择蛋白配体和L-选择蛋白。

本研究中特别重要的是：发现了除匹美莫司的常见的强大抗炎作用外，通过施用匹美莫司还可以特异性地、显著地下调若干已知与哮喘和IBD病理生理学有关的基因。与哮喘相关的基因包括：

●RANTES，在特应性哮喘患者的嗜酸性粒细胞中表达(参见Raychaudhuri等人，Acta.Derm.Venereol.，79(1)，9-11页(1999))并且可见于肺炎和哮喘中(参见Chihara等人，J.Allergy Clin.Lmmunol.，100(6)，第2部分，S52-S55页(1997)；Alam等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，153(4)，第1部分，1398-1404页(1996))。此外，在小鼠哮喘模型中拮抗RANTES已显示可阻断过度反应和嗜酸性粒细胞汇集(参见Gonzalo等人，J.Exp.Med.，188(1)，157-167页(1998))。

●在哮喘中被上调的GALECTIN-3(参见Monteseirin等人，J.Exp.Med.，183(6)，2571-2579页(1996))。

●在哮喘中可引起支气管收缩的血栓素A2受体(参见Shen等人，J.Biomed.Sci.，5(3)，153-172页(1998))。

●随哮喘患者血液中嗜酸性粒细胞数量增加而增加的谷光甘肽过氧化物酶(参见Misso等人，J.Leukoc.Biol.，63(1)，124-130页(1998))。

这些发现明确提示：匹美莫司是高度有效的用于哮喘及其它炎性病变包括IBD的治疗药物。治疗前后患者外周血的基因组分析显示出稳定的匹美莫司基因组特征。数据显示：匹美莫司可经多个靶点发挥作用并且具有强大而广泛的抗炎活性。许多在匹美莫司治疗后经表达谱识别的标记物表明：匹美莫司用于哮喘和IBD的治疗非常有效。

炎症的进展需要细胞迁移至炎症部位，而匹美莫司可削弱迁移的多个步骤如化学吸引、白细胞汇集、牢固粘附于内皮及渗出。

下调化学引诱物RANTES有助于防止新的炎性细胞到达炎症部位。对RANTES表达的下调作用特别有意义，是由于它完全符合所报道的匹美莫司的体外活性，即减弱炎症介质的释放、减弱IgE启动因子的活性、减弱T细胞的活化和增殖(参见Bochelen等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，288(2)，653-659页(1999))。

L-选择蛋白和P-选择蛋白配基、白细胞汇集过程中的关键分子也被下调。P-选择蛋白配体可与各种凝集素结合并且可参与细胞/内皮相互作用。这种蛋白是转录后修饰的，其中一种修饰变体被称作皮肤淋巴细胞抗原(CLA)。CLA被认为是将淋巴细胞导向皮肤或其它上皮组织的原因。CLA的下调也可减少渗出部位的淋巴细胞的迁移。

匹美莫司也可下调细胞支架蛋白的合成，从而削弱细胞的活动性。此外，主要的酶例如前列腺素内过氧化物合酶和白细胞三烯A4水解酶也被下调。激肽生成抑制剂Kallistatin被上调。因此，匹美莫司的作用似乎是有效地阻断循环细胞的致炎能力。

综合以上数据显示：匹美莫司可下调：

●大环内酯亲和素调节途径

●细胞活化和增殖

●HLA表达

●炎症部位的细胞迁移

●炎症

在表达谱中没有发现明显的毒性作用。没有发现与可能的不良作用或毒性途径有关的基因被调节。匹美莫司对RANTES、粘附分子和炎症蛋白(例如造成哮喘支气管收缩的血栓素A2受体)的强大的作用综合显示：匹美莫司在哮喘的治疗中是有效的。

显示匹美莫司对肺嗜酸性粒细胞增多大鼠的作用的研究提供了匹美莫司对哮喘的效果的直接依据。一项研究考察了匹美莫司对空气过敏原引起的嗜酸性粒细胞向敏感小鼠的肺内汇集的抑制作用。此研究发现：匹美莫司口服施用后可减少肺内嗜酸性粒细胞的数量并降低嗜酸性粒细胞过氧化物酶的活性。

另一项研究考察了口服施用匹美莫司对活动的致敏Brown Norway大鼠中抗原诱导的肺部嗜酸性粒细胞增多的作用。此研究发现：当以微乳剂或溶入Neoral安慰剂口服施用时，匹美莫司是有效的。

除了发现匹美莫司可下调众多已知与哮喘的病理生理学有关的基因外，在该药临床试验期间还获得了一个意想不到的发现，即原先未知的匹美莫司的特性。这个发现涉及匹美莫司的特性，所述特性表明：该药用于哮喘和常见EID如IBD具有独特的疗效，并且可取代哮喘或IBD治疗方案中的部分或全部糖皮质激素或皮质类固醇或免疫抑制剂，从而显著降低由于使用这些药物控制严重或慢性哮喘或IBD而导致的副作用。此发现明确显示：与通常的全身性作用相比，匹美莫司优选在上皮组织中发挥其抗炎作用。匹美莫司用于银屑病的研究显示：该药具有皮肤选择性抗炎作用，并且由于其独特的分子特性(包括但不限于其亲油性)，其通常对皮肤和上皮组织具有优先亲和力。

匹美莫司在皮肤炎症的动物模型中局部和全身给药后均非常有效。当局部应用时，可渗透通过人(和动物)皮肤的匹美莫司与例如FK506和皮质类固醇相比分别低9倍和60至120倍，显示匹美莫司进入体循环的能力较低，因此产生全身性副作用的能力也较低。众所周知，糖皮质激素为非选择性药物，因此无论局部应用还是全身应用都与许多全身作用和多种副作用有关。这和匹美莫司相反。

