CN1483834A - 酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，用酶水解薯蓣类皂甙糖基，制备药效高、溶血性低的低糖基次生薯蓣类皂甙或者甙元。包括如下步骤：取能水解薯蓣类皂甙糖基的酶；将酶、薯蓣类皂甙及缓冲液混合反应4－40小时，反应条件为温度4－75℃、pH值3－9；提取低糖基次生薯蓣类皂甙或者甙元。克服了现有技术(酸碱水解法)所存在的对甙破坏性大，污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解薯蓣类皂甙糖基，更加提高了低糖基次生薯蓣类皂甙或甙元的转化率，对医药和保健品意义很大。

Description

酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法

技术领域：

本发明涉一种制备低糖基薯蓣皂甙的方法，尤其是一种用酶水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法。

背景技术：

薯蓣类皂甙是甾醇类皂甙，是薯蓣科薯蓣属(Dioscorea genus)植物的主要有效成分。含薯蓣皂甙的薯蓣属中草药有穿山龙(Dioscorea nipponicaMakino)、盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis G.H.Wright)、萆解(Dioscoreahypoglauca)、山萆(Dioscorea tocoro Makino)、纤细薯蓣(Dioscoreagracillima Mip)，川萆(Dioscorea septemloba)、蜀葵叶薯蓣(Dioscoreaal thacoides)等，根状茎入药，皂甙的平均含量为0.93％-2.26％。

薯蓣类皂甙甙元相同，但糖基的种类和数量不同分了很多种皂甙。化学结构为(R为糖基)：

皂甙1(薯蓣皂甙Dioscin)、R：α-L-rha-(1→2)-β-D-glc-

                                α-L-rha-(1→4)/

皂甙2(双葡萄糖皂甙)     R：β-D-glc-(1→3)-β-D-glc-

                                α-L-rha-(1→2)/

皂甙3(延龄草甙Thillin)  R：α-L-rha-(1→2)-β-D-glc-

                                α-L-ara_r-(1→4)/

皂甙4(纤细皂甙Gracillin)R：β-D-glc-(1→3)-β-D-glc-

皂甙5                   R：β-D-glc-

甙元                    R：H

上述皂甙中，皂甙1、2、3结构在薯蓣属中草药中含量很高，而皂甙5和甙元几乎不存在。

虽然薯蓣类皂甙具有消炎、祛痰、平喘、增加冠脉流量、降低血脂、改善心血管功能及抗菌、抗病毒等药理活性，对巨噬细胞的吞噬功能有增强作用，并有脱敏等作用。但是，具有药效高、溶血性低特点、对医药和保健品意义很大的却是在薯蓣属中草药中含量小的含一个糖基的薯蓣类皂甙5和甙元。而在中草药中含量高的薯蓣类皂甙1、2、3的结构中，每一个分子中含有三个糖基，即多糖基薯蓣类皂甙，多糖基薯蓣类皂甙不但药效低还具有溶血性。为了得到低糖基皂甙和甙元，曾报道过酸碱水解法(郭文松等，贵州化工，1996，第二期，14-17)，但是对皂甙破环大、污染严重。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术中所存在的技术问题，提供一种用能水解薯蓣类皂甙糖基的酶，处理薯蓣类中含量较高的皂甙，制备薯蓣类中含量低的低糖基次生薯蓣类皂甙或甙元的方法。

本发明的技术解决方案是：一种酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，即用酶水解薯蓣类皂甙糖基，制备低糖基次生薯蓣类皂甙或者甙元。

包括如下步骤：

a.取能水解薯蓣类皂甙糖基的酶；

b.将酶、薯蓣类皂甙及缓冲液混合反应4-40小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；

c.提取低糖基次生薯蓣类皂甙或者甙元。

所述的a步骤可由微生物发酵制备。

所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。

所述的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。

所述的微生物为曲霉属(Aspergillus genus)霉菌。

所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。

所述的b步骤的淫羊藿甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。

所述的缓冲液为醋酸或磷酸。

所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。

本发明同现有技术相比，最大的特点是制造能够水解薯蓣类皂甙糖基的酶来水解薯蓣类皂甙糖基，制备疗效高、溶血性低的低糖基次生薯蓣类皂甙或甙元。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解薯蓣类皂甙糖基，更加提高了低糖基次生薯蓣类皂甙或甙元的转化率。

具体实施方式：

实施例1：

a.以高温好氧菌Bacillus sp.JF₂菌(文献1)在含3％玉米粉、0.2％产酶诱导物——薯蓣类浸出物(干物)、0.01％MgSO4培养基中，在温度60℃条件下通风培养30-40小时，离心除菌、往上清液(含酶混合液)内加入65％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸缓冲液透析，离心除渣，冻干，得到皂甙酶；

b.取2克上述皂甙酶、30克薯蓣类皂甙1、1500毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)和150毫升乙醇混合均匀，使30克薯蓣类皂甙1占总反应体积的0.1-10％，在温度75℃条件下搅拌反应4小时；

c.反应後加入6000毫升乙醇，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到20克低糖基皂甙粗品。用薄层层析法(文献2)检测结果80％以上转化成低糖基次生皂甙。

