CN1470641A - 一种用于筛选和评价抗hcv药物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在细胞中评价和筛选抗HCV药物的方法及其应用。该方法包括制备在丙肝病毒基因组序列的NS5B编码区插入报道基因的载体；用制备出的载体通过一种高效增殖丙肝病毒体的方法制备出含有报道基因的HCV颗粒；用此含有报道基因的HCV颗粒二次感染加入了候选抗HCV药物的HCV敏感的细胞，检测报道基因是否表达确定该候选药物的药效。该方法可以快速筛选抗HCV的药物。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种筛选和评价抗HCV(丙型肝炎病毒)药物的方法，更具体的说是用一种制备出来的含有报道基因的有二次感染活性的HCV，感染加入了候选抗HCV药物的HCV敏感细胞里，通过检测报道基因标记的表达评价抗HCV药物抗性的方法及其应用。
背景技术：
正链RNA病毒包括许多细菌病毒、植物病毒和动物病毒。其中，丙肝病毒是丙型肝炎的致病病原体，目前尚没有疫苗来防止其感染，唯一的治疗药物干扰素即使与病毒唑结合使用，也只能在不到43％的医治患者上消除病毒(Lacet1998年10月31日；NEJM 1998年11月19日)。为控制丙肝病毒这一流行病，需要丙肝病毒疫苗和更有效的抗丙肝病毒药物。而对于药物开发来说，必须有合适的药物筛选系统来筛选病毒复制的抑制剂。
RNA基因组的复制是体内丙肝病毒繁殖的关键步骤。病毒编码的RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp)是这RNA复制过程所必需的。因而，丙肝病毒RdRp抑制剂将有效地抑制丙肝病毒复制。丙肝病毒RdRp是一种由NS5B(非结构蛋白5B)基因所编码的68KD酶，该基因位于病毒RNA基因组的3`末端，也叫做正链(+)RNA。丙肝病毒的RNA基因组一旦进入靶细胞如体内的大多数肝细胞和淋巴细胞，就被翻译成一个多聚蛋白，之后多聚蛋白又被剪切成多个复合蛋白，其中之一就是RdRp。然后，RdRp可以利用基因组RNA作为模板，合成一种叫做负链(-)RNA的中间物RNA，而它又是生产更多的正链RNA的模板，以便为子代病毒体提供基因组。不论是负链中间物的形成，还是最终的大规模生产基因组RNA，都依赖于RdRp的活性。
丙肝病毒RdRp的体外检测系统已有记载(Hagedom等，1999年)。这些系统利用了大肠杆菌或昆虫细胞中所产生的重组体丙肝病毒RdRp。有一篇报道中利用了含活性丙肝病毒RdRp的哺乳动物细胞的裂解液(Heller等，1998)。而且，体外转录系统转录的短片段的RNA，也可以在含有四种核苷酸和重组RdRp的合适缓冲液里合成。可以对其中的一种或多种核苷酸进行修饰，使其含有标记(通常为放射性同位素)，以便在RNA凝胶上检测RdRp所合成的RNA产物。
这些体外检测方法用作丙肝病毒RdRp抑制剂的筛选方法时，或用于研究相关的丙肝病毒RdRp突变体时，存在一些严重的缺陷。第一，体外检测方法不能再现在生物活性细胞中所发生的相关的RdRp生理活性。例如，在体外检测中，所说的酶可能会利用不相关的RNA和相关的病毒RNA作为模板，而在体内，所说的酶可以将相关病毒RNA与细胞RNA区分开来，因为后者的复制将会导致引起细胞死亡的大量的双链RNA的复制。另外，丙肝病毒RdRp与细胞膜有关，这些细胞膜能为所说的酶发挥作用提供疏水的环境，体外检测无法再现与细胞膜相似的条件。很可能RdRp合成RNA时在体外的要求与在体内的要求不同，这意味着所描述的体外检测所测定的活性实际上不同于丙肝病毒在靶细胞中复制所依赖的活性。第二，这些检测方法要求用提纯的丙肝病毒RdRp，无论是重组型或天然型。然而，实际证明这种酶很难生产或提纯。经过许多努力都未能从感染的组织中提纯到足够数量的天然蛋白。在大肠杆菌或昆虫细胞中所生产的重组型RdRp可能缺少合适的实现它特殊功能的宿主表达和修饰系统，而这种修饰是其正常发挥作用所必需的。很难得到足够量的活性酶当然会使这些检测方法用于大规模的筛选受到限制。第三，这些检测方法麻烦又速度慢，很难做到工业化，而且，这些体外检测方法涉及许多成本昂贵的过程和仪器，例如体外转录、蛋白提纯以及放射性标记等，这使得它们对于较小的实验室和开发公司没有吸引力。
最近，开发了一种丙肝病毒复制子系统，并认为其具有评估抗丙肝病毒药物的前景(Lohmann等，1999)。但其复杂的实验步骤使其不可能成为高效检测的实用检测系统，而且从这种复制子系统所可能开发的筛选检测方法，也会检测到任何能够干扰亚基因组复制子的表达和复制过程的因素，而不只是特定的RdRp活性。这看似很有利，但事实上该系统的混杂性使筛选的药物没有特异性，并会抑制细胞的RNA代谢。
发明内容：
由于现在筛选抗HCV的药物的方法检测麻烦，速度又慢，很难做到工业化，而且这些体外检测方法涉及许多成本昂贵的过程和仪器，使其很难被广泛的利用。
本发明的目的是提供了一种低成本、大通量的，而且更为重要的是模拟天然HCV感染机制的方法，用以筛选和评价抗HCV药物，该检测方法克服了现有检测方法中的所有上述缺点，方便，可靠，能在工业上进行应用。
一种用于筛选和评价抗HCV药物的方法，它包括的步骤是：
A制备含指示的重组载体，该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组序列的NS5B编码区插入报道基因；
