CN1452661A - 用于监测hiv药物抗性的病毒载体 - Google Patents
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Abstract
提供了用于检测HIV和监测HIV药物抗性的重组表达载体和方法。该方法包括：采集细胞培养物；在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，所述重组病毒载体含有报道序列和受体序列，所述报道序列含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的培养物中的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，所述受体序列含有CD4和一种或多种共同受体基因，其表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞；用含有HIV的样品感染转导的细胞；在细胞培养物中加入一种或多种抗－HIV药物；并检测细胞中报道基因表达水平的变化。
Description
发明领域
本发明涉及重组载体和细胞系，以及检测和监测病毒感染的方法。更具体的，本发明涉及重组载体和细胞系，和检测HIV感染，监测HIV药物抗性和筛选抗HIV药的方法。
发明背景
人免疫缺陷病毒(HIV)是免疫系统的缓慢变性疾病，称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要原因。HIV 1型病毒(HIV-1)感染T-淋巴细胞的CD4+亚类导致该主要淋巴细胞亚类的耗竭，不可避免的导致机会感染、神经性疾病、肿瘤生长和最终死亡。被人免疫缺陷病毒(HIV)感染是一个缓慢过程，伴有持续高速率的病毒复制。HIV-1感染的发病机理的特征是可变但通常是长期的无症状时期，然后是急性病毒血症期。先前的工作确定了HIV疾病进程和感染性病毒、病毒抗原和病毒特异性核酸数量的增加之间的相关性(Ho等，New England J.Med.321：1621-1625(1989)；Schnittman等，AIDS Res.Hum.Retrovirus 7：361-367(1991)；Pantalco等，Nature 362：355-358(1993))。
开发了各种试剂和试验用于检测HIV的感染和监测HIV在体内的进程。例如，使用了计算CD4+细胞的耗竭来指示AIDS的预后。在世界范围内还利用了血清学筛选技术来检测HIV，其中检测针对HIV抗原，例如HIV p24抗原的存在。
目前大多数医院和筛选实验室采用ELISA试验测定血清样品。然而，目前使用的ELISA试验可能不敏感，不足以检测所有感染HIV的个体。这是由于一些感染了HIV的个体没有可检测水平的针对HIV的血清抗体。在检测HIV感染和血清转化之间有显著的时间延迟。另外，一些感染了HIV但是血清阴性的个体可能永不转化，但将在其一生中保持被感染状态。因此，这种筛选方法可产生假阴性，它反过来可增加由这些个体使健康人感染HIV的可能性。
描述了另一种在血清阴性个体中检测HIV感染的方法(Jehuda-Cohen，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3972-3076(1990))，其中从血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后与促分裂原，例如商陆促分裂原接触。分离的PBMC与商陆促分裂原一起培养，导致PBMC分泌对HIV特异性的免疫球蛋白。ELISA试验不能检测所有感染HIV的个体，通过误导感染了HIV的个体他们没有被感染，使公众受到威胁，因此使得感染HIV的个体将更有可能不知不觉的感染其它人。
还用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增血浆HIV RNA(美国专利号5,674,680)，确定HIV的存在。用该方法检测外周血中的三种HIV mRNA：AIDS病人、感染HIV但无症状的个人和接受AIDS治疗的个人的未剪接的、多重剪接的、和单剪接的mRNA。然而，需要确定HIV mRNA水平和AIDS预后中的差异之间的相关性。
已开发了许多抗病毒药，通过靶向HIV反转录酶和蛋白酶来抑制HIV感染和复制。在长期用一种药物治疗后获得有限的成功，病毒负荷下落相当小，然后血液中可检测的病毒量上升，推测是由于产生HIV药物抗性株。HIV对药物的抗性不仅与HIV的高突变率有关，还由于长期抗-HIV药物治疗的选择性压力。从原始描述HIV-1的分离物对齐多夫定(AZT)的易感性减低(Larder等，Science(1989)243：1731-1734)开始，文献描述了在不同临床状态下，用不同的试验系统对AZT的易感性降低，和负责易感性变化的基因突变。例如，未用AZT治疗的个体的分离物显示对AZT的易感性范围狭窄，50％抑制浓度(IC50)范围是0.001-0.04μM(Larder等，(1989)，见上；Rooke等，AIDS(1989)3：411-415；Land等，J.Infect Dis(1990)161：326-329；Richman等，J.AIDS(1990)3：743-746；Tudor-Williams等，Lancet(1992)339：15-19)。该易感性的狭窄范围对于所有年龄和所有HIV感染阶段的个体的HIV分离物是典型的。然而，接受AZT的病人的HIV分离物在几个月到几年缓慢地显示对AZT的易感性进行性降低。还报道了长期治疗中的一个病人的HIV-2分离物对AZT易感性的降低(Pepin等，第八届国际AIDS会议，Amsterdam，The Netherlands，July 19-24，1992 Abstract PoA 24401)。除了AZT，对于其它核苷和非核苷抗反转录病毒药物也可见HIV抗性。例如对AZT抗性的分离物显示对其它含有3’-叠氮基团，包括3’-叠氮-2’，3’-双脱氧尿苷、3’-叠氮-2’，3’-双脱氧鸟苷和3’-叠氮-2’，3’-双脱氧腺苷的易感性下降(Larder等(1989)，见上；Larder等，Antimicrob Agents Chemother(1990)34：436-441)。另外，报道了AZT-分离物显示对双脱氢双脱氧胸苷的交叉抗性(Rooke等，Antimicrob.Agents Chemother.(1991)35：988-991)。
对HIV分离物的药物抗性不限于反转录酶的抑制剂，实际上所有抗HIV治疗的药物靶标都容易产生抗性。例如，分离了对蛋白酶抑制剂具有抗性的突变体，它显示对蛋白酶抑制剂的易感性降低8倍(Patterson等，第八届国际AIDS会议，Amsterdam，The Netherlands，July 19-24，1992 Abstract ThA 1506)。
在最近5年来，随着抗HIV药物的开发和组合治疗的利用，用多种抗病毒药物(“混合物(cocktail)”)治疗HIV感染导致了用常规检测方法血液中病毒RNA量和可检测的病毒减少。已显示用3种或多种抗病毒药物，例如印地那韦、齐多夫定和拉米夫定，或者，用奈韦拉平、齐多夫定和地丹诺辛组合治疗先前未治疗的病人，导致病毒负荷显著下降(Wainberg，M.A.和Friendland，G.JAMA(1998)279：1977-1983)。据信，所用的组合抗病毒方案必须阻止病毒复制达到不发生编码药物抗性的突变的程度。然而，目前的研究显示，越来越多的病人用组合药物方案失败(Deek，S.等，5届反转录病毒和机会感染会议，Chicago，Feb.1-5，1998，Abstract #419)。寻找对其有效的拯救治疗是困难的。
在临床环境中，常常检测不到药物抗性，直到病人显示疾病进展的症状，一般观察不到直到在产生了病毒的药物抗性株后才直到变得明显。因此，很清楚需要一种检测法，它能够表明病毒株的药物抗性，因此可以改变病人的药物治疗，并优选立即检测到抗性而不是拖延到观察到临床症状。
目前，对于HIV对抗病毒药物易感性的最常用检测法是检测HIV的实验室株在类淋巴母细胞系中的细胞病理学、p24产生或反转录酶产生的抑制。这些检测法不容易用于HIV的临床分离物。常用的临床分离物的药物易感性试验的例子是CD4-HeLa细胞中的多核体聚焦试验(Chesebro，B.和Wehrly，K.，J.Virol.(1988)62：3779-3788)，原代外周血单核细胞中p24产生的抑制，和用来自病人血液的培养的原代T-细胞进行反转录酶(RT)试验(Richman等，于：Current Protocols inImmunology，Coligan等编，(1993)Brooklyn，J.Wiley)。
与多核体聚焦试验有关的缺点之一是它可能仅检测显示多核体诱导表型的HIV病毒，在实践中这仅可能从少数血清阳性个体的标本中获得。而且多核体聚焦试验不能用于筛选影响翻译后加工的药物，例如糖苷酶和蛋白酶抑制剂。在另一方面，p24和RT试验还受到难以定量、低灵敏度和不确证的临床效力的限制。
发明简述
提供了一种重组细胞，它含有：引入重组细胞的报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒的基因组表达的；重组细胞能细胞分裂，并表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，它们促使HIV病毒生产性感染重组细胞；和重组细胞使感染该重组细胞的HIV病毒复制并感染重组细胞培养物中未感染的细胞。
本文所用的将报道序列引入重组细胞指用任一种不同的重组方法，包括但不限于转化、转染和转导将序列引入细胞。
重组细胞可优先地表达足够数量的细胞表面受体，使重组细胞接受基本上所有的HIV株。另外，重组细胞可以表达所选的一组细胞表面受体，以致重组细胞接受所选的一组HIV株。重组细胞能表达的细胞表面受体的例子包括但不限于：CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
稳定转移的报道序列可任选的含有启动子序列，包括HIV特异性增强子序列，和报道基因，通过HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列的结合调节其表达。根据该改变，HIV特异性反式激活蛋白优选是Tat，HIV特异性增强子序列优选含有至少一个TAR序列的拷贝。另外，HIV特异性蛋白质可任选的通过HIV特异性蛋白质和存在于重组细胞中的反式激活蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用来，调控报道序列的表达。
HIV特异性蛋白质的例子包括但不限于HIV蛋白质Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。HIV特异性蛋白质可任选的是HIV反式激活蛋白，例如Tat。
重组细胞中报道基因的表达可以是由HIV特异性蛋白质上调或下调。
提供了一种检测样品中HIV病毒存在的方法，包括：取一种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是由HIV病毒基因组在HIV病毒感染重组细胞后表达的；使细胞培养物与要分析样品中HIV病毒存在的样品接触；和检测重组细胞培养物中报道基因表达水平的改变。
还提供了一种方法，用于检测不同HIV病毒株在样品中的存在，包括：取第一种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体能使第一种细胞培养物接受第一组HIV株，但不能使第一组细胞培养物接受第二组不同的HIV细胞株，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是由HIV病毒基因组在HIV病毒感染重组细胞后表达的；取第二种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体能使第二种细胞培养物接受第二组HIV株，但不能使第二组细胞培养物接受第一组不同的HIV细胞株，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是由HIV病毒基因组在HIV病毒感染重组细胞后表达的；使第一和第二种细胞培养物与要分析样品中HIV病毒存在的样品接触；检测第一细胞培养物中报道基因表达水平的改变；检测第二细胞培养物中报道基因表达水平的改变；根据第一或第二中细胞培养物中是否产生报道基因表达水平的改变，把第一和第二组病毒株区别开。
