CN1366065A - 快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法 - Google Patents

快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法 Download PDF

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快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法。解决现有酶抑制法检测灵敏度低、准确度差的问题。本发明方法包括植物酯酶原酶液的制备、pH8.0缓冲液及酶溶液的制备、酶的固定、基质液和显色液制备、检测方法、结果判定(目测)等过程。本发明所使用的农药检测器是用聚苯乙烯微孔塑料条制成,塑料条上设有3个孔,中间为对照孔C,两边为样品孔S1和S2,每孔加酶溶液0.015～0.03ml,使内壁表面均被固定有植物酯酶,室温下或4℃冰箱自然凉干后,用无离子水冲洗,凉干制成。本发明开创性地使用植物酯酶代替常规方法使用的动物chE。不仅取材方便、制备简单容易、廉价,而且反应灵敏,有效地解决了杂质干扰问题。

Description

快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法
技术领域：本发明涉及一种痕量有机磷(OP)和氨基甲酸酯(CM)农药的检测方法。
背景技术：目前利用胆碱酯酶(chE)抑制技术检测OP和CM农药已有了50余年的历史。使用的方法有薄层层析法、分光光度法和纸片法等。使用的酶均为动物来源的chE。如动物(牛、鼠)肝脏chE、马血清chE、家蝇、果蝇、蜜蜂的脑chE、电鳗、电鳐等鱼类以及人血清chE等等。目前市场上使用的主要是动物chE浸渍的纸片法和分光光度法。这些方法均存在两个问题：其一是由于样品中杂质的干扰，假阳性率较高，准确度差；其二是检测灵敏度低，有的农药竟达到几十个ppm(mg/kg)达不到国家最高残留限量标准的要求。
发明内容：本发明目的是解决现有农药检测方法检测灵敏度低、准确度差的问题，提供可供现场使用的环境样品和农产品中OP和CM农药残留的快速检测方法。
本发明快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法是按以下步骤完成：
第一、植物酯酶原酶液的制备：植物种子、根、茎、叶、花、果实均可作植物酶源，特别是面粉，取面粉，按重量体积比1∶5比例加入蒸馏水，经震荡、离心，上清液过滤，滤液作为原酶液保存备用；
第二、pH8.0缓冲液的制备：取46.8ml 0.1N NaOH溶液，加入50ml 0.1M KH2PO4溶液中，再加入适量牛血清白蛋白和戊二醛，加水至100ml；
第三、酶溶液：取前述原酶液加入缓冲液中，使原酶液浓度为10～20％，充分混合均匀；
第四、酶的固定：取聚苯乙烯微孔塑料条，塑料条上设有3个孔，中间为对照孔C，两边为样品孔S1和S2，每孔加酶溶液0.015～0.03ml，内壁表面均被固定有植物酯酶，室温下或4℃冰箱自然凉干后，用无离子水冲洗，凉干，室温干燥避光保存；
第五、基质液和显色液制备：
基质液：取醋酸-1-萘酯1.25mg置于试剂瓶中，加入基质溶解液1ml，振摇至基质完全溶解备用；
显色液：取固兰B盐1.56mg置于试剂瓶中，加水1ml，振摇至固兰B盐全部溶解，备用；
第六、检测：将待测样品液加入到样品孔S1和S2中，每孔各加2滴，使样品液与酶充分反应后甩掉样品液，再向每孔各加入2滴无离子水洗1次甩掉，然后向样品孔S1、S2和对照孔C各加1滴基质液和显色液，反应显色；
第七、检测结果：S1和S2孔颜色与C孔相同或极相近似即均为紫红色，判为阴性，即样品中不含有有机磷和/或氨基甲酸酯农药或含量低于本法检测限；S1和S2孔或其中某一孔的颜色与C孔有明显差别，即S1和/或S2孔无色或其中某一孔的颜色比C孔明显的浅，则判为阳性，被检样品含有有机磷和/或氨基甲酸酯农药。
