CN1401000A - 检测配体或类配体低分子量化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种测定供试化合物中的配体或类配体低分子量化合物的方法，其特征在于从其它的细胞系中分离用配体受体基因和抗生素抗性基因转染的配体依赖性细胞系，在所述供试化合物存在的条件下培养所述的配体依赖的细胞系且然后检测细胞的细胞增殖活性。此方法的应用使得通过简单步骤来精确地筛选配体(生理活性物质)或具有相同功能的低分子量化合物成为可能。

Description

检测配体或类配体低分子量化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种通过用配体受体基因转染的配体依赖性细胞系的细胞增殖活性作为指标来检测配体或类配体低分子量化合物的方法。
背景技术
已知各种参与免疫系统、造血系统、内分泌系统和神经系统活动的配体(生理活性物质)，结合在各种细胞细胞膜上的特异性受体上。人们认为细胞膜外部的刺激物通过结合被作为信息传递到细胞中并诱导细胞的增殖或分化来维持体内高度有序的功能。
迄今为止，已有30种类型的细胞因子、生长因子及其类似物被鉴定为配体。例如，粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种由单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞或类似物产生的生长因子。已知这种因子作用于嗜中性前体并诱导它们的增殖、分化和兴奋，其结果是该因子可以使有机体不受病原体的侵害，并具有抗肿瘤的活性[Asano等，“JIKKEN IGAKU(Experimental Medicines)”，7(15)，1859-1865(1989)]。相应的，配体被期望不仅仅用于嗜中性白血球减少症，顽固性传染性疾病和骨髓机能减退，还用于AIDS。
在另一方面，已知白介素10(IL-10)是一种由Th2细胞产生的因子，且能抑制来自Th1细胞的细胞因子[Ishida等，“RINSHO MENEKI(Clinical Immunology)”，27(Suppl.16)，97-106(1995)]。最近几年，这种IL-10已被发现产生于不同的细胞例如激活的B细胞，巨噬细胞，角质形成细胞，肥大细胞等等。已知这种白介素可以抑制单核细胞或巨噬细胞的MHC II型抗原，B7(CD80，CD86)的表达，且也能抑制胞间粘附分子的表达[de Waal Malefyt等，“J.Exp.Med”，177，915(1991)]。此外，其增殖抑制作用抵抗了T细胞的增殖和其激活作用可以激活B细胞[Ishida等，“RINSHO MENEKI(Clinical Immunology)”，27(Suppl.16)，97-106(1995)]。鉴于这些作用，IL-10被期望临床应用于自身免疫疾病(类风湿性关节炎，等)、器官移植准备、炎症性细胞因子引起的器官移植后失败、炎性疾病等等。
另外，红细胞生成素(EPO)主要产生于管状内皮细胞，其通过促进成红细胞的分化或增殖和血红素合成的mRNA诱导作用于早期成红细胞前体和晚期成红细胞前体来刺激红细胞生成[Hirashima等，“JIKKEN IGAKU(Experimental Medicines)”，7(15)，1852-1858(1989)]，且其目前被临床应用于肾贫血和顽固性贫血(再生障碍性贫血，顽固性贫血)。另一方面，血小板生成素(TPO)主要产生于肝的窦状内皮细胞，其作用于成巨核细胞前体和成巨核细胞来刺激诱导巨核细胞产生血小板[Teramura等，“GAN TOKAGAKU RYOHO”(Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy)，26(4)，421-428(1999)]，且其目前被期望临床用于血小板减少症，急性骨髓性白血病，再生障碍性贫血，脊髓发育不良综合征以及与制癌化学疗法，癌放射治疗或骨髓移植相关的疾病等。
胰岛素是一种生理活性物质，其由胰腺β细胞产生且与糖尿病密切相关。与细胞膜上的胰岛素受体结合的结果增强了细胞膜的跨膜传递，促进了糖或氨基酸进入细胞，抑制脂肪组织的脂肪水解作用，并促进糖原和蛋白质在肌肉和肝脏中的合成[Zawalich，W.S.等，“Endocrinology”，103，2027-2034(1978)]。目前在日本采取胰岛素疗法治疗的糖尿病患者有280，000之多，且此种病患者的人数呈每年稳定地增加。
神经生长因子(NGF)是被合成在大脑皮层和海马沟中，其作用于周围神经例如交感神经和感觉神经，且在功能维持和存活维持中是有效的[Mima等，“IYAKU JOURNAL(Medcine and Drug Journal)”，26(2)，245-249(1990)]。现在神经生长因子被期望发现对阿耳茨海默氏病，脑局部贫血病，外周神经损伤等疾病的临床应用。