匹美莫司的意想不到的上皮选择性的例子见图7，图7显示匹美莫司和CyA及FK506在ACD小鼠模型和一系列全身性免疫抑制动物模型(如肾移植、移植物抗宿主反应及抗体形成)中的比较。在左上图中，用于ACD时口服匹美莫司的效果是口服CyA的效果的2倍以上并且(左下)优于FK506。但是，在一系列移植和接种模型中，匹美莫司与CyA(右上)或FK506(右下)相比显示出极小的常见全身性免疫抑制作用。

在大鼠中进行的比较研究显示：和其它药物如FK506相比，匹美莫司(q.d.皮下(s.c.)施用)的皮肤抗炎作用相对全身免疫抑制的治疗窗明显增大。由于3个全身性免疫抑制模型中有2个包括皮下应用(＝类似于100％透皮给药)，所以这些结果对于局部应用也是适用的。

另一项对匹美莫司和FK506单次及多次口服给药后在大鼠中的组织分布的研究发现：与FK506相比，匹美莫司对皮肤的亲和力高于对体内任何其它器官的亲和力。

在为探究匹美莫司和FK506之间的差异并确定这些差异是否与不同的组织分布有关而设计的另一项研究中，测定了口服给药后各种器官中分布的匹美莫司和FK506。间隔2小时两次向动物口服施用25mg/kg的剂量。末次给药后2、6及24小时通过HPLC-MS测定不同组织中(包括真皮、皮下组织、血液、肾、淋巴结)的浓度并计算AUC-时间曲线。研究发现匹美莫司的皮肤/血液浓度比持续地高于FK506的皮肤/血液浓度比(2小时：7.3比2.8；6小时：13比1.6；24小时：36比6.0)。计算得出的匹美莫司的皮肤AUC_0-24h为FK506的两倍。在所有其它组织包括血液、淋巴结和肾脏中，匹美莫司的暴露低于FK506。

综上所述，这些数据提示：匹美莫司对皮肤的亲和力比FK506高，并且此发现与所观察到的匹美莫司的皮肤选择性药理学性情况相一致(参见Stuetz等人，Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery，20卷，233-241页(2001))。

所得到的增大的治疗窗在近期研究中也被证实，所述研究比较了ACD的敏感期和激发期期间匹美莫司和FK506对皮肤炎症和淋巴结的影响，研究显示：匹美莫司主要在皮肤中干预炎症，而FK506主要作用于皮下淋巴组织(参见Meingassner等人，J.Invest.Dermatol.，付印中(2002))。

与药理学观察结果一致，在大鼠中的分布研究(口服应用)已显示：匹美莫司对皮肤的亲和力高于FK506，对淋巴结的亲和力低于FK506。这些分布特征不仅与口服应用有关，而且与局部应用也有关，因为匹美莫司通过皮肤渗透后可进入体循环。

综上所述，这些数据证明：匹美莫司经局部或口服应用后具有皮肤选择性的分布模式并且在皮肤中的抗炎活性显著较高，与其它免疫抑制剂例如FK506相比具有明显差异。

对于常见EID如哮喘和IBD的治疗而言，非常重要的发现是匹美莫司对于皮肤上皮组织的优先作用也适用于其它上皮组织，如在肺内覆盖气道内表面的上皮组织和覆盖胃肠道内表面的上皮组织或粘膜。这是意料之外的发现并且仅可在匹美莫司临床研究期间被发现。

该发现提示了匹美莫司的显著特性并且显示：无论是全身还是局部(即在哮喘治疗中通过吸入剂或在IBD的治疗中通过灌肠剂或栓剂)施用匹美莫司在肺或胃肠道上皮组织内产生的抗炎作用与常见全身性抗炎作用或全身性副作用相比将明显较大。如匹美莫司治疗银屑病的研究中所明确证实的，这种作用的差异将在治疗哮喘时于肺内或治疗IBD时于胃肠道内导致相同类型的增大的抗炎作用治疗窗。

因此，给定剂量的所述药物无论是经口服或经吸入或经直肠给药都将在肺部或胃肠道上皮组织中产生有效的抗炎作用，但产生更少的常见全身性作用或全身性副作用。这使得可在患有EIDs如哮喘或IBD的患者中使用高剂量的匹美莫司，而不必考虑全身性副作用对剂量的限制。因此，匹美莫司用于EID如哮喘或IBD的治疗时与糖皮质激素或其它免疫抑制剂同样有效或更为有效，而总体副作用较低。

此外，匹美莫司可以替代既定的需要糖皮质激素和/或免疫抑制剂的EID如IBD或哮喘的治疗方案中的全部或至少一部分(否则)必需的糖皮质激素或免疫抑制剂，因此可使用较低剂量的糖皮质激素和/或免疫抑制剂并得到相同或甚至更高的效果。这种所谓的“节约类固醇作用”或也许是“节约免疫抑制剂作用”对于将糖皮质激素或免疫抑制剂治疗的不良作用减至最小具有巨大的价值。

因此，对被下调的炎症相关基因和对上皮及相关组织中的优先作用的大型研究证明：匹美莫司对于任何其中出现于上皮组织的炎症过程是症状或发病原因或其中上皮或相关组织(例如粘膜或粘液膜)的炎症在疾病(即EIDs)的病理或发病机理中发挥突出作用的其它疾病也是唯一有效的治疗方法。

