CN1443855A

CN1443855A - 罗氏沼虾诺达病毒核酸rt－pcr检测的方法

Info

Publication number: CN1443855A
Application number: CN 03118734
Authority: CN
Inventors: 石正丽; 宝纳米·简·罗伯特
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2003-03-06
Filing date: 2003-03-06
Publication date: 2003-09-24
Anticipated expiration: 2023-03-06
Also published as: CN1179052C

Abstract

本发明公开了一种罗氏沼虾诺达病毒核酸RT－PCR检测的方法，其步骤是：首先设计病毒特异引物；其次是组织RNA提取；第三是反应体系；第四是扩增体系。本发明灵敏度高，检测时间短，适合于罗氏沼虾肌肉白浊病的病原诊断及亲虾、幼苗和成虾的健康监测。

Description

罗氏沼虾诺达病毒核酸RT-PCR检测的方法

技术领域：

本发明属于虾类病害检测技术领域，具体涉及一种罗氏沼虾诺达病毒核酸RT-PCR检测的方法，适用于罗氏沼虾肌肉白浊病病毒病原的诊断。

背景技术：

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)白体病是90年代以来影响东南亚和加勒比国家罗氏沼虾养殖业的主要病害(Nash et al.，1987；Tung et al.，1999；Arcier et al.，1999)。该病害的感染对象是育苗场的幼苗，发病幼苗的肌肉呈白浊现象。该病害导致虾苗在短时间内大量死亡，从农业部渔业局全国水产技术推广总站编辑的《水产养殖动植物病情月报》知道，该病害目前已经传播到我过主要罗氏沼虾养殖地区。法国研究人员从来自安替列群岛(Antillan)的患白体病的罗氏沼虾样品中已经成功地分离了一种27nm的诺达病毒，暂命名为罗氏沼虾诺达病毒Antillan分离株(M.Rosenbergii Nodavirus，MrRV-ant)，并对该病毒进行了基因组克隆和免疫检测工作(Bonami，2002；Romestand & Bonami，in press)。即将发表的罗氏沼虾诺达病毒免疫检测技术侧重于抗原-抗体反应，灵敏度低于本发明，没有相关的试剂盒的专利。从目前的文献和专利查询结果知道，没有关于罗氏沼虾诺达病毒的RT-PCR检测的方法及其试剂盒的报道。

参考文献：

(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，MariJ.& Bonami J.R.(1999).A viral disease associated withmortalities in hachery-reared postlarvae of the giantfreshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases ofAquatic Organisms，38，177-181.

(2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giantfreshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.WorldAquaculture 2002.Annual Meetings of the World AquacultureSociety and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79.

(3)钱冬杨国梁刘问等。罗氏沼虾苗肌肉白浊病病原研究。水生生物学报，2002，26：472-476

(4)Romestand B.& Bonami J.R.(2002)Asandwich enzyme linkedimmunosorbent assay(S-ELISA)for detection of MrNV in thegiant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii.Journalof Fish Diseases，(in press).

(5)Tung C.W.，Wang C.S.& Chen S.N.(1999)Histological andelectron microscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured in Taiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5.

参考资料(1)、(2)(3)和(5)主要侧重于罗氏沼虾肌肉白浊病的病原研究，在组织病理、病毒的超微结构和生化特征的水平上对病毒进行描述。资料(4)报道了一种罗氏沼虾诺达病毒的免疫检测方法，该方法操作简便快速，但灵敏度低。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种罗氏沼虾诺达病毒核酸RT-PCR检测的方法。根据罗氏沼虾诺达病毒核酸的cDNA文库序列，设计特异性病毒核酸引物，用RT-PCR的方法，对罗氏沼虾体内诺达病毒的感染状况进行检测。该方法简便快速，灵敏度高，适合于罗氏沼虾肌肉白浊病病原的诊断以及亲虾、幼苗和成虾的健康状况监测。

为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案：

A、制备检测试剂盒：试剂盒含有所有检测程序中的必要成分，包括总RNA提取试剂(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.5％月桂基肌氨酸钠盐，0.1M巯基乙醇，0.2M醋酸钠)、病毒特异引物(设计上游引物：ccacgttcttagtggatcct；下游引物：cgtccgcctggtagttcc)、扩增系统成分(在50μl反应体系内，加入4μl 10mM脱氧核糖核甘酸混合物，2.5μl 100mM DTT，1μl RNA酶抑制剂5U/μl，10μl 5x RT-PCR缓冲液，2μl的上下游引物(10pmol/μl)，1μl酶混合物，底物为从组织提取的总RNA)。

B、建立DNA扩增的最佳条件(55℃ 30min，1个循环；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30个循环，72℃ 7min，1个循环。1.2％琼脂糖电泳检查扩增产物)。

本发明与现有技术相比有以下优点：灵敏度高，能检测出少于2.5pg的病虾组织总RNA；样品处理程序简单；检测时间短；可以同时检测多个样品。

具体实施方式：

具体步骤如下：

(1)设计病毒特异引物，上游引物：ccacgttcttagtggatcct；下游引物：cgtccgcctggtagttcc。

(2)组织总RNA提取：称取10-50mg的病虾苗或成虾组织，用1ml样品处理液研磨，样品处理液为4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠盐，0.1M巯基乙醇，0.2M醋酸钠，3000g离心10min。取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g离心10分钟，取水相0.6ml加入0.5ml的异戊醇混匀，放置10分钟后，12000g离心10分钟，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯处理的双蒸水溶解。

(3)反应体系：在50μl反应体系内，加入4μl 10mM dNTP，2.5μl 100mMDTT，1μl RNA酶抑制剂5U/μl，10μl 5x RT-PCR buffer，2μl的上下游引物(10pmol/μl)，1μl酶混合物，底物为从组织提取的总RNA.

(4)扩增条件：55℃ 30min，1个循环；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30个循环，72℃ 7min，1个循环。1.2％琼脂糖电泳检查扩增产物。

Claims

1、一种罗氏沼虾诺达病毒核酸RT-PCR检测的方法，包括下列步骤：

(1)设计病毒特异引物，上游引物：ccacgttcttagtggatcct；下游引物：cgtccgcctggtagttcc；

(2)组织总RNA提取：称取10-50mg的病虾苗或成虾组织，用1ml样品处理液研磨，3000g离心10min，取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g离心10分钟，取水相0.6ml加入0.5ml的异戊醇混匀，放置10分钟，12000g离心10分钟，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯处理的双蒸水溶解；

(3)反应体系：在50μl反应体系内，加入4μl 10mM dNTP，2.5μl 100mMDTT，1μl RNA酶抑制剂5U/μl，10μl 5x RT-PCR buffer，2μl的上下游引物，1μl酶混合物，底物为从组织提取的总RNA；

(4)扩增条件：55℃ 30min，1个循环；94℃，30s，55℃ 30s，72℃1min30s，30个循环，72℃ 7min，1个循环，1.2％琼脂糖电泳检查扩增产物。

2、根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾诺达病毒核酸RT-PCR检测的方法，其特征在于样品处理液为：4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠盐，0.1M巯基乙醇，0.2M醋酸钠。