关于上述的这些配体(生理活性物质)，其基因最近被相继地分离，由此可以提供基因重组型的生理活性物质并且可以鉴定很多种能够充当配体(生理活性物质)的肽。
然而，这些肽除了很少一部分外尚未被用作药物，仅仅G-CSF，干扰素α等在被临床应用。这些肽难于用作药物的原因是，除了其他因素外，这些肽作为蛋白质，易受新陈代谢的影响，且残基阶段短暂，另外其也趋向于诱导抗体的产生从而被中和。
鉴于要克服上述的问题，能够诱导这些配体(生理活性物质)的类似功能取代蛋白质配体的低分子量化合物(以下称为“类配体低分子量化合物”)的筛选正在被进行中。然而，迄今已知的这些筛选方法伴随这样一个问题，由于它们要使用感受态细胞作为配体的受体(生理活性物质)，在结合配体到相应的受体上之后必须进行信号的复杂追踪尽管这种信号的测定是很难的。例如，产生于感受态细胞的物质的定量测定或感受态细胞中的信号或类似物的测定是必需的，其中产生的问题是需要极端复杂的定量分析或测定。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过简单的步骤精确筛选配体(生理活性物质)或能够以类似的方式充当配体的低分子量化合物的方法。
发明的内容
本发明人对配体(生理活性物质)的检测方法进行了各种研究工作。结果，发现利用仅在配体存在下增殖的细胞来代替常规方法中所使用的配体感受态细胞，使得通过检测细胞的增殖来容易地测定配体或类配体物质的存在成为可能，从而完成了本发明。
因此本发明提供了一种检测供试化合物中的配体或类配体低分子量化合物的方法，其包括步骤：从其他细胞系中分离配体依赖的细胞系，其已被转染来自其它细胞系的配体受体基因和抗生素抗性基因，在供试化合物存在的条件下培养配体依赖的细胞系，然后检测配体依赖的细胞系的细胞增殖活性。
本发明也提供了一种如上所述的检测供试化合物中的配体或类配体低分子量化合物的方法，其中配体依赖的细胞系的培养是在供试化合物和至少一种还原剂和白介素3(IL-3)的存在下进行的。
本发明进一步提供了一种试剂和一种试剂盒，其用于上述的两种方法中。
附图的简要说明
附图1是一个图表，其显示了实施例1培养基中hG-CSF浓度和用hG-CSF受体基因转染的细胞系增殖程度之间的关系。
附图2是一个显示了实施例2培养基中hIL-10浓度和用hIL-10受体基因转染的细胞系的增殖程度之间关系的图表。
附图3为一个显示还原剂对G-CSF依赖的细胞系增殖的影响的图表。
附图4为一个显示IL-3对G-CSF依赖的细胞系增殖的影响的图表。
附图5为一个显示还原剂和IL-3对G-CSF依赖的细胞系增殖的影响的图表，其中的G-CSF是类G-CSF低分子量物质。
附图6为一个显示还原剂对IL-10依赖的细胞系增殖的影响的图表。
附图7为一个显示IL-3对IL-10依赖的细胞系增殖的影响的图表。
附图8是一个图表其表明实施例8培养基中的hEPO浓度和用hEPO受体基因转染的细胞系增殖的程度之间关系的结果。
附图9是一个表明还原剂对EPO依赖性细胞系的增殖的影响的图表。
附图10是一个表明IL-3对EPO依赖细胞系的增殖的影响的图表。
发明的实施方案
此处的术语“配体依赖的细胞系”是指一种细胞系，其仅仅当配体或类配体低分子量化合物(在下文被称作“配体或其类似物”)存在于培养中时才可以生长和增殖。此外，术语“类配体低分子量化合物”是指一种低分子量化合物，其具有一种或多种特异性结合于在细胞表面表达的受体上的特性，一种激活受体的活性和一种取代细胞中信号的特性，并且该配体低分子量化合物作用于生物体类似于配体。
每一种用于本发明的配体依赖的细胞系均可通过导入与被测定的配体或其类似物相关的配体受体基因，和一种抗生素抗性基因到所培养的细胞系中来制备。
具体说，配体依赖的细胞系可通过悬浮所培养的细胞系在合适的缓冲液中，将已被用配体受体基因和抗生素抗体基因转染的在合适溶剂中的DNA溶液加到悬浮液中，然后导入DNA到所培养的细胞系中来制备。
用于本发明的所培养的细胞系的例证为白介素3(IL-3)依赖的鼠细胞系，例如，BAF/B03[Palacios，R.等，“Cell”，41，727-734(1985)；Shi，Y.等，“J.I mmunol.”，159，5318-5328(1997)]。用于悬浮此种细胞的缓冲液的例子可包括K-PBS(30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.46mMKH2PO4，5mM MgCl2)。
被插入到此种细胞中的配体受体基因，可以使用，例如通过下述论文中描述的方法获得的：
-人粒细胞菌落刺激因子受体：
Larsen，B.A等，“J.Exp.Med”，172，1559-1570(1990).
