CN1367247A - 一种重金属解毒药剂、其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种缓解重金属中毒的生物药剂,具体地说,本发明涉及一种以人金属硫蛋白L(Metallothionein－L,简称为“MTL”)为主要成分的重金属解毒药剂。本发明的MTL是金属硫蛋白家族成员之一,它含有SEQ ID NO 2所述氨基酸序列的多肽,其核苷酸编码序列与SEQ ID NO 1所述核苷酸序列具有至少70%的同源性。它能缓解重金属、半金属中毒,在发育过程中调节锌和铜的体内平衡,参与金属代谢和解毒,在消除自由基方面也有作用。此外它还与肝脏疾病有一定关系。因此,本发明的药剂作为肿瘤治疗辅助药剂,可降低肿瘤药物中重金属成分对细胞的毒性,增强细胞的抗氧化作用。本发明还涉及该药剂的生产方法和该药各种剂型的应用。

Description

一种重金属解毒药剂、其制法和用途

技术领域

本发明涉及一种缓解重金属中毒的生物药剂。具体地说，本发明涉及以人金属硫蛋白L(Metallothionein-L，简称为“MTL”)为主要成分的重金属解毒药剂。本发明还涉及该药剂的生产方法和应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，其特征在于细胞的恶性增殖。目前对大多数肿瘤的治疗方案主要是手术、放疗、化疗、免疫疗法和中草药疗法等，各种疗法的机理可归结为四大类：(1)影响核酸合成；(2)直接破坏DNA结构并阻止其功能；(3)嵌入DNA中干扰其模板功能；(4)调节体内激素平衡。重金属、半金属药物是目前常用药物之一，其主要作用在于直接破坏DNA结构并阻抑其功能，As₂O₃即为此类药物。据报道，As₂O₃对急性早幼粒白细胞血症(APL)、淋巴瘤和肝癌具有良好的疗效(ZhangTD，Li YS，Hu YS，et al.Summary of Arsenic trioxide in treating 73cases of acute promyelocytic leukemia.Meeting Discussion oftreating hematological disorders.1982；Li YS，Zhang TD，Li CHW，et al.Traditional Chinese and Western Medicine in the treatment of27 patients with malignant lymphoma.Chin J Oncol 1988；10：61)。例如，将其施用于急性早幼粒白细胞血症(APL)患者，初发者的诱导缓解率为72.3％，复发者的诱导缓解率为85.1％，疗效显著高于以往应用化疗及维甲酸药物治疗的疗效(通常约为30％)，然而，As₂O₃对正常细胞，尤其是肝细胞的损伤很大，受治疗的11位初发病人中有2位由于肝功能损伤异常而死亡。

本发明的药剂主要成分是人MTL，它是金属硫蛋白(MT)家族成员之一。MT能解毒金属，在发育过程中调节锌和铜的体内平衡，参与金属代谢和解毒，MT在消除自由基方面也有作用(Temopleton，D.M.et al 1991.Riordan JF and Vallee BL ed.Methods of Enzymology.Vol.205，11-24)，在门克氏综合症(Menkes disease)、鼠花斑状表型、肝豆状核变性(Wilson’s disease)中，MT可能保护机体免受铜毒害。MT与某些抗肿瘤化疗药物，特别是顺二胺二氯铂(cDDP)相互作用，可减轻其细胞毒性(Saijo，N.et al Mrtallothionein 111，Basel：Birkhauser Verlag，1993.279-292)。此外它还与肝脏疾病有一定关系(周杰昊等，1995.生理科学进展.26：29-34)。

因此，本发明的药剂作为肿瘤治疗辅助药剂，可增强细胞的抗氧化作用，降低肿瘤药物对细胞的毒性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种降低缓解重金属、半金属药物中毒的药剂，其主要成分是人MTL蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述药物的方法。

本发明还提供了该药物的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种重金属解毒药剂，它含有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

在本发明中，术语“人MTL蛋白多肽”指具有人MTL蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人MTL相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人MTL蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人MTL DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人MTL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人MTL多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人MTL多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人MTL多肽序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约40个连续氨基酸，更佳地至少约50个连续氨基酸，最佳地至少约60个连续氨基酸。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的另一个方面，提供了一种生产上述重金属、半金属解毒药剂的一种方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人MTL蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人MTL蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人MTL蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人MTL蛋白活性的多肽。

(e)把步骤(d)中所述多肽与适当的物质连接，制成药剂。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对人MTL DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MTL基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MTL基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MTL蛋白的分子，也包括那些并不影响人MTL蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人MTL基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人MTL基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MTL或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人MTL功能的抗体以及不影响人MTL功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人MTL基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MTL基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人MTL核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。在本发明的人MTL的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人肝λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A：5’-TCGCTTGAGATCTCCAGCCTTAC-3’为正向引物，寡核苷酸B：5’-ACATCTGGGAGAAGAGCTGTTGC-3’为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断约为250bp的目的片段。最后通过测序验证为SEQ ID NO：1所述核苷酸序列。

以上述核苷酸序列为模板，将编码人MTL的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人MTL cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5-CAAGGTCGACATGGACCCCAACTGCTCCT-3’，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人MTL编码序列的19个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-TAGGAAGCTTTCAGGCACAGCAGCTGCAG-3’，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人MTL的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(QiagenInc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒测序验证人MTL的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人MTL。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人MTL。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约6kDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。

