CN1346680A - 一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因和含有该基因的质粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因,它依次由编码信号肽,B链,C链,和A链的核苷酸序列组成。本发明还提供了含有本发明的基因并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。

Description

一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因 和含有该基因的质粒

本发明涉及将胰岛素前体基因的真核表达质粒直接导入骨骼肌细胞对糖尿病进行基因治疗的技术。

基因治疗是近十年来随着现代医学与分子生物学相结合而诞生的，它是指通过基因的转移，将目的基因导入到患者体内，使之弥补原有基因的突变或表达缺陷，达到治疗的目的。目的基因是指弥补功能缺损的外源性正常基因。基因转移途径可分两类：一类是目的基因直接注射，即将带有目的基因的病毒、包裹有目的基因的脂质体或裸露的目的基因直接注射到试验个体内；另一类是将细胞系或试验对象的细胞取出，体外培养，并用病毒、脂质体等方式导入目的基因，而后将这些遗传修饰的细胞重新输回试验个体体内。目的基因直接转移途径操作简便，容易推广，但是这类方法目前尚未成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。细胞转移方法比较经典，而且效果较易控制，但其存在步骤多，技术复杂难度大，不容易实施的问题。目的基因的导入可以用病毒或质粒作载体。病毒载体虽然有转染效率高的优点，但存在安全性问题。逆转录病毒DNA可能随机插入宿主细胞基因组内，导致细胞的恶变；腺病毒本身的表达产物可激发机体的免疫反应。以质粒为载体单独或与脂质体等包裹一起直接注射转移，经许多实验表明是可行的，目的基因得到了表达，且质粒的构建，大量制备也较容易，其携带的基因片段也相对较大。脂质体可提高质粒DNA向细胞内的转移，电穿孔法同样可以提高质粒DNA的转化率。目的基因在靶细胞中表达相对来说并不十分困难，而使基因表达接近生理水平并非易事。基因表达调控的研究工作包括两方面：一是定点插入目的基因；二是目的基因上游有真核生物的启动子序列。目的基因注入体内的部位很多，可根据治疗目的而定，现报道的部位有骨骼肌、心肌、肝、脾、颅内、腹膜、皮下组织、静脉、动脉壁等。

糖尿病分为两个类型，I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病，和II型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病。目前对I型糖尿病治疗最常用的方法是外源性胰岛素注射治疗，许多病情较重的II型病人也需要胰岛素的治疗，但这种疗法由于注射后吸收较慢，缺乏食物反溃调节作用，不符合生理反应要求，且需重复注射。胰腺或胰岛移植技术，由于其供体来源不足且需长期免疫抑制辅助治疗，使其应用受到限制。随着近年来基因重组技术及转基因技术的迅速发展，为糖尿病的基因治疗提供了前提。糖尿病可能的基因治疗的方法包括细胞转移法及胰岛素基因直接导入法。细胞转移法根据使用的靶细胞不同可分为β细胞转移和非β细胞转移。β细胞早已被用来治疗糖尿病，但是用胰腺移植治疗糖尿病有许多困难。非β细胞系的靶细胞主要是内分泌器官的细胞系，研究得不太充分。胰岛素基因直接导入法即是把含有胰岛素基因的质粒、脂质体包被的质粒或用逆转录病毒和腺病毒介导的胰岛素基因直接转移到体内组织使其表达。近年已有一些体内直接注射基因的方法进行基因治疗糖尿病的研究。将含人胰岛素基因质粒用脂质体包被，直接通过成年大鼠的门静脉输入，7天内在鼠肝脏内可见人胰岛素基因的DNA和RNA，说明外源基因可以直接导入体内进行表达(Kaneda Y et al.J Biol Chem，1989，264：12126-12129)。用重组逆转录病毒作载体，将大鼠胰岛素cDNA注入大鼠门静脉，胰岛素基因持续表达可达6个月。二周后再给大鼠腹腔注射大剂量streptozotocin(STZ)致糖尿病，转染了鼠胰岛素基因的动物有80％可存活至21天(Kolodka TM et al.Proc Natl Acad Sci USA.1995，92：3239-3297)。将含有肌肉特异性的人肌酐激酶启动子和人胰岛素原cDNA的质粒直接注射到肌肉组织中，4天后所有动物的血液中均可检测到人胰岛素原，2周时达到最高水平，并可持续7个月(Bartlett RJ et al.TransplantationProceedings 1998，30：451-452)。