-人白介素10受体：
Liu，Y等，“J.Immunol.”，152，1821-1829(1994).
-人促红细胞生成素受体：
Jones，S.S，等，“Blood“，76，31-35(1990).
-人血小板生成素受体：
Mignotte，V.等，“Genomics”，20，5-12(1994).
-人胰岛素受体：
Ebina，Y.等，“Cell”，40，747-758(1985).
-人神经生长因子受体：
Johnson，D.等，“Cell”，47，545-554(1986).
在另一方面，在细胞中插入抗生素抗性基因是为了方便对带有被导入的配体受体基因的细胞的筛选。可利用的抗生素抗性基因的例子包括嘌呤霉素抗性基因，潮霉素抗性基因和新霉素抗性基因。与这些抗生素抗性基因一样，那些通过已知的相关论文中描述的方法获得的抗生素抗性基因可以被使用。然而，带有各种被插入的抗生素抗性基因的质粒也可以现成得到。所以，也可以插入上述的配体受体基因到这些质粒中并将产生的质粒用作配体受体基因和抗生素抗性基因转染的DNAs。此种质粒的例子为pcDNA3.1，pcDNA3.1/Zeo，pcDNA3.1/Hygro，和pIRESpuro。
在溶解和插入用配体受体基因和抗生素抗性基因转染的DNA时，最好使用通常用来溶解DNAs的溶剂来溶解DNAs，例如，TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA；pH8.0)。
作为导入配体受体基因和抗生素抗性基因到所培养的细胞系中的程序和方法，已知的程序和方法例如电穿孔，DEAE葡聚糖法，核糖体法或微注射法可被使用。其中，优选使用电穿孔法，因为其简单且高效的基因导入。
依照电穿孔方法，采用高电压脉冲来通过悬浮培养物细胞系和用于编码配体受体基因及其类似物的DNA的溶液，由此使细胞系的细胞壁形成微孔并且通过这些微孔使配体受体基因被导入到细胞中。作为电穿孔的特定条件，优选设置电压为260V到300V且电容大约为960μF。一种关于配体受体基因导入到小鼠细胞系BAF/B03中的方法已被Rowlinson S.W等所报道。配体受体的导入可以，采用被报道的方法[“J.Biological Chemistry”，273(9)，5307-5314(1998)]。
上述的导入配体受体基因的细胞系然后在配体和抗生素存在的条件下被培养来将其从未被导入配体受体基因的培养物细胞系中分离出来。此处所使用的培养基可以为常规的培养基。然而，必需的是培养基含有导入的配体受体对应的配体以及与抗生素抗性基因对应的抗生素，而不能加入其它的配体。
在此培养中，仅仅用配体受体基因和抗生素抗基因转染的细胞系被允许生长，而让没有用配体受体基因转染的细胞系全部死亡。此使得从其它细胞系中分离出配体依赖的细胞系成为可能。另外，如不将配体受体基因中组合进抗生素抗性基因的话，由于培养基中的成分，如胎牛血清(FCS)，的作用，即便是未用配体受体基因转染的细胞系也会有增殖的可能性。
依上述方法构建的配体依赖细胞系被用于供试化合物中配体或类配体低分子量化合物的测定。这种试验的方法可通过在供试化合物以合适浓度存在的条件下培养细胞系且然后测定细胞增殖的程度来进行。由于配体依赖的细胞系仅在配体或类配体低分子量化合物存在的条件下生长，配体依赖的细胞系的增殖使得测定配体或类配体低分子化合物的存在成为可能，并且可以因此推断化合物为类配体低分子化合物。
在进行配体依赖的细胞系的上述培养时，优选除供试化合物外在培养基中加入还原剂和可选择性地加入白介素3(IL-3)。其中，还原剂增强培养物中细胞的活性并促进其增殖。
尽管对还原剂没有特别的限定，但从起作用的角度考虑，最好使用例如2-巯基-乙醇和α-硫代甘油等还原剂。还原剂在培养基中的优选的量有个范围，但并不特定的限定于，从大约10-6到大约10-3M，特别是10-5到大约10-4M。
此外，IL-3也可以增强所培养的细胞的活性，在本发明方法的实施中，IL-3可以产生促进所培养的细胞增殖的优越效果。
对于IL-3来说，IL-3例如小鼠重组IL-3或已知含有相同物质的培养物可以被使用。IL-3的浓度优选从大约0.01到大约100ng/mL，特别是从大约0.1到大约10ng/mL。
配体依赖性细胞增殖或不增殖可以被测定，例如，通过培养配体依赖的细胞系在含有供试化合物的培养基中维持预定的时间且在培养结束后进行计数。培养可在优选的条件下进行，例如，在5％CO2培养箱中37℃培养大约48小时。在培养后进行细胞计数时，还原型显影染色试剂被用作比色物质。优选的还原型显影染色试剂的例子可包括四氮唑盐，WST-1[2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二硫代-苯基)-2H-四氮唑钠盐]是特别优选的。
作为此四氮唑-染色显影剂的电子载体，吩嗪甲基硫酸盐电子载体是优选的，特别优选的是与1-甲氧基PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐)联合使用。用于细胞增殖测定的试剂盒市场上有销售，产品名称为“细胞计数试剂盒”(”Cell Counting Kit”)，销售厂家为Dojindo Laboratories。该试剂盒内有WST-1和1-甲氧基PMS。