B用方法A制备出的载体通过一种高效增殖丙肝病毒体的方法制备出含有报道基因的HCV颗粒；
C制备出对HCV敏感的宿主细胞；
D在宿主细胞中加入要检测药物；
E用B方法制备出来的HCV颗粒感染宿主细胞；
F检测报道基因是否表达；
用分子克隆技术构建含有HCV基因组的指示重组载体，它在NS5B编码区域插入了携带报道基因的丙肝病毒基因组的质粒。先将全长度丙肝病毒基因组克隆到pT7的多重克隆位点，再用Hpa I消化所得的质粒pT7-HCV，使之线性化，Hpa I可以识别只存在于NS5B编码区域内的序列GTTAAC。用Pst I和Bcl I进行消化，从携带报道基因的HCV基因组指示质粒中除去EMCV IRES-GFP表达序列盒。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通过末端连接酶将报道基因连接到线性化的pT7-HCV上。转染细菌，选择含有克隆到HCV NS5B编码区的报道基因的细菌克隆。
根据专利02117666.3所述，用基因枪注射法，脂质体转染法等方法将载体转染入宿主细胞。在一个具体的实施例中，采用Lipofect Amine脂质体转染法，用含有克隆到HCV NS5B编码区的报道基因的载体转染HeLa细胞系，培养液是含2.5％胎牛血清的DMEM。经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-1，ATCCNo.VR-2153。病毒感染2小时后，除去病毒上清液，加入细胞培养基，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经72小时的温育后，收集细胞培养上清液即为含有丙肝病毒体的液体。在另一个具体的实施例中采用Lipofect Amine转染法，将pHCV-1，CCTCC M201013表达载体转染CV-1细胞，培养液是含1.0％胎牛血清的0PTI-MEM。经过6个小时的转染后，除去转染介质，并用含1.0％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有105pfu vTF7-3，并加入利福平，病毒感染2小时后，除去病毒上清液，加入含有利福平的细胞培养基，细胞在含1.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48小时的温育后，收集细胞培养上清液即为含有携带报道基因的HCV的液体。
96孔板每孔在前一天接种上106个哺乳动物肝细胞，优选人类的肝细胞，最好是用Huh-7或HepG2细胞。经24小时培养，除去接种物，并用10％胎牛血清的1ml新鲜DMEM取代之，并在细胞里加入待检的候选药物，将收集的细胞培养物上清液加入到每一孔中，培养6天之后，收集细胞，并检测报道基因是否表达。
此处所述的丙肝病毒RdRp在细胞中检测方法，与现有的检测方法相比，具有如下主要优点：1.该方法是模拟HCV自然感染的过程，来评价抗HCV药物的，是生理上最相关的检测方法。检测可以在HCV天然靶细胞中进行。2.该方法是一种细胞中的检测方法，可以很容易地进行放大，以适应工业规模筛选的要求，而不需要进行大的调整。3.该方法是通量很大，而且用量很少，成本很低，操作方便。
术语“正链RNA病毒”是指那些基因组RNA也是对病毒蛋白进行编码的信使RNA的病毒。
附图说明：图1：丙肝病毒基因组示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或彭秀玲等人，基因工程实验技术，(科学技术出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。丙肝病毒的基因图谱参考已报道的文献如金奇主编，医学分子病毒学(科学出版社，2001)。实施例(1)含有报道基因LacZa能表达丙肝病毒全长基因组载体的制备。
引物是根据1a和1b的保守序列中设计而获得，由美国genebase公司合成
从急性丙肝病人肝组织(100mg)或100μl血清中用TrL20L System(GIBCO/BRL)提取RNA，用100μl的10mM DDT加上5％RNasin(Promega)悬浮。10μl的样品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
cDNA制备：RNA在65℃中变性2分钟，在20μl的反应液中用Superscr ptII reverse transcriptase(GIBCO/BRL)，通过SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5合成cDNA。反应在42℃进行1小时，然后用RNase H和RNase T1(GIBCO/BRL)消化20分钟，1/10的cDNA产物直接用于以下的PCR扩增。
PCR扩增HCV 3’UTR：1a株的3’UTR是通过两对引物而扩增的。1a株用SEQID NO：1和SEQ ID NO：2。在50μl反应液中(含有1倍的PCR buffer，250μm dNTP(Pharmacia)，20pmol引物，1μl(5unit)Taqman多聚酶(Stategene)，2μl cDNA产物，扩增条件是94℃，2分钟，变性，然后是35个循环PCR扩增，每次循环包括94℃1分钟，60℃退火30秒钟，68℃30秒钟合成，最后68℃7分钟扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳分离相应产物然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化DNA。