匹美莫司的这种新的意想不到的特性将在所述“EID”的治疗中通过产生“治疗窗”作用而形成在匹美莫司的使用中迄今未被认识到的优势，所述“治疗窗”作用即在发炎的上皮或相关组织中可获得显著的治疗作用但却产生极小的全身性作用包括不良副作用。匹美莫司的这种治疗优势将与通过施用任何其它不具有匹美莫司的上皮组织选择性的抗炎或免疫抑制药物而在已知EID中产生同等治疗效果形成对比。这将包括但不限于皮质类固醇、其它免疫抑制剂如CyA或FK506。

实施例2

匹美莫司治疗IBD动物模型

如上所述，经口服施用匹美莫司在人银屑病的治疗中是有效的。银屑病和IBD(即CD和UC)具有共同的潜在病理机制，其涉及Th1型的致病T细胞的活化和扩增。这提供了将现有的口服形式的匹美莫司用于单纯IBD小鼠模型的研究的理论基础。

如上所讨论，匹美莫司的作用的“上皮选择性”方面已通过观察到匹美莫司在皮肤炎症动物模型呈现出高度的抗炎作用、但和CyA及FK506相比却仅具有较低的全身性免疫抑制而被显示。

成熟的IBD动物模型是存在的(参见Leach等人，Am.J.Pathol.，148(5)，1503-1515页(1996)，及Powrie等人，Int.Immunol.，5(11)，1461-1471页(1993))。已知将同源基因的原T淋巴细胞(CD4⁺CD45RB^Hi)转移至SCID小鼠可导致严重的结肠炎和消耗性疾病SCID-IBD(严重联合免疫缺陷病——炎症性肠病)。从组织病理学的角度讲，CD和UC的特征均体现在本模型中，所述模型在整个90年代中被用来使人们对这种人类免疫调节异常疾病的病理病因学(pathoetiology)的理解达到目前的状态。没有其它IBD动物模型被认为在机制和临床治疗有效性方面均和人类疾病相适应。迄今为止，此模型已被用于显示阻断TNF-α、IL-12和IFN-γ的抗体具有部分的和短暂的保护作用。最近，CD134配体(OX40L)、CD154和β7粘合素或MAdCAM-1抗体的有益作用也已被报道。CyA和地塞米松均可抑制本模型中的结肠炎，但所使用的剂量与严重毒性作用有关。此外，CyA治疗与淋巴细胞数量的普遍降低有关，反映了其在此模型中的强大的免疫抑制活性。

本研究中，使用的是用CD4⁺CD45RB^HiT淋巴细胞重构的SCID小鼠。如上所述，已知这些小鼠可产生和人IBD特征相似的慢性结肠炎。如上所述，匹美莫司是一种在炎症性皮肤病变动物模型和患有变应性皮炎或银屑病的患者中具有确切疗效但没有FK506或CyA样的全身性免疫抑制作用的免疫调节剂。本研究的目的是对匹美莫司在SCID-IBD模型中的作用进行评价并与CyA进行比较以便评价匹美莫司在这种疾病中的“上皮选择性”作用。

本研究中，用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠，随后用匹美莫司(30、60和100mg/kg/天)或赋形剂每日口服进行治疗，为期4周。为进行比较，使另一组小鼠经微型渗透泵接受CyA皮下给药(15、30和60mg/kg/天)。全程监测体重。研究结束时，采集血液，摘除脾、肠系膜淋巴结(MLN)和结肠。检测血清结合珠蛋白水平(ELISA)，对结肠炎进行组织学评价并且根据血液、脾及MLN细胞悬液的FACS分析结果计算淋巴细胞和中性粒细胞的数量。

本研究的结果显示：在3项研究(n＝24只小鼠)中的对照SCID-IBD小鼠在T细胞转移后4周体重减轻了原体重的15至18％。用匹美莫司治疗(30、60和100mg/kg/天)的小鼠的体重减轻了7.1、8.8或3.2％，但CyA治疗甚至引起未经转移的SCID小鼠的体重减轻。

因此，在这种小鼠模型中，致病T细胞转移后随即口服施用匹美莫司为期4周，可以以剂量-效应方式在30至100mg/kg/天的剂量范围内防止与疾病有关的严重的体重减轻。相比之下，CyA剂量依赖性地(经微型泵施用60、30和15mg/kg/天)使体重减轻进一步加重(见图1和图2)。

为了确定ASM981治疗在SCID-IBD小鼠中预防肠粘膜损伤的有效性，根据所定义的形态学参数对结肠切片进行了组织学检查。根据方案对全部结肠切片进行评价，所述方案根据细胞渗透和炎症的程度判定严重程度，最高分数为8。

在安慰剂治疗组SCID-IBD小鼠中观察到的严重结肠炎显著地被ASM981治疗所抑制。用ASM981治疗的小鼠在剂量为100mg/kg/天时可重现性地发现结肠仅轻度发炎，但剂量为60和30mg/kg/天时则分别产生中度和中至重度炎症。CyA 60mg/kg/天的大剂量治疗也是有效的并且炎症评分为轻度，然而30mg/kg/天治疗则产生轻至中度炎症。低于30mg/kg/天的剂量未能显著地抑制结肠炎(见图3)。

地塞米松治疗也可抑制结肠炎但所需剂量(口服3和10mg/kg/天)和类固醇相关性的体重快速减轻有关。此外，CyA和地塞米松均强烈抑制血液、脾和MLN中淋巴细胞数量，没有观察到匹美莫司有此作用，提示匹美莫司剂量为100mg/kg/天时尽管可极为有效地抑制进展中的结肠炎，但却不具有CyA和地塞米松的常见免疫抑制特性。

