CN1440981A - 新型重组组织因子抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种新型具有抗凝和抗栓活性的重组组织因子抑制肽及其制备方法。本发明根据对全长组织因子的结构及其生化特性的分析，设计了新型重组组织因子抑制肽结构。将突变后组织因子抑制肽基因与原核表达载体pLY－4重组，转化蛋白酶缺陷型大肠杆菌，筛选高表达工程菌。工程菌发酵，高压破菌，包涵体溶解、复性和纯化而获得重组组织因子抑制肽。所得产品具有抗凝和抗栓活性，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。

Description

新型重组组织因子抑制肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及新型重组组织因子抑制肽。本发明还涉及新型重组组织因子抑制肽的制备方法及其应用。

背景技术

组织因子(Tissue Factor，简称TF)是外源性凝血途径的启动因子，其作用机理是，先与凝血因子VII(VIIa)形成复合物，该复合物激活凝血因子X和IX，从而启动外源性凝血途径。已有研究表明TF胞外区的N-末端的氨基酸残基对TF与因子VIIa的结合非常重要；而C-末端对TF·因子VIIa复合物的活性至关重要。通常其中K165、K166和Y185为丙氨酸替代后促凝活性损失98％以上，而与因子VIIa的亲和力基本保持不变[Ruf W.，et al(1992)J.Biol.Chem.267(31)，22206～22210.Kelley R.F.，et al.(1995)Biochemistry，34，10383～10392.]。

外源性凝血途径，也称TF凝血途径，为人体主要的凝血途径。TF的表达与败血症、DIC、心肌梗塞、癌、中风、急性呼吸窘迫综合征及缺血再灌注损伤等许多病理生理过程密切相关，因此对TF凝血途径的阻断调节，对许多疾病的预防与治疗有非常重要的临床意义。

在动物模型中抗TF抗体可以防止由大肠杆菌引起的急性感染性休克导致的死亡，并能减轻由内毒素诱导的兔DIC，还可以抑制兔动脉血栓形成模型中的血栓形成。因此调节TF凝血功能的药物可能在血栓形成及败血症中起重要作用。[Taylor，F.B.，et al.(1991)Circ Shock 33，127.Pawashe A.B.，et al(1994)Circ.Res.7456.]。

由于TF与因子VIIa结合的功能域与催化协同功能域是相对独立的，因此可以通过设计其突变体，将其催化协同的功能域通过突变而失活，保留与因子VIIa结合的功能域。TF突变体可以与野生型TF竞争结合因子VIIa，从而对野生型TF的功能发挥竞争性抑制作用，降低TF凝血途径的启动速度，达到防治DIC以及其他以血栓形成为主要病理变化的疾病。

近年来，研究人员使用各种TF途径抑制剂，进行了一系列的动物实验和若干临床实验，结果表明抑制TF途径对于冠状动脉血栓形成、脓毒血症、弥漫性血管内凝血、中风、癌症、急性呼吸窘迫综合征和缺血再灌注损伤等均有很好的疗效，而且出血的危险性明显低于低分子肝素，有安全高效等特征。

发明内容

本发明的目的是提供新型的具有抗凝和抗栓功能的TF突变体及其制备方法。本发明对人TF进行了改造，获得的突变体具有明显的抗TF活性，命名为重组人TF抑制肽(recombinant TF inhibition peptide，简称r-TFIP)，具有抗凝和抗血栓形成作用。

本发明应用蛋白质工程方法对组织因子进行结构改造而生产抑制肽，所得产品具有高效的抗凝和抗栓功能，并且制备工艺简便、安全。

本发明r-TFIP1和r-TFIP2的基因核苷酸序列及氨基酸序列如序列表SEQID NO：1、2所示。

另一方面，本发明还提供制备r-TFIP的方法，包括制备r-TFIP cDNA基因；在表达载体中克隆cDNA基因；用该载体转化宿主细胞；培养转化后的宿主细胞；及从培养液中纯化所需r-TFIP。

本发明中r-TFIP基因的制备包括经过缺失突变和点突变后的基因，与质粒pUC19重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证cDNA基因。