为了实施本发明的方法，优选使用，例如用于配体或类配体低分子量化合物的分析试剂或试剂盒，其含有下列(a)到(d)的组分：
(a)一种用配体受体基因和抗生素抗性基因转染的配体依赖的细胞系；
(b)一种用于所述配体依赖的细胞系的培养基；
(c)一种比色物质；以及
(d)一种电子载体。
在这些组分中，组分(a)和组分(b)分别为用于本发明方法中的细胞系和允许其增殖的培养基，而组分(c)和组分(d)为测定细胞增殖的试剂。依据需要可以将还原剂和/或IL-3加到上述组分的组分(b)中。
当制备用于配体或其类似物的试剂盒时，这些单独的组分可分别提供或以两种或多种组分混合试剂的形式提供，且最终这些组分或组分混合试剂将被混合在一起。如果不自己制备试剂盒，也可以按上文提到的渠道，商业购买用于细胞增殖测定的WST-1、比色物质、和1-甲氧基PMS、电子载体组合式试剂盒。这种试剂盒可被用来替代组分(c)和组分(d)。工业应用性
配体或类配体低分子量化合物物质的传统测定方法是使用配体(生理活性物质)的感受态细胞，并且需要经过诸如测定信号或测定配体(生理活性物质)结合到物质的受体上之后的产物等过程。
另一方面，本发明的方法利用了通过插入配体受体基因到细胞中而获得的并在细胞表面含有生理活性物质受体的细胞系。受体表达的细胞不能够增殖除非来自受体的信号被传递。换句话说，这些细胞不能存活除非配体(生理活性物质)或其替代化合物结合到在细胞表面表达的受体上。
从前面所述的可以理解，通过细胞的存活或死亡表达来表示配体或类配体低分子量化合物在测试系统中的存在或不存在已成为可能。目前依据细胞系增殖的程度来定量筛选大量的低分子量化合物已成为可能，且与传统的测定相比其非常地简单。
相应地，本发明能敏捷地和容易地测定替代配体(生理活性物质)参与免疫系统、造血系统、内分泌系统或神经系统活动的低分子量化合物，并且在能够直接作用免疫系统、造血系统、内分泌系统或神经系统的药物例如免疫增强剂的开发中是非常有用的。
实施例
本发明依据下面的实施例将被进一步具体的描述。然而，可以理解本发明并不限定于或被这些实施例所限定。实施例1
                人G-CSF-依赖的细胞系的构建
利用基于人G-CSF受体基因制备的引物，人G-CSF受体基因被通过RT-PCR技术从人脾脏cDNA文库来克隆[Mullis，K.等，“Cold Spring Harb Symp.Quant.Biol.”，51，263-273(1986)]。人G-CSF受体基因被插入到表达载体(pIRESpuro)的多克隆位点EcoRI中。表达载体(人G-CSF-R/pIRESpuro)被插入到E.coli中，然后增殖。表达载体然后被提取。作为宿主细胞，BAF/B03细胞系被使用。
表达载体人G-CSF-R/pIRESpuro，(20μg)被加到K-PBS(800μL；30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.46mM KH2PO4，5mMMgCl2)中的宿主细胞BAF/B03(5×107细胞)中，产生的混合液4℃放置15分钟。基因的导入通过280V电压和950μF电容电穿孔来进行。导入基因后，细胞被悬浮在含有10％小鼠细胞系WEHI-3B培养物(WEHIsup)的DMEM培养基((+)10％FCS)中并被温育，所述培养物含有小鼠IL-3。48小时后，细胞被悬浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的DMEM培养基((+)10％FCS，2ng/mL重组人G-CSF(rhG-CSF))中，并且被构建。
在检测细胞增殖活性时，用人G-CSF受体基因(BAF/hGCSFR)转染的细胞系被回收，用PBS(-)洗涤，被悬浮在DMEM培养基((-)FCS)中。细胞在96孔皿上被制备为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，rhG-CSF分别以0，0.025，0.1，0.4，1.6或6.4ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃温育48小时。温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。反应后，在450nm的测定波长处进行测定。
结果，用人G-CSF受体基因转染的细胞系(BAF/hGCSFR)被发现在0.025到6.4ng/mL的rhG-CSF浓度范围中具有良好的线性(附图1)。因此，很显然本发明的方法使得hG-CSF或类hG-CSF低分子量化合物的定量测定成为可能。
实施例2
                人IL-10-依赖的细胞系的构建