匹美莫司治疗还可以以剂量依赖方式改善腹泻，即严重结肠炎的特征。在100mg/kg/天治疗组中约半数小鼠的粪便正常。总之，用匹美莫司对SCID-IBD小鼠进行治疗，匹美莫司以剂量依赖方式减轻了结肠炎的严重程度。相反，CyA仅在高剂量时有效，所述大剂量可导致毒性全身性副作用(参见图3-用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于1天后开始治疗。匹美莫司每日经口服给药，CyA(以SANDIMMUN^形式)经微型渗透泵给药。全部研究于29天后终止，在那时清洗一段结肠并用福尔马林溶液固定、嵌入石蜡、以3μm厚度切片、用H&E(苏木精及曙红)染色并且用0(无影响)至8(重度)级标准进行评分。最高分为8，非转移小鼠评分为0。箱形图显示了每组(n＝7或8)分数的中位数、平均数和标准偏差。)

匹美莫司治疗强烈地抑制了全身性炎症，所述全身性炎症是通过急性期反应蛋白(血清结合珠蛋白)检测并通过血液及脾中的中性粒细胞增多而确定的。

在SCID-IBD小鼠中被提高的结合珠蛋白的生成在匹美莫司治疗小鼠中、在30-100mg/kg/天的剂量范围内被显著地降低了68％至92％，同样，血液和脾中的中性粒细胞增多分别被降低了85％至96％和74％至83％。CyA治疗产生了相似的抑制水平但仅在30和60mg/kg/天的最大剂量时有显著性(见图4和图5)。

中性粒细胞渗透进入结肠是人IBD和SCID-IBD模型的共同特点。结肠匀浆中的髓过氧化物酶活性的程度与结肠中中性粒细胞的数量相关。使用这项技术发现：匹美莫司剂量为100mg/kg/天时中性粒细胞向结肠的渗透被完全阻断，而剂量为60mg/kg/天时被阻断72％(见图6)。CyA治疗也显著地降低了发炎结肠中的MPO活性。剂量为30、15和7.5mg/kg/天时，MPO活性分别被抑制79.8％、66.5％和30.2％(见图6)。

匹美莫司治疗的全身性作用和选择性治疗作用之间的明显的差异通过事实而体现，所述事实即在这些研究中浓度不超过100mg/kg/天的匹美莫司没有显著地影响血液和脾中淋巴细胞的数量但在MLN中检测到淋巴细胞数量的显著下降。相反，CyA治疗小鼠在剂量为60、30和15mg/kg时的血液、脾和MLN中的淋巴细胞数量降低(见图8和图9)。这种结果提示：治疗剂量的匹美莫司没有CyA的强大的常见全身性免疫抑制作用和副作用。

这些结果显示：由于化合物在体内对上皮组织(此处为对胃肠道粘膜)的选择性分布，匹美莫司没有CyA的常见全身性免疫抑制活性。

延迟治疗结果

为判断一旦IBD被确定匹美莫司是否也是有效的，于致病CD4⁺T细胞转移后的第7、14或21天用剂量水平为100mg/kg/天的匹美莫司对SCID小鼠进行治疗。41天后终止研究，即小鼠分别被治疗33、26和19天。结果见图10至图12，并且描述如下。

图10显示：匹美莫司对于扭转与确定的/进展性轻至重度结肠炎有关的体重减轻是高度有效的。用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于7、14或21天后开始匹美莫司治疗(口服100mg/kg/天)并持续每日治疗至第41天。安慰剂制剂治疗开始于7天后。前2周每周1次、随后每两周一次监测BW。将数据表示为每组小鼠(n＝9(PBS)、n＝8(ASM(7天)及ASM(21天))及n＝7(ASM(14天)及安慰剂))体重和第0天的体重相比的百分比的平均值±标准误差。PBS指的是非转移小鼠，其体重百分比值被作为对照，因为在其中没有发现与治疗相关的改变。41天时相对于安慰剂治疗组P＜0.01。

图11显示：如对结合珠蛋白的抑制作用所示，匹美莫司可抑制患有确定的IBD的SCID小鼠的进展性急性期反应。用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于7、14或21天后开始匹美莫司治疗(口服100mg/kg/天)并持续每日治疗至第41天。安慰剂制剂治疗开始于7天后。第41天时将小鼠处死，保留血清用于结合珠蛋白检验。将数据表示为每组小鼠(n＝9(PBS)、n＝8(ASM(7天))及n＝7(ASM(14天)、ASM(21天)及安慰剂))的平均结合珠蛋白(mg/ml)±标准误差。PBS指的是非转移小鼠，其结合珠蛋白值被作为对照，因为没有在其中发现与治疗相关的变化。41天时相对于安慰剂治疗组P＜0.01。

图12显示：匹美莫司可强烈地抑制与确定的/进展性结肠炎有关的血液和脾中的中性粒细胞增多。用2×10⁵CD4⁺CD45RB^HiT细胞重构SCID小鼠并于7、14或21天后开始匹美莫司治疗(口服100mg/kg/天)并持续每日治疗至第41天。安慰剂制剂治疗开始于7天后。第41天时将小鼠处死，去除血液和脾，制成细胞悬液并用相应抗体孵化通过FACS分析以确定中性粒细胞的数目。将数据表示为每组n只(每柱中的n)小鼠的平均中性粒细胞数±标准误差，其平均中性粒细胞数由每个样本的阳性细胞的百分比和细胞总数计算得出。相对于安慰剂治疗组计算P＜0.05。