将本发明的cDNA基因与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用了P_R、P_L启动子，5sRNAt₁、t₂终止信号，cIts857阻抑蛋白基因的原核表达载体，例如pLY-4等商业化表达载体。

上述重组表达载体可按常规方法导入宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌菌株如JF1125，DH5α等。

本发明的表达产物以包涵体的形式存在于菌体中，匀浆泵破菌后分离包涵体。包涵体溶解后，复性并分离和纯化所需产品。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。

具体实施方式实施例1 r-TFIP1的设计、制备和鉴定

(1)r-TFIP1基因的克隆、改造及原核表达质粒r-TFIP1-pLY-4的构建

按照sTF的氨基酸顺序，依照大肠杆菌偏好密码子设计引物序列。设计PCR引物，并且在引物中引入Ser163，Gly164，Lys165，Lys166突变为Ala的序列。(5’-TCT TCA AGT GCC GCT GCC ACA GCC AAA-3’)并以此引物和sTF基因的3’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增点3’端的核苷酸片段。回收后以此片段为3’-端引物和sTF基因的5’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增得到r-TFIP的基因。所得基因与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将r-TFIP1基因切出，并与大肠杆菌表达载体pLY-4重组，构建原核表达质粒r-TFIP1-pLY-4。质粒r-TFIP1-pLY-4转化大肠杆菌JF1125，抽提质粒并做相应的酶切分析。质粒片段与理论片段一致者为阳性克隆。限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、JF-1125，质粒pUC19，pLY-4为本室保存。

(2)筛选高效表达菌株

挑取上述阳性克隆接种于5mlLBA培液中，30℃快速振摇(250 RPM)，培养过夜。次日按1∶50接种于5mlM9CA培液中，30℃继续振摇培养约3小时，使其测定光密度OD₆₀₀达到1.00左右，留样后将培养温度升高至42℃，继续振摇培养3小时，离心收集细菌。

诱导前后的细菌分别用1x上样缓冲液悬浮后，沸水浴煮5分钟，20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后的细菌裂解液在相应分子量处有一浓集的条带，而诱导前的细菌裂解液没有。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的40％左右。取表达水平高的克隆为工程菌。

诱导后的细菌，用超声破菌并离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果表明，表达产物是以非活性的包涵体的形式存在于菌体中。

上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。

(3)发酵表达工程菌

按上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划LBA平板，30℃温箱培养过夜。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于50mlLBA培养液中，30℃振摇培养8小时。此为一级种子液，再将一级种子液按1∶10接种于500mlLBA中，30℃振摇培养8小时，，此为二级种子液。种子菌按1∶10比例接种于4L M9CA培液中，调节发酵参数，温度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并与搅拌连动。继续培养6小时，将培养温度提高到42℃，继续诱导培养3小时，停止发酵，离心收集细菌。发酵工程菌的表达水平大于40％。

(4)制备包涵体

将发酵工程菌按湿重体积以1∶20的比例，用0.02M PB(pH8.0)悬浮细菌，高压匀浆泵破菌，压力保持在45-50MP，离心收集沉淀即为包涵体。用洗涤液洗涤包涵体。

(5)r-TFIP复性。

洗涤后的包涵体用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的复性液，稀释20倍。4℃搅拌复性过夜。并测定r-TFIP活性。

(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析

Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍体积的20mmol/L PB(pH8.0，0.5M尿素)平衡，复性后的r-TFIP1离心后上清，直接上柱结束后，用20mmol/LPB(pH8.0)继续洗脱至基线，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH8.0)线性梯度洗脱，收集有r-TFIP1活性组分，并进行纯度分析。

所有色谱操作均为常规操作。

(7)纯度鉴定及分子量测定

样品进行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS扫描测定纯度。所得产品纯度95％以上。

(8)r-TFIP1抑制TF活性测定：将r-TFIP1加入正常人血浆，37℃保温5分钟，加入稀释兔脑粉后，继续保温1分钟，加入Ca²⁺后凝血时间。结果表明加入r-TFIP2后血浆凝血时间明显延长20％-30％，在r-TFIP1浓度达到12umol/L时，TF活性抑制50％以上。实施例2 r-TFIP2的设计、制备和鉴定