糖尿病病人的急慢性并发症的发生、发展与高血糖状态有密切联系。1993年美国首次提出糖尿病的胰岛素强化治疗(DCCT)，即持续维持接近正常的血糖水平可减少并发症发生(The Diabetes Control and ComplicationsTrial Research Group.N Engl J Med 1993，329：977-986)。胰岛素强化治疗的基本原则就是维持糖尿病人一定的基础胰岛素水平，然而因为目前胰岛素强化治疗中低血糖发生率高以及反复胰岛素注射，使病人产生极大的痛苦。利用电穿孔技术可以提高外源基因在肌肉中的转化率和表达量(Mir LM et al.Proc Natl Acad Sci USA 1999，96：4262-4267)。肌肉注射人胰岛素基因通过电穿孔对糖尿病进行基因治疗的研究，迄今未见报道。本工作把含有人胰岛素前体基因的质粒直接注射到糖尿病小鼠骨骼肌中，通过基因表达，观察了治疗，得到了较好的结果，为基因治疗人的糖尿病提供一种可能的简便有效的手段。

本发明的目的是通过检测对比4种不同胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血液中血糖和胰岛素浓度的影响及随时间的变化情况，以及对糖尿病小鼠死亡率的影响，找到最适合的治疗糖尿病的胰岛素前体基因。通过对人胰岛素前体基因在糖尿病小鼠骨骼肌中转录、表达及疗效等几个方面的研究，我们已经初步建立了直接肌肉注射重组人胰岛素前体基因质粒对糖尿病进行基因治疗的技术方法。

本发明的另一个目的是提供一种含有本发明的基因，并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。

本发明提供了一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因，它依次由编码信号肽，B链，C链，和A连的核苷酸序列组成。

在本发明的基因中，优选在编码C链和A链的核苷酸序列之间插入一段编码furin酶切位点的序列。

在本发明的基因中，编码C链的核苷酸序列中最好含有天然状态下存在于该基因中的内含子。

本发明还提供了一种含有本发明的基因，并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。

本发明所说的质粒可以是任何一种能够在人肌肉组织中表达本发明的基因的质粒。但最好是真核表达质粒pcDNA3.1(-)。

附图简要说明图1  真核表达质粒pcDNA3.1(-)图谱(参见Invitrogen公司产品说明书)CMV-巨细胞病毒；PolyA-多聚腺苷酸；EcoRI，BamHI，HindIII-限制性内切酶；T7-启动子代号；BGHpA-牛生长激素多腺苷酸；Ampicilin-氨苄青霉素基因；ColEl-质粒复制起始点；SV40 ori-猴肾病毒复制起始点；SV40pA-猴肾病毒多聚腺苷酸；fl ori-丝状噬菌体复制起始点；kb-千碱基对；Neomycin-新霉素；ori-复制起始点；pCMV-巨细胞病毒启动子；内切酶NheI PmeI之间的片段为pcDNA(-)的多克隆位点，目的DNA连接在该多克隆片段的内切酶EcoRI/HindII之间和EcoRI/BamHI之间。图2  4种胰岛素前体基因的结构示意图P-分泌肽序列；B-胰岛素B链；C-C肽；A-胰岛素A链；IVS-内含子序列。INcDNAm和IN的C肽与A链之间有furin蛋白酶的酶切位点。 4种人胰岛素前体基因分别被克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-)中并受启动子CMV的控制。图3  带有胰岛素前体基因的真核表达质粒对较重病情的糖尿病小鼠血糖的影响选择血糖25-30mmol/L的糖尿病小鼠，分别注射100ug的带有胰岛素前体基因的真核表达质粒pCMV-IN、pCMV-INcDNA、pCMV-INcDNAm和pCMV-proIN并立即进行电刺激。pcDNA3.1(-)为对照。分别于注射DNA后的第7、14、21、28天，从小鼠的尾巴取1滴血，用Glucotrend血糖测定仪测定血糖浓度。n＝5；^*：p＜0.05图4  带有胰岛素前体基因的真核表达质粒对较轻病情的糖尿病小鼠血糖的影响选择血糖大约20mmol/L的糖尿病小鼠，分别注射100ug带有胰岛素前体基因的真核表达质粒pCMV-IN和pCMV-INcDNAm并立即进行电刺激。pcDNA3.1(-)为对照。分别于注射DNA后的第7、14、21、28天，从小鼠的尾巴取1滴血，用Glucotrend血糖测定仪测定血糖浓度。n≥6；^*：p＜0.05图5  带有胰岛素前体基因的真核表达质粒pCMV-IN对较轻病情的糖尿病小鼠血清胰岛素浓度的影响从小鼠眼球取血约0.5mL，8000g离心10分钟。用人胰岛素多抗抗体和放免方法测定小鼠血清胰岛素浓度。非转基因的正常小鼠血清胰岛素浓度为17.95±3.8μu/ml；n≥5；^*：p＜0.05