用Long-PCR扩增HCV cDNA片断及全长HCV DNA：
1)复盖NS3到3’UTR区域的HCV DNA的合成及扩增是用相应的cDNA产物及通过3’UTR DNA小片段及SEQ ID NO：4而合成的。3’UTR cDNA经94℃5分钟变性后直接置入4℃，用于以下PCR反应，PCR合成是通过长模板延长系统(Boehringer Mannheim)合成的。缓冲液和相应的试剂及反应条件均由生产厂提供，其中包括2μl cDNA模板，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化。
2)复盖5’UTR到NS3区域的DNA片断的合成和扩增是以相应的cDNA产物做模板通过SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5作物用长模板延长系统合成，扩增条件及DNA纯化和上述相同。
3)合成全长HCV DNA
用纯化过的5’UTR-NS3及NS3-3’UTR为模板通过SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6作引物合成和扩增HCV全长DNA，试剂，条件均按长模板延长系统(Boehinger Mannheim)提供，因SEQ ID NO：6含有T7启动子序列，由此所获全长HCV基因的5’端带有T7 RNA酶启动子。
克隆：HCV全长DNA经HindIII和Spe I酶切后克隆到pFK-1载体HindIII和Spe I位点上。pFK-1由pBR322衍生而来，经StyI-EcoR I切除后，pBR322的Sty I-EcoR I片断，被多克隆片断HindIII-Not I-Spe I位点所代替而得到pFK-1 HCV DNA。
点突变：为保证HCV能够在敏感Huh-7细胞中高效复制，转录，表达，我们应用点突变技术在NS3和NS5A基因上进行3个特异氨基酸突变。所有突变点的编号均按EmBL database accession number AJ238799为参考。特异突变点为NS3基因的1202位点的Glu变为Gly，NS3基因的1280位点的Thr变为Ile，以及NS5A的2197位点的Ser变为Proline。具体操作如下，分别设计合成3对24核苷酸的寡链(突变点在寡链中间)，每对寡链为互补序列。点突变通过mutagenesis kit(突变试剂盒)(Stategene)来完成。实验条件和试剂均由厂家提供，得到克隆后经检测序列证实点突变后在此基础上进行第二次点突变，依次进行，顺序如下pFK HCV→pFK HCV E1202G→pFK HCV E1202G T1280I→pFK HCV E1202G T1280I S2197P(名称为pHCV-2a)。用1μl(相当于5unit)的HpaI消化所得的质粒pHCV-2a 100μl，使之线性化，Hpa I可以识别只存在于NS5B编码区域内的序列GTTAAC。用1μl(相当于5unit)的Pst I和Bcl I对上述100μlpHCV-2a消化液再进行消化，从HCV基因组质粒中除去EMCV IRES表达序列盒。用2μl Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后加入2μl末端连接酶将报道基因LacZa连接到线性化的pHCV-2a上得到质粒pHCV-3a。将pHCV-3a重组载体转染HB101细菌，用含氨苄的LB培养基选择细菌克隆，扩大培养，获取大量载体。含有丙肝病毒全长基因的pHCV-2a重组载体武汉大学中国典型培养物保藏中心有保藏，保藏号CCTCC M201013a。实施例(2)含有报道基因绿色荧光蛋白基因(GFP)能表达丙肝病毒全长基因组载体的制备。
引物是根据1a和1b的保守序列中设计而获得，由美国genebase公司合成
从急性丙肝病人肝组织(100mg)或100μ1血清中用TrL20L System(GIBCO/BRL)提取RNA，用100μl的10mM DDT加上5％RNasin(Promega)悬浮。10μ1的样品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
cDNA制备：RNA在65℃中变性2分钟，在20μl的反应液中用SuperscrptII reverse transcriptase(GIBCO/BRL)，通过SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5合成cDNA。反应在42℃进行1小时，然后用RNase H和RNase T1(GIBCO/BRL)消化20分钟，1/10的cDNA产物直接用于以下的PCR扩增。
PCR扩增HCV3’UTR：1a株的3’UTR是通过两对引物而扩增的。1a株用SEQID NO：1和SEQ ID NO：2。在50μl反应液中(含有1倍的PCR buffer，250μm dNTP(Pharmacia)，20pmol引物，1μl(5unit)Taqman多聚酶(Stategene)，2μl cDNA产物，扩增条件是94℃，2分钟，变性，然后是35个循环PCR扩增，每次循环包括94℃1分钟，60℃退火30秒钟，68℃30秒钟合成，最后68℃7分钟扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳分离相应产物然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化DNA。
