CN1408212A

CN1408212A - 生产c4植物幼苗的方法

Info

Publication number: CN1408212A
Application number: CN02144100A
Authority: CN
Inventors: 古在丰树; 肖玉蓝; 长谷川修; 大野洋次郎
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2003-04-09
Also published as: JP2003102299A; US20030110687A1

Abstract

一种生产C4植物幼苗的方法，包括将所述C4植物的组织移植到一种不含糖，但是含有多孔支撑材料的培养基中，并在光照和补充二氧化碳的条件下培养所述组织，以便形成该植物的幼苗。该方法具有诸如改善了的成本和栽培期的实用特征。

Description

生产C4植物幼苗的方法

发明背景

1.发明领域

本发明涉及C4植物，特别是甘蔗幼苗的光合自养栽培的生产方法(光合自养微量繁殖)。

2.相关技术的说明

甘蔗是一种主要为了生产糖而在世界范围内栽培的植物，在世界上甘蔗的种植面积达到了2千万英亩，并且从经济和工业角度来看，是非常重要的(FAO生产年鉴51：155，1997)。

营养繁殖甘蔗一直是传统的常用方法。就是说，繁殖是通过以下方法进行的：通过从茎插条或栽植体上获得多个芽，作为长度大约20-30厘米的繁殖体，将其切成单个的芽，并且由长大的芽再次获得茎插条。最终，将所述茎插条移植到大田中，以便生产甘蔗。因此，为了繁殖和种植，特别当甘蔗的新品种被投放市场时，每年都需要大量的茎插条。不过，这种生产方法需要很长时间。仅仅是驯化时间就需要大约2个月。因此，事实是，所述方法不能被认为是完美的生产方法，并且一直都需要更有效的、更经济的繁殖和生产系统。

另一方面，通过植物组织培养进行的微量繁殖被认为是另一种有用的营养繁殖方法。该方法能够生产大量无病毒或无病原体的，并且在遗传上优良的均匀移植体。因此，如果该技术应用在甘蔗生产上，可以预料会导致糖产量的显著提高。不过，该方法在传统上具有某些问题，因为该方法是在将糖作为碳源添加到培养基中的条件下实施的，使得它依然不能在甘蔗上被商业化应用，所述条件被称为“光合混合营养培养条件”或“异养培养条件”。所述问题包括(1)幼苗生产缓慢，(2)芽和根发育不良，(3)由于生物学污染而导致幼苗损失，(4)在驯化期间存活百分比较低等(Desjardings等，微量繁殖系统的碳同化的体外调控和操作中的碳养分：植物组织培养的自动化和环境控制，Kluwer学术出版社，441-465页，1995)。

最近的研究发现，来自C3植物的、有叶绿素的外殖体，可以在无糖的培养基上生长，即它是光合自养的。还证实了，上述问题中的很多都可以通过控制有利于促进光合作用的外部环境的方法加以解决，并且，所述外殖体在无糖培养基上的生长，比在含有糖的培养基上的生长更好(Kozai，在光合自养条件下的微量繁殖：微量繁殖技术和应用，Kluwer学术出版社，447-469页，1991)。本文所说的“控制体外环境”表示将培养环境中的二氧化碳浓度和/或光照强度，提高到高于在传统光合混合营养培养中所使用条件的水平。另外，还证实了，由于光合自养微量繁殖同样是很多C3植物提高长根百分比和生产生理学和形态学上优质幼苗的有效方法，该方法提供了一种降低幼苗生产成本的技术，即使将环境控制的复杂性考虑在内也是如此(Aitken-Christie等，植物组织培养的自动化，一般介绍和综述：植物组织培养的自动化和环境控制，Kluwer学术出版社，1-18页，1995)。

不过，由以上例子所代表的研究一直都是用C3植物进行的，没有对C4植物作过介绍。已知诸如甘蔗和玉米的C4植物具有不同于C3植物的光合途径(C4光合途径)。已知C4植物的二氧化碳补偿点(＜10微摩尔/摩尔)低于C3植物的二氧化碳补偿点，并且二氧化碳饱和点(＜1000微摩尔/摩尔)低于C3植物的饱和点(Salisbury和Ross，植物生理学，Wadswaoth出版公司，257-260页，1998)。另外还知道C4植物的光补偿点(PPF(光合作用有效的光子通量)＞20微摩尔/平方米/秒)高于C3植物的光补偿点，并且光饱和点(PPF＞1000微摩尔/平方米/秒)高于C3植物的光饱和点(Hesketh，对不同植物的光合作用反应的限制，作物科学，3：493页，1963)，因此认为对C3植物的光合自养培养(光合自养微量繁殖)的作用和影响，可能与对C4植物的光合自养培养(光合自养微量繁殖)的作用和影响不同。不过，上述研究都没有澄清C4植物的光合自养微量繁殖。