本研究的总体结论为：匹美莫司治疗可剂量依赖性地减轻SCID-IBD小鼠的病变，和CyA相反却没有抑制循环淋巴细胞的增殖功能，这一发现和银屑病试验中所见的匹美莫司的上皮选择性功能相一致。匹美莫司的强大的选择性抗炎作用显示：匹美莫司用于IBD的治疗具有巨大的早先未被认识到的潜力(参见Moore等人，在第11届国际粘膜免疫学大会时提交“匹美莫司在SCID小鼠模型中具有显著的IBD抑制作用”，2002年6月16至20日，奥兰多，佛罗里达，美国)。

哮喘的临床评价

作为本发明方法的一部分，可根据下列方案对临床情况和症状的程度进行评价。

哮喘严重性的评价

任何特定患者的哮喘的严重性的临床情况包括对每次发作的性质和严重程度的客观检测以及哮喘发作的次数和频率的因素。临床医师根据一些标准评价任何特定(归因于哮喘的)发作的严重性。这种评价已为临床医师所熟知并且遵循下列步骤。本评价方案取自希氏内科学(Cecil Textbookof Medicine)，第21版，Goldman及Bennett编辑，W.B.Saunders出版公司，费城，宾夕法尼亚州，第74章(2000))。

体格检查和实验室检查

体格检查时临床医师将注意很多急性哮喘发作的共同特征，包括快速的呼吸频率(通常25至40次呼吸/分钟)、心动过速和奇脉(收缩压在吸气期过度下降)。脉搏的量值与发作的严重程度有关。

患者胸部的望诊可揭示患者使用他们的辅助肌肉进行换气。如果这种情况发生，胸部表面的皮肤在呼吸过程中会缩入肋间隙。这是严重哮喘发作的指征。此外，胸部可见隆起，并且呼气相相对于吸气延长。胸腔叩诊显示反响过强，由于膈移动使得浊音的正常变化消失。胸部听诊显示喘鸣，这是哮喘的首要体检。喘鸣以同时可听见多于一种音调的复调为特征，通常呼气期间为高调但吸气时也可听见。伴随的偶发声音可包括提示气道内腔没有分泌物的干罗音，或指示为局部感染或心衰的痰鸣音。哮喘患者的呼吸音的强度降低或消失是严重气流阻塞的象征，因此为严重发作。

哮喘发作的严重程度的评价还包括临床医师对实验室检查的评价，并且很可能这些检查中最重要的是一组肺功能检查的结果。基本的理解即肺活量的气流速度的下降是哮喘发作时最重要的肺功能异常，可将这些检查的解释单纯化。呼气流速峰值(PEFR)、第一秒用力呼气容积(FEV₁)和最大中段呼气流速(MMEFR)在哮喘时均降低并且这些参数较正常值(对该患者而言)的改变程度是对严重性的最准确的评价。

在非常严重的哮喘中，呼吸困难可如此严重以至于可妨碍患者完成一次完整的呼吸描记图(spirogram)。这种情况下，如果可记录2秒内的用力呼气，就可获得有用的PEFR和FEV₁值。发作严重程度的评估如表5所示必须通过气流的客观检测结果来评价。发作减轻时，PEFR和FEV₁均升高趋于正常值但MMEFR仍保持显著降低；当发作进一步减轻时，FEV₁和PEFR归于正常但MMEFR保持降低。甚至当发作已经达到临床缓解时，MMEFR的残余降低也并不罕见，这种降低经过长期治疗可被缓解。如果患者能够配合以便进行更完全的肺功能检查，则肺容积测定将证实总肺活量(TLC)和残余容积(RV)均升高，TLC和RV的改变随治疗而缓解。

表5PEFR、FEV₁和MMEFR所显示的哮喘发作的相对严重程度

检查	预测值的百分比	哮喘严重程度
			PEFRFEV1MMEFR	≥80％≥80％≥80％	无肺活量的异常
PEFRFEV1MMEFR	≥80％≥70％55-75％	轻度哮喘
			PEFRFEV1MMEFR	≥60％45-70％30-50％	中度哮喘
PEFRFEV1MMEFR	＜50％＜50％10-30％	重度哮喘

PEFR＝峰值呼气流速

MMEFR＝最大中段呼气流速

FEV₁＝第一秒用力呼气容积

动脉血气

在严重哮喘的情况下，动脉血气的检测可提供一些严重程度的辅助指征。轻度哮喘的病例无需进行血气分析。如果哮喘足够严重，则必须进行血气分析，并且其将可能显示低氧血症和低碳酸中毒。呼吸室内空气的患者，其PaO₂通常为55至70mmHg，PaCO₂为25至35mmHg。在发作初期，通常具有明显的适当的单纯性呼吸性碱中毒；随发作时间延长，pH由于代偿性代谢性酸中毒而归于正常化。在患有中度至重度气流阻塞的患者中应关注PaCO₂是否正常，因为它可预示显示呼吸系统承受的机械负荷超过了可被呼吸肌维持的机械负荷并且呼吸衰竭即将出现。

当PaCO₂在这种情况下升高时，因为碳酸氢钠储备由于肾脏对长期的先前的呼吸性碱中毒的代偿作用而已被逐渐耗竭，所以pH迅速下降。由于这一连串事件可迅速发生，所以必须对具有“正常”PaCO₂水平的中度至重度气流阻塞的哮喘患者进行密切观察。

其它实验室发现在确定具体发作的严重程度时是次要值，但它们可用于更为慢性的病情的评价。哮喘患者常常是过敏体质，因此常见血嗜酸性粒细胞增多。此外，由于流行病学研究显示哮喘不常出现于IgE水平低的患者中，所以经常对升高的IgE的血清水平进行评价并且将其作为慢性哮喘的评价标准。出于同样的原因，可进行特异性放射过敏原吸附试验(RASTs)，检测直接对抗具体的攻击性抗原的IgE。在严重哮喘发作期间罕见升高的氨基转移酶、乳酸脱氢酶、肌肉肌酸激酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶及抗利尿激素的血清浓度。