用Long-PCR扩增HCV cDNA片断及全长HCV DNA：
4)复盖NS3到3’UTR区域的HCV DNA的合成及扩增是用相应的cDNA产物及通过3’UTR DNA小片段及SEQ ID NO：4而合成的。3’UTR cDNA经94℃5分钟变性后直接置入4℃，用于以下PCR反应，PCR合成是通过长模板延长系统(Boehringer Mannheim)合成的。缓冲液和相应的试剂及反应条件均由生产厂提供，其中包括2μl cDNA模板，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化。
5)复盖5’UTR到NS3区域的DNA片断的合成和扩增是以相应的cDNA产物做模板通过SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5作物用长模板延长系统合成，扩增条件及DNA纯化和上述相同。
6)合成全长HCVDNA用纯化过的5’UTR-NS3及NS3-3’UTR为模板通过SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6作引物合成和扩增HCV全长DNA，试剂，条件均按长模板延长系统(Boehinger Mannheim)提供，因SEQ ID NO：6含有T7启动子序列，由此所获全长HCV基因的5’端带有T7 RNA酶启动子。
克隆：HCV全长DNA经HindIII和Spe I酶切后克隆到pFK-1载体HindIII和Spe I位点上。pFK-1由pBR322衍生而来，经Sty I-EcoR I切除后，pBR322的Sty I-EcoR I片断，被多克隆片断HindIII-Not I-Spe I位点所代替而得到pFK-1 HCV DNA。
点突变：为保证HCV能够在敏感Huh-7细胞中高效复制，转录，表达，我们应用点突变技术在NS3和NS5A基因上进行3个特异氨基酸突变。所有突变点的编号均按EmBL database accession number AJ238799为参考。特异突变点为NS3基因的1202位点的Glu变为Gly，NS3基因的1280位点的Thr变为Ile，以及NS5A的2197位点的Ser变为Proline。具体操作如下，分别设计合成3对24核苷酸的寡链(突变点在寡链中间)，每对寡链为互补序列。点突变通过mutagenesiskit(突变试剂盒)(Stategene)来完成。实验条件和试剂均由厂家提供，得到克隆后经检测序列证实点突变后在此基础上进行第二次点突变，依次进行，顺序如下pFK HCV→pFK HCV E1202G→pFK HCV E1202G T1280I→pFK HCVE1202G T1280I S2197P(名称为pHCV-2a)。用1μl(相当于5unit)的Hpa I消化所得的质粒pHCV-2a 100μl，使之线性化，Hpa I可以识别只存在于NS5B编码区域内的序列GTTAAC。用1μl(相当于5unit)的Pst I和Bcl I对上述100μlpHCV-2a消化液再进行消化，从HCV基因组质粒中除去EMCV IRES表达序列盒。用2μl Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后加入2μl末端连接酶将报道基因绿色荧光蛋白基因(GFP)连接到线性化的pHCV-2a上得到质粒pHCV-4a。将pHCV-4a重组载体转染HBl01细菌，用含氨苄的LB培养基选择细菌克隆，扩大培养，获取大量载体。含有丙肝病毒全长基因的pHCV-2a重组载体武汉大学中国典型培养物保藏中心有保藏，保藏号CCTCC M201013a。实施例(3)构建表达T7 RNA聚合酶重组痘病毒vT7D13L
vTFD13L痘病毒重组体是由同源重组所产生的，采用的是Moss和Earl所提出的方法。含有T7 RNA聚合酶痘病毒重组体的第一步获得vTF7-3痘病毒重组体，该病毒可从美国ATCC中获得，该重组体具有插入在胸腺嘧啶编码区域的T7 RNA基因是利用下列引物从痘病毒基因组DNA中PCR放大痘病毒D13L编码区域以及两侧的500bp侧链序列：以SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11作引物，2.7kb PCR产物含平整末端，然后将其克隆在pUC19的PvuII位中。所得的质粒用BstxI和Hind III进行消化，以除去D13L编码区域，随后与一DNA片断相连，该片断在痘病毒前/后启动子7.5的控制下，对细菌gpt基因进行编码。所得质粒为pGPT-D13L。在T25摇瓶中的非洲绿猴肾细胞CV-1 106个细胞在MOI为0.05下用vTF7-3痘病毒重组体(ATCC可购得)进行感染。初始感染两小时后，采用LipofectAmine法用10μg的pGPT-D13L质粒转染细胞，四小时转染之后，细胞置于具有2.5％胎牛血清的新鲜DMEM中。经过48小时的保温，可以收集细胞，并反复冻融使细胞裂解，所得的0.5ml细胞裂解液中含有vT7D13L痘病毒重组体和vTF7-3筛选vT7D13L重组体。是由DMEM中含有2.5％胎牛血清、2.5μg/ml MPA、250μg/ml黄嘌呤和15μg/ml次黄嘌呤的xGPT选择培养基中进行。