在1991年，Walker等研究了栽培C4植物之一的甘蔗的合适的繁殖条件，但是未能发现光合自养微量繁殖的优点，并且，所得出的结论是，使用糖并且没有二氧化碳增强和通风的光合混合营养微量繁殖是最佳的(Walker等，甘蔗微量繁殖的最佳环境，Trans.of the ASAE，34(6)：2609-2614页，1991)。

另外，Tay等也报导了二氧化碳浓度对甘蔗栽培的影响(Tray等，在体外细胞中改变二氧化碳和光照水平对耳草属植物和甘蔗芽培养物生长的影响，Dev.Biol.Plant，36：118-124页，2000)。不过，研究是用糖进行的，并且他们得出的结论是，甘蔗生长的差异是由于二氧化碳浓度的差别很小，因为考虑到了这样的事实，即C4植物中的C4途径对外部二氧化碳环境敏感性较低。这清楚地表明，他们根本就不了解光合自养微量繁殖。

另一方面，在2000年，Erturk和Walker发现甘蔗可以在180微摩尔/平方米/秒的光照强度和2200微摩尔/摩尔的二氧化碳浓度的条件下，以光合自养方式生长(Erturk和Walker，在微量繁殖中，光照、二氧化碳和激素含量对甘蔗芽向光合自养方向转化的影响，Trans.of the ASAE，43(1)：147-151页，2000)。他们所提供的结果仅仅证实了光合自养微量繁殖的可能性，而且，根据生长结果并不能说有关技术已经发展到可以实际应用的水平。截止到他们的报导发表时，仍然有许多问题需要解决，例如(1)植物生长调节剂(植物激素)是一个无法消除的、导致额外步骤和成本的因素，并且会导致植物的变异，(2)没有考虑过栽培环境中的通风条件，(3)使用类似于在传统方法中所使用的胶凝剂作为植物的支撑材料，会导致所获得的根系的形状类似水下根系，并且，这些根系在移植到土壤中之后不能正常起作用，如此等等。

发明概述

本发明就是在上述情况下完成的，并且本发明的一个目的是提供一种C4植物，特别是甘蔗幼苗的光合自养微量繁殖的生产方法，其中，通过将C4植物的组织转移到多孔的/纤维状不含糖和植物生长调节剂的培养基而进行栽培的，并且，该方法在成本、栽培时间等方面都有所改善。

本发明人为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现将C4植物的组织移植到既不含糖又不含植物生长调节剂，而是含有多孔支撑材料的培养基中，并且在补充二氧化碳的条件下，在光辐射条件下栽培，可以极好地促进C4植物，特别是甘蔗小植株的长根和生长。另外，本发明人还发现，通过将光辐射条件设定为高的PPF水平，将二氧化碳浓度保持在高浓度上，以及控制上述栽培中的通风条件，可以促进所述幼苗的生长。

就是说，本发明提供了以下内容：

(1)一种生产C4植物幼苗的方法，包括：

将所述C4植物的组织移植到不含糖，但含有多孔支撑材料的培养基中，和

在光照条件下，在补充二氧化碳的条件下培养所述组织，以便形成所述植物的幼苗。

(2)如(1)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在二氧化碳能够扩散到容器外面的培养容器中培养的。

(3)如(2)项的方法，其中，所述培养容器可以向外界通风，并且，其中，控制所述培养容器内部的二氧化碳浓度，使得所述培养容器外面的二氧化碳浓度保持在高于培养容器内部的水平上。

(4)如(3)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在通风条件下培养的，通风是以2-20/小时的多种空气交换速度进行的。

(5)如(3)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器周围的二氧化碳浓度为1000-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

(6)如(3)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

(7)如(5)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

(8)如(2)项的方法，其中，所述培养容器装配了用于进气和排气的装置，以便向该容器内供应二氧化碳。

(9)如(8)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在通过所述进气和排气装置通风的条件下培养的，以2-20小时的多种空气交换速度吸入和排出空气。

(10)如(8)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器周围的二氧化碳浓度为1000-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