利用基于人IL-10受体基因制备的引物，人IL-10受体基因被从人脾脏cDNA文库通过RT-PCR技术来克隆[Mullis，K.等，“Cold Spring Harb Symp.Quant.Biol.”，51，263-273(1986)]。人IL-10受体基因被插入到表达载体(pIRESpuro)的多克隆位点EcoRI中。表达载体(人G-IL-10/pIRESpuro)被插入到E.coli中，然后增殖。然后表达载体被提取。
表达载体，人IL-10/pIRESpuro，(20μg)被加到K-PBS(800μL；30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.46mM KH2PO4，5mM MgCl2)中的宿主细胞BAF/B03(5×107细胞)中，产生的混合液4℃放置15分钟。通过280V电压和950μF电容电穿孔来进行基因的导入。导入基因后，细胞被悬浮在含有10％小鼠细胞系WEHI-3B培养物(WEHIsup)的DMEM培养基((+)10％FCS)中并被温育，所述培养物含有小鼠IL-3。48小时后，细胞被悬浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的DMEM培养基((+)10％FCS，2ng/mL重组人IL-10(rhIL-10))中，并且被构建。
在检测细胞增殖活生时，回收用人IL-10受体基因(BAF/h IL-10R)转染的细胞系，接着用PBS(-)洗涤，然后悬浮在DMEM培养基((-)FCS)中。细胞在96孔皿上被制备为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，rh IL-10分别以0、0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，100或1000ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃温育48小时。温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。在反应后，在450nm的测定波长处进行测定。
结果，用人IL-10受体基因转染的细胞系(BAF/h IL-10R)被确定其细胞增殖增加的量同等于当rhIL-10为0.1到1000ng/mL时增加的量(附图2)。因此，很显然本发明的方法使得hIL-10或类hIL-10低分子量化合物的测定成为可能。
实施例3
          还原剂对G-CSF-依赖的细胞系增殖的影响
关于在实施例1中获得的导入G-CSF受体基因的细胞系(BAF/hGCSFR)，通过还原剂(2-氢硫基乙醇)的存在对其筛选产生的影响被研究且描述如下。首先，两种培养基被提供，一种为通过加入5×10-5M的2-氢硫基乙醇到DMEM培养基((-)FCS)中获得的培养基且另一种仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/hG-CSFR被悬浮为5×104细胞/孔。
对于每个小孔而言，rhG-CSF分别以0，0.025，0.1，0.4，1.6或6.4ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃温育48小时。温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。结果，BAF/hG-CSFR的增殖在rhG-CSF的存在下通过加入2-氢硫基乙醇，一种还原剂，经过细胞系的温育而被加强。此外，在rhG-CSF的浓度分别为0.1，0.4，1.6和6.4ng/mL时增殖的显著的差别被观察到。结果被显示于附图3。
实施例4
          IL-3对G-CSF-依赖的细胞系增殖的影响
关于在实施例1中获得的导入G-CSF受体基因的细胞系(BAF/hGCSFR)，通过IL-3的存在对其筛选产生的影响被研究且描述如下。首先，三种培养基被提供，包括一种通过加入一种以最终0.5ng/mL浓度的小鼠重组IL-3到DMEM培养基((-)FCS，加入终浓度为5×10-5M的2-氢硫基乙醇)中获得的培养基，另一种培养基为通过加入小鼠细胞系WEHI-3B的培养物获得的培养基，所述培养物也含有小鼠重组IL-3，终浓度为1.25％，且另一种仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。
这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/hG-CSFR被悬浮为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，rhG-CSF分别以0，0.025，0.1，0.4，1.6或6.4ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃温育48小时。