哮喘患者的胸部射线照片通常是正常的，因此几乎对严重程度的评价没有帮助。但是，如横膈下降和异常透明的肺部视野所示，严重哮喘与过度充气有关并且过度充气可通过胸部摄片确定。此外，严重哮喘的并发症，包括纵隔积气或气胸，可经X线摄片观察到。

除窦性心动过速外，急性哮喘时心电图通常也是正常的。但是严重哮喘期间可出现电轴右偏、右束支阻滞、“肺型P波”或甚至ST-T波型异常，并且随哮喘缓解而缓解，这些发现也可用于确定严重程度。

对于没有共存致病(co-morbid)病症、患有(伴随血液嗜酸性粒细胞增多的)加剧和减轻的气道阻塞的年轻患者而言，哮喘易于识别。对支气管扩张剂治疗的迅速反应通常足以确诊。可通过使用以上技术对严重程度而进行评价，但是迄今为止最重要的方法是进行肺功能检查，对其的解释在表1中给出。

药物组合物

本发明的药物组合物优选作为包含治疗药物和一种或多种可药用的载体的组合物被施用。组合物可被单独施用或与至少一种其它试剂如起稳定作用的化合物联合施用，其可在任何无菌的、生物相容的药用载体(包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水)中被施用。组合物可被单独施用或和其它试剂、药物和激素联合施用于患者。

本发明的药物组合物可通过许多途径被施用，包括但不限于口服、以气雾剂或粉剂形式吸入、静脉内、肌肉内(i.m.)、关节内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠方式等。

除活性成分外，这些药物组合物还可包含适宜的可药用的载体，所述载体包括有利于将活性成分加工为可药用制剂的赋形剂和佐剂。在一个优选的实施方案中，赋形剂包括无水乳糖、聚乙烯聚吡咯烷酮XL和硬脂酸镁。更多的用于制剂和给药的技术细节可见于最新版的Remington的“药物科学(Pharmaceutical Sciences)”，Maack出版公司，Easton，PA。

用于口服施用的药物组合物可使用本领域内熟知的、用量适宜于口服施用的可药用的载体制备。这些载体能使药物组合物被制备成用于被患者摄入的片剂、丸剂、气雾剂、干粉剂、糖衣丸、胶囊、液体制剂、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等。

用于口服使用的药物制剂可通过将活性成分和固体赋形剂进行混合，任选将得到的混合物研磨并在(如果需要)加入适宜的辅料后对颗粒混合物进行处理以得到片剂或糖衣丸核。

在本发明的方法中使用的优选的匹美莫司的口服制剂可按上述方法制备。匹美莫司的“固体分散体”制剂由匹美莫司(20％)、泊洛沙姆188(10％)和HPMC(70％)组成，并且这种制剂的制备公开于美国专利6,004,973和6,197,781中，二者的全部内容在此引入作为参考。此外，美国专利6,197,781和6,004,973及EP 0427680 B1、WO 01/90110 A1和WO97/03654中公开了匹美莫司及其组合和口服制剂，所有这些专利在此引入作为参考。

此外，匹美莫司为大环内酯类化合物，以两种假多晶型形式，即水合物(形式A)和无水形式(形式B)存在。两种形式均可被用于制备固体分散产品，在以上公开的口服制剂中使用的是水合物(形式A)形式。在一个优选的实施方案中，使用的是如WO 99/01458所公开的匹美莫司的无水形式(形式B)，所述专利的全部内容在此引入作为参考。

用于局部或经鼻施用时，制剂中可使用适合于待渗透的具体屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。使用本领域内已知的技术，也可将匹美莫司配制成用于吸入施用的气雾剂。本发明的药物组合物可依照本领域已知的方式，例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨(levigating)、乳化、胶囊化、包埋(entrapping)或冻干处理的方法生产。药物组合物被制备后，可将其置放于适宜的容器内并且贴上标签用于指定病情的治疗。这样的标签包括施用量、施用频率和施用方法。

II-2报道基因分析

美国专利5,897,990中公开并授权了本分析方法，其全部内容在此引入作为参考。为测定治疗期间全身性免疫反应作用的量或具体的免疫抑制剂(例如治疗期间患者体液中的匹美莫司、CyA、FK506或皮质类固醇)的浓度，使用了用于监测影响基因表达的免疫抑制剂(包括但不限于子囊霉素，例如匹美莫司)在体液中的活性的分析方法，所述方法使用报道基因分析法，例如用于具有免疫抑制作用的环孢菌素、皮质类固醇和子囊霉素的IL-2报道基因分析或用于具有免疫抑制作用的雷帕霉素的c-jun报道基因分析。

在本发明方法中使用的报道基因分析中，创建了一个包含报道基因的嵌合基因构筑体，所述报道基因处于(被待监测的免疫抑制剂例如匹美莫司、CyA、FK-506、AZA或皮质类固醇影响的)人细胞因子基因启动子的转录控制之下，并将该构建体引入适宜的细胞系。细胞系优选为人T细胞或巨噬细胞系(例如Jurkat细胞系)，优选所需基因产物可高度自然生成的细胞系，例如在IL-2报道基因分析的情况下对刺激产生反应可生成IL-2。报道基因是可表达易于观察的产物的任何基因，所述产物例如酶标记物如β-半乳糖激酶或荧光素酶，或任何其它适宜的酶标记物。例如当酶标记物为β-半乳糖激酶时，报道基因为例如细菌lacZ基因；当酶标记物为荧光素酶时，所述基因为例如Phorinus荧光素酶基因。另一种适宜的标记物为例如如Chalfie等人在“Science”，263卷，802-805页(1994)中所述的由生物荧光海蜇产生的绿色荧光蛋白的基因。启动基因为其转录被待监测药物所刺激或抑制的细胞因子或蛋白的启动基因。