(11)如(8)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

(12)如(10)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

(13)如(1)项的方法，其中，所述C4植物的组织是在光照条件下，在光合作用光子通量100-500微摩尔/平方米/秒的条件下培养的。

(14)如(1)项的方法，其中，所述多孔的支撑材料是选自下列一组的至少一种材料：蛭石、珍珠岩、纤维素纤维、纤维素衍生的纤维、聚酯纤维、陶瓷纤维、褐块石棉及其混合物。

(15)如(14)项的方法，其中，所述多孔支撑材料包括纤维素纤维和蛭石的混合物。

(16)如(1)项的方法，其中，所述培养基包括不含植物生长调节剂的培养液。

(17)如(1)项的方法，其中，所述C4植物是甘蔗。

附图说明

图1a是光合自养生长的甘蔗幼苗在第10天的照片；图1b是光合自养生长的甘蔗幼苗在第18天的照片；

图2表示随着时间推移，在培养容器和培养室中二氧化碳浓度变化的曲线图；和

图3是表示每一个实验小组中甘蔗幼苗的净光合速度随时间推移变化的曲线图。

优选实施方案详述

下面将对本发明作详细说明。

本发明的C4植物幼苗的生产方法，是一种通过光合自养微量繁殖方法生产C4植物的方法，其中，将所述C4植物的组织移植到一种不含糖的培养基中，并在该培养基中栽培，其特征在于所述C4植物的栽培是将一种多孔的支撑材料用作上述培养基，在光照和补充二氧化碳的条件下进行的。

在这里，本发明可以采用的植物没有具体限制，只要它们是C4植物就行，并且包括，例如，属于以下科的植物：禾本科、莎草科、藜科、大戟科、菊科和苋科，特别是甘蔗和玉米。具体地讲，对于甘蔗来说，可以优选使用本发明的生产方法。一般，甘蔗是给能积累蔗糖的甘蔗属植物起的属名。

作为用于栽培的植物材料组织(外殖体)，可以是茎插条和幼苗等。它们通常具有一个或几个叶片。

在本发明的栽培方法中，推荐将光照的PPF(光合作用光子通量)值设定为高的水平。具体的值在100-500微摩尔/平方米/秒的范围内，优选200-500微摩尔/平方米/秒，更优选200-450微摩尔/平方米/秒。

一般，作为照射用的灯光，可以使用，例如，由白色荧光灯发出的灯光。

另外，在本发明的栽培方法中，在所述栽培期间控制二氧化碳浓度，以便幼苗的栽培可以在高二氧化碳浓度气氛中进行。

用于在幼苗周围形成具有高二氧化碳浓度氛围的措施特别包括以下方式。

一种方式是使用能够向外界排气的培养容器，并且在该培养容器中栽培所述C4植物，同时，将所述培养容器周围的二氧化碳浓度保持在高的浓度水平上。通过提高所述培养容器周围的二氧化碳浓度，所述培养容器内的二氧化碳浓度也可以提高。例如，当将所述培养容器放入培养室，并且在该培养室中进行栽培时，将该培养室中二氧化碳的浓度设定为1000-2000微摩尔/摩尔是有利的，优选1000-1800微摩尔/摩尔，更优选1000-1700微摩尔/摩尔。

在这种情况下，所述能够向外界排气的培养容器特别包括这样一种培养容器：在它的盖子和/或壁的一部分上设有气体可渗透的薄膜。例如，作为所述气体可渗透的薄膜，使用Milli-Seal(Millipore公司)是合适的。

另一种模式是使用一种培养容器，其中，所述C4植物是通过有效提供用于吸入和排出空气的装置，如可以强制实施空气吸入和排出的空气泵而进行栽培的，并且向该培养容器中提供具有高二氧化碳浓度的空气，例如，通过使用Heo，J.和Kozai，T.所披露的方法(1999，用于增强甘薯幼苗的光合作用、生长和发育的强制通风微量繁殖系统，生物学的环境控制，37(1)：83-92)，可以将具有高的二氧化碳浓度的空气大量送入所述培养容器，以便增强该培养容器的通风。

所述培养容器每小时的空气交换次数优选通过Kozai，T.所披露的方法测定(1986，对植物组织培养容器中环境的基础研究(2)，塞子和容器对通过塞子密封的容器内部和外部之间气体交换速度的影响，J.Agr.Met.42，以下又称之为Kozai等，1986)。在该方法中，空气交换的次数可以是2-20/小时，优选3-20/小时。