本发明优点及其效果：1、本发明开创性地使用植物酯酶代替常规方法使用的动物chE。植物酯酶(P-E)不仅取材方便、制备简单容易、廉价，而且反应灵敏；2、为解决杂质干扰问题，本发明将酶固定在聚苯乙烯塑料微孔反应板上，制成农药快速检测器，该固化酶具有极好的稳定性，对pH值或存在于样品中的有机溶剂或碳水化合物变得几乎不敏感；3、由于OP和CM农药对酶的抑制几乎是不可逆的，而某些杂质如重金属、氟化物离子等对酶的抑制是可逆的，当样品液与酶作用后洗去样品液，受到可逆性抑制的酶活性很快便可恢复，而农药抑制的酶活性(不可逆抑制)短时间内很难恢复，这样便可以有效地排除了杂质干扰问题，从而提高了检测方法的准确度和灵敏度，使得现有的酶抑制法有了新的突破性的进展；4、本发明与同类方法比较，检测准确度和灵敏度都有明显改善，达到甚至超过了国家规定的最高残留限量标准的要求，经过检验的果菜可以保证消费者食用的安全，而现有同类方法难以做到；5、由于使用了植物酯酶代替了同类方法使用的动物胆碱酯酶，不仅酶的来源方便，制备简单，而且费用至少较同类方法低5-10倍，更便于普及应用；6、本发明具有操作简便、快速、廉价、灵敏度高、适用性广和适于现场使用等特点，不需要专用实验室，也不需要贵重的仪器设备和专业技术人员，在现场使用30分钟可测定3-5个样品，费用低，在常用的30余种OP和CM农药检测灵敏度在0.5-100ppb(μg/kg)范围，该方法可以广泛应用于水、土壤等环境样品和蔬菜、水果、粮食等农产品中农药残留检测。
具体实施方式：
1、农药快速检测器的制备：使用的酶为植物酯酶(P-E)，来源于市售面粉，按1∶5(W/V)比例加入蒸馏水在震荡器上震荡30min，以6000r/min离心30min，上清液经滤纸过滤，滤液作为原酶液保存在4℃冰箱，用前加pH8缓冲液稀释一定倍数，作为酶工作液。本发明选用聚苯乙烯塑料微孔板为载体，牛血清白蛋白(BSA)为蛋白模板，戊二醛(GA)作为P-E与BSA模板的中间介质。GA的两个醛基分别与P-E分子上的氨基和BSA分子上的氨基共价结合，便可以把酶固定在载体上。
固定步骤：(1)pH8.0缓冲液：46.8ml 0.1N NaOH溶液，加入50ml 0.1MKH2PO4溶液中，加入适量BSA和GA，加水至100ml。(2)酶溶液：取前述原酶液1ml加入缓冲液9ml，充分混合均匀。(3)酶的固定：取聚苯乙烯微孔塑料条若干，每孔加酶溶液0.02ml，室温下(或4℃冰箱)自然凉干后用无离子水冲洗3次，凉干，室温干燥避光保存。固化酶稳定性很好，保存期至少180天以上。每个塑料条上设有3个孔，中间为对照孔C，两边为样品孔S1和S2，孔内壁表面均被固定有P-E，制成农药快速检测器。
2、基质液和显色液配制：
基质液：取醋酸-1-萘酯1.25mg置于试剂瓶中，加入基质溶解液(丙酮水溶液)1ml，盖紧瓶盖用力振摇或用刻度滴管反复抽取至基质完全溶解备用。
显色液：取固兰B盐1.56mg置于试剂瓶中，加水1ml，盖紧盖用力振摇或用滴管反复抽吸至固兰B盐全部溶解，备用。
3、样品处理：
水样：河流、池塘、湖泊、工业废水等水样取2ml通过滤纸过滤，滤液加入少量活化剂后编号作为待测水样。
叶菜类：从不同部位取5片叶子，每片叶上取下约4cm2叶片，放在一起稍加剪碎，放在小烧杯中、加入提取液2ml，用玻璃棒稍加搅拌、浸渍2min、浸渍液的上清液即为待测样品液。果菜及水果类：如茄子、黄瓜、西红柿、苹果、梨等样品，取2ml提取液反复冲洗果菜表面、冲洗液即为待测样品液。
根菜类：洗去泥土、去掉须根，从不同部位取约2g样品、置于小烧杯中，加提取液2ml、稍加搅拌、浸渍2min，浸渍的上清液即为待测样品液。
4、检测：
将待测样品液加入到农药快速检测器的样品孔S1和S2，每孔各加2滴，静止10min，使样品液与酶充分反应后甩掉样品液，再向每孔各加入2滴无离子水洗1次甩掉。然后向S1、C(对照)和S2各加1滴基质液和显色液，反应3-5min，观察结果(目测)：S1和S2孔颜色与C孔相同或极相近似(均为紫红色)，判为阴性，即样品中不含有OP和/或CM农药或含量低于本法检测限。如果S1和S2孔或其中某一孔的颜色与C孔有明显差别，即S1和/或S2孔无色或其中某一孔的颜色比C孔明显的浅，则判为阳性，被检样品含有OP和/或CM农药。对检出的阳性样品需重复检1次。实例1、水中农药残留检测
取自天津北郊鱼塘水2份，农药厂排水口水样1份，化工厂排水口水样1份，分别编号为1、2、3、4号。用前述检测方法进行检测。结果1、2号样品为阴性，3、4号样品为阳性。用多残留色谱法检测，1、2号样品未检出农药残留；3号样品检出滴滴畏4.28ppm和甲拌磷0.65ppm；4号样品检出滴滴畏1.40ppm和甲拌磷0.28ppm。实例2、果蔬中农药残留检测
取自天津三个批发市场的黄瓜、番茄、青椒、苹果、梨等样品共18份，编号为1～18号；取温室试验黄瓜样品2份，编号为19、20号。
用前述方法检测结果是1～18号样品均为阴性，而19和20号样品均为阳性。用多残留气相色谱法测定结果是1～18号样品未检出农药残留，而19号样品检出滴滴畏0.6ppm，20号样品检出滴滴畏0.37ppm。
上述实例说明，本发明的有机磷和氨基甲酸酯农药现场快速检测方法与常规的实验室气相色谱检测方法有很好的相关性，而且方法的准确度和灵敏度也能达到食品卫生与安全的要求，可以有理由认为，本发明的检测方法是在现场进行快速筛选的较为理想的方法，因此，将会有很好的应用前景。