细胞裂解产物进行10倍稀释，然后感染已经用xGPT选择培养基预保温12小时的非洲绿猴肾细胞CV-1，每孔中用1ml的稀释的细胞裂解产物进行感染。2小时后将一小部分野生型痘病毒WR加入到培养基中，至MOI为10。细胞再保温2小时。除掉病毒接种物后，用3ml 1％的低熔琼脂糖进行重叠。挑选出来的vT7D13L空斑可用于感染，96孔板中用5μg/孔的pD13L质粒转染非洲绿猴肾细胞CV-1，该质粒含有痘病毒前/后启动子相连的D13L。转染是采用LipofectAmine法。保温72小时后收集空斑，并用pD13L瞬间转染的非洲绿猴肾细胞CV-1进行数次连续重复选择，进一步提纯。构建pD13L质粒。使用下列两个引物从痘病毒WR基因组DNA放大D13L；以SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13作引物，得到的片断克隆在pSC59的克隆位点上，质粒pSC59是在pUC19基础上构建的。它含有痘病毒前/后启动子，多个克隆位点以及痘病毒终止子。由于痘病毒重组体基因组中含有gpt基因，以及重组体不含D13L基因。vT7D13L在未被pD13L转染的细胞中不能繁殖，用此种方法可证实vTFD13L痘病毒重组体的纯度。在pD13L质粒瞬间感染CV-1细胞中，vT7D13L可以进行繁殖和滴度测定。vT7D13L可用蔗糖梯度离心法可以进一步提纯。实施例(4)转染细胞及丙肝病毒的获得。将实施例(1)获得的载体pHCV-3a经ScaI酶切及纯化后转染Hela细胞。取1μgpHCV-3a加入100微升OPTI-MEM中，置室温15分钟；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室温15分钟混匀，将载体与LF2000混匀，转染106个Hela细胞，并设无载体和无LF2000两个对照组，经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清和DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-3(ATCC NO VR-2153)重组痘病毒。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48-72小时的温育后，收集含有报道基因β-gal丙肝病毒体的细胞培养物上清液。实施例(5)转染细胞及丙肝病毒的获得。将实施例(2)获得的载体pHCV-4a经ScaI酶切及纯化后转染Hela细胞。取1μgpHCV-4a加入100微升OPTI-MEM中，置室温15分钟；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室温15分钟混匀，将载体与LF2000混匀，转染106个Hela细胞，并设无载体和无LF2000两个对照组，经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清和DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-3(ATCC NO VR-2153)重组痘病毒。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48-72小时的温育后，收集含有带报道基因绿色荧光蛋白基因(GFP)丙肝病毒体的细胞培养物上清液。实施例(6)抗HCV单抗和抗血清的筛选。
将HepG2或Huh-7(武汉大学中国典型培养物保藏中心，细胞系编号GDC134)接种于96孔板，每个孔1.5×104个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，再在孔中加入抗E1抗体、抗E2抗体、抗C抗体、丙肝病人的血清不同稀释浓度并8孔重复；加入实施例(4)获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入0.5ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，观察孔中的蓝斑数得出结果：
实施例(7)抗HCV干扰素的筛选。
| 蓝斑数 | 10-12 | 10-11 | 10-10 | 10-9 | 10-8 | 10-7 | 10-6 |
| 抗E1抗体 | 132 | 128 | 131 | 123 | 121 | 126 | 124 |
| 抗E2抗体 | 151 | 147 | 143 | 137 | 135 | 131 | 139 |
| 抗C抗体 | 103 | 99 | 97 | 90 | 87 | 86 | 82 |
| 丙肝病人的血清 | 89 | 90 | 87 | 66 | 61 | 64 | 67 |
将HepG2或Huh-7(武汉大学中国典型培养物保藏中心，细胞系编号GDC134)接种于96孔板，每个孔1.5×104个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，再在孔中加入干扰素α-IFN、β-IFN、γ-IFN不同稀释浓度并8孔重复；加入实施例(4)获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入0.5ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，观察孔中的蓝斑数得出结果。