温育后，将WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。结果，BAF/hG-CSFR的增殖在rhG-CSF的存在下通过加入小鼠重组IL-3和WEHIsup并经过细胞系的温育而被加强。当经过加入小鼠重组IL-3和WEHIsup的细胞增殖进行比较时，在rhG-CSF的浓度分别为1.6和6.4ng/mL时观察到增殖的显著差别。结果被显示于附图4。
实施例5还原剂和IL-3对G-CSF-依赖的细胞系增殖的影响，其中G-CSF是类G-CSF
                     低分子量物质
关于在实施例1中获得的导入G-CSF受体基因的细胞系(BAF/hGCSFR)，通过IL-3的存在对其筛选产生的影响被研究且被描述如下。首先，两种培养基被提供，一种为通过加入终浓度为1.25％的小鼠细胞系WEHI-3B的培养物(WEHIsup)到DMEM培养基((-)FCS；加入终浓度为5×10-5M的2-氢硫基乙醇)中获得的培养基且另一种仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。
这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/hG-CSFR被悬浮为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，分别以0，10-10，10-9，10-8，10-7和10-6M加入SB247464[一种替代G-CSF的低分子量化合物，Smithkline Beecham Seiyaku K.K报道；参见“Science”，281(5374)：257-9(1998)]，然后在5％CO2中37℃温育48小时。
温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。结果，BAF/hG-CSFR的增殖在SB247464的存在下通过加入WEHIsup到培养基中而被加强。此外，在SB247464的浓度分别为10-8，10-9，10-10时观察到增殖的显著差别。结果被显示于附图5。
实施例6
          还原剂对IL-10-依赖的细胞系增殖的影响
关于在实施例2中获得的导入了人IL-10受体基因的细胞系(BAF/h IL-10R)，通过还原剂(2-氢硫基乙醇)的存在对其筛选产生的影响被研究且描述如下。首先，两种培养基被提供，一种为通过加入5×10-5M的2-氢硫基乙醇到DMEM培养基((-)FCS)中获得的培养基且另一种仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/h IL-10R被悬浮为5×104细胞/孔。
对于每个小孔而言，rh IL-10F分别以0，0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，100和1000ng/mL被加入，然后在5％CO2中37℃温育48小时。温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。结果，BAF/hIL-10R的增殖在rhIL-10的存在下通过加入2-氢硫基乙醇，一种还原剂，经过细胞系的温育而被加强。此外，在rhIL-10的浓度分别为10，100和1000ng/mL时被观察到增殖的显著差别。结果被显示于附图6。实施例7
          IL-3对IL-10-依赖的细胞系增殖的影响
关于在实施例2中获得的导入人IL-10受体基因的细胞系(BAF/hIL-10R)，通过IL-3的存在对其筛选产生的影响的研究被描述如下。首先，三种培养基被提供，包括一种通过加入一种以最终2ng/mL浓度的小鼠重组IL-3到DMEM培养基((-)FCS，加入终浓度为5×10-5M的2-氢硫基乙醇)中获得的培养基，另一种培养基为通过加入小鼠细胞系WEHI-3B使终浓度为0.625％的培养物而获得的培养基，且另一种培养基仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。
这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/hIL-10R被悬浮为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，分别加入以0、0.025、0.1、0.4、1.6或6.4ng/mL的rhIL-10，然后在5％CO2中37℃温育48小时。
温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。结果，BAF/hIL-10R的增殖在rIL-10的存在下通过加入小鼠重组IL-3和WEHIsup并经过细胞系的温育而被加强。结果被显示于附图7。
实施例8
                人EPO-依赖的细胞系的构建