(1)r-TFIP2基因的克隆、改造及原核表达质粒r-TFIP2-pLY-4的构建

按照sTF的氨基酸顺序，依照大肠杆菌偏好密码子设计引物序列。设计PCR引物，并且在引物中引入Tyr185突变为Ala的序列。(5’-AAA GGA AAT GCATGC TTC AGT GTT CAA-3’)并以此引物为5’-端引物和sTF基因的3’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增点3’端的核苷酸片段。回收后以此片段为3’-端引物和sTF基因的5’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增得到r-TFIP2的基因。所得基因与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将r-TFI2基因切出，并与大肠杆菌表达载体pLY-4重组，构建原核表达质粒r-TFIP-pLY-4。质粒r-TFIP2-pLY-4转化大肠杆菌JF1125，抽提质粒并做相应的酶切分析。质粒片段与理论片段一致者为阳性克隆。限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、JF-1125，质粒pUC19，pLY-4为本室保存。

(2)高效表达菌株的筛选

挑取上述阳性克隆接种于5mlLBA培液中，30℃快速振摇(250RPM)，培养过夜。次日按1∶50接种于5mlM9CA培液中，30℃继续振摇培养约3小时，使其测定光密度OD₆₀₀达到1.00左右，留样后将培养温度升高至42℃，继续振摇培养3小时，离心收集细菌。

诱导前后的细菌分别用1x上样缓冲液悬浮后，沸水浴煮5分钟，20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后的细菌裂解液在相应分子量处有一浓集的条带，而诱导前的细菌裂解液没有。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的40％左右。取表达水平高的克隆为工程菌。

诱导后的细菌，用超声破菌并离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果表明，表达产物是以非活性的包涵体的形式存在于菌体中。

上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。

(3)工程菌的发酵表达

取上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划LBA平板，30℃温箱培养过夜。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于50mlLBA培养液中，30℃振摇培养8小时。此为一级种子液，再将一级种子液按1∶10接种于500mlLBA中，30℃振摇培养8小时，，此为二级种子液。种子菌按1∶10比例接种于4L M₉CA培液中，调节发酵参数，温度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并与搅拌连动。继续培养6小时，将培养温度提高到42℃，继续诱导培养3小时，停止发酵，离心收集细菌。发酵工程菌的表达水平大于40％。

(4)制备包涵体

将发酵工程菌按湿重体积以1∶20的比例，用0.02M PB(pH8.0)悬浮细菌，高压泵匀浆破菌，压力保持在45-50MP，离心收集沉淀即为包涵体。用洗涤液洗涤包涵体。

(5)r-TFIP复性。

洗涤后的包涵体用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的复性液，稀释20倍。4℃搅拌复性过夜。并测定r-TFIP2活性。

(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析

Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍体积的20mmol/L PB(pH8.0，0.5M尿素)平衡，复性后的r-TFIP离心后上清，直接上柱，上柱结束后，用20mmol/L PB(pH8.0)继续洗脱至基线，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH8.0)线性梯度洗脱，收集有r-TFIP2活性组分，并进行纯度分析。

本发明所述所有色谱操作均为常规操作。

(7)纯度鉴定及分子量测定

样品进行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS扫描测定纯度。所得产品纯度95％以上。

(8)r-TFIP2抑制TF活性测定：将r-TFIP2加入正常人血浆，37℃保温5分钟，加入稀释兔脑粉后，继续保温1分钟，加入Ca²⁺后凝血时间。结果表明加入r-TFIP2后血浆凝血时间明显延长20％-30％，在r-TFIP2浓度达到20umol/L时，TF活性抑制50％以上。

实施例3 r-TFIP在血栓性疾病中的应用

应用本发明所制备的r-TFIP进行抗血栓实验，证实其在血栓性疾病的防治中有良好的作用，与低分子肝素相比，抗栓效果明显，对凝血功能的影响明显小于低分子肝素。

(1)抑制静脉血栓形成

结扎大鼠下腔静脉诱发静脉血栓形成。血栓形成2小时后静脉注射给药。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予低分子肝素60-100抗Xa U/kg，治疗组分别给予r-TFIP1.00-2.0mg/kg。给药后4小时后取出血栓，称重。结果显示r-TFIP比低分子肝素更能抑制静脉血栓形成。