本发明蛋白在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人MTL蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。通常，其中pH为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

由于本发明的药物源自人的天然氨基酸序列，因此，与源于化学合成的同种药物相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

本发明的药物含有金属硫蛋白，是减缓重金属对细胞毒性的有效工具。作为重金属、半金属肿瘤药物的辅助成分，可以保护正常机体，减轻重金属、半金属成分对正常细胞DNA的损伤；制成保健药品，可以增强正常人机体对环境中重金属物质损伤的抵抗；还可制成化妆品美白成分添加剂，目前市售的美白产品中不可避免的会含有一些重金属成分，加入本发明所含的重金属解毒药剂，可以使此类化妆品、护肤品更加安全有效。

此外，还可将本发明用于生产MTL抗体，然后把该抗体特异性的引入肿瘤细胞，降低其对重金属、半金属药物的耐受性，从而起到增强药效的作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施方式

实施例1

用偶氮芳香聚合物包裹MTL蛋白制成口服药剂

将MTL蛋白用蔗糖粉稀装入胶囊或制成小丸，用偶氮芳香聚合物包裹(包衣)。该聚合物将芳香族化合物按一定比例混合，如将苯乙烯与乙基甲丙烯按1∶6共聚，随后与偶氮化合物，如1-2％的二乙烯偶氮苯交联形成聚合物。然后，包衣的过程可将聚合物溶于氯代烷烃，如二氯甲烷中完成。

由于偶氮芳香聚合物能保护蛋白免受胃与小肠中的酸解与酶解，故包衣复合物不会在小肠中立即全部分解；当包衣到达大肠部位时，包衣层受内生菌群的作用而分解，使MTL蛋白进入结肠发挥局部作或吸收。

实施例2

将MTL蛋白制成微球制剂

取MTL蛋白500ug-50mg与明胶60-100mg，水1ml，混合加热至60℃为内水相，油相为聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)或聚乳酸乙醇酸共聚物，溶于二氯甲烷，然后将油相在搅拌或超声处理逐渐倒入水相中制成微乳剂，此乳剂冷却至15℃，在5000rpm下用喷嘴加入到0.5ml的聚乙烯醇水溶液中搅拌1-4分钟使之形成乳剂。最后在室温下搅拌2小时或旋转蒸发除去二氯甲烷，得到硬化圆形微球(或胶囊)。

将此微球制剂用肌内注射的方法施药，根据油相共聚物成分的不同，可以在不同时间之内在体内持续释放药物成分。

实施例3

制成试剂盒

首先将MTL蛋白透析去盐，-70℃冷冻一小时，然后冻干机抽真空过夜，制成冻干粉。随后，配以磷酸缓冲液、注射用水、滴注用葡萄糖盐水及0.1％的三氧化二砷溶液，制成试剂盒。

该试剂盒可用于治疗肿瘤复发患者，如急性早幼粒细胞性白血病复发患者。治疗时，取三氧化二砷溶液用葡萄糖盐水稀释成0.002％，每天静脉滴注2-3小时，检测其临床表与细胞形态学变化。如若出现中毒症状，立即停止静脉滴注，并将MTL蛋白冻干粉溶解于磷酸缓冲液中、用注射用水稀释，向病人注射。对于肝功能障碍的病人应每天注射，其用量视病人肝细胞损伤情况而定，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

实施例4

制备抗体

将MTL重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人MTL基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

将MTL重组蛋白抗体引进肿瘤细胞该抗体将与细胞中MTL蛋白结合，降低肿瘤细胞对重金属、半金属药物的耐受性，从而达到增强药效的功能。

本发明涉及序列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：247bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1TCGCTTGAGA TCTCCAGCCT TACCGCGGCT CGAAATGGAC CCCAACTGCT CCTGCACCAC 60TGGTGTCTCC TGCGCCTGCA CCGGCTCCTG CAAGTGCAAA GAGTGCAAAT GCACCTCCTG 120CAAGAAGAGC TGCTGCTCCT GCTGCCCCGT GGGCTGTGCC AAGTGTGCCC ACGGCTGTGT 180CTGCAAAGGG ACGTTGGAGA ACTGCAGCTG CTGTGCCTGA TGTGGGAACA GCTCTTCTCC 240CAGATGT                                                           247

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：61个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2：Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr Thr Gly Val Ser Cys Ala Cys 15Thr Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys 30Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala 45His Gly Cys Val Cys Lys Gly Thr Leu Glu Asn Cys Ser Cys Cys 60Ala                                                         61

Claims (4)

1.一种药剂，其特征在于，编码其主要多肽成分的核苷酸序列与SEQID NO.1中从35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性，它可以降低、缓解重金属药物的毒副作用。

2.如权利要求1所述药剂，其特征在于，它含有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

3.如权利要求1所述药剂主要多肽成分的一种生产方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人MTL蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人MTL蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人MTL蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人MTL蛋白活性的多肽。

4.一种如权利要求1所述药剂的蛋白成分的抗体，其特征在于，它能与SEQ ID NO.2中氨基酸序列特异性互补结合。