从人成红白血细胞细胞系制备了一种DNA文库。利用基于人EPO受体基因制备的引物，人EPO受体基因被通过RT-PCR技术从上述cDNA文库克隆[Mullis，K.等，“Cold Spring Harb Symp.Quant.Biol.”，51，263-273(1986)]。人EPO受体基因被插入到表达载体(pIRESpuro)的多克隆位点EcoRI中。表达载体(人EPO-R/ pIRESpuro)被插入到E.coli中，然后增殖。然后提取表达载体。作为宿主细胞，BAF/B03细胞系被使用[Palacios，R.等，“Cell”，41，727-734(1985)；Shi，Y.等，“Immunol”，159，5318-5328(1997)]。
表达载体人EPO-R/pIRESpuro，(20μg)被加到K-PBS(800μL；30.8mM NaCl，120.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4.1.46mM KH2PO4，5mM MgCl2)中的宿主细胞BAF/B03(5×107细胞)中，产生的混合液4℃放置15分钟。基因的导入通过280V电压和950μF电容电穿孔来进行。导入基因后，细胞被悬浮在含有含有小鼠IL-3的DMEM培养基((+)10％FCS)中，并被温育。48小时后，细胞被悬浮在含有嘌呤霉素(2μg/mL)的DMEM培养基((+)10％FCS，250单位/mL重组人EPO(rhEPO))中，且细胞系(BAF/hEPOR)被构建。
在检测细胞增殖活性时，回收用人EPO受体基因(BAF/hEPOR)转染的细胞系，用PBS(-)洗涤后，悬浮在DMEM培养基((-)FCS)中。细胞在96孔皿上被制备为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，rhEPO分别以0，0.8，1.6，3.1，6.3，12.525或50单位/mL被加入，然后在5％CO2中37℃温育48小时。温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。在反应后，在450nm的测定波长处进行测定。
结果，用人EPO受体基因转染的细胞系(BAF/hEPOR)被发现在0.8到50单位/mL的rhEPO浓度范围中具有良好的线性(附图8)。因此，很显然本发明的方法使得hEPO或类hEPO低分子量化合物的定量测定成为可能。
实施例9
             还原剂对EPO-依赖的细胞系增殖的影响
关于在实施例8中获得的导入人EPO受体基因的细胞系(BAF/hEPOR)，通过还原剂(2-氢硫基乙醇)的存在对其筛选产生的影响被研究且描述如下。首先，两种培养基被提供，一种为通过加入5×10-5M的2-氢硫基乙醇到DMEM培养基((-)FCS)中获得的培养基且另一种仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/hEPOR被悬浮为5×104细胞/孔。
对于每个小孔而言，分别加入0，0.8，1.6，3.1，6.3，12.5，25或50单位/mL的rhEPO，然后在5％CO2中37℃温育48小时。温育后，WST-l/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。反应后，在450nm的测定波长处进行测定。结果，BAF/hEPOR的增殖在rhEPO的存在下通过加入2-氢硫基乙醇，一种还原剂，经过细胞系的温育而被加强。结果被显示于附图9。
实施例10
              IL-3对EPO-依赖的细胞系增殖的影响
关于在实施例8中获得的导入人EPO受体基因的细胞系(BAF/hEPOR)，通过IL-3的存在对其筛选产生的影响的研究被描述如下。首先，三种培养基被提供，包括一种通过加入最终0.5ng/mL浓度的小鼠重组IL-3到DMEM培养基((-)FCS，加入终浓度为5×10-5M的2-氢硫基乙醇)中获得的培养基，另一种培养基为通过加入小鼠细胞系WEHI-3B的培养物(WEHIsup)而获得的培养基，所述培养物含有终浓度为1.25％的小鼠重组IL-3，且另一种培养基仅含有DMEM培养基((-)FCS)而没有加入其它添加剂。
这些培养基分别被注入到96孔皿的各小孔中，且已用PBS(-)洗涤的BAF/hEPOR被悬浮为5×104细胞/孔。对于每个小孔而言，分别加入0，0.8，1.6，3.1，6.3，12.5，25或50单位/mL的rhEPO，然后在5％CO2中37℃温育48小时。
温育后，WST-1/1-甲氧基PMS溶液(Dojindo Laboratories产品)被加入到各小孔中(最终浓度：5mM)，且然后在CO2细菌培养箱中进行染色反应。反应后，在450nm的测定波长处进行测定。结果，BAF/hEPOR的增殖在rEPO的存在下通过加入小鼠重组IL-3和WEHIsup并经过细胞系的温育而被加强。当加入小鼠重组IL-3和WEHIsup的增殖被进行比较时，在rhEPO的浓度分别为3.1，6.3和12.5单位/mL时观察到显著的差异。结果被显示于附图10。