优选对空气交换次数加以控制，以便在栽培开始阶段的数日内保持在上述范围内的较小的值，然后逐渐提高到较大的值。

建议在进行所述栽培时将所述培养容器中二氧化碳的浓度值设定在400-2000微摩尔/平方米/秒的范围内，优选400-1800微摩尔/平方米/秒，更优选500-1600微摩尔/平方米/秒。

由于所述培养容器中二氧化碳浓度还要受到该培养容器中幼苗的光合速度的影响，还建议根据需要可以改变上述培养容器周围的二氧化碳浓度以及空气交换的次数，以便能够在栽培期间将培养容器内的二氧化碳浓度保持在一个优选范围内。

下面将介绍用于本发明中的培养基。

在本发明中，使用不含糖(无糖)的培养基。所述培养基没有特别限制，只要它不会损害本发明的效果就行。例如，所述培养基包括用2倍强度磷酸二氢钾、硫酸镁和EDTA二钠改进过的MS培养基。

另外，没有必要向用于本发明的培养基中添加诸如植物生长素和细胞分裂素的植物生长调节剂。

另外，在本发明中，要使用一种多孔的支撑材料。所述多孔的支撑材料没有特别限制，只要它不损害本发明的效果就行。建议用以下材料生产所述多孔支撑材料，例如，蛭石、珍珠岩、纤维素纤维、纤维素衍生的纤维、聚酯纤维、陶瓷纤维、褐块石棉及其混合物。特别优选的是使用蛭石和纤维素纤维的混合物(例如，由Nisshinbo工业公司生产的Florialite)。

至于其他栽培条件，温度优选为25-30℃，而培养容器中的湿度为60-100％。优选对湿度加以控制，以便在栽培的开始阶段将湿度设定在高的水平上，然后逐渐降低。

所述栽培容器优选至少是部分透光，以便幼苗能够进行光合作用。例如，可以使用具有透明盖子的培养容器。

在本发明中，在幼苗栽培期间，建议栽培是在传统的12-16小时/天的光照期和12-8小时/天的黑暗期的光照条件下进行的。

所获得的幼苗通常是在外部环境中驯化之后再移植到大田中的。还可以通过采用本发明的生产方法将通过所述体外栽培所获得的C4植物的幼苗移植到大田中，取消了在体外环境下驯化的过程。

通过本发明可以获得以下效果。

就是说，由于通过使用多孔的支撑材料在受控制的环境下通过光合自养栽培生长的C4植物，能够以很高的效率在短时间内生产出健康的幼苗，预计不仅可以简化驯化阶段，而且预计能够取消所述驯化过程，并将所述幼苗直接移植到大田中。

另外，在将幼苗转移到驯化处理环境或直接移植到大田中时，连同所述支撑材料一起移植幼苗可以减少洗涤根系的操作，并避免损伤根系，这样就有可能获得高的幼苗存活百分比和生长速度。

如上文所述，本发明的C4植物幼苗的光合自养微量繁殖的生产方法，可以提供这样一种C4植物幼苗的生产方法，其中，诸如成本和栽培时间的实践特征得到了改善。

下面将通过举例的方式对本发明作更详细的说明。不过，本发明不应当被视为局限于这些实施例。

(1)材料和方法

将光合混合营养生长的甘蔗(编码：Roc22)幼苗的单一的芽用作外殖体，其中，每个外殖体的平均叶面积、鲜重和干重分别为210平方毫米、153毫克和13毫克。

将所述单一的芽移植到Magenta型培养容器中(体积370毫升，高9.7厘米；由日本的Verde有限公司生产)，每个容器装有两个外殖体和60毫升用2倍强度磷酸二氢钾、硫酸镁和EDTA二钠改良过的MS培养基。

在高压灭菌之前，将所述培养基的pH调整到5.8。在整个培养期间，将培养室中的空气温度和相对湿度分别保持在27-28℃和70-75％。光照条件为16小时/天，由白色荧光灯提供光照。

上述实验有7个处理。在下面披露的表1中提供了处理代码以及对各种处理的说明。对于光合自养微量繁殖处理来说，将因素实验设计成具有两种水平的PPF(光合光子通量)和三种水平的N(培养容器的空气交换次数)，并且每个处理有10个重复。将以上结果与对照处理(用含有糖的琼脂糖培养基，在低的PPF和低的N条件下进行常规的光合混合营养栽培)的结果加以比较。进行方差分析(ANOVA，通过两种水平的PPF和三种水平的N的组合进行了六种类型的分析)和Duncan’s多范围测试。