根据上述方法，重组细胞的第一和第二种培养物可任选的彼此混合。第一和第二种重组细胞培养物中的报道基因还可任选的彼此不同，从而第一种细胞培养物的细胞可以与第二种细胞培养物中的细胞区别开来。这使得可以在含有两种培养物的细胞的一个孔中检测不同的HIV病毒株。
还提供了在样品中检测HIV药物抗性的方法，包括：取一种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂。(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是由HIV病毒基因组在HIV病毒感染重组细胞后表达的；使细胞培养物与要分析样品中HIV病毒存在的样品接触；在细胞培养物与样品接触前后加入一种或多种抗HIV药；和检测重组细胞培养物中报道基因表达水平的改变。
还提供了一种取一个已知被一种或多种HIV株感染的病人，并确定一种或多种抗HIV药的组合是否对治疗该病人有效的方法，该方法包括：取多种细胞培养物，各种培养物含有重组细胞，其(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是由HIV病毒基因组在HIV病毒感染重组细胞后表达的；使细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；在细胞培养物与样品接触前后，在各细胞培养物中加入不同组的一种或多种抗HIV药；和比较多种细胞培养物中报道基因的表达。
一种筛选抗HIV活性的组合物的方法，包括：取一种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是由HIV病毒基因组在HIV病毒感染重组细胞后表达的；使细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；在细胞培养物与样品接触前后，加入一种或多种对于细胞培养物的抗HIV活性未知的药物；和检测细胞培养物中报道基因表达水平的改变。
根据上述任一种方法，用于这些方法的细胞培养物中的重组细胞可任选的含有引入重组细胞的报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒的基因组表达的；重组细胞能细胞分裂，并表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，它们促使HIV病毒生产性感染重组细胞；和重组细胞使感染该重组细胞的HIV病毒复制并感染重组细胞培养物中未感染的细胞。
还根据上述任一方法，HIV特异性蛋白质可以是任一HIV蛋白质Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。HIV特异性蛋白质可任选的是HIV反式激活蛋白，例如Tat。
还根据上述任一方法，报道序列可含有启动子序列，其含有HIV特异性增强子序列，和报道基因，通过HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列的结合调节其表达。在一个改变中，HIV特异性反式激活蛋白是Tat，HIV特异性增强子序列含有至少一个TAR序列的拷贝。
还根据上述任一方法，由重组细胞表达的一种或多种额外细胞表面受体可包括但不限于：CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
还根据上述任一方法，检测细胞中报道基因表达水平的改变可包括检测单个细胞中报道基因表达水平的改变。
还根据上述任一方法，检测细胞中报道基因表达水平的改变可包括在整个细胞培养物中检测报道基因表达水平的改变。
还根据上述任一方法，检测细胞中报道基因表达水平的改变可包括检测是否在细胞培养物中存在病毒复制。
还根据上述任一方法，检测细胞中报道基因表达水平的改变可包括将与样品接触的细胞表达水平和与一种或多种对照样品接触的表达细胞水平比较。
还根据上述任一方法，样品可以是任何可能含有HIV的样品，包括但不限于全血、血清、分离的外周血细胞、T细胞和骨髓。
还提供了试剂盒，用于进行各种本发明的方法。这些试剂盒可包括本发明的细胞系和用于进行这些方法的任何两种或多种成分。
在一个变化中，提供了一种试剂盒，它含有：第一和第二种重组细胞系，各重组细胞系含有：引入重组细胞的报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒的基因组表达的，重组细胞能细胞分裂，并表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，它们促使HIV病毒生产性感染重组细胞；和重组细胞使感染该重组细胞的HIV病毒复制并感染重组细胞培养物中未感染的细胞；其中第一种重组细胞系表达的一种或多种额外细胞表面受体使得第一种重组细胞系接受第一组HIV株，第二种重组细胞系表达的一种或多种额外细胞表面受体使得第二种重组细胞系接受第二组不同的HIV株。
根据该变化，第一和第二种重组细胞系可任选的在试剂盒中一起混合。还根据该变化，第一种重组细胞系可任选的含有第一个报道基因，第二个重组细胞系可任选的含有第二种不同的报道基因，其使得第一和第二种重组细胞系分别被识别。
本发明还提供了用于产生上述重组细胞的重组病毒载体。重组病毒载体含有：报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在重组病毒载体转导细胞感染后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
在一个优选例中，重组病毒载体是重组腺病毒载体。重组腺病毒载体可能是不能复制的，但携带腺病毒包装信号。载体携带编码HIV受体的基因，例如CD4、CXCR4和CCR5，和报道基因，例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、荧光蛋白(例如GFP和BFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、激素和细胞因子。载体还可以携带编码白细胞介素(例如IL-2和IL-12)的基因，它使转导的细胞更容易受到HIV感染。载体还可以携带真核聚腺苷酸化序列，例如SV40聚腺苷酸化位点或BGH聚腺苷酸化位点。
编码HIV受体的基因可置于位于腺病毒载体靠近左侧末端重复(L-TR)的E1区组成型(例如CMV和SV40)或可诱导(例如四环素诱导)启动子的转录控制下。报道基因可置于重组腺病毒载体的右侧末端，例如在重组腺病毒载体靠近右侧末端重复(R-TR)的E4区中。
各种HIV受体可以用一个携带所有HIV受体的重组病毒载体，或多个重组病毒载体，各携带一个或多个HIV受体，转移到细胞中，赋予细胞不同的向性。
另外，可用重组质粒将受体序列和报道序列引入细胞。重组质粒含有：报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在重组质粒转染感染细胞后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转染的细胞，并使感染了转染的细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒质粒转染的细胞培养物中未感染的细胞。
本发明还提供了一种产生上述重组细胞的试剂盒。该试剂盒含有：重组病毒载体和能被载体感染的细胞系，重组病毒载体含有报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在重组病毒载体转导的细胞系中的细胞感染后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染，转导细胞的HIV病毒复制，并感染重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
本发明还提供了一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒存在的方法。该方法包括：取一种细胞培养物；在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，重组病毒载体含有报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在重组病毒载体转导的培养物中的细胞感染后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
另外，本发明的重组细胞可以通过用含有报道序列的重组病毒载体转导已表达CD4和一种或多种HIV共同受体，例如CXCR4和CCR5的细胞产生。
可任选的，本发明的重组细胞还可以通过用表达CD4和一种或多种HIV共同受体的重组病毒载体转导已含有报道序列的细胞产生。
可任选的，本发明的重组细胞还可以通过用含有报道序列的重组病毒载体转导已以足够促使HIV病毒在细胞中生产性感染的水平表达CD4和一种或多种HIV共同受体，例如CXCR4和CCR5的细胞产生。
本发明的重组细胞还可以通过用多个重组病毒载体，各种多个重组病毒载体表达受体序列，例如编码CD4、CXCR4和CCR5的基因，或报道序列，转导细胞产生。
本发明的重组病毒载体还可用于转导天然表达CD4或共同受体(例如CXCR4和CCR5)，但以比人工表达系统的水平(例如本发明系统的重组表达载体)低的水平表达的细胞。通过在细胞内引入携带HIV受体的载体，HIV受体的表达水平可用强启动子(例如CMV和SV40启动子)显著增加，以超过表达受体。
本发明的重组病毒载体还可用于产生在受控的时间段内，通过使用可诱导启动子，或在较短的时间段内，通过使用腺病毒载体表达受体的细胞。这使得多方面和有效产生各种各样能用于检测细胞中HIV感染、筛选抗HIV药物和检测细胞中的HIV药物抗性的细胞。
附图简述
图1A说明HIV受体和报道基因的表达质粒。
图1B说明HIV受体和报道基因的逆转录病毒载体。
图2A说明人CD4和CXCR4受体的表达质粒。
图2B说明lacZ报道基因的质粒。
图3A显示在HIV病毒存在下培养的HeLaT4细胞，和随后用X-Gal处理。
图3B显示在HIV病毒存在下培养的HeLa D4R4细胞，和在最初感染后1天用X-Gal处理。
图3C显示在HIV病毒存在下培养的HeLa D4R4细胞，和在最初感染后3天用X-Gal处理。
图3D显示在HIV病毒存在下培养的HeLa D4R4细胞，和在最初感染后4天用X-Gal处理。
图3E显示在HIV病毒存在下培养的HeLa D4R4细胞，和在最初感染后5天用X-Gal处理。
图3F显示在HIV病毒和AZT存在下培养的HeLa D4R4细胞，和随后用X-Gal处理。
图4A说明人CD4、CXCR4和CCR5受体的穿梭质粒。
图4B说明报道基因的穿梭质粒。
图5A说明人CXCR4和CCR5受体的穿梭质粒。
图5B说明人CD4受体的穿梭质粒。
图6说明构建本发明重组腺病毒载体的示意图。
发明详述
本发明涉及新颖和有用的方法，包括检测HIV的方法，检测HIV药物抗性的方法，设计为病人定制的抗HIV药物混合物治疗的方法，和筛选抗HIV活性的组合物的方法。还提供了可用于本发明的方法的新颖载体和细胞系。
本发明的方法使用重组细胞，它们：(a)能细胞分裂；(b)允许HIV病毒；(c)表达一种报道基因，其表达受到HIV感染的选择性调控；和(d)允许HIV在受感染的细胞中复制，这种感染使相同细胞培养物中最初未被感染的细胞被感染。重组细胞通过表达细胞表面受体，例如CD4、CXCR4和CXCR5能接受HIV病毒。可通过用几种分别携带报道基因和受体基因的质粒或载体转染细胞，产生重组细胞。另外，可用同时携带HIV受体(CD4)和共同受体(例如CXCR4和CXCR5)的报道基因和基因的单个质粒或不能复制的病毒载体转染细胞，产生重组细胞。
本发明提供的优点之一是所用的重组细胞能细胞分裂。结果，容易产生和维持这些细胞，从实施本发明的各种方法。
本发明提供的另一个优点是重组细胞可被多种不同的HIV病毒株感染，包括来自临床分离物或实验室适应株的野生型和突变型HIV株。结果，本发明的方法可广泛应用于所有HIV病毒株。
本发明的还有一个优点是可方便监测和测定HIV病毒对重组细胞的感染。通过使用一种表达受到HIV感染调控的报道基因，可以用简单的检测方法，例如比色法检测HIV感染。通过受到HIV感染选择性调控的报道基因的表达，减少了例如由于非HIV病毒感染引起的假阳性信号。