其它的配体受体基因也可被形成为将被插入的基因，通过RT-PCR技术克隆它们并插入这些克隆基因到如实施例1，2或8的表达载体中。在进行实施例1，2或8的方法后，形成的基因也可通过电穿孔或类似的操作被导入到靶细胞中，且能够抵抗相应的配体或类配体低分子物质进行增殖的细胞系可被构建。此外，依据实施例3到7或实施例9或10的描述，配体或类配体低分子化合物可分别利用细胞系被检测。

Claims (19)

1.一种测定供试化合物中的配体或类配体低分子化合物的方法，其包括从其它的细胞系中分离用配体受体基因和抗生素抗性基因转染的配体依赖性细胞系，在所述供试化合物存在的条件下培养所述的配体依赖的细胞系，然后检测所述配体依赖的细胞系的细胞增殖活性。
2.根据权利要求1的方法，其中用所述配体受体基因和所述抗生素抗性基因转染的所述配体依赖性细胞系的所述培养是在所述供试化合物和一种还原剂存在的条件下进行的。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的还原剂是2-氢硫基乙醇或α-硫代甘油。
4.根据权利要求1的方法，其中用所述配体受体基因和所述抗生素抗性基因转染的所述配体依赖性细胞系的所述培养是在所述供试化合物，一种还原剂和白介素3存在的条件下进行的。
5.根据任一权利要求1-4之一的方法，其中所述配体受体基因是人粒性白细胞集落刺激因子受体基因，且所述供试化合物中的所述配体或所述类配体低分子量化合物为人粒性白细胞集落刺激因子或能够替代人粒性白细胞集落刺激因子的低分子量化合物。
6.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述配体受体基因是人白介素10受体基因，且所述供试化合物中的所述配体或所述类配体低分子量化合物为人白介素10或能够替代人白介素10的低分子量化合物。
7.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述配体受体基因是人促红细胞生成素受体基因，且所述供试化合物中的所述配体或所述类配体低分子量化合物为人促红细胞生成素或能够替代人促红细胞生成素的低分子量化合物。
8.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述配体受体基因是人血小板生成素受体基因，且所述供试化合物中的所述配体或所述类配体低分子量化合物为人血小板生成素或能够替代人血小板生成素的低分子量化合物。
9.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述配体受体基因是人胰岛素受体基因，且所述供试化合物中的所述配体或所述类配体低分子量化合物为人胰岛素或能够替代人胰岛素的低分子量化合物。
10.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述配体受体基因是人神经生长因子受体基因，且所述供试化合物中的所述配体或所述类配体低分子量化合物为人神经生长因子或能够替代人神经生长因子的低分子量化合物。
11.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述抗生素抗性基因是对具有蛋白质合成抑制作用的抗生素有抗性的基因。
12.根据权利要求1或8的方法，其中所述的抗生素抗性基因是嘌呤霉素抗性基因，潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。
13.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述配体依赖细胞系的细胞增殖活性是通过在所述配体依赖细胞系上产生比色物质和电子载体来被测定的。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的比色物质是四氮唑盐，以及所述的电子载体为吩嗪甲基硫酸盐电子载体。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的比色物质是WST-1，以及所述的电子载体为1-甲氧基PMS。
16.一种用于配体或类配体低分子量化合物的检测试剂，其含有下列的组分(a)-(d)：
(a)一种用配体受体基因和抗生素抗性基因转染的配体依赖细胞系；
(b)一种用于所述配体依赖的细胞系的培养基；
(c)一种比色物质；以及
(d)一种电子载体。
17.如权利要求16所述的检测试剂，其中所述的组分(b)含有一种还原剂和/或白介素3。
18.一种用于配体或类配体低分子量化合物的检测试剂盒，其含有下列组分(a)-(d)的一种或多种：
(a)一种用配体受体基因和抗生素抗性基因转染的配体依赖细胞系；
(b)一种用于所述配体依赖的细胞系的培养基；
(c)一种比色物质；以及
(d)一种电子载体。
19.如权利要求18所述的检测试剂盒，其中所述的组分(b)含有一种还原剂和/或白介素3。
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