表1

处理	PPF(μmol/m²/s) 空气交换次数(/h)
	PPF(μmol/m²/s) 空气交换次数(/h)
	0-3 4-10 11-18 0-3 4-10 11-18天天天天天天
	0-3 4-10 11-18 0-3 4-10 11-18天天天天天天	对照LL^*LMLHHLHMHH	60 60 60 0.2 0.2 0.2100 200 300 1.8 1.8 1.8100 200 300 1.8 2.7 3.6100 200 300 2.7 6.0 10.2200 300 400 1.8 1.8 1.8200 300 400 1.8 2.7 3.6200 300 400 2.7 6.0 10.2

在表1中，与符号“^*”一起使用的第一个(左侧)字母L和H分别表示低的和高的PPF。而第二个(右侧)字母L、M和H分别表示培养容器空气交换的低、中等的和高的次数。在除了对照处理以外的所有处理中，培养基中都不含糖。

(1-1)光合自养栽培(光合自养微量繁殖)

在光合自养栽培条件下，在下文所述的Florialite上体外栽培上述甘蔗外殖体。在第0-3天、4-10天和11-18天，在LL、LM和LH中的PPFs分别为100、200和300微摩尔/平方米/秒，在HL、HM和HH中的PPFs分别为200、300和400微摩尔/平方米/秒。

在光合自养栽培条件下，不仅不向所述培养基中添加糖，而且还从改进的MS培养基中排除了萘乙酸(以下又称之为NAA)——一种植物生长调节剂(生长激素)，维生素和其他有机物质。在光合自养栽培中，用Florialite(由蛭石和纤维素纤维混合物制成的具有高的孔隙度的支撑材料；Nisshinbo工业公司)作支撑材料。用一台二氧化碳控制仪将培养室中的空气二氧化碳浓度保持在1500微摩尔/摩尔。将透气性薄膜(直径10毫米，膜的孔径0.5微米)连接在相应容器的盖子和壁的孔上，以便增强自然通风。

在表1中所提供的培养容器每小时的空气交换次数是按照Kozai等(1986)所披露的方法测定的。在LM、LH、HM和HH处理中，随着时间推移通过增加透气性薄膜的数量提高N值。

在第3、10和17天，用气相层析仪(GC-12A，Shimadzu有限公司，日本京都)测定培养容器内部和外部的二氧化碳浓度。

按照Fjiwara等所建立的方法(Fjiwara，K.，Watanabe，I.，1987，测定装有组织培养幼苗的密封容器中的二氧化碳气体浓度，并估算幼苗净光合速度，J.Agr.Meteorol.43：21-30)，用以下公式计算净光合速度。

Pn＝KNV(C_外部-C_内部/)E

其中，K是将二氧化碳从体积转换成摩尔数的换算系数(0.0405摩尔/升，28℃)；N是培养容器每小时的空气交换次数(/小时)；V是培养容器的空气部分的体积(0.37升)；C_外部和C_内部是在光照期间，在稳态条件下，培养容器内部和外部的二氧化碳浓度(微摩尔/摩尔)；E是每个容器的幼苗数量。

在光合自养栽培条件下的处理中，在第0、10和18天测定每个幼苗的鲜重和干重、叶面积和展开(不折叠)叶片的数量。在第18天，某些幼苗在光合自养栽培条件下，在培养容器中明显变大，并且大多数叶片的上半部分接触到栽培容器盖子的内表面。这样，在第18天不得不终止该实验。

(1-2)对照处理

另一方面，在常规光合混合营养栽培条件下的处理中，添加蔗糖(30克/升)作为碳能源，并且添加萘乙酸(NAA)——一种植物生长调节剂(植物激素)(0.5毫克/升)，以便促进幼苗长根。用琼脂(6.5克/升)作为根系的支撑材料。

将对照处理的培养室中的二氧化碳浓度调整到与大气中的常见二氧化碳浓度相同(大约400微摩尔/摩尔)。在所述对照处理中，在整个实验期间将PPF设定为60微摩尔/平方米/秒。在光合自养栽培条件下的处理的实验时间是18天，与此不同的是，对照处理的实验时间是30天。

