CN1491572A - 一种能减轻色变的大豆蛋白酶解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化技术领域,涉及一种能减轻色变的酶水解大豆蛋白制备小于10个氨基酸的寡肽混合物的方法。其主要技术特征是,在不外加碱的pH值渐变条件下进行蛋白质水解的同时,向水解罐中引入能阻止还原糖与氨基酸及蛋白质的氨基之间发生美拉德反应的抑制剂。本发明的效果和益处是,可以使大豆蛋白水解物的下游处理既省去脱盐步骤,又省去脱色步骤。
Description
技术领域
本发明属于酶催化技术领域,提供了一种在不外加碱的pH值渐变条件下酶解大豆蛋白制备小于10个氨基酸的寡肽混合物,同时抑制酶解液色变的方法。
背景技术
近年来的研究表明,大豆蛋白肽除具有与大豆蛋白一样的营养价值之外,还具有多种生理保健功能。因此,研究大豆蛋白转化为大豆蛋白肽的方法受到人们的关注。
用酶解法获得大豆蛋白肽具有条件缓和,环境友好和不破坏营养等好处,是大豆蛋白水解技术开发的方向。专利CN1151848A、CN1168770A、CN1323535A和CN1344138中披露了酶解大豆蛋白的具体方法,其中均要求在酶解过程中不断向酶解液中补加强碱溶液,通过维持酶解液pH值来保持碱性蛋白酶的酶解活性,进而得到满意的原料(底物)降解率和寡肽含量。这些方法的问题在于,维持pH值的碱溶液在酶解物中会产生明显的碱性异味并引入盐类杂质,因此在下游处理中必须采用复杂的脱盐除杂操作。为此,我们在前期申报的中国专利(03110987.X)中,提出了一种利用碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同酶解作用,在不外加碱的pH值渐变条件下酶解大豆蛋白制备寡肽的方法。但该方法的不足之处在于,大豆蛋白酶解转化为寡肽的过程中往往伴随有色素物质生成,导致酶解物呈现深褐色乃至黑褐色,限制了其在食品中的应用。
实际上,在发酵工业中,发酵液的色变问题带有一定普遍性。以下专利文献和公开文献提供了一些脱色方法:公开文献氨基酸和生物资源,18,1(1996)18-19中报道了对猪血粉水解制得的氨基酸混合物用活性炭方法脱色的条件和效果;食品科学,19,7(1998)17-20中报道了对鱼蛋白水解制得的鱼蛋白水解液用活性炭脱色的条件和效果;食品工业科技,20,3(1999)27-28中报道了对新鲜猪血水解制得的食用蛋白酶解物用活性炭脱色的条件和效果;粮食与油脂,3(2001)5-7中报道了对大豆蛋白水解制得的大豆蛋白肽水解物用活性炭脱色的条件和效果。专利文献CN 1291449A中披露了对用豆粕、麸皮和小麦制得的酱油产品用活性炭处理的方法;专利文献CN 1336441A中披露了离子交换树脂用于糖浆吸附脱色的方法;专利文献CN 1397192A中披露了对脱脂蚕蛹粉水解制得的蛋白水解液用H2O2氧化脱色的方法。以上专利文献和公开文献所批露的脱色方法均属于后处理脱色方法,在实施工艺上需要至少一个专门的设备和一个独立的单元操作。不仅如此,以上各种方法的脱色能力有限。其中,用各种吸附法脱色还会降低目的产物的产率。
显然,在蛋白质酶解过程中抑制色素物质生成,是解决蛋白质酶解物颜色问题的最佳办法。但是,迄今尚未见到公开或专利文献涉及在蛋白质酶解过程中进行色素抑制的细节。
发明内容
本发明的目的是提供一种在不外加碱的pH值渐变条件下酶解大豆蛋白制备小于10个氨基酸的寡肽混合物时抑制酶解液色变的方法。
经研究发现,在不外加碱的PH值渐变条件下,当大豆蛋白在碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同作用下酶解时,酶解液的色变主要与美拉德副反应(Maillard reaction)有关。美拉德反应亦即羰氨反应,是指氨基酸及蛋白质中的氨基和还原糖或还原糖分解物中的羰基之间发生的反应。该反应最终生成棕色甚至黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素。在大豆蛋白酶解中,参与美拉德反应的还原糖及还原糖分解物来自于大豆蛋白中含有的低聚糖。因此,本发明利用事先加入到酶解罐中的少量色变抑制剂(氧化剂或还原剂)将大豆蛋白在酶解过程中释放出的低聚糖的羰基分解或转化为羟基,达到抑制美拉德反应,进而抑制酶解液色变的目的。