本发明的另一个优点是重组细胞不仅允许HIV病毒进入和感染，还促使其在重组细胞中有效复制，并传递成熟HIV病毒颗粒以感染培养物中的其它细胞。通过使用一种细胞系(其中HIV能感染培养物中的一些细胞，复制，然后感染培养物中的其它细胞)，并通过将病毒复制与细胞分裂结合，使报道基因产生的信号放大，因为细胞培养物内被感染的细胞比在没有HIV复制的情况下被感染的多。例如，样品中所含的一个病毒粒子最终能够感染细胞培养物中所有的细胞。该特征使得施加到重组细胞培养物中的样品所含的HIV病毒能被灵敏检测到。
通过利用上述优点，以及下面详述的特征，可在许多与HIV有关的实验室和临床应用的各种方法和试验中使用重组细胞系。
应注意的是，本发明的方法和细胞可以针对除了HIV外的各种病毒可以改变和适应，包括但不限于逆转录病毒、冠状病毒、疱疹病毒和腺病毒。例如，可构建无限增殖细胞系，它含有一系列受体和共同受体，使得靶病毒的一种或多种病毒株能够感染、复制和扩增；和一种报道基因，其表达受到靶病毒表达的特定基因产物的调控。
1.重组细胞系
本发明的一个方面涉及用于检测HIV病毒感染的重组细胞。在一个实施例中，重组细胞含有：
一种引入重组细胞的报道序列，含有一种报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；
重组细胞能细胞分裂，并表达一个CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，其促使HIV病毒生产性感染重组细胞；和
重组细胞使感染重组细胞的HIV病毒复制并感染重组细胞培养物中未感染的细胞。
报道基因表达的调控可涉及上调，其中HIV特异性蛋白质导致报道基因的表达开始或增加。另外，报道基因表达的调控可涉及下调，其中HIV特异性蛋白质导致报道基因的表达停止或减少。
HIV特异性蛋白质可以是HIV反式激活蛋白，例如Tat，一种HIV调控蛋白例如Rev，HIV辅助蛋白，例如Vpr、Vprx、Vif、Vpu和Nef，HIV结构蛋白，例如Gag和Env，或HIV酶蛋白，例如RT(反转录酶)、PR(蛋白酶)和IN(整合酶)。报道基因的调控可以用本领域已知的各种方法实现。例如，报道基因的表达可以通过反式激活蛋白Tat与含有至少一个TAR序列拷贝的上游增强子序列直接结合来调控。另外，报道基因的表达可以通过HIV特异性蛋白和存在于重组细胞中的反式激活蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用来调控。
在该实施例的一个变化中，重组细胞中的报道序列含有一种启动子序列，包括HIV病毒特异性增强子序列，和报道基因，其表达受到HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列的结合调控。
根据此优选例，重组细胞中报道基因表达的调控是用包括HIV病毒特异性增强子序列的启动子序列实现的，该增强子序列对HIV特异性反式激活蛋白有转录反应性。HIV病毒感染后，HIV基因组表达的HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列结合，增强报道基因的表达。检测报道基因产物的存在与否或水平，用于指示HIV病毒的感染。
在一个特定优选例中，报道序列含有TAR序列的至少一个拷贝，作为HIV病毒特异性增强子序列。报道序列的表达受到HIV特异性反式激活蛋白Tat与增强子序列TAR的结合调控。
各种各样的报道基因可在本发明的实施例中用于报道基因编码的蛋白质，但不限于，容易试验检测的酶，例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和增强的青色荧光蛋白(ECFP)；和可方便使用免疫检测法的蛋白质，例如激素和细胞因子。这些报道基因的表达还可以通过测定这些基因转录的mRNA水平监测。
重组细胞表达的一种或多种额外的细胞表面受体可任选的包括但不限于CXCR4、CCR5、其它趋化因子受体例如CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1，和趋化因子受体样孤独蛋白，例如STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
CD4和这些一种或多种额外的细胞表面受体的存在使具有不同嗜性的HIV病毒株能有效进入、感染和复制。使重组细胞表达尽可能多的细胞表面受体，使重组细胞能接受几乎所有的HIV病毒株，而不论其嗜性。这可以通过用所有已知参与HIV感染的细胞表面受体转染或转导细胞，或通过与细胞(例如T细胞或单核细胞，其在细胞表面上表达这些受体)的细胞融合来实现。另外，通过使重组细胞表达某些细胞表面受体，或几组细胞表面受体，能设计重组细胞，使其接受某些HIV病毒株而不接受其它HIV病毒株。因此，通过筛选表达哪一种细胞表面受体，可设计细胞系用于筛选特定的HIV病毒株或组。
与HIV病毒生产领域所用的人T-细胞比较，本发明的重组细胞系较容易培养，更稳定，价格低廉。已证实由HIV-1靶向的主要细胞类型是在体内通过CD4受体途径的辅助型T-淋巴细胞和单核细胞巨噬细胞谱系的细胞，而是在组织培养系统中，HIV是CD4+-淋巴细胞病变性的，且导致巨噬细胞功能失调，这直接引起体内T-细胞耗竭。由于在感染的个体中复制性的HIV可方便地在外周血和淋巴结中检测到，特别频繁地使用人外周血单核细胞(PBMC)作为HIV体外感染和抗HIV药物易感性测试的宿主细胞。PBMC细胞的缺点之一是这些原代细胞必须从供体中获得，小心培养并每次新鲜制备。这些原代T-细胞用于商业目的昂贵并且效率低。另外，这些T-细胞对HIV病毒的不同病毒株的接受性随供体而变，导致临床检测的不确定性。因此，以大量供应的方式生产的本发明重组细胞是接受HIV感染，相对稳定并可更容易的在体外培养和操纵及适合大批量的商业复制，和用于高通量筛选。
2.检测样品中HIV的方法
提供了检测样品中HIV病毒存在的方法。在一个实施例中，该方法包括：
取一种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV病毒复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道系列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；
使细胞培养物与要分析样品中HIV病毒存在的样品接触；和
检测重组细胞培养物中报道基因表达水平的改变，该改变表明样品中存在HIV病毒并感染细胞培养物中的细胞。
该方法使用的重组细胞培养物可以是具有上述特征的任何细胞培养物。第I节所述的重组细胞是具有这些特征的细胞的例子，可用于该方法。
可通过检测单个细胞中报道基因表达水平的改变，或细胞培养物中报道基因的表达水平的改变，来检测培养物中细胞的报道基因的表达水平的改变。
在一个实施例中，检测表达水平的改变包括检测细胞培养物中是否存在病毒复制。可通过检测最初被感染的细胞，和检测不是最初被感染的细胞培养物中细胞表达水平的改变来检测病毒复制。
在另一个实施例中，检测表达水平的改变包括比较与样品接触的细胞中的表达水平与一种或多种对照样品接触的细胞的表达水平。例如，与不含HIV病毒的样品接触的细胞可作为阴性对照，而与含有HIV病毒、重组和稳定化的HIV病毒，或其它能感染细胞并导致HIV特异性蛋白质表达的病毒，例如编码Tat的修饰的腺病毒的样品接触的细胞可作为阳性对照。使用合适的对照，报道基因表达的诱导与HIV感染可有更好的相关性。
本发明还提供了一种产生重组细胞的方法，然后检测样品中HIV病毒的存在。该方法包括：
取一种细胞培养物；
在培养物中加入重组病毒载体，以转导细胞，该重组病毒载体含有：
一种报道序列，含有报道基因，其表达受到对HIV特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的培养物中的细胞后由HIV病毒基因组表达的，和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞；
使细胞培养物与要分析样品中存在HIV病毒的样品接触；和
检测培养物中细胞的报道基因的表达水平的改变。
根据该方法，重组细胞可通过用含有报道基因和受体基因的腺病毒载体转导细胞而产生。这些基因的表达是附加型，因此导致最小基因毒性。另外，转导的细胞中腺病毒表达对于较长的时间(几周)是稳定的，使得各种细胞操作，例如用于检测病人样品中HIV的存在有足够时间。这些重组病毒载体的例子如第6节所述。
本发明还提供了一种检测已被HIV感染或可被HIV感染的培养物中HIV病毒存在的方法。该方法包括：
取一种细胞培养物，它能促使细胞的生产性感染，并使感染细胞的HIV病毒复制，并感染细胞培养物中未感染的细胞；
在培养物中加入重组病毒载体，以转导细胞，该重组病毒载体含有：
一种报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在培养物中的细胞感染后由HIV病毒的基因组表达的；和
检测培养物中细胞内报道基因的表达水平。
根据该方法，细胞可以是或可以不是重组的。例如，衍生自PBMC的稳定细胞系对HIV感染是敏感的。这种细胞已被HIV感染，或被HIV感染的细胞可加入细胞培养物中。在细胞被重组病毒载体转导后，病毒载体携带的报道基因表达可以通过对HIV病毒特异性的蛋白质(例如Tat)调控，这可通过测定报道基因的表达水平检测。
应注意的是，报道基因的调控可以上调或下调。因此，报道基因的表达水平的改变可以是报道基因表达的增加或减少。
上述方法可用于诊断各种样品(包括但不限于全血、血清、分离的外周血细胞、T细胞、其它生物液例如尿液、唾液、泪液和精液)中所含的HIV病毒和实验室和临床获得的分离的野生型或突变型HIV病毒。例如，可用上述方法检测个体的全血用于测试HIV病毒的存在。另外，可筛选来自单个捐献者的血液或骨髓样品和血库中储藏的汇聚的血液样品中HIV病毒的存在。该方法检测甚至一个HIV病毒颗粒的灵敏性使得可在HIV感染的很早阶段诊断病人中的HIV，并可用于防止HIV阳性血液被转输给病人。
使用上述HIV诊断方法的一个优点是重组细胞仅对HIV病毒特异性反应。由于报道基因的表达是由HIV特异性基因产物特异性调控的，因此可在临床上避免诊断中的不确定性或假阳性报道。另一方面，通过使用上述方法，可在被HIV感染但没有可检测水平的血清抗体(血清阴性)的病人中检测HIV病毒，从而减少使用基于抗体的检测方法可能引起的假阴性事故。
上述方法还可用于扩增HIV病毒，尤其是在血液样品中出现少和逃避其它检测的病毒株。随着HIV病毒在重组细胞中复制和扩增，可在细胞培养物中产生高滴度的HIV病毒，并分离，用于克隆新的HIV病毒株等进一步的研究。
上述方法还可用于通过使用选择性表达某些HIV共同受体的重组细胞，在样品中甄别HIV病毒株或嗜性。例如，可在第一重组细胞系中选择性表达T-嗜性病毒株所需的CXCR4共同受体，使HIV的T-嗜性病毒株感染。同时，由于M-嗜性病毒株需要CCR5共同受体来感染细胞，可构建第二种重组细胞系，选择性表达CDR5，使HIV的M-嗜性株感染。通过使第一和第二种重组细胞系表达不同的共同受体，第一和第二种重组细胞系可在其它HIV病毒株存在下选择性检测T-嗜性、M-嗜性或双重嗜性株。
另外，第一种重组细胞系可包括第一种报道基因，例如GFP，而第二种重组细胞系可包括第二种报道基因，例如EBFP。当第一和第二种细胞系在一种培养物中混合，并与含有未知嗜性的HIV病毒的样品接触时，一种报道基因的选择性表达可指示病毒的一种嗜性，而两种报道基因的表达表明双重嗜性。在显微镜下观察到的第一和第二种细胞系发射的不同荧光将能分别鉴别一种培养物中的各种细胞系。
上述方法可用于定量分析样品中的HIV病毒。例如，通过使用具有不同的滴度的对照样品，通过与对照样品比较可容易地计算病毒负荷。另外，还可通过系列稀释样品直到在多个细胞培养平板中达到终点感染，即一些细胞培养平板被感染而其它平板不被稀释的样品感染，来确定样品的病毒滴度。
3.检测HIV药物抗性的方法
还提供了检测样品中HIV药物抗性的方法。这些方法还可用于检测用一种或多种药物治疗HIV感染的一个疗程是否由于存在对所用的一种或多种药物抗性的一种或多种HIV病毒株而无效。这些方法还可用于分离对一种或多种抗HIV药物抗性的HIV病毒株。
在一个实施例中，该方法包括：