例如，当待监测的免疫抑制作用由匹美莫司、CyA、FK-506、AZA或皮质类固醇产生时，启动基因可以是哺乳动物的IL-2、TGF-β、IFN-γ或IL-4的启动基因，这是因为已发现这些药物可抑制这些细胞因子在哺乳动物中的基因表达。优选地，当待监测的免疫抑制作用由匹美莫司、CyA、FK-506、AZA或皮质类固醇产生时，启动基因为人IL-2的启动子。

将患者的血样稀释，并对它们在上述系统中对基因表达的作用进行测量，使用已知浓度的免疫抑制物质作为分析的标准。对基因表达的抑制作用在低浓度时呈剂量依赖性，并且应用此系统例如可以检测浓度低于0.01ng/ml的匹美莫司。在此分析中，达50％的抑制(IC₅₀值)所需匹美莫司的浓度为1.5nM，相比之下FK506的IC₅₀值为1.0nM。因此，IL-2受体分析技术可被用于测定和比较由各种药物产生的免疫抑制的总体全身性水平及具体的免疫抑制剂(包括但不限于匹美莫司、CyA、FK-506、AZA或皮质类固醇)的浓度。

从本分析方法的另一方面而言，当患者接受免疫抑制药物的组合时，报道基因分析法可以以具体的免疫抑制剂为目标，通过使用特异性的亲和分离技术例如采用特异性(多克隆或单克隆，优选单克隆)抗体或特异性的这种免疫抑制剂的受体(例如CyA的亲环蛋白、FK-506或雷帕霉素的FKBP-12或皮质类固醇的特异性受体)剔除或抑制其它免疫抑制剂，并且随后检测剩余的免疫抑制剂。特别地，当使用皮质类固醇和抑制IL-2基因的免疫抑制药物(例如匹美莫司或FK506或CyA)的组合对患者进行治疗时，首先需要剔除皮质类固醇。

例如，当患者(例如哮喘或IBD患者)接受匹美莫司加皮质类固醇(例如泼尼松)时，匹美莫司浓度可通过以下步骤检测：自患者体内取血，使血液与用泼尼松的单克隆抗体包衣的小球相接触，随即将血液与小球分离，进行IL-2报道基因分析检测血液中IL-2基因表达的抑制，并且和已知浓度的匹美莫司中观察到的抑制水平进行比较。其它可与环孢菌素或子囊霉素联用的药物例如AZA、布喹那、desoxyspergualine和雷帕霉素，在治疗浓度例如低的纳摩尔浓度下不影响IL-2报道基因分析，因此无需剔除。

子囊霉素(包括匹美莫司和雷帕霉素)可与细胞内大环内酯亲和素结合(例如结合FK的蛋白或FKBP-12)，而环孢菌素和亲环蛋白结合。通过使用过量的非免疫抑制的亲免素结合竞争剂进行治疗或通过(例如通过热处理)使亲免素变性而使这些化合物从它们各自的亲免素中被释放出来。适合作为免疫抑制性环孢菌素的结合竞争剂使用的非免疫抑制性亲环蛋白结合型环孢菌素在EPA 484,281中被述及。适合作为免疫抑制性大环内酯类化合物的结合竞争剂使用的非免疫抑制性大环内酯亲和蛋白结合型大环内酯类化合物(如雷帕霉素和子囊霉素)在WO 94/18207中被述及，这两篇专利的全部内容在此引入作为参考。

除IL-2报道基因分析外，免疫抑制剂如匹美莫司和FK-506的浓度可通过混合淋巴细胞反应进行检测(参见Meo，“小鼠的混合淋巴细胞反应(The MLR in the Mouse)”，免疫学方法，Lefkovits及Pernis编辑，227页，Academic出版社，纽约)。在MLR分析中，匹美莫司的IC₅₀值为9.0nM，而FK506的IC₅₀值为1.0nM，两者之间存在9倍的差异。

参考文献

所有在此引用的文献其全部内容在此引入作为参考，其引用程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被特别并单独地指出其全部内容被引入作为参考。此处对参考文献的讨论仅仅是为了对它们的作者所作出的声明进行概括，并非承认任何参考文献都构成现有技术。申请人保留对引用的参考文献的准确性和相关性进行质疑的权利。

本发明不受本申请中所述的具体的实施方案的限制，所述实施方案仅作为本发明的个别方面的单纯的例证。如本领域技术人员所了解的，在不背离本发明的原则和精神的情况下，可对本发明作出各种变动和改进。根据以上描述和附图，除那些此处已列出的之外，处于本发明范围内的功能上相同的方法和设备对于本领域技术人员是显而易见的。这种变动和改进应处于所附的权利要求的范围内。本发明仅受到所附权利要求中的条款的限定，其包括与这些权利要求所要求保护的内容等同的全部范围。

Claims (52)

1.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变(EID)、并可使全身性免疫抑制的程度最小化的药物中的用途，其包括向需要这种EID的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种EID的症状但产生的全身性免疫抑制作用低于临床上同等有效剂量的皮质类固醇的所述药物。