本发明的技术方案和实施步骤是:
向带有机械搅拌装置的普通发酵罐中加入适量自来水,并按照底物浓度要求向其中加入一定量的大豆蛋白。启动机械搅拌浆,使之以适当的速度搅动浆液,同时通过水夹套或/和水蒸汽直接接触将反应浆液温度提到指定温度。用pH计和固定于发酵器内的pH计电极测定酶解反应之前的浆液酸碱度。然后,向发酵罐中加入计量的蛋白酶和色变抑制剂(氧化剂或还原剂),开始酶解反应。最后,用pH计监测酶解液酸碱度的变化,并通过采样(搅拌均匀的酶解液)分析不同时刻的原料降解率、蛋白质水解度。酶解反应结束之后,将酶解液在95℃煮沸5-10分钟灭活。
适合本发明的碱性蛋白酶如:碱性霉菌蛋白酶(来源于米曲霉,使用pH值6.5-8.5,使用温度45-60℃),碱性细菌蛋白酶(来源于地衣芽孢杆菌,使用pH值6.5-8.5,使用温度55-70℃),Alcalase碱性细菌蛋白酶(来源于枯草杆菌,使用pH值6.5-8.5,使用温度55-70℃)。
适合本发明的酸性蛋白酶如:酸性霉菌蛋白酶(来源于黑曲霉,使用pH值2-5.0,使用温度45-55℃),胃蛋白酶(来源于动物胃,使用pH值1.0-3.0,使用温度30-40℃)。
适合本发明的中性蛋白酶如:中性霉菌蛋白酶(来源于米曲霉,使用pH值5.0-7.5,使用温度50-65℃)、中性细菌蛋白酶(来源于枯草芽孢杆菌,使用pH值4.5-7.0,使用温度45-60℃)、ProtamexTM细菌蛋白酶(属于杆菌蛋白酶复合体,使用pH值5.5-7.5,使用温度55-60℃)。
在本发明中,碱性蛋白酶要与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶配合使用。如果允许使用温度范围相近,则酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以与碱性蛋白酶同时加入酶解罐。如果酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的允许使用温度低于碱性蛋白酶的使用温度,则应在碱性蛋白酶的酶解活性基本消失之后(即酶解液的pH值停止下降之后)再向发酵罐中加入酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶。并将酶解温度调整到酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的适宜使用温度。
在以上所说的碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶配合使用方案中,碱性蛋白酶可以是一种酶,也可以是复合碱性蛋白酶。同样,酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以是一种酶,也可以是复合酸性蛋白酶或/和复合中性蛋白酶。
为了充分发挥碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同酶解作用,碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的投放量(在本发明中表示为酶溶液与底物比,或酶固体占底物重量的百分率)可根据其活力不同,由这一领域中的工程师用惯用的方法确定。酶解温度的选择主要取决于酶的使用温度。在碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶同时加入的方式中,酶解温度应根据使用温度最低的酶来定。在碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶分步加入的方式中,酶解温度可根据不同酶解阶段所使用的酶的允许使用温度来调整。根据本发明,酶解反应温度的选择范围为30-70℃。
适合本发明的大豆蛋白原料(底物)如大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、脱脂大豆粉、大豆粕和豆饼等。其中,优选大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白。根据本发明,底物浓度的选择范围为20-100克/升。底物浓度太高时,酶的酶解活性低,难以得到满意的底物降解率。另一方面,底物浓度太低,虽然酶的酶解活性高,但会增加下游处理过程中蒸发、浓缩酶解液的难度。当把适量的大豆分离蛋白或脱脂大豆粉在搅拌下加入自来水中并加热到如上所述的酶解温度范围时,大豆蛋白浆液的初始pH值能达到7-7.5,能够满足碱性蛋白酶对酸碱度的要求。