Claims (1)

1.一种用植物酯酶抑制技术快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法，其特征是该方法按以下步骤完成：
第一、植物酯酶原酶液的制备：植物种子、根、茎、叶、花、果实均可作植物酶源，特别是面粉，取面粉，按重量体积比1∶5比例加入蒸镏水，经振荡、离心，上清液过滤，滤液作为原酶液保存备用；
第二、pH8.0缓冲液的制备：取46.8ml 0.1N NaOH溶液，加入50ml 0.1MKH2PO4溶液中，再加入适量牛血清白蛋白和戊二醛，加水至100ml；
第三、酶溶液：取前述原酶液加入缓冲液中，使原酶液浓度为10～20％，充分混合均匀；
第四、酶的固定：取聚苯乙烯微孔塑料条，塑料条上设有3个孔，中间为对照孔C，两边为样品孔S1和S2，每孔加酶溶液0.015～0.03ml，内壁表面均被固定有植物酯酶，室温下或4℃冰箱自然凉干后，用无离子水冲洗，凉干，室温干燥避光保存；
第五、基质液和显色液制备：
基质液：取醋酸-1-萘酯1.25mg置于试剂瓶中，加入基质溶解液1ml，振摇至基质完全溶解备用；
显色液：取固兰B盐1.56mg置于试剂瓶中，加水1ml，振摇至固兰B盐全部溶解，备用；
第六、检测：将待测样品液加入到样品孔S1和S2中，每孔各加2滴，使样品液与酶充分反应后甩掉样品液，再向每孔各加入2滴无离子水洗1次甩掉，然后向样品孔S1、S2和对照孔C各加1滴基质液和显色液，反应显色；
第七、检测结果：S1和S2孔颜色与C孔相同或极相近似即均为紫红色，判为阴性，即样品中不含有有机磷和/或氨基甲酸酯农药或含量低于本法检测限；S1和S2孔或其中某一孔的颜色与C孔有明显差别，即S1和/或S2孔无色或其中某一孔的颜色比C孔明显的浅，则判为阳性，被检样品含有有机磷和/或氨基甲酸酯农药。
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CN107831257A (zh) * 2017-10-27 2018-03-23 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 一种有机磷残留量检测方法

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