CN1341716A - 一个锌指蛋白家族的人类新基因znf328 - Google Patents

Abstract

本发明涉及锌指蛋白家族人类基因。本发明的一个锌指蛋白家族的人类新基因ZNF328,它的cDNA全长2467bp,编码262个氨基酸的蛋白质。该基因在人体不同发育时期均有广泛表达,该基因定位在染色体19q13区段。

Description

一个锌指蛋白家族的人类新基因ZNF328

技术领域：本发明涉及锌指蛋白家族的一个人类新基因ZNF328及其克隆，它在人体各组织和胚胎不同发育阶段的表达，它的遗传学定位以及该基因在不同物种间同源基因的同源程度分析，以探索利用该基因进行人类疾病的诊断及治疗。

背景技术：锌指蛋白家族一般具有该家族的特征性结构----锌指蛋白结构域，是最先在果蝇被确立的、为中枢神经系统和肌肉等组织分化所必需的调控因子(POSTIGO AA，SHEPPARD A M，MUCENSKI M L，et al.EuropeanMolecular Biology Organization ofJournal，1997，16(13)：3924-3834)。已知zfh-1基因在早期果蝇胚胎的中胚层以及晚期胚胎的多种中胚层衍生结构中表达，其中包括背侧内脏、性腺支持细胞和成肌细胞等；此外还主要在发育时的中枢神经系统运动神经元中表达。研究表明，Zfh-1蛋白是果蝇中调节肌细胞和性腺细胞分化的转录抑制因子；zfh-1基因参与调节果蝇的尾部中胚层(CVM)的早期分化；参与调节eve基因的表达，控制心脏前体细胞(EPC)的形成；还与tinman基因一同调节包括性腺中胚层在内的外侧中胚层的进一步分化(LAI Z C，FORTONI M E，RUBIN C M et al，Mechanism of Development，1991，34(1-2)：123-124；POSTIGO AA，DEAN D C.Proceeding National AcademicScience USA.2000，1997(12)：6391-6396；KUSCH T，REUTER R.Development，1999，126(18)：3991-4003；SU M T，FUJIOKA M，GOTO T，et al，Development，1999，126(14)：3241-3251)。

脊椎动物中的zfh同源基因也有相似的功能。如ZEB基因的表达产物ZEB-1和ZEB-2蛋白，在包括肌肉、中枢神经系统、T淋巴细胞等组织中均有表达，而最近发现ZEB蛋白包含两个独立的区域，分别调节哺乳动物肌细胞和淋巴细胞的分化(POSTIGO AA，DEAN D C Development，1999，19(12)：7961-7971)。小鼠的zfp-35基因则是精子发生中粗线期精母细胞发育的上游调节基因(CUNLIFFE V，KOOPMAN P，MCLAREN A et al，EuropeanMolecular Biology Organization of Joural，1990，9(1)：197-205)。而人类锌指基因ZNF家族已被发现参与调节某些肿瘤的形成(OGURI T，KATOHO，TAKAHASHI T et al，Gene，1998，222(1)：61-67.)。

发明内容：本发明利用果蝇zfh-1的cDNA序列，检索基因组序列数据库而得到该cDNA的各种人类同源序列所编码的氨基酸序列，在其中发现了一个新的蛋白质，得到ZNF328基因的部分cDNA序列，并以该序列克隆ZNF328全长cDNA。

本发明以胎盘组织的cDNA为模板，利用部分cDNA序列设计引物，PCR扩增得到该基因开放阅读框序列，经T载体克隆并测序，测序结果证明其与计算机检索获得的部分cDNA序列完全吻合。以从T载体酶切下的开放阅读框片段为探针，进行Northern杂交，结果表明：该基因全长mRNA约为2.4kb，且在脑组织中有较强的表达。利用获得的开放阅读框序列设计引物，采用TakaRa公司的5’端RACE试剂盒，以脑组织mRNA为模板，做5’端RACE获得该基因5’端序列。以胎盘组织cDNA为模板，利用获得的5’端序列设计5’端引物，利用数据库检索得到的3’端同源EST序列设计3’端引物，PCR扩增得到ZNF328全长cDNA，T载体克隆并测序。(图1)。该基因cDNA全长2467bp，其中5’端非翻译区为430bp，编码区为789bp，编码262个氨基酸组成的蛋白质，3’端非翻译区为1248bp(图2)；其近5’端有一个起始密码子ATG，近3’端有一个终止密码子TGA以及末端的加尾信号ATAAA。

进行18周，19周，21周，25周，26周的人体胚胎各种组织总RNA膜的Northern杂交分析，结果表明该基因在人体不同发育时期均有广泛表达(图3)。其中在18周时，大脑中表达最强，肝，肾上腺，肺次之，在小脑，肌肉，胃，脾也有一定表达，而在肠，心脏和舌中则几乎没有表达。在19周，大脑，小脑中有较强表达，肝中次之，在肾，肺，肌肉中也有一定表达，而在肠和心脏中则几乎没有