在所述对照处理中，分别在第0、10、18和30天测定每个幼苗的鲜重和干重、叶面积和展开的(非折叠的)叶片的数量。

(2)结果

(2-1)幼苗的生长

第18天的生长和发育结果归纳在表2和图1中。

表2

处理叶面积编号 (mm²)	鲜重(mg) 干重(mg)	芽的数量展开的叶片数量
	鲜重(mg) 干重(mg)		芽根芽根
	对照 319±127d²LL 190±96dLM 700±97cLH 1049±317bHL 135±44dHM 1022±400bcHH 1648±65a		芽根芽根	303±100c 21±15c 29±8cd 2±1c124±86c 33±22c 18±8d 5±4c535±101b 311±121bc 77±15bc 24±13bc716±249b 356±114b 107±39b 31±11b106±29c 46±26c 13±5d 4±3c781±329b 388±303b 109±47b 34±24b1394±616a 669±562a 201±104a 61±48a	3.0±1.0b 4.3±0.5d1.4±0.5c 3.4±0.5d3.6±0.7ab 5.9±1.1c3.8±1.2ab 5.3±0.4c1.3±0.4c 4.3±0.7d4.3±1.6a 7.4±1.3b3.9±1.3ab 9.5±1.9a
方差分析^YNo.^A(A) ^XPPF(B) A×B NS		** NS * NS* NS * NS	NS NS

在表2中，为了进行比较还归纳了对照处理(传统的光合混合营养栽培)的生长结果(处理代码参见表1)。

在表2中，每一个幼苗的芽的数量表示繁殖比例(可用于下一阶段的繁殖的外殖体的数量)。另外，在表2中，Z表示同一栏的平均值后的相同字母，通过LSD(最小显著差异)测试p＜0.05的无显著差别。Y表示对6个处理进行的方差分析，这些处理是由培养容器的两种水平PPF和三种水平的空气交换次数组成的。X表示NS，^*和^**分别代表不显著、在5％的可能性水平上(p＝0.05)显著和在1％的可能性水平上(p＝0.01)不显著。A表示培养容器的空气交换次数。

图1A和1B是表示第10天(图1A)和18天(图1B)光合自养生长的甘蔗幼苗受培养容器的PPF和空气交换次数影响的照片。为了进行比较，还示出了对照处理中光合混合营养生长的幼苗(处理代码参见表1)。

在所有实验组的HH处理中，甘蔗生长(叶面积、根和芽的鲜重，以及根和芽的干重)是最高的。每个幼苗的叶面积、芽和根的鲜重以及芽和根的干重，分别比对照处理中的相应的值高5.2、4.6、32、6.9和30倍。(下面在适当的时候会省略术语“处理”)。

在HM、LH和LM中的生长明显比在对照中的生长快(表2，图1)。

在LL、HL和对照之间的增长没有明显差别。

培养容器的空气交换次数N，对甘蔗的所有生长参数(叶面积、根和芽的鲜重，以及根和芽的干重)都有正面影响。PPF对叶面积、芽的鲜重和干重有正面影响。

N和PPF对生长的正面影响在第10天就已经出现了(参见表3)。在所有处理中，在HH中的生长最快。

表3

处理叶面积鲜重干重展开的叶片代码 (mg) (mg) 数量(每个(mm²) 幼苗的)
处理叶面积鲜重干重展开的叶片代码 (mg) (mg) 数量(每个(mm²) 幼苗的)	对照 298±90c 247±111c 20±10c 4.0±0.7cLL 231±152c 201±90c 19±12c 4.0±0.7cLM 431±113b 559±151b 57±9b 4.8±0.8cLH 675±144b 651±139b 61±15b 7.5±1.1bHL 265±96c 225±72c 21±11c 4.8±0.8cHM 654±161b 634±130b 60±13b 5.0±1.2cHH 1179±221a 1055±258a 33±52a 8.3±1.1a
方差分析^YNo.^A(A) ^X PPF(B) NSA×B NS

表3表示在光合自养培养条件下，受培养室的PPF和空气交换次数影响的甘蔗幼苗在第10天的生长情况。表3还示出了对照处理(常规的光合混合营养培养)的生长结果，以便比较(有关处理代码参见表1)。

在表3中X表示NS和^**代表在1％可能性的水平上(P＝0.01)“不显著”和“显著”。其他符号的含义与表2中相同。

在HH处理中每个甘蔗幼苗的叶面积、鲜重和干重分别比对照处理的高4.0、4.3和6.7倍。在HM、LH和LM中的生长明显快于在对照中的生长(表3)。LL、HL和对照之间的生长没有显著差别。在LL、HL中，在第3天就已经可以看到芽和根的生长和发育。