取一种重组细胞的培养物，其(a)能细胞分裂。(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道序列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；
使细胞培养物与含HIV病毒的样品接触；在细胞培养物与样品接触前后在细胞培养物中加入一种或多种抗HIV药；和
检测细胞中报道基因的表达水平的改变。
在另一个实施例中，提供了一种检测样品中HIV药物抗性的方法。该方法包括：
取被HIV病毒感染的细胞培养物，细胞能促使细胞生产性感染，并使感染细胞的HIV病毒复制并感染细胞培养物中未感染的细胞；
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，重组病毒载体包括：
报道序列，其含有表达受到HIV表达特异性的蛋白质调控的报道基因，该蛋白质是培养物中的细胞被感染后由HIV病毒的基因组表达的；
在细胞培养物中加入一种或多种抗HIV药物；和
检测细胞中报道基因的表达水平的改变。
根据该实施例，细胞细胞可以是或可以不是重组的。在用重组病毒载体转导细胞之前，细胞已被HIV感染，或可以通过在细胞培养物中加入HIV被感染。细胞被重组病毒载体转导后，可通过对HIV特异性的蛋白质，例如Tat调控载体携带的报道基因的表达。在抗HIV药物存在或不存在下，检测报道基因表达水平的改变应提供HIV对这些药物的抗性信息。
本方法中使用的抗HIV药物可以是任何具有已知抗HIV活性，临床使用前或临床测试的药物。可用于筛选HIV药物抗性的抗HIV药物的例子包括但不限于核苷RT抑制剂，例如齐多夫定、地丹诺辛、扎西他宾、拉米夫定、斯塔夫定、阿巴卡韦、非核苷RT抑制剂，例如奈韦拉平、地拉夫定、依非韦伦(EFAVIRENZ)，蛋白酶抑制剂，例如印地那韦、利托那韦、沙奎那韦、奈非那韦、安泼那韦，HIV整合酶抑制剂，HIV融合抑制剂及其组合。
用于该方法的重组细胞培养物可以是任何具有上述特征的细胞。第I节所述的重组细胞是具有这些特征的细胞的例子，并可用于该方法。
可通过检测单个细胞中报道基因的表达水平的改变，或细胞培养物中表达基因的表达水平的改变，来检测培养物中细胞的报道基因的表达水平的改变。
在一个实施例中，检测表达水平的改变包括检测细胞培养物中是否存在病毒复制。可通过检测最初被感染的细胞，和检测不是最初被感染的细胞培养物中细胞表达水平的改变来检测病毒复制。
在另一个实施例中，检测表达水平的改变包括比较与样品接触的细胞中的表达水平与一种或多种对照样品接触的细胞的表达水平。例如，与含HIV病毒的样品接触，但不与一种或多种抗HIV药物接触的细胞可作为阴性对照，而与含添加对一种或多种抗HIV药物未知有抗体的HIV病毒的样品接触的细胞可优先作为阳性对照。使用合适的对照，报道基因表达的诱导与HIV病毒对药物的抗性有更好的相关性。
应注意的是，报道基因调控可以上调或下调。因此，报道基因的表达水平的改变可以是报道基因表达的增加或减少。
在该实施例的一个变化中，细胞培养物与一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触前接触。另外，细胞培养物可以与一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触后接触，并培养足够的时间，使HIV病毒发生复制。这对于在测试药物抗性前在样品中具有低滴度的HIV病毒的最初复制特别有利。
上述方法可用于检测病人样品中所含的HIV病毒、分离的病毒原种或实验室适应的HIV病毒株的药物抗性。由于重组细胞对一个HIV病毒颗粒的超敏感，逃过药物疗法的HIV病毒株或哪些不是主要的循环变体的病毒株可在细胞培养物中复制并分离，用于进一步基因型分析。
比较来看，用于检测抗HIV药物抗性的方法较不灵敏，耗费时间而且需要一定的技术水平。目前使用的方法包括基于PCR扩增病毒RNA，然后对扩增的DNA模板进行测序的检测HIV基因组突变的基因型检测法，和基于重组HIV病毒的表型检测法(Hirsch，M.S.(1998)JAMA 279：1964-1991)。不仅已开发了最灵敏的基于PCR的试验不够灵敏，不足以检测低于50拷贝/mL的血浆HIV RNA，而且由于实验室中携带其它HIV样品或来自PCR过程中的随机聚合酶差错，可产生突变的假阳性。重组病毒检测法需要首先RT-PCR扩增多于1000拷贝/mL的血浆HIV RNA，将病毒cDNA克隆入HIV载体，然后在允许的细胞系中培养病毒。整个过程花费两周以上，产生结果并且需要高度熟练的工作人员来进行该试验。
因此，本发明提供的方法能更灵敏的检测复制性HIV病毒(以仅约5个病毒颗粒/mL)，更有效的测试HIV药物抗性(小于1周)，更经济的进行高通量筛选。
4.设计为病人定制的HIV混合物治疗的方法
还提供了取一个已知被一种或多种HIV病毒株感染的病人，确定一种或多种抗HIV药物的哪种组合能有效治疗该病人的方法。这些方法可用于当一个病人最初用抗HIV药物治疗或在一个病人被一种或多种抗HIV药物治疗一段时间后，可能产生了一种或多种对所用的抗HIV药物抗性的病毒株的时候。
在一个实施例中，该方法包括：
取多种细胞培养物，各细胞培养物含有重组细胞，它们(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道系列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；
使细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；
在细胞培养物与样品接触之前或之后在各细胞培养物中加入不同组的一种或多种抗HIV药物；和
在多种细胞培养物中比较报道基因的表达。
在一个变化中，多种细胞培养物中的每一种与不同组的一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触前接触。
在另一个变化中，多种细胞培养物中的每一种与不同组的一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触后接触，并培养充足的时间使HIV病毒产生复制。
抗HIV药物可以是任何具有已知抗HIV活性的药物，例如第3部分中所述的那些药物，及其组合。
用于该方法的重组细胞的培养物可以是任何具有上述特征的细胞。第I部分中所述的重组细胞是具有这些特征的细胞的例子，可用于该方法。
可通过检测单个细胞中报道基因的表达水平的改变，或细胞培养物中报道基因的表达水平的改变，来检测培养物中细胞的报道基因的表达水平的改变。
在一个实施例中，检测表达水平的改变包括检测细胞培养物中是否存在病毒复制。可通过检测最初被感染的细胞，和检测不是最初被感染的细胞培养物中细胞表达水平的改变来检测病毒复制。
在该实施例的另一个变化中，该方法进一步包括当采用不同的抗HIV药物或不采用抗HIV药物时，比较报道基因的表达水平的改变。例如，与含HIV病毒的样品接触，但不与一种或多种抗HIV药物的样品接触的重组细胞培养物作为阴性对照，而与含HIV病毒或修饰的腺病毒的一种或多种抗HIV药物的样品接触的重组细胞培养物作为阳性对照。使用合适的对照，报道基因表达的抑制与药物的抗HIV效力有更好的相关性。
应注意的是，报道基因调控可以上调或下调。因此，报道基因的表达水平的改变可以是报道基因表达的增加或减少。
在该实施例的一个变化中，细胞培养物与一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触前接触。另外，细胞可以与一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触后接触，并培养足够的时间，使HIV病毒发生复制。这种HIV病毒的预扩增对于要测试药物抗性的含有低滴度HIV病毒的病人样品特别有利。
该部分提供的方法可用于筛选在抑制HIV病毒感染和/或复制中最有活性的抗HIV药物或药物组合。筛选可以针对几乎所有的HIV病毒株进行，不论其基因型或嗜性。产生的结果可以帮助HIV感染病人的医生监测HIV药物抗性，优化药物疗法和使用最有效的药物“混合物”来治疗病人。通过使用对于各病人定制的这种药物混合物，并在治疗过程中调节，医生可以成功地防止HIV病毒产生药物抗性。另外，医生可避免由于用无效的抗HIV药物治疗病人产生的不必要的副作用和药物毒性。
这些方法中使用的重组细胞有丰富和稳定的来源，以及培养细胞的方便，使人们能用本部分提供的方法以高通量筛选方式可能测试比其它方法更多的药物混合物组合。另外，由于病人样品中所含的HIV病毒可能携带药物抗性株，常规的药物筛选不能有效发现最佳的药物疗法。通过使用该部分提供的方法，可通过设计和彻底测试针对HIV病毒或HIV受体的不同组分的不同药物组合，容易鉴别出最有效的药物方案。
5.筛选组合物的抗HIV活性的方法
本发明还提供了筛选不知道具有抗HIV活性的组合物的抗HIV活性的方法。如本文所用的，组合物指任何物质的组合物，包括单个分子、大分子例如蛋白质和核苷酸，或两种或多种分子或大分子的组合。在一个优选例中，该方法包括：
取一种重组细胞培养物，它们(a)能细胞分裂，(b)表达CD4受体和一种或多种额外的细胞表面受体，这些受体是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV复制并感染细胞培养物中的未感染细胞，和(d)含有引入重组细胞的报道系列，其含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；
使细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；
在细胞培养物与样品接触之前或之后加入对细胞培养物不知道有抗HIV活性的一种或多种药物；和
检测细胞培养物中报道基因的表达水平的变化。
用于该方法的重组细胞的培养物可以是任何具有上述特征的细胞。第I节所述的重组细胞是具有这些特征的细胞的例子，可用于该方法。
药物可以是任何天然来源或合成产生的抗HIV候选药物。药物可以是任何靶向HIV病毒的任何组分的任何药物，例如RT抑制剂、蛋白酶抑制剂、针对HIV mRNA或病毒RNA基因组的反义和核酶寡核苷酸、TAR序列或RRE(rev应答元件)的假目标、可溶性CD4、Gag或Env蛋白突变体等竞争性抑制剂、和与HIV受体或共同受体结合，阻止HIV进入宿主细胞的药物。
可通过检测单个细胞中报道基因的表达水平的改变，或细胞培养物中报道基因的表达水平的改变，来检测培养物中细胞的报道基因的表达水平的改变。
在一个实施例中，检测表达水平的改变包括检测细胞培养物中是否存在病毒复制。可通过检测最初被感染的细胞，和检测不是最初被感染的细胞培养物中细胞表达水平的改变来检测病毒复制。
在另一个实施例中，检测表达水平的改变包括比较样品中的表达水平与一种或多种对照样品中的表达水平。例如，与含HIV病毒的样品接触，但不与任何潜在的抗HIV药物的样品接触的重组细胞培养物作为阴性对照，而与含HIV病毒和已知具有抗HIV活性的一种或多种药物的样品接触的重组细胞培养物作为阳性对照。使用合适的对照，报道基因表达的调节与药物的抗HIV效力有更好的相关性。
应注意的是，报道基因调控可以上调或下调。因此，报道基因的表达水平的改变可以是报道基因表达的增加或减少。
在该实施例的一个变化中，细胞培养物与一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触前接触。另外，细胞可以与一种或多种抗HIV药物在与含有HIV病毒的样品接触后接触，并培养足够的时间，使HIV病毒发生复制。这对于针对药物测试前样品中含有低滴度HIV病毒的初始扩增特别有利。
上述方法可用于高通量筛选针对各种含HIV样品的抗HIV候选药物，尤其是由组合化学产生的化合物文库。这些方法可以能够快速制备和处理多孔板(例如96孔培养板)中的细胞的任何方式进行。测试药物的储存液以及其它试验试剂可手工制备，所有的随后移液、稀释、混合、洗涤、培养、样品读数和数据收集可用市售的机器人移液装置、自动化工作站、分析仪器检测试验产生的信号。这些检测仪的例子包括但不限于分光光度计、比色计、光度计、荧光计和测量放射性同位素衰变的装置。
上述方法用于高通量筛选特别合算，因为重组细胞是无限增殖的，容易培养，与原代人细胞，例如PBMC细胞相比更稳定。另外，可通过在比色或荧光平板阅读机上检测96-孔培养板中的报道基因产物的水平直接监测多种药物的多个剂量对HIV感染和复制的影响。