实施例(8)杀伤细胞的筛选。
| 蓝斑数 | 10-12 | 10-11 | 10-10 | 10-9 | 10-8 | 10-7 | 10-6 |
| α-IFN | 93 | 87 | 83 | 37 | 39 | 32 | 35 |
| β-IFN | 126 | 123 | 103 | 66 | 69 | 73 | 71 |
| γ-FN | 103 | 99 | 97 | 90 | 87 | 86 | 82 |
将HepG2或Huh-7(武汉大学中国典型培养物保藏中心，细胞系编号GDC134)接种于96孔板，每个孔1.5×104个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，再在孔中加入杀伤细胞淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)、T淋巴细胞(TK)、TC细胞、巨噬细胞、体外致敏的杀伤细胞不同稀释浓度并8孔重复；加入实施例(4)获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入0.5ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，观察孔中的蓝斑数得出结果。
实施例(9)抗HCV单抗和抗血清的筛选。
| 蓝斑数 | 10-12 | 10-11 | 10-10 | 10-9 | 10-8 | 10-7 | 10-6 |
| 杀伤细胞淋巴因子活化杀伤细胞(LAK) | 93 | 87 | 83 | 37 | 39 | 32 | 35 |
| T淋巴细胞(TK) | 126 | 123 | 103 | 66 | 69 | 73 | 71 |
| TC细胞 | 103 | 99 | 97 | 90 | 87 | 86 | 82 |
| 巨噬细胞 | 102 | 92 | 86 | 73 | 69 | 72 | 74 |
| 体外致敏的杀伤细胞 | 203 | 234 | 193 | 186 | 192 | 198 | 202 |
将HepG2或Huh-7(武汉大学中国典型培养物保藏中心，细胞系编号GDC134)接种于96孔板，每个孔1.5×104个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入抗E1抗体、抗E2抗体、抗C抗体、丙肝病人的血清不同稀释浓度并8孔重复；加入实施例(5)获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入0.5ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，用荧光显微镜观测荧光细胞数量得出结果。
实施例(10)抗HCV干扰素的筛选。
| 荧光细胞数 | 10-12 | 10-11 | 10-10 | 10-9 | 10-8 | 10-7 | 10-6 |
| 抗E1抗体 | 132 | 128 | 131 | 123 | 121 | 126 | 124 |
| 抗E2抗体 | 151 | 147 | 143 | 137 | 135 | 131 | 139 |
| 抗C抗体 | 103 | 99 | 97 | 90 | 87 | 86 | 82 |
| 丙肝病人的血清 | 89 | 90 | 87 | 66 | 61 | 64 | 67 |
将HepG2或Huh-7(武汉大学中国典型培养物保藏中心，细胞系编号GDC134)接种于96孔板，每个孔1.5×104个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入干扰素α-IFN、β-IFN、γ-IFN不同稀释浓度并8孔重复；加入实施例(4)获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入0.5ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，用荧光显微镜观测荧光细胞数量得出结果。
实施例(11)杀伤细胞的筛选。
| 荧光细胞数 | 10-12 | 10-11 | 10-10 | 10-9 | 10-8 | 10-7 | 10-6 |
| α-IFN | 93 | 87 | 83 | 37 | 39 | 32 | 35 |
| β-IFN | 126 | 123 | 103 | 66 | 69 | 73 | 71 |
| γ-IFN | 103 | 99 | 97 | 90 | 87 | 86 | 82 |
将HepG2或Huh-7(武汉大学中国典型培养物保藏中心，细胞系编号GDC134)接种于96孔板，每个孔1.5×104个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入杀伤细胞淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)、T淋巴细胞(TK)、TC细胞、巨噬细胞、体外致敏的杀伤细胞不同稀释浓度并8孔重复；加入实施例(5)获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入0.5ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，用荧光显微镜观测荧光细胞数量得出结果。