大豆蛋白在以上所述的条件下酶解的适宜时间范围为2-24小时。在酶解过程中,底物降解率和蛋白质水解度随酶解时间的延长而增加,但酶解物的颜色也随酶解时间的延长而转深。酶解时间太短时,不利于得到满意的底物降解率和蛋白质水解度。相反,如果酶解时间过长,则不但无益于抑制酶解液的色变,而且酶解液容易在微生物作用下变质。
关于在不外加碱的pH值渐变条件下利用碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同酶解作用从大豆蛋白获得寡肽酶解物的实施方法和效果已经在我们前期发明专利中做了阐述(中国发明专利申请号03110987.X)。因此,本发明的关键是色变抑制剂的选择与使用。尤其重要的是,色变抑制剂应属于食品加工中允许使用的药剂,其用量应不影响所使用酶的活性,更不能高于食品法规的限量(按干燥后的酶解物考虑)。
本发明采用的色变抑制剂属于氧化剂和还原剂。其中氧化剂指H2O2,还原剂指Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3。以上药剂在食品中使用已获得中国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)许可:如Na2S2O5(焦亚硫酸钠),Na2SO3(亚硫酸钠)和NaHSO3(亚硫酸氢钠)可用于蜜饯、饼干、葡萄糖、食糖、冰糖、饴糖、糖果、液体葡萄糖、竹笋、蘑菇,蘑菇罐头,蜜饯等液体和固体产品,加入限量不高于千分之零点六,一般在千分之零点四五以下。而过氧化氢(H2O2)已用于生牛乳保鲜,加入限量为0.03%过氧化氢2.0毫升/升。
由于根据用本发明所得的酶解液将不做脱盐处理,因此将色变抑制剂Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3的用量限定在千分之零点五以下。对于过氧化氢,限定用量为千分之二以下,因为过氧化氢在酶解及酶解后的下游处理过程中能借受热条件自行分解掉。在上述用量范围内,各种色变抑制剂均不影响酶活性。
本发明的实施效果是可用底物降解率,蛋白质水解度和色变抑制率来衡量。
底物降解率定义为被酶解的大豆蛋白原料重量占投料的大豆蛋白原料重量的百分比;水解度定义为在酶解过程中打开的肽键数量占蛋白质分子总肽键数量的百分比。
降解率的测定方法如下:酶解液在4000r/min下离心10min,把上层清液和固体物分离,将固体不溶物在110℃下干燥至恒重,称重。然后按下式计算底物降解率:
其中,大豆蛋白投料量折算成干基。大豆蛋白的含水量是在110℃下干燥至恒重后测定的。底物降解率越高,表示原料的单程利用率高。
蛋白质水解度的测定采用甲醛滴定法,具体测定方法如下:将酶解液在4000r/min下离心10min,取5ml上层清液,用0.1M的NaOH溶液滴定到pH=8.2,加入5ml 37%的甲醛溶液(所用甲醛溶液先用NaOH滴定到pH=8.2),再用0.1M的NaOH滴定到pH=8.2。记录加入甲醛后把溶液滴定到pH=8.2所耗碱量。pH值测量使用精密pH计。然后按照下式计算蛋白质的酶解度:
其中,大豆蛋白彻底水解的方法是将大豆蛋白在6M HCl中于105-110℃下水解24个小时。蛋白质的水解度高,表示酶解物的平均分子量小。
在本发明中,色变抑制效果用色变抑制率表示,色变抑制率采用分光光度法测定。具体测定方法如下:取酶解液的离心上清液用0.22微米的微孔滤膜过滤,然后用紫外-可见分光光度计在波长400nm处测其吸光度值。色素抑制率用下式计算:
式中:A0为未加色变抑制剂的酶解液吸光度;A为加色变抑制剂后的酶解液吸光度。
本发明的益处是,利用碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同酶解作用,在不外加碱的pH值渐变条件下可使大豆蛋白原料的降解率达到70%以上,蛋白质的酶解度达到20%以上。同时,利用色变抑制剂可使酶解液的色变抑制率达到50%以上。利用本发明,可以省去酶解物下游处理过程中的脱盐和脱色工序,有利于降低寡肽酶解物的生产成本。