2.权利要求1的方法，其中的EID为哮喘。

3.权利要求1的方法，其中的EID为炎症性肠病。

4.权利要求2或3的方法，其中全身性免疫抑制的程度是通过IL-2报道基因分析法测定的。

5.权利要求1的方法，其中所述匹美莫司的施用量为5至100mg/天。

6.权利要求1的方法，其中所述药物是以片剂、胶囊或液体混悬剂或溶液剂经口服施用或经静脉输注、经皮释放、经气雾剂吸入或通过灌肠剂或栓剂经直肠施用。

7.权利要求2的方法，其还包括向所述人体施用表1中所列的一种或多种哮喘药物。

8.权利要求7的方法，其中所述的哮喘药物为糖皮质激素。

9.权利要求7的方法，其中所述的哮喘药物为色甘酸钠。

10.权利要求7的方法，其中所述的哮喘药物为α-肾上腺素能激动剂。

11.权利要求8的方法，其中所施用的糖皮质激素的量低于不加匹美莫司时所施用的治疗有效所需的量。

12.权利要求3的方法，其还包括向所述人体施用表3中所列的一种或多种炎症性肠病(IBD)治疗药物。

13.权利要求12的方法，其中所述的IBD药物为糖皮质激素。

14.权利要求12的方法，其中所述的IBD药物为环孢菌素A。

15.权利要求12的方法，其中所述的IBD药物为氨基水杨酸。

16.权利要求12的方法，其中所述的IBD药物为硫唑嘌呤。

17.权利要求12的方法，其中所述的IBD药物为以细胞因子为靶点的治疗药物。

18.权利要求17的方法，其中以细胞因子为靶点的治疗药物为infliximab。

19.权利要求13的方法，其中所施用的糖皮质激素的量低于不加匹美莫司时所施用的治疗有效所需的量。

20.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变、并可使全身性免疫抑制的程度最小化的药物中的用途，其包括向需要这种上皮炎症性病变的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种上皮炎症性病变的症状但产生的匹美莫司的血药浓度低于产生全身性免疫抑制所需的血药浓度的所述药物。

21.权利要求20的方法，其中的上皮炎症性病变为哮喘。

22.权利要求20的方法，其中的上皮炎症性病变为IBD。

23.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于IL-2报道基因分析法测得的IC₅₀。

24.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于2.0ng/ml。

25.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于1.5ng/ml。

26.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于1.0ng/ml。

27.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于0.75ng/ml。

28.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于0.5ng/ml。

29.权利要求21或22的方法，其中匹美莫司的血药浓度低于0.25ng/ml。

30.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变、并可使全身性免疫抑制的程度最小化的药物中的用途，其包括向需要这种上皮炎症性病变的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种上皮炎症性病变的症状但产生的匹美莫司的血药浓度低于在所述人体中导致任何不良副作用所需的血药浓度的所述药物，所述不良副作用为由细菌、病毒或真菌病原体导致的机会性感染或淋巴增生性病变，或淋巴瘤或其它恶性肿瘤。

31.权利要求30的方法，其中的上皮炎症性病变为哮喘。

32.权利要求30的方法，其中的上皮炎症性病变为IBD。

33.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变、并可使全身性免疫抑制的程度最小化的药物中的用途，其包括向需要这种上皮炎症性病变的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种上皮炎症性病变的症状但产生的匹美莫司的血液浓度低于产生1000ng.h/ml的24小时内平均稳态AUC所需的血药浓度的所述药物。

34.权利要求33的方法，其中的上皮炎症性病变为哮喘。

35.权利要求33的方法，其中的上皮炎症性病变为IBD。

36.权利要求34或35的方法，其中匹美莫司的血液浓度低于产生600ng.h/ml的24小时内平均稳态AUC所需的血药浓度。

37.权利要求34或35的方法，其中匹美莫司的血液浓度低于产生400ng.h/ml的24小时内平均稳态AUC所需的血药浓度。

38.权利要求34或35的方法，其中匹美莫司的血液浓度低于产生200ng.h/ml的24小时内平均稳态AUC所需的血药浓度。

39.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变、并可使全身性免疫抑制的程度最小化的药物中的用途，其包括向需要这种上皮炎症性病变的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种上皮炎症性病变的症状但产生的匹美莫司的血液浓度在稳态条件下的谷值浓度高于7ng/ml但低于18ng/ml的所述药物。

40.权利要求39的方法，其中的谷值浓度低于15ng/ml。

41.权利要求39的方法，其中的谷值浓度低于10ng/ml。

42.权利要求40或41的方法，其中的上皮炎症性病变为哮喘。

43.权利要求40或41的方法，其中的上皮炎症性病变为IBD。

44.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变、并可使全身性免疫抑制的程度最小化的药物中的用途，其包括向需要这种上皮炎症性病变的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种上皮炎症性病变的症状但产生的稳态条件下的血液浓度的C_max低于70ng/ml的所述药物。

45.权利要求45的方法，其中的上皮炎症性病变为哮喘。

46.权利要求45的方法，其中的上皮炎症性病变为IBD。

47.权利要求46或47的方法，其中的C_max低于60ng/ml。

48.权利要求46或47的方法，其中的C_max低于50ng/ml。

49.权利要求46或47的方法，其中的C_max低于40ng/ml。

50.匹美莫司在制备用于在人体中治疗或预防上皮炎症性病变的药物中的用途，其包括向需要这种上皮炎症性病变的治疗或预防的人体施用一定量的、足以改善至少一种上皮炎症性病变的症状的所述药物。

51.权利要求51的方法，其中的上皮炎症性病变为哮喘。

52.权利要求51的方法，其中的上皮炎症性病变为炎症性肠病。

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