| 蓝斑数 | 10-12 | 10-11 | 10-10 | 10-9 | 10-8 | 10-7 | 10-6 |
| 杀伤细胞淋巴因子活化杀伤细胞(LAK) | 93 | 87 | 83 | 37 | 39 | 32 | 35 |
| T淋巴细胞(TK) | 126 | 123 | 103 | 66 | 69 | 73 | 71 |
| TC细胞 | 103 | 99 | 97 | 90 | 87 | 86 | 82 |
| 巨噬细胞 | 102 | 92 | 86 | 73 | 69 | 72 | 74 |
| 体外致敏的杀伤细胞 | 203 | 234 | 193 | 186 | 192 | 198 | 202 |
序列表<110>广州中海潮生物技术有限公司、广州佳德伟生物工程有限公司<120>一种用于筛选和评价抗HCV药物的方法及其应用<160>16<210>1<211>74<212>DNA<213>丙肝病毒<400>CAA AAA ACC CCT CAAGAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG GGG TTA
TGC45CT
ACTAGTACT TGA TCT GCA GAG AGG CCA 74<210>2<211>19<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
AAGGTTGGGTAAACACTCC 19<210>3<211>22<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
AACGGGGAGCTAAACACTCCTG 22<210>4<211>30<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CGA CTC CTC GCG CCT ATT ACG GCC TAC TCC 30<210>5<211>30<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
GGA GTA GGC CGT AAT AGG CGC GAG GAG TCG 30<210>6<211>48<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CGT AAG CTT AAT ACG ACT CACT AIA GCC AGC CCC CTG ATG GGG
GCG AC 48<210>7<211>25<212>DNA<213>丙肝病毒<400>CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGC 25<210>8<211>23<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CCTATCAGGCAGTAGTACCACAA 23<210>9<211>23<212>DNA<213>HCV<400>
CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTG 24<210>10<211>25<212>DNA<213>痘病毒<400>
CATAGTATCGATTACACCTCTACCG 25<210>11<211>28<212>DNA<213>痘病毒<400>
GAGAGGTTTTCTACTACTTGCTCATTAG 28<210>12<211>39<212>DNA<213>痘病毒<400>
TTAATTGTTGTCGCCCATAATCTTGGTAATACTTACCCC<210>13<211>27<212>DNA<213>痘病毒<400>
ATGAATAATACTATCATTAATTCTTTG 27<210>14<211>25<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGC 25<210>15<211>23<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CCTATCAGGCAGTAGTACCACAA 23<210>16<211>24<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTG 24主要参考文献
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3.Foumier CC et al.In vitro infection of adult normal human hepatocytes inprimary culture by hepatitis C virus.J Gen Virol.1998，79：2367-2374
4.Bouffard PP et al.Hepatitis C virus is detected in a monocyte/macrophagesubpopulation of peripheral blood mononuclear cells of infected patients.J InfectDis.1992，166：1276-1278
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22.Nicole Krieger，Volker Lohmann，and Ralf Bartenschlager，JVI.75.10.4614-4624.2001