具体实施方式
以下详细叙述本发明的具体实施例。
实施例1(对比实施例)
将8g大豆分离蛋白(干基重量)和200ml自来水加入带有水夹套的酶解罐中,在搅拌下将酶解罐内的温度提高到60℃。通过pH计测得酶解罐内料液的pH值约为7.0。然后,向酶解罐内加入120μl Alcalase碱性蛋白酶(2.4L,标示活力为2.4AU/克,丹麦NOVO公司出品)和0.48克黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g),在不断搅拌下开始酶解。在本例中,底物浓度为40克大豆分离蛋白/升水,Alcalase溶液与底物的比为15μl/克大豆分离蛋白,黑曲霉酸性蛋白酶占底物6%(以底物干基重量为基准),总酶解时间为6小时,底物降解率约71%,蛋白质水解度约22%。酶解清液为深褐色。
实施例2(根据本发明)
重复实施例1,但向酶解罐中加入Alcalase和黑曲霉酸性蛋白酶的同时,向其中加入相当于大豆蛋白原料干基重0.12‰的过氧化氢(即30%双氧水4.8毫克)。则底物降解率仍为约71%,蛋白质水解度仍为约22%,但酶解清液颜色明显变浅,色变抑制率达到29.3%。
实施例3(根据本发明)
重复实施例2,但加入的过氧化氢依次为大豆蛋白原料干基重的0.06‰、0.25‰、0.50‰和1.9‰。则在此四种情况下,底物降解率和蛋白质水解度仍然都保持在71%和22%左右,但酶解清液颜色随着过氧化氢加入量的增加而变浅,色变抑制率依次为25%、32.4%、35%和51.8%。用碘滴定法在过氧化氢加入量为1.9‰的酶解液中未检测出残存过氧化氢。说明过氧化氢经过95℃的高温灭活已经分解。
实施例4(根据本发明)
重复实施例2,但用Na2SO3(亚硫酸钠)代替过氧化氢作为色变抑制剂。Na2SO3的加入量依次相当于大豆蛋白原料干基重的0.12‰、0.25‰、0.48‰。则在此三种情况下,底物降解率和蛋白质水解度均保持在71%和22%左右,但酶解清液颜色随着Na2SO3加入量的增加而变浅,色变抑制率依次为18.4%、22.0%和24.2%。
实施例5(根据本发明)
重复实施例2,但用NaHSO3(亚硫酸氢钠)代替过氧化氢作为色变抑制剂。NaHSO3的加入量依次相当于大豆蛋白原料干基重的0.06‰、0.12‰、0.25‰和0.50‰。则在此四种情况下,底物降解率和蛋白质水解度均保持在71%和22%左右,但酶解清液颜色随着NaHSO3加入量的增加而变浅,色变抑制率依次为19.0%、20.6%和22.0%和27.1%。
实施例6(根据本发明)
重复实施例2,但用Na2S2O5(焦亚硫酸钠)代替过氧化氢作为色变抑制剂。Na2S2O5的加入量依次相当于大豆蛋白原料干基重的0.06‰、0.12‰、0.25‰和0.48‰。则在此四种情况下,底物降解率和蛋白质水解度均保持在71%和22%左右,但酶解清液颜色随着Na2S2O5加入量的增加而变浅,色变抑制率依次为15.2%、17.9%、21.4%和25.8%。
Claims (4)
1.一种能减轻色变的大豆蛋白酶解方法,是当酶解反应在碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同作用下,在不外加碱的pH值渐变环境中进行时,酶解罐中还加有能抑制有色物质产生的氧化剂或还原剂,其特征在于,所说的氧化剂是H2O2,还原剂是Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3。
2.根据权利要求1所述的一种能减轻色变的大豆蛋白酶解方法,其特征在于,碱性蛋白酶指碱性霉菌酶,碱性细菌酶及其任意复合物,酸性蛋白酶指酸性霉菌酶,胃蛋白酶及其任意复合物,中性蛋白酶指中性霉菌酶,中性细菌酶及其任意复合物。
3.根据权利要求1所述的一种能减轻色变的大豆蛋白酶解方法,其特征在于,作为酶解原料的大豆蛋白指大豆浓缩蛋白,大豆分离蛋白,脱脂大豆粉,大豆粕和豆饼中的任何一种。
4、根据权利要求1所述的一种能减轻色变的大豆蛋白酶解方法,其特征在于,酶解反应在30-70℃,底物浓度20-100克/升,水解时间2-24小时条件下进行。
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