得到低糖基次生皂甙粗品，用硅胶柱分离方法(文献3)得到薯蓣类皂甙酶反应产物单体2种，经热甲醇溶解、冷却结晶法精制单体。经核磁共振方法(文献4)确定结构：其单体结构是薯蓣类皂甙5和甙元，得到皂甙5(8.1克)；甙元(1.2克)。

把酶反应底物-薯蓣类皂甙1替换成薯蓣类皂甙2或者3或者4时，同样得到次生的薯蓣类皂甙5和甙元。

上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献5)分离提纯薯蓣类皂甙酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献6)，酶的分子量为6.0万。

实施例2：

其它条件同实施例1，只是培养基中的0.2％的产酶诱导物——薯蓣类浸出物(干物)为0.05％的黄酮。

实施例3：

a.黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含5％麦芽浸出物、1％产酶诱导物——薯蓣类浸出物(干物)的培养基中，在温度为28-30℃条件下搅拌通风培养50-100小时，离心除菌得含酶混合液，用60-75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为酶液；

b.取3克薯蓣类皂甙、100毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和50毫升上述酶液混合，使3克薯蓣类皂甙1占总反应体积的0.1-10％，在温度为4℃条件下反应40小时；

c.加入1/3体积的正丁醇萃取皂甙三次，减压蒸干，得到低糖基次生皂甙粗品。

用硅胶柱分离方法(文献3)得到0.5-1.4克的纯低糖基次生皂甙。经核磁共振方法确定结构(文献4)，其结构是薯蓣类皂甙5。

上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献5)分离提纯薯蓣类皂甙酶蛋白，用SDS电泳方法(文献6)测定分子量，酶的分子量为5.5万。

实施例4：

a.取米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麦麸浸出物、0.2％产酶诱导物——大豆异黄酮或者芦丁，或者0.6％其黄酮类来源植物的浸出物(干物)的培养基中，温度28-30℃条件下搅拌通风培养50-100小时，离心除菌得含酶混合液，用60-75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析出去硫酸按，离心除渣，即为酶液；

b.按实施例1方法处理薯蓣类皂甙。

提纯和检测酶反应产物的结果，薯蓣类皂甙转化成低糖基次生皂甙的转化率为60％以上，产物主要是薯蓣类皂甙5和少量的甙元。

上述酶液经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献5)分离提纯薯蓣类皂甙酶蛋白，用SDS电泳方法(文献6)测定分子量，酶的分子量为6.4万。

实施例5：

a.假丝酵母在含薯蓣类粉10％的麦麸培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中30℃、培养3～6天，收集培养物加入6000毫升的生理盐水，浸泡一小时，离心取上清(含酶混合液)，加入饱和度60～75％的硫酸按，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析除去硫酸按，离心除渣，即得1000毫升左右的酶液。

c.按实施例1的方法用上述酶液处理薯蓣类皂甙。

提纯和检测酶反应产物的结果：薯蓣类皂甙转化成低糖基次生皂甙的转化率为60％以上，产物主要是薯蓣类皂甙5和少量的甙元。酶的分子量为5万。

实施例6：

a.大肥菇菌(Agaricus bitorguis)培养在薯蓣类粉和稻皮各10％的麦麸培养基上、在温度为25℃条件下培养6-8天，按实施例5的方法提取酶液；

b.按实施例3的方法处理薯蓣类皂甙。

分离提纯和检测酶反应产物，30％的薯蓣类皂甙转化成低糖基皂甙，产物有薯蓣类皂甙5和少量甙元。

实施例所述文献：

1.Fengxie Jin，et al(金凤燮等)：J.Gen Appl.Bact.，1990，36，415-424.

2.张彩霞等：基层中药杂志2000，14(2)，32-33。.

3.徐人生主编，天然物化学，科学出版社，1997，p17-20.

4.韩秀文等，波谱学杂志，1999，16(6)，533-539。

5.Hongshan Yu，et al(鱼红山等)：Chem.Pharm.Bull.，2002，50(2)，175-178。

6.张龙翔等：升华实验方法和技术，高等教育出版社，1997，p100-111。

Claims (10)

1.一种酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：用酶水解薯蓣类皂甙糖基，制备低糖基次生薯蓣类皂甙或者甙元。

2.根据权利要求1所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于包括如下步骤：

a.取能水解薯蓣类皂甙糖基的酶；

b.将酶、薯蓣类皂甙及缓冲液混合反应4-40小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；

c.提取低糖基次生薯蓣类皂甙或者甙元。

3.根据权利要求2所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：所述的a步骤可由微生物发酵制备。

4.根据权利要求3所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。

5.根据权利要求3或4所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：所述的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。

6.根据权利要求3或4所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：所述的微生物为曲霉属(Aspergillus genus)霉菌。

7.根据权利要求3所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法其特征在于：所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。

8.根据权利要求2所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：所述的b步骤的淫羊藿甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。

9.根据权利要求2所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法方法，其特征在于：所述的缓冲液为醋酸或磷酸。

10.根据权利要求2所述的酶法水解薯蓣类皂甙糖基制备低糖基薯蓣皂甙的方法，其特征在于：所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。