Claims (16)
1、一种用于筛选和评价抗HCV药物的方法，它包括的步骤是：
A制备含指示的重组载体，该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组序列的NS5B编码区插入报道基因；
B用方法A制备出的载体通过一种高效增殖丙肝病毒体的方法制备出含有报道基因的HCV颗粒；
C制备出对HCV敏感的宿主细胞；
D在宿主细胞中加入要检测药物；
E用B方法制备出来的HCV颗粒感染宿主细胞；
F检测报道基因是否表达；
2、根据权利要求1所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是包括以下步骤：
A制备含指示的重组载体，该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组序列的NS5B编码区插入报道基因LacZa；
B用方法A制备出的载体通过一种高效增殖丙肝病毒体的方法制备出含有报道基因LacZa的HCV颗粒；
C制备出对HCV敏感的宿主细胞；
D在宿主细胞中加入要检测药物；
E用B方法制备出来的HCV颗粒感染宿主细胞；
F检测报道基因LacZa是否表达；
3、根据权利要求2所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是肝细胞。
4、根据权利要求2所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是哺乳动物肝细胞。
5、根据权利要求2所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是人类的肝细胞。
6、根据权利要求2所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是Huh-7细胞。
7、根据权利要求2所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是HepG2细胞。
8、根据权利要求1所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是包括以下步骤：
A制备含指示的重组载体，该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组序列的NS5B编码区插入报道基因荧光蛋白基因(GFP)；
B用方法A制备出的载体通过一种高效增殖丙肝病毒体的方法制备出含有报道基因荧光蛋白基因(GFP)的HCV颗粒；
C制备出对HCV敏感的宿主细胞；
D在宿主细胞中加入要检测药物；
E用B方法制备出来的HCV颗粒感染宿主细胞；
F检测报道基因荧光蛋白基因(GFP)是否表达；
9、根据权利要求8所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是肝细胞。
10、根据权利要求8所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是哺乳动物肝细胞。
11、根据权利要求8所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是人类的肝细胞。
12、根据权利要求8所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是Huh-7细胞。
13、根据权利要求8所述的筛选和评价抗HCV药物的方法，其特征是：所述的对HCV敏感的宿主细胞是HepG2细胞。
14、权利要求1-13中任何一种筛选和评价抗HCV药物的方法在评价单抗或抗血清抗性中的应用。
15、权利要求1-13中任何一种筛选和评价抗HCV药物的方法在评价干扰素抗性中的应用。
16、权利要求1-13中任何一种筛选和评价抗HCV药物的方法在评价杀伤细胞抗性中的应用。
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|---|---|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103687868A (zh) * | 2011-07-06 | 2014-03-26 | 吉利德科学股份有限公司 | Hcv基因型4复制子 |
| CN104558127A (zh) * | 2013-10-14 | 2015-04-29 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法 |
-
2002
- 2002-07-22 CN CNA021255881A patent/CN1470641A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103687868A (zh) * | 2011-07-06 | 2014-03-26 | 吉利德科学股份有限公司 | Hcv基因型4复制子 |
| CN104558127A (zh) * | 2013-10-14 | 2015-04-29 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法 |
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