(2)抑制动脉血栓形成

用气囊导管损伤家兔股动脉内皮细胞，并结扎损伤部分的血管，使局部血流阻滞而诱发动脉血栓形成。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予低分子肝素60-120抗Xa U/kg，治疗组分别给予r-TFIP 1.00-2.0mg/kg。实验结果表明，r-TFIP可使动脉血栓形成率下降，并呈剂量相关性。

(3)防治弥漫性血管内凝血(DIC)

给家兔注射内毒素诱发DIC形成。与低分子肝素相比，静脉注射r-TFIP可明显纠正DIC所致的凝血功能异常和血栓形成的程度。

(4)冠状动脉成形术(PTCA)后血栓再形成的防治

损伤狗的左冠状动脉前降支内皮细胞，诱发阻塞性冠脉血栓形成。应用r-TFIP作为重组链激酶的附加用药，能促进冠脉再通，抑制血栓再形成，减少残余血栓的重量，并呈剂量的依赖性。与低分子肝素相比，发生再通的时间较短，再灌注的持续时间延长，且残留的血栓重量较轻。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。所有这些变更和改进均包括在所附权利要求的保护范围之内。

新型重组组织因子抑制肽1的核甘酸序列和氨基酸序列，序列中斜体部分即为突变部分。TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATro Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val GluGAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT GCC GCA GCT GCC ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAC TAC TGT TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg

新型重组组织因子抑制肽2的核甘酸序列和氨基酸序列，序列中斜体部分即为突变部分。TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATrp Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val GluGAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu lle Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT TCA GGA AAG AAA ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAT GCA TGC TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Ala Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg

Claims (13)

1.新型重组组织因子抑制肽，其特征在于改变组织因子的胞外区C-末端的结构域，重组特异性地竞争抑制TF活性、抑制外源性凝血途径、具有抗凝与抗栓的作用的组织因子抑制肽。

2.根据权利要求1所述的新型重组组织因子抑制肽，其特征在于重组组织因子抑制肽保留了TF胞外区1-218氨基酸残基中与凝血因子VII(VIIa)结合的部位，其中参与激活凝血因子X和IX的部位被突变。

3.根据权利要求1和2所述的新型重组组织因子抑制肽，其特征在于所述的重组组织因子抑制肽为重组组织因子抑制肽1和新型重组组织因子抑制肽2，

4.根据权利要求3所述的新型重组组织因子抑制肽，其特征在于所述的突变位点为：重组组织因子抑制肽1将163位的丝氨酸、164位的甘氨酸、165位的赖氨酸和166赖氨酸被分别替换为丙氨酸，重组组织因子抑制肽2中185的酪氨酸被替换为丙氨酸。

5.一种制备新型重组组织因子抑制肽的方法，其特征在于采用下列步骤：

(1)分析全长TF的结构及其生化特性，设计新型重组组织因子抑制肽分子结构；

(2)重组组织因子抑制肽基因与表达载体重组；

(3)用上述重组载体转化表达的宿主细胞；

(4)发酵培养宿主细胞，并从中纯化所需产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA基因重组，形成表达质粒。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的载体为真核表达载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的载体为pLY-4。

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达上述重组表达载体。

10.根据权利9所述的方法，其中所述的宿主细胞为大肠杆菌菌株JF1125。

11.根据权利要求5所述的方法，其中用低营养培养基扩增工程菌，发酵参数为：温度30℃-32℃，氧容量控制在50±5％，pH＝6-7，搅拌速度与DO连动，诱导温度为40℃-42℃。

12.根据权利要求5所述的方法，其中重组组织因子抑制肽终产物为将发酵工程菌高压匀浆泵破菌，包涵体溶解、复性和离子交换色谱法纯化而获得。

13.根据权利要求1-5所述的重组组织因子抑制肽在制备防治血栓性疾病药物中的应用。