6.本发明重组细胞系的构建
用于本发明的重组细胞系可用许多方法构建。可以通过用单独携带报道基因和受体基因的几个质粒和载体转染宿主细胞构建重组细胞系。另外，可用同时携带报道基因和受体基因的单个质粒或不能复制的病毒载体转染宿主细胞，产生重组细胞。
a)宿主细胞系
可用各种各样的无限增殖的细胞系构建本发明所用的重组细胞系。在一个实施例中，重组细胞是无限增殖的肿瘤细胞。使用肿瘤细胞的优点之一是肿瘤细胞经历较快的细胞周期或分裂，进一步增强培养物中病毒的复制和扩增。无限增殖的肿瘤细胞系可从原代肿瘤细胞或建立的肿瘤细胞系产生。另外，还可用正常细胞，只要这些细胞是无限增殖的。例子包括但不限于人转化的原代胚肾293细胞，用端粒酶基因转染无限增殖的原代细胞(Bodnar，A.G.等(1998)Science 279：349-352)和通过SV40转化无限增殖的正常细胞。这些无限增殖的细胞可无限增殖，从而提供丰富和经济的细胞来源。
可任选的，天然但低水平表达CD4或共同受体(例如CXCR4和CCR5)的细胞也可作为本发明的宿主细胞。例如，可用表达CD4和低水平的CXCR4的Hud78或CME-NKR细胞生产本发明的重组细胞。
b)报道基因和受体基因的单独载体
为了建立接受HIV感染的细胞系，首先可将CD4和一种或多种其它HIV受体转染、转导或引入无限增殖的细胞。一种或多种其它HIV受体优选包括CXCR4和CCR5受体。然后将检测HIV感染的报道基因转移到表达CD4和一种或多种HIV受体的宿主细胞中。
据信CD4受体是HIV进入宿主细胞的主要受体。近来发现特定的趋化因子受体，例如CXCR4和CCR5受体在介导HIV进入和对不同靶细胞的嗜性中起重要作用(Berger，E.A.(1997)AIDS 11，增刊.a：S3-S16；Dimitrov，D.S.(1997)Cell91：721-730综述)。HIV病毒的巨噬细胞嗜性(M-嗜性)株可在原代CD4+T细胞和巨噬细胞中复制，并利用β-趋化因子受体CCR5和较不常见的使用CCR3受体。T细胞系嗜性(T-嗜性)HIV株也可以在原代CD4+T细胞中复制，但可以在体外通过α-趋化因子受体CXCR4感染建立的CD4+T细胞系。除了CXCR4许多T-嗜性株还可使用CCR5。趋化因子受体样HIV共同受体STRL33在活化的外周血淋巴细胞和T-细胞系中表达，功能可作为HIV-1和SIV的M-嗜性、T-嗜性和双重嗜性株的Env蛋白的进入辅助因子。还用许多体外试验鉴别了其它HIV共同受体，包括趋化因子受体CCR2b、CCR3、CCR8和CX3CR1，以及几种趋化因子受体样孤独受体蛋白，例如GPR15/BOB和STRL33/BONZO。这些HIV共同受体中的几个或一组可以介导不同的HIV病毒株进入宿主细胞。通过转染、转导或将这些受体引入无限增殖细胞系，宿主细胞系可接受具有广谱嗜性的HIV株。特别是，通过无限增殖的细胞与表达已知参与与HIV感染的细胞表面受体的细胞，例如T细胞或单核细胞进行细胞-细胞融合，可用各种HIV受体同时转导无限增殖的细胞。
通过转染、转导或将选定组的共同受体引入无限增殖的细胞系或在细胞表面选择性的表达某些共同受体，可设计接受一些HIV病毒株但不接受其它HIV病毒株的细胞系。例如，可以在重组细胞中选择性表达T嗜性病毒株所需的CXCR4共同受体，使感染HIV的T嗜性株。同时，M-嗜性株需要CCR5共同受体来感染细胞。通过使重组细胞不表达CCR5共同受体，在M-嗜性株的存在下重组细胞系可选择性检测T-嗜性株。
为了高灵敏度水平的检测HIV感染，在表达CD4受体和一种或多种其它HIV受体的无限增殖细胞系中引入具有高诱导率的“分子开关”。分子开关是一种报道基因，当细胞被HIV感染时诱导其表达。可用各种报道基因，包括lacZ(编码β-半乳糖苷酶)、荧光素酶、CAT基因、SEAP基因和编码荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和增强的青色荧光蛋白(ECFP)的基因。
报道基因的启动子区含有碱性启动子和一个或多个HIV特异性增强子序列的拷贝。碱性启动子可以是任何细胞或病毒启动子，例如β-肌动蛋白启动子、胰岛素启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、HIV-LTR(HIV长末端重复)、Rous肉瘤病毒RSV-LTR和猿病毒SV40启动子的碱性启动子区。HIV特异性增强子序列可以是通过与一种或多种HIV特异性基因产物直接或间接相互作用，调节报道基因表达的任何序列。例如，可用HIV反式激活蛋白Tat的效应元件(TAR)增强报道基因的表达。在HIV感染后，病毒基因组表达的Tat与TAR序列结合，并与碱性启动子偶联，诱导报道基因的表达。可连接一个以上的TAR序列拷贝，来进一步增强报道基因的表达，提高诱导率。
另外，宿主细胞表达的HIV基因产物、DNA结合蛋白(例如GAL4 DNA结合域)、反式激活蛋白(例如衍生自单纯疱疹病毒的VP16反式激活蛋白结构域)之间的蛋白质-蛋白质相互作用可诱导报道基因的表达。HIV特异性基因产物与DNA结合蛋白以及反式激活蛋白结合后，通过将DNA-结合蛋白与反式激活蛋白大致接近来实现转录因子的重建。重新构建的转录因子然后可通过碱性启动子上游的增强子序列(例如GAL4增强子序列)和DNA结合蛋白之间的特异性结合来活化下游报道基因表达。
应注意的是，报道基因的表达还可以由HIV特异性蛋白质间接地调控。例如，报道基因的转录可在强启动子，例如噬菌体T7或SP6启动子的控制下，而T7或SP6聚合酶的表达由含有碱性启动子和HIV特异性增强子序列的启动子调控。HIV特异性蛋白与增强子序列结合后，增强了T7或SP6聚合酶的表达。结果细胞中表达的T7或SP6聚合酶可以与报道基因上游的T7或SP6启动子结合，诱导细胞中报道基因的表达。
可用各种方法将基因引入无限增殖的细胞。可使用的方法的例子包括但不限于磷酸钙介导的定向转染、脂质体辅助的转染和病毒介导的转染。HIV受体还可以通过与在细胞表面表达这些受体的天然细胞进行细胞融合，引入宿主细胞。可用抗生素，例如潮霉素、G418、半胱甲酯(zeocin)等，或基于单纯疱疹病毒tk基因筛选表达转染的基因的细胞克隆。各受体基因的表达可以通过Western印迹法用抗体检测蛋白质，通过Western印迹法用核苷酸探针检测RNA，或通过荧光激活细胞分选仪(FACS)用细胞表面表达的HIV受体作为抗原加以证实。
图1A和1B表示含有HIV受体基因和报道基因的质粒载体的两个例子。
如图1A所示，CD4和HIV共同受体是以相对方向从SV40早和晚启动子表达的。编码CD4和CCR5受体的基因是从SV40早启动子通过SA位点处的剪切机制表达的。编码CXCR4和潮霉素抗性的基因是作为双顺反子从SV40晚启动子表达的，其中Hygro被内部核糖体进入位点(IRES)隔开。潮霉素抗性基因的表达能够筛选细胞。质粒还含有原核复制起始点和氨苄青霉素抗性基因，用于细菌中DNA增殖。报道基因由一个分开的质粒携带，该质粒含有第二个选择基因(tk)。两个质粒可同时或依次共转染入HeLa细胞。可用抗生素筛选表达所有转染的基因的细胞克隆。
编码HIV受体和共同受体的基因也可用图1B所示的两个逆转录病毒载体表达。受体基因由小鼠白血病病毒(MLV)LTR-启动子表达，各蛋白质是由剪切的mRNA或IRES(B.1)表达的。报道序列由第二个逆转录病毒载体携带。报道基因的转录是在MLV LTR启动子的反向，除去了增强子序列，以防从LTR启动子(B.2)失控表达。
采用包装的细胞系，例如基于293T细胞系的稳定和瞬时生产品系包装将这些载体包装入感染性但不可复制的病毒颗粒。包装细胞系表达所有必需的蛋白质Gag、Pol和Env，它们是包装、加工、反转录和含有Psi包装信号的重组逆转录病毒基因组整合必需的。
逆转录病毒载体转染入包装细胞系。然后，收集包装细胞中产生的病毒颗粒，用于感染靶细胞。由于病毒颗粒是不能复制的，逆转录病毒载体携带的基因稳定整合入靶细胞基因组，并能在上游启动子控制下表达，而不产生感染性病毒颗粒。可用抗生素筛选表达所有转导的基因的细胞，并用Northern印迹法、Western印迹法或FACS证实。另外，可通过用携带HIV特异性基因，例如tat的修饰的腺病毒感染细胞培养物来筛选表达报道序列的细胞。
应注意的是，还可以通过可诱导启动子，例如四环素效应元件TRE来控制HIV受体的表达。例如，一个或多个HIV共同受体可通过由Clontech提供的Tet-on和Tet-off表达系统的控制的表达选择性呈现在细胞表面(Gossen，M.和Bujard，H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551)。在Tet-on系统中，通过加入四环素衍生的强力霉素(Dox)激活基因表达，而在Tet-off系统中，去除四环素(Tc)或Dox启动基因表达。还可用任何可诱导哺乳动物基因表达系统。例子包括使用热休克因子、类固醇激素、重金属离子、佛波酯和干扰素，在哺乳动物细胞中条件性表达基因的系统。
c)构建重组细胞的重组载体系统
重组载体系统还可用于将报道基因和受体基因转移到宿主细胞中，以产生本发明的重组细胞。载体可以是质粒或病毒。重组载体系统可由单个载体或多个重组载体组成。
在一个实施例中，使用一个重组质粒将报道基因和受体基因转移到宿主细胞中。质粒含有：所述报道序列含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组质粒转染的细胞后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，受体和共同受体的表达促使生产性感染转染的细胞，并使感染了转染的细胞的HIV病毒复制，并感染被重组质粒转染的细胞培养物中未感染的细胞。
可用几种非病毒方法将重组质粒转移到宿主细胞中。非病毒方法的例子包括但不限于磷酸钙沉淀、电穿孔、直接显微注射、DNA-负荷的脂质体和lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理、用高速微粒的基因轰击、和受体-介导的转染。
在一个优选例中，单载体系统是基于重组病毒，例如修饰或重组逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒。单病毒载体系统含有：报道序列，含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组病毒转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转染的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒转导的细胞培养物中未感染的细胞。
重组病毒是优选复制缺陷型或不可复制型。这些病毒通过受体介导的胞吞作用进入宿主细胞，将外源基因转移到核，并在其中表达外源基因和病毒基因。病毒载体系统的转导效率通常比非病毒载体系统的转染效率高得多。
对于逆转录病毒，病毒基因组以非特异性方式整合入宿主基因组，并在转导的宿主细胞中稳定、有效的表达外源基因和病毒基因。为了构建逆转录病毒载体，将编码报道基因和受体基因的核酸插入病毒基因组中某些病毒序列的位置，产生复制缺陷型病毒。在含有gag、pol和env基因但缺少LTR和psi组件的包装细胞系中产生含有插入的基因的病毒颗粒。当含有插入的基因的重组质粒和逆转录病毒LTR和psi序列一起被引入此细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)中，psi序列使重组质粒的RNA转录物包装入病毒颗粒中，然后分泌入培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，可任选地浓缩，并用于将报道基因和受体基因转移入宿主细胞，产生本发明的重组细胞。
在更多优选例中，单载体系统是不可复制的重组腺病毒载体。与逆转录病毒相比，腺病毒载体的优点之一是腺病毒DNA感染入宿主细胞不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以游离形式复制，而没有潜在的基因毒性。另外，腺病毒结构稳定，在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒载体可感染各种细胞，不论其细胞周期阶段。腺病毒载体已被安全地用于基因治疗试验，其中病人耐受了滴注到肺中的1013个感染性颗粒。干燥成粉末的复制缺陷型腺病毒可安全运输和储藏相当长的时间，而不丧失其感染性。