在HH中的根的鲜重和干重分别比在对照中的高32和30倍，所述对照是在添加了0.5毫克/升萘乙酸(NAA)——一种植物生长调节剂(植物激素)的培养基中培养的(参见表2)。在HH中，在没有NAA的条件下，长根的加强可能是由于适当选择了光合自养栽培的条件，并且由于支撑材料(即Florialite)具有较高的空气孔隙度。具有高的空气孔隙度的支撑材料提供给芽底部周围的溶解氧气的浓度，一般高于诸如琼脂的胶凝支撑材料所提供的溶解氧气的浓度。

如上文所述，在体外驯化期间，活跃的根系生长是甘蔗幼苗存活所必需的。

在所述实验中，在HH、HM和LH中幼苗的生长出人预料的快，并且，在第10天的之后，很少有幼苗的叶片顶端没有达到容器盖子内表面的。

另一方面，在对照、HL和LL中幼苗的生长是缓慢的。

在第30天，每个幼苗的叶面积、芽和根的鲜重、芽和根的干重以及芽的数量分别为423±83平方毫米、439±75毫克、36±5毫克、3.6±0.5毫克。

(2-2)栽培容器中的二氧化碳浓度

图2是分别表示栽培室和培养容器中二氧化碳浓度随时间而变化的曲线图。该曲线是用在光照期中测定的值作的图。在光合自养培养的遮光期间，培养容器中二氧化碳浓度至少为1500微摩尔/摩尔。

另一方面，在第3天，在光合自养培养的光照期培养容器中二氧化碳的浓度低于培养室中的浓度(1500微摩尔/摩尔)。这表明从培养一开始外殖体的净光合速度是正的。

在HM和HH中，在光照期间，培养容器中二氧化碳的浓度随着时间推移而降低，并且在第17天达到大约150微摩尔/摩尔。在LM中，第17天的二氧化碳浓度为530微摩尔/摩尔，这一浓度值比培养室中的浓度低大约1000微摩尔/摩尔。

在光合自养培养条件下，LL和HL中的某些幼苗逐渐变黄，并在第3-7天失去活力。在第12天，LL和HL中80-90％的幼苗死去，并且在第14和15天出现新芽。这可能是因为在光照期间由于培养容器空气交换次数较少所导致的培养容器中二氧化碳浓度较低的结果，使得幼苗出现了负的净光合速度，并且，因此限制了幼苗在体外的生长。另一方面，在HH、HM、LH和LM处理中，空气交换的次数高于LL和HL中的空气交换次数，并且，叶片颜色保持绿色和有活力。

在LL和HL中，在光照期间二氧化碳的浓度随着培养时间的推移没有显著降低。

在第3、10和17天，对照的二氧化碳浓度分别为大约7000、7300和8100微摩尔/摩尔，与之对应的是，在培养室中二氧化碳的浓度为390-440微摩尔/摩尔，这表明在整个培养期间外殖体/幼苗具有负的净光合速度。

(2-3)净光合速度

在HH、HM、LH和LM中，净光合速度随着培养时间的推移而提高。在HH中的净光合速度最高，在第3、10和17天每个幼苗的净光合速度分别是3.5、16和95微摩尔/小时，随后是HM、LH和LM(图3)。

在整个实验中，在LL和HL中的净光合速度是略微正的，但不会随着时间推移而提高。

空气交换次数N的增加，能显著提高幼苗的净光合速度。N的增加是由于在培养室中幼苗周围空气运动或空气流速度的提高，以及促进了存在于幼苗周围的二氧化碳的扩散，由此导致了体外植株光合作周的增强。另外，N的增加明显降低了在光照期间培养容器中的相对湿度，并因此显著提高了幼苗的蒸腾速度。

对照的净光合速度是负的并且最低，在第3、10和17天每个幼苗的净光合速度分别为-8.8、-9.2和-10.4微摩尔/小时。对照的负的净光合速度，可能是因为在培养容器中的培养基中存在糖、PPF较低、以及在整个培养期间空气交换次数较少(在光照期间，培养容器中的二氧化碳浓度较低)。

在光合自养条件下，在培养期间提高HH、HM和LH中PPF和N(空气交换次数)，并保持培养容器中二氧化碳的浓度高于大气中的二氧化碳浓度，可能对促进光合作用和生长非常有效。

(2-4)每个幼苗的芽和展开叶片的数量。

在第18天，LM、LH、HM和HH中的可以用作外殖体进行进一步的体外扩增，以及用于进行体外移植的芽的数量明显高于在HL、LL和对照中的数量(表2)。因此，可以认为LM、LH、HM和HH的繁殖比例高于在HL、LL和对照中的繁殖比例，从而能够有效生产幼苗。