实施例1人胰岛素前体基因真核表达质粒的构建

本实验使用的真核表达质粒pcDNA3.1(-)(图1)为Invitrogen公司市售商品。4个胰岛素前体基因结构如图2所示，它们都分别连接在质粒pcDNA3.1(1)中的CMV启动子的下游，并受CMV启动子的控制。2糖尿病小鼠模型的制备

采用经典方法，选体重18-20克，6-8周的雄性C57BL/6J小鼠，每天注射40mg/kg剂量的streptozotocin(STZ)，连续注射5天，观察血糖浓度变化。3-4周后挑选出血糖浓度15-30mmol/L的小鼠，即可用于下一步的实验。3注射胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血糖浓度的影响

选择血糖25-30mmol/L的糖尿病小鼠，每只分别注射带有胰岛素前体基因的质粒pCMV-IN、pCMV-INcDNA、pCMV-INcDNAm和pCMV-proIN各100ug，注射部位为后肢腓肠肌，每侧各50ug，注射后，立刻用100v、40ms、10个脉冲、1Hz的电流进行电刺激。糖尿病小鼠血糖浓度的变化见图3，其中pCMV-IN、pCMV-INcDNA、pCMV-INcDNAm中的3种胰岛素前体基因可使血糖下降30％左右，有效期可以至少持续1个月，pCMV-proIN中的胰岛素前体基因没有明显的降血糖的作用。从以上的研究我们发现，在使用胰岛素前体基因进行糖尿病基因治疗时，前导肽序列是必须的。

如果选择病情较轻的，血糖浓度在20mmol/L左右的糖尿病小鼠，用如上的剂量和方式注射带有胰岛素前体基因的质粒pCMV-IN、pCMV-INcDNAm，那么pCMV-IN中的胰岛素前体基因比pCMV-INcDNAm中的胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血糖水平的降低效果更好，可达50％(图4)。

由此可见，我们发明的糖尿病基因治疗的方法可以起到降血糖的作用至少是1个月，这就可能使病人避免常规的经常性地胰岛素注射带来的痛苦和不便。4胰岛素前体基因对糖尿病小鼠血液中胰岛素浓度的影响

把pCMV-IN用如上的剂量和方式注射到糖尿病小鼠骨骼肌中，用放免的方法测定血液胰岛素浓度的变化，发现经治疗的糖尿病小鼠血液胰岛素浓度明显高于对照，并接近或达到正常水平(17.95±3.8μu/ml)(图5)。本发明维持体内一定水平的胰岛素浓度可以预防和减少糖尿病病人急、慢性并发症的发生。5胰岛素前体基因在肌肉组织中转录产物mRNA的测定

给糖尿病小鼠注射pCMV-IN、pCMV-INcDNA、pCMV-INcDNAm21天后，取其注射部位的肌肉组织约100mg，提取总RNA，用RT-PCR方法检测外源DNA在肌肉组织中转录产物mRNA。以注射pcDNA3.1(-)的小鼠为对照。以β-action的mRNA为PT-PCR内参对照。结果表明pCMV-IN、pCMV-INcDNA、pCMV-INcDNAm 3种胰岛素前体基因在骨骼肌内可转录产生相应的mRNA。这证明了本发明使用的肌肉直接注射的方法，可以使外源胰岛素原前体基因在骨骼肌内表达。6胰岛素前体基因对严重病情的糖尿病小鼠死亡率的影响

如果每次给小鼠注射更多剂量的STZ(50mg/kg)，连续5天，3周后就可造成糖尿病病情严重的模型，在接下来的4周内其死亡率很高，若给这些病情严重的糖尿病小鼠注射胰岛素前体基因，可使死亡率明显下降。结果见表1。本发明可以使严重的糖尿病病人的病情得到缓解。

表1  胰岛素前体基因对糖尿病小鼠死亡率的影响外源DNA     开始的糖尿病  4周后死亡的    糖尿病小鼠

        小鼠数目      糖尿病小鼠数   的死亡率

                      目PcDNA3.1(-) 28            24             85.7％pCMV-proIN  20            16             80.0％pCMV-IN     19            4              21.1％pCMV-       19            5              26.3％IncDNA

Claims (5)

1.一种用于直接肌肉注射治疗糖尿病的人胰岛素前体基因，它依次由编码信号肽，B链，C链，和A连的核苷酸序列组成。

2.按照权利要求1所述的基因，其特征在于，在编码C链和A链的核苷酸序列之间插入一段编码furin酶切位点的序列。

3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于，编码C连的核苷酸序列中含有天然状态下存在于该基因中的内含子。

4.含有权利要求1至3中任意一项所述的基因，并能够在人肌肉组织中表达该基因的质粒。

5.按照权利要求4所述的质粒，它是含有权利要求1至3中任意一项所述的基因的真核表达质粒pcDNA3.1(-)。

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