腺病毒由于其中等大小的基因组、操作方便、高滴度、广泛的靶细胞范围和高感染性特别适用作为基因转移载体。病毒基因组的两端都含有100-200个碱基对的末端反向重复(ITL)，它们是病毒DNA复制和包装必需的顺式(cis)元件。基因组的早(E)和晚(L)区含有不同的转录单元，在病毒DNA复制开始时分开。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组转录的蛋白质和一些细胞基因。E2区(E2A和E2B)的表达导致病毒DNA复制所需的蛋白质合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚基因表达和宿主细胞关闭。晚基因的产物包括大部分病毒衣壳蛋白，它们仅在主要晚启动子(MLP)产生的一个主要转录物显著加工后表达。MLP在感染晚期特别有效，所有该启动子产生的mRNA具有5′三分前导序列(TL)序列，使其成为翻译的优选mRNA。
不可复制的腺病毒载体的产生和增殖在辅助细胞系中进行。辅助细胞系表达必需基因，例如E1、E2、E4或晚期基因，它们已从病毒载体中除去。辅助细胞系可衍生自人细胞系，例如人胚肾细胞(例如293细胞)、肌肉细胞、造血细胞或其它人胚胎间充质细胞或上皮细胞。另外，辅助细胞可衍生自其它接受人腺病毒的哺乳动物物种的细胞。这些细胞包括例如Vero细胞或其它猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。
重组腺病毒载体可衍生自任何血清型或亚组A-F。C组的腺病毒5型可能是获得不可复制的腺病毒载体以构建本发明的重组细胞的优选起始材料。这是由于腺病毒5型是人腺病毒，已知其大量的生物化学和遗传信息，而且它在历史上已被用作大多数使用腺病毒作为载体的构建。
重组腺病毒载体含有：报道序列，含有报道基因，该基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组腺病毒载体转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，受体和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导的细胞的HIV病毒复制，并感染被重组腺病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
重组腺病毒载体可以是不可复制的，但携带腺病毒包装信号。腺病毒载体携带编码HIV受体，例如CD4、CXCR4和CCR5的基因，和报道基因，例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光蛋白(例如GFP和BFP)、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、激素和细胞因子。载体还可以携带编码白细胞介素(例如IL-2和IL-12)的基因，它使转导的细胞更容易受到HIV感染。载体还可以携带真核聚腺苷酸化序列，例如SV40聚腺苷酸化位点或牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点。
编码HIV受体的基因可置于位于腺病毒载体靠近左侧末端重复(L-TR)的E1区组成型(例如CMV和SV40)或可诱导(例如四环素诱导性)启动子的转录控制下。报道基因可置于重组腺病毒载体的右侧末端，例如在重组腺病毒载体靠近右侧末端重复(R-TR)的E4区中。
应注意的是，各种HIV受体可以用一个携带所有HIV受体的重组病毒载体转移到细胞中。另外，受体基因也可由多个重组病毒载体，各含有一个或多个HIV受体携带，赋予细胞不同向性。
本发明还提供了一种产生上述重组细胞的试剂盒。该试剂盒含有：重组载体和能被载体感染的细胞系，重组病毒载体含有报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞系中的细胞后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导的细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
本发明还提供了一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒存在的方法。该方法包括：取一种细胞培养物；和在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，重组病毒载体含有报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中的细胞后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导的细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
本发明还提供了一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒存在的方法。该方法包括：取一种细胞培养物；和在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，重组病毒载体含有报道序列，它含有报道基因，其表达被对HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的培养物中的细胞后由HIV病毒的基因组表达的；和受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，该受体和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导的细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
另外，本发明的重组细胞可以通过用含有报道序列的重组病毒载体转导已表达CD4和一种或多种HIV共同受体，例如CXCR4和CCR5的细胞产生。CD4和一种或多种HIV共同受体可以足够使细胞被HIV病毒生产性感染的水平表达。
可任选的，本发明的重组细胞还可以通过用表达CD4和一种或多种HIV共同受体的重组病毒载体转导已含有报道序列的细胞产生。在HIV病毒感染后，报道序列上报道基因的表达被对HIV病毒特异性的蛋白质(例如Tat)激活。
本发明的重组细胞还可通过用表达CD4或至少一种HIV共同受体，其水平足够促始HIV病毒在细胞中生产性感染的重组病毒载体转导已含有报道序列和CD4或至少一种HIV共同受体的细胞产生。在HIV病毒感染后，报道序列上报道基因的表达被对HIV病毒特异性的蛋白质(例如Tat)激活。
本发明的重组病毒载体还可用于转导天然但以低水平表达CD4或共同受体(例如CXCR4和CCR5)的细胞。例如，Hud78或CME-NKR细胞表达CD4和低水平的CXCR4。这些细胞可被重组病毒载体转导，这些重组病毒载体含有CD4或其它在培养物中产生细胞的HIV感染必需的共同受体。另外，细胞可被上述实施例所述的重组质粒转染。通过在细胞中引入含有HIV受体的载体，HIV的表达水平可通过使用强启动子(例如CMV和SV40启动子)显著提高，以超表达受体。
本发明的重组病毒载体还可用于产生使用可诱导启动子在一段受控时间内，或用腺病毒载体在短时间内表达受体的细胞。这使多样和有效的产生各种各样的细胞，可用于检测细胞中的HIV感染，筛选抗HIV药物和检测细胞中的HIV药物抗性。
总的说来，本发明提供了新颖的重组载体和细胞系，以及使用这些细胞系的方法。这些方法便利、合算廉并对HIV感染和复制的检测超灵敏。这些方法对临床前药物研究和开发的高产量筛选，以及在临床对抗HIV药物抗性中设计更有效的抗-HIV药物混合物非常有用。
实施例
1.用HIV病毒生产性感染重组的HeLa细胞
用人宫颈癌HeLa细胞建立重组细胞系。用表达载体(pRepD4R4)和载体(pTAR3Clac)以1∶1的比例共转染HeLa细胞。如图2A所示，表达载体pRepD4R4包括CD4受体基因和CXCR4受体基因，它们被IRES序列分开。如图2B所示，载体pTAR3C1ac包括一报道序列，其含有包括3个TAR序列的拷贝和一个CMV碱性启动子，和lacZ报道基因，其表达是在启动子的控制下。通过在含有900μg/ml G418的培养基中培养筛选稳定转染的细胞。所选的细胞的各克隆随后一式两份培养，用低滴度HIV储液感染其中的一份。低滴度HIV原种是从被B-细胞嗜性HIV原病毒DNA(GRCSF株)转染的HeLa细胞培养物的上清液收集而来的，在转染后培养3天。
感染储液中所含的HIV后，病毒基因组表达的Tat蛋白质与TAR结合，并诱导lacZ报道基因表达，产生高水平的β-半乳糖苷酶。鉴定表达β-半乳糖苷酶并被X-gal染成蓝色的细胞克隆，增殖最深的蓝色集落未感染的一份中的细胞。这些被选择的细胞称为HeLaD4R4细胞。
测试所述构建的HeLaD4R4细胞的HIV感染。表达人CD4受体的HeLaT4细胞(也称为HT4)用作为对照。HeLaD4R4细胞和HeLaT4细胞在DMEM和5％胎牛血清中培养。
在6孔培养板中培养对数生长的细胞，并用从上述HIV原病毒转染的HeLa细胞培养物获得的1毫升稀释的HIV原种(约10感染颗粒/mL)感染。细胞连续培养，在最初感染后1、3、4、5天用1％甲醛固定2分钟。细胞用0.5％甲醛固定2分钟，并用X-gal(0.5％)37℃染色过夜。由于lacZ报道基因产物β-半乳糖苷酶将底物从无色转化成深蓝色，作为被HIV感染的结果，表达β-半乳糖苷酶的细胞显现明显的蓝色。
图3A显示在接触HIV3天后的对照HeLaT4细胞。如所见的，几乎所有HeLa细胞不被染成蓝色，只有极少数细胞被染上淡兰色。这表明没有HIV CXCR4的细胞几乎不被感染，HIV病毒不在细胞培养物中复制。
图3B-2E显示在1、3、4和5天后的HeLaD4R4。如图3B所见，在1天后可轻易检测到感染，如蓝细胞所示。如图3C和3D分别所示，在3和4天后逐渐有更多的细胞被感染并染成蓝色。如图3E所示，孔中几乎所有的细胞被感染并在5天后被染成深蓝色。
图3B-3E所示的结果表明约10个HIV病毒颗粒最初感染一些细胞后，HIV能够进行生产性感染，即感染一个完全接受病毒复制的细胞并产生子代病毒颗粒(Stevenson，M.AIDS 11增刊.a：S25-S33)。另外，感染的细胞似乎维持正常形态，即维持与培养板的底物结合，而不是变圆并与板分离。
图3E所示的结果特别重要，因为最初加到样品中的HIV病毒颗粒能在细胞培养物中复制并散播感染其它最初未被培育的细胞(与图3B和3E比较)。这与仅仅由于细胞分裂而使染成蓝色的细胞增加是明显相反的。
图3F显示另一个实验，其中加入AZT(100μg/mL)来抑制HIV复制和感染。如图3F所见，在AZT存在下感染4天后，仅几簇细胞被感染并染成蓝色。稀疏的蓝色细胞簇最有可能是几个被加到孔中的HIV病毒颗粒最初感染的细胞分裂得到的细胞。
通过将图2F与图3B-3E比较，可以看到AZT能有效作为抗-HIV药物，因为报道基因的表达由于AZT的存在显著下降。图3F与3B-3E中的结果的比较是一个例子，说明如何用本发明检测HIV药物抗性和筛选组合物的抗HIV活性。
2.HIV诊断的方法
提供了在样品中检测HIV的例子。该方法可用于诊断被HIV感染的病人。根据该方法，将重组细胞接种到多孔板中。将少量要测试的病人血清分成几份加到孔中。在培养2-4天后，处理细胞，根据所用的报道基因的类型分析结果。例如，当lacZ基因用作重组细胞的报道基因时，用含有β-半乳糖苷酶的底物X-Gal、低浓度甲醛(1％)和戊二醛(0.1％)的处理溶液温和地固定细胞，而不灭活报道蛋白。当绿色荧光蛋白(GFP)基因作为重组细胞的报道基因时，在UV显微镜下直接观察细胞。存在发射绿色荧光的细胞表明细胞被样品中所含的HIV病毒感染。通过使用GFP作为报道基因，可直接在培养过程中的任何时间直接监测HIV复制，而不用固定和处理细胞，以确保足够的HIV病毒在培养物中复制。
可用上述诊断试验作为HIV感染病人的单独测试，或与HIV药物抗性和其它HIV诊断测试结合。