另外，在第18天，HH中每个幼苗的未折叠的叶片的数量明显高于在其他处理中的数量，并且在对照、LL和HL中最低(表2)。体外幼苗的净光合速度，以及刚刚移植到体外的外殖体的净光合速度会随着未折叠叶片数量的增加而提高，或者更具体地讲，会随着所述芽(或外殖体)所具有的叶面积的增加而增加。因此，可以认为在HH处理组中的外殖体，每一个幼苗的叶面积大于其他处理组中的每一个幼苗的叶面积这一事实，是光合自养生产的非常有利的条件。

HM和HH中比较高的繁殖比例和比较大的叶面积可能是由于通过外殖体的高的净光合速度以及使用多孔的支撑材料而增强并促进了根组织和芽的发育和生长。根组织的较快的生长改善了对水分和养分的吸收，使得幼苗较少枯萎，并且芽能更好地生长。

(2-5)繁殖周期

如图1所示，在第18天，HH处理组中的幼苗由于过度生长并且太大，以至不能用于繁殖或体外驯化。另一方面，HH中第10天的幼苗大于对照中第18天的幼苗，并且其大小适合繁殖并且用于体外驯化。

在HH中，在第10天每个幼苗的未折叠叶片的数量为8.3，这一数量比对照在第18天上的数量高大约2倍。

因此，可以认为HH的最佳繁殖期只需要大约10天，这一时间仅为传统组织培养的30天时间的三分之一。换句话说，与对照的繁殖速度相比，HH中的繁殖速度可以显著提高。

从上述实验结果可以看出，根据本发明，在体外培养的甘蔗幼苗表现出了较高的光合自养生长能力。在光合自养微量繁殖中，高的PPF(100-500微摩尔/平方米/秒)，高的二氧化碳浓度以及高的培养容器的空气交换次数(2-20/小时)，能明显加强甘蔗幼苗的生长。

与多孔支撑材料的组合使用还能增强甘蔗芽和根组织的生长。另外，在培养基中没有必要添加任何植物生长调节剂(植物激素)。

从成本和培养时间角度来看，在上述综合培养条件下，通过光合自养培养进行C4植物的微量繁殖，是一种比传统微量繁殖方法更实用和更优良的方法，因为有关条件之间是相互影响的。在采用高的PPF和高的培养容器空气交换次数的光合自养系统中，甘蔗幼苗的体外培养时间，比传统微量繁殖系统缩短了大约70％(从30天缩短到10天)。因此可以预料生产成本能显著降低。这样就可以提高在大规模商业化生产时的效益。

Claims

1.一种生产C4植物幼苗的方法，包括：

2.如权利要求1的方法，其中，所述C4植物的组织是在二氧化碳能够扩散到容器外面的培养容器中培养的。

3.如权利要求2的方法，其中，所述培养容器可以向外界通风，并且，其中，控制所述培养容器内部的二氧化碳浓度，使得所述培养容器外面的二氧化碳浓度保持在高于培养容器内部的水平上。

4.如权利要求3的方法，其中，所述C4植物的组织是在通风条件下培养的，通风是以2-20/小时的多种空气交换速度进行的。

5.如权利要求3的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器周围的二氧化碳浓度为1000-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

6.如权利要求3的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

7.如权利要求5的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

8.如权利要求2的方法，其中，所述培养容器装配了用于进气和排气的装置，以便向该容器内供应二氧化碳。

9.如权利要求8的方法，其中，所述C4植物的组织是在通过所述进气和排气装置通风的条件下培养的，以2-20小时的多种空气交换速度吸入和排出空气。

10.如权利要求8的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器周围的二氧化碳浓度为1000-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

11.如权利要求8的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

12.如权利要求10的方法，其中，所述C4植物的组织是在所述培养容器内部二氧化碳浓度为400-2000微摩尔/摩尔的浓度下培养的。

13.如权利要求1的方法，其中，所述C4植物的组织是在光照条件下，在光合作用光子通量100-500微摩尔/平方米/秒的条件下培养的。

14.如权利要求1的方法，其中，所述多孔的支撑材料是选自下列一组的至少一种材料：蛭石、珍珠岩、纤维素纤维、纤维素衍生的纤维、聚酯纤维、陶瓷纤维、褐块石棉及其混合物。

15.如权利要求14的方法，其中，所述多孔支撑材料包括纤维素纤维和蛭石的混合物。

16.如权利要求1的方法，其中，所述培养基包括不含植物生长调节剂的培养液。

17.如权利要求1的方法，其中，所述C4植物是甘蔗。