可用阳性对照因子确保重组细胞对HIV感染有反应。可用携带编码HIV反式激活蛋白Tat的HIV tat基因的缺陷型流感病毒株作为阳性对照因子。用流感病毒作为载体将HIV tat基因转移到细胞中，模拟HIV感染。HIV本身不能理想的用作阳性对照，因为HIV不够稳定，容易丧失活性，因此病毒不能长期储藏。相反，可将流感病毒干燥成粉末，并长期储藏。另外，该流感病毒株衍生自一种流感病毒株(腺病毒5型)，它是病毒复制缺陷型，因此广泛用作阳性对照更安全。
3.检测HIV药物抗性的方法
提供了一个如何实施检测HIV药物抗性的方法的例子。将重组细胞接种到多孔平板的各孔中。一式两份的孔中含有各种要测试的抗HIV药物。将少量病人血清加到各孔中，培养数天。培养2-4天后，处理细胞并根据所用的报道基因类型分析结果。例如，当lacZ基因用作重组细胞的报道基因时，用含有β-半乳糖苷酶的底物X-Gal、低浓度甲醛(1％)和戊二醛(0.1％)的处理溶液温和地固定细胞，而不灭活报道子蛋白。对于定量分析，可用ONPG试验对细胞提取物测定β-Gal的水平。当绿色荧光蛋白(GFP)基因用作重组细胞的报道基因时，在UV显微镜下直接观察细胞。为了定量分析，用FACS分拣荧光细胞，并测定表达GFP报道基因的细胞数。
如果含有特定药物的孔中的细胞以足够的水平表达报道基因，表明样品中所含的HIV病毒在测试的剂量下对于药物是抗性的，病毒复制并在抗HIV药物存在下在重组细胞中传播感染。
未加入血清样品的孔可用作阴性对照。可对各测试的药物进行阴性对照。还可对于各测试的药物进行阳性对照，例如使用实施例2所述的阳性对照因子(携带HIV tat基因的腺病毒)，从确保重组细胞功能正常。
4.确定病人血清中病毒负荷的方法
提供了一个如何确定病人血清中病毒负荷的方法。将约1毫升病人血清逐步稀释，例如1∶10、1∶100、1∶1000等，加到含有重组细胞的孔中。仍诱导孔中重组细胞的报道基因表达的最高稀释度是HIV在病人血清中的滴度(浓度)。当病毒负荷变低，可进行更精细的稀释步骤来更精确地确定病人血清中病毒颗粒的数目。
该方法可用于确定每毫升病人血清中存在多少病毒颗粒。由于培养物中的重组细胞对甚至一个病毒颗粒也是敏感的，因此该方法可检测仅由一个病毒颗粒引起的感染，因此适合检测含有低滴度HIV的病人样品，甚至每毫升病人血清仅几个病毒颗粒。这样的高灵敏度对于监测抗HIV药物治疗的过程是重要的。与“超灵敏”的基于PCR的试验(仅能检测每毫升病人血清数百个或更多病毒颗粒)相比，该方法更灵敏，而且可用于检测样品中滴度低得多的HIV。这对于检测抗HIV药物治疗后，当病毒滴度低于常规HIV检测法的可检测水平时，病人样品中的HIV病毒特别重要。
5.筛选抗HIV药物的方法
在此描述了一种进行高通量抗HIV药物筛选的方法的例子。为了筛选新的抗HIV药物，将重组细胞接种到多孔培养板，例如96-孔板中。在各孔中加入要测试抗HIV活性的药物。在各孔中加入少量HIV原种，使各孔中的细胞被约10个病毒颗粒感染。在培养数日后，在比色或荧光平板阅读机上分析孔中的细胞。将孔与一个或多个含有重组细胞和病毒但不含药物的孔比较。含有药物的孔中报道基因表达的抑制表明药物在所测试的剂量具有抗HIV活性。一旦鉴别出潜在的抗HIV药物，可重复测试从进一步证实该药物的抗HIV活性。
6.重组腺病毒载体的构建
通过使用携带受体序列和报道基因的穿梭质粒或载体构建本发明的重组腺病毒载体。
图6A说明一种含有人CD4、CXCR4和CCR5受体的穿梭质粒(pLAd.R5-D4-X4)。穿梭质粒pLAd.R5-D4-X4含有包括左侧长末端重复L-TR的腺病毒基因组的左侧末端和腺病毒包装信号(β)。用多基因表达盒和CMVie启动子替换腺病毒的E1区。
将编码CD4、CXCR4和CCR5受体的基因通过在SA位点的剪切机制和通过内部核糖进入位点(IRES)置于CMVie启动子的转录控制下。质粒pLAd.R5-D4-X4还含有SV40聚腺苷酸化位点和原核复制起始点，以及氨苄青霉素抗性基因，用于细菌中DNA增殖。
图4B显示另一种含有报道序列的穿梭质粒(pPAdMS/Repo)。穿梭质粒pRAdMS/Repo含有包括右侧长末端重复R-TR的腺病毒基因组的右侧末端。大部分E4区域(除了orf6)被包括含HIV TAR的启动子和报道基因，例如GFP、SEAP、Luc和LacZ的报道序列替换。报道基因的表达可被HIV的Tat蛋白质激活。质粒pRAdMS/Repo还含有牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点，以及原核复制起始点和氨苄青霉素抗性基因，用于细菌中DNA增殖。
图5A和5B说明另一种用于构建重组腺病毒载体的设计。如图5A说明的，穿梭质粒pLAd.R5-X4携带人CXCR4和CCR5受体。穿梭质粒pLAd.R5-X4含有包括左侧长末端重复L-TR的腺病毒基因组的左侧末端和腺病毒包装信号(β)。用多基因表达盒和CMVie启动子替换腺病毒的E1区。将编码CXCR4和CCR5受体的基因通过在SA位点的剪切机制置于CMVie启动子的转录控制下。质粒pLAd.R5-D4-X4还含有SV40聚腺苷酸化位点和原核复制起始点，以及氨苄青霉素抗性基因，用于细菌中DNA增殖。
图5B说明一种含有人CD4基因的穿梭质粒(pPAdCD4)。穿梭质粒pPAdCD4含有包括右侧长末端重复R-TR的腺病毒基因组的右侧末端。CD4的表达在CMVie启动子的控制下。质粒pPAdCD4还含有BGH聚腺苷酸化位点和原核复制起始点以及氨苄青霉素抗性基因，用于细菌中DNA增殖。编码人HIV受体(如CD4、CXCR4和CCR5受体)的基因可在这两种质粒pPAdCD4和pLAd.R5-X4之间互换。在另一种设计中，重组腺病毒载体仅携带受体基因和共同受体基因。该载体可与重组细胞系联合使用，该细胞系含有被HIV蛋白质(例如Tat)可诱导启动子(例如TAR)控制的报道基因。相反，携带报道基因的载体可与天然或重组细胞系联合使用，该细胞系含有编码HIV受体(CD4)和共同受体(例如CXCR4和CCR5)的基因。
重组腺病毒基因组是由两个穿梭质粒pLAd.R5-D4-X4和pRAdMS/Repo装配的，它们分别携带腺病毒基因组的左侧末端和右侧末端。分别用限制性酶，例如XbaI和EcoRI消化穿梭质粒pLAd.R5-D4-X4和pRAdMS/Repo。
如图6所示，分离了对应于这两个穿梭质粒pLAd.R5-D4-X4和pRAdMS/Repo的腺病毒的左侧末端和右侧末端的片段，并与腺病毒基因组的中间部分(腺病毒骨架)连接。
然后，将连接的载体基因组DNA转染入表达腺病毒的E1蛋白的293HK细胞。在E1蛋白存在下，去除E1的载体基因组可复制并包装成病毒颗粒，即产生本发明的重组腺病毒载体。
重组腺病毒载体可作为冻干粉末长期保存和运输。重组腺病毒载体可用于检测临床样品中的HIV存在，用于高通量抗HIV药物筛选和监测HIV药物抗性。
在该申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容，其中的参考文献在此完整引入以供参考，以更完整的描述与本发明有关的领域的状态。
本领域技术人员应理解在本发明中可作出各种修改和变化，而不违背本发明的范围或精神。本发明的其它实施方式对于本领域技术人员在考虑说明书和本文所公开的本发明的实施来说是明白的。应理解说明书和实施例仅被视为举例，本发明的真正范围和精神由权利要求表明。
Claims (63)
1.一种重组病毒载体，其特征在于，该载体含有：
一种报道序列，含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的；和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述病毒载体是不能复制的。
3.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述受体基因表达被HIV特异性蛋白质上调。
4.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述受体基因表达被HIV特异性蛋白质下调。
5.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质是HIV反式激活蛋白。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述HIV反式激活蛋白是Tat。
7.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质选自Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。
8.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述报道序列含有包括HIV病毒特异性增强子序列的启动子序列，和报道基因，其表达通过HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列结合而调控。
9.如权利要求8所述的重组病毒载体，其特征在于，所述HIV特异性反式激活蛋白是Tat，而所述HIV特异性增强子序列含有至少一个TAR序列的拷贝。
10.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质通过HIV特异性蛋白质和重组细胞中存在的反式激活蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用调控报道序列的表达。
11.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质通过HIV特异性蛋白质和重组病毒载体中所含的或存在于重组细胞中的可诱导启动子之间的蛋白质-核苷酸相互作用调控报道序列的表达。
12.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述报道基因选自β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶、激素和细胞因子。
13.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因选自CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB基因。
14.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因是CXCR4基因。
15.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因是CCR5基因。
16.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因包括CXCR4和CCR5。
17.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述载体还含有编码白细胞介素的基因，所述基因使转导的细胞对HIV感染更敏感。
18.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述编码白细胞介素的基因是编码白细胞介素-2或白细胞介素-12的野生型基因或重组基因。
19.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述载体是重组腺病毒载体。
20.如权利要求19所述的重组病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体的E1区被受体序列替换，保留E1启动子来表达受体序列。
21.如权利要求19所述的重组病毒载体，其特征在于，所述包括重组腺病毒载体的E1启动子的E1区被外源启动子和受体序列替换，其中外源启动子表达受体序列。
22.如权利要求21所述的重组病毒载体，其特征在于，所述外源启动子是CMV启动子。
23.如权利要求19所述的重组病毒载体，其特征在于，所述报道序列位于重组腺病毒载体的右侧末端。
24.如权利要求23所述的重组病毒载体，其特征在于，所述报道序列位于重组腺病毒载体的E4或E3区。
25.如权利要求19所述的重组病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体含有腺病毒包装信号。
26.如权利要求19所述的重组病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体含有真核聚腺苷酸化序列。
27.如权利要求26所述的重组病毒载体，其特征在于，所述真核聚腺苷酸化序列是牛生长激素或SV40聚腺苷酸化位点。
28.一种重组质粒，其特征在于，该质粒以可操纵性结合含有：
一种报道序列，含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组质粒转染的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的；和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转染的细胞，并使感染了转染细胞的HIV病毒复制，并感染被重组质粒转染的细胞培养物中未感染的细胞。
29.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：
重组病毒载体和能被所述载体感染的细胞系，所述重组病毒载体含有
一种报道序列，含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
30.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒存在的方法，其特征在于，该方法包括：
取一种重组细胞的培养物；和
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，该重组病毒载体含有
一种报道序列，含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的培养物中的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是不能复制的。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述受体基因表达被HIV特异性蛋白质上调。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述受体基因表达被HIV特异性蛋白质下调。
34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质是HIV反式激活蛋白。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述HIV反式激活蛋白是Tat。
36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质选自Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。
37.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述报道序列含有包括HIV病毒特异性增强子序列的启动子序列，和报道基因，其表达通过HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列结合而调控。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述HIV特异性反式激活蛋白是Tat，而所述HIV特异性增强子序列含有至少一个TAR序列的拷贝。
39.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质通过HIV特异性蛋白质和重组细胞中存在的反式激活蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用调控报道序列的表达。
40.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特异性蛋白质通过HIV特异性蛋白质和重组病毒载体中所含的或存在于重组细胞中的可诱导启动子之间的蛋白质-核苷酸相互作用调控报道序列的表达。
41.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述报道基因选自β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶、激素和细胞因子。
42.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因选自CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB基因。
43.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因是CXCR4基因。
44.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因是CCR5基因。
45.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述一种或多种共同受体基因包括CXCR4和CCR5。
46.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述载体还含有编码白细胞介素的基因，所述基因使转导的细胞对HIV感染更敏感。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述编码白细胞介素的基因是编码白细胞介素-2或白细胞介素-12的野生型基因或重组基因。
48.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述载体是重组腺病毒载体。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述重组腺病毒载体的E1区被受体序列替换，保留E1启动子来表达受体序列。
50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述包括重组腺病毒载体的E1启动子的E1区被外源启动子和受体序列替换，其中外源启动子表达受体序列。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述外源启动子是CMV启动子。
52.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述报道序列位于重组腺病毒载体的右侧末端。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述报道序列位于重组腺病毒载体的E4或E3区。
54.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述重组腺病毒载体含有腺病毒包装信号。
55.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述重组腺病毒载体含有真核聚腺苷酸化序列。
56.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述真核聚腺苷酸化序列是牛生长激素或SV40聚腺苷酸化位点。
57.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于：
取一种重组细胞的培养物，其中所述细胞表达CD4或HIV共同受体；和
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，该重组病毒载体含有
一种报道序列，含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞后，HIV病毒的基因组表达的，和
一种受体序列，含有CD4基因或至少一种在细胞中基本不表达的HIV共同受体基因，所述CD4基因或HIV共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
58.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于：
取一种细胞培养物，其中所述细胞表达报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染培养物中细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，该重组病毒载体含有：
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
59.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于：
取一种细胞培养物，其中所述细胞表达CD4或HIV共同受体，和一种报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染培养物中的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，该重组病毒载体含有：
一种受体序列，含有CD4基因或至少一种在细胞中基本不表达的HIV共同受体基因，所述CD4基因或HIV共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
60.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于：
取一种细胞培养物，其中所述细胞表达CD4或HIV共同受体，所述CD4基因或HIV共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染细胞培养物中未感染的细胞。
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，该重组病毒载体含有：
一种报道序列，其含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是由培养物中感染细胞后的HIV病毒的基因组表达的。
61.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于：
取一种细胞培养物；和
在培养物中加入多种重组病毒载体以转导细胞，多种重组病毒载体中的每一种含有：
一种报道序列，其含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被多种重组病毒载体转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，或
一种受体序列，含有CD4基因或至少一种HIV共同受体基因，所述CD4基因或HIV共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被多种重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞。
62.一种产生重组细胞用于检测样品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于：
取一种细胞培养物；
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，所述重组病毒载体含有：
一种报道序列，其含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述受体基因和共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞；
使所述细胞培养物与要分析样品中HIV病毒的存在的样品接触；和
检测培养物中细胞报道基因的表达水平的改变。
63.一种检测样品中HIV药物抗性的方法，其特征在于，该方法包括：
取一种细胞培养物；
在培养物中加入重组病毒载体以转导细胞，所述重组病毒载体含有：
一种报道序列，其含有报道基因，所述基因的表达由对HIV病毒特异性的蛋白质调控，所述蛋白质是在感染被重组病毒载体转导的细胞后，由HIV病毒的基因组表达的，和
一种受体序列，含有CD4基因和一种或多种共同受体基因，所述共同受体基因的表达促使生产性感染转导的细胞，并使感染了转导细胞的HIV病毒复制，并感染被重组病毒载体转导的细胞培养物中未感染的细胞；
用含有HIV的样品感染转导的细胞；
在细胞培养物中加入一种或多种抗HIV药物；和
检测细胞内报道基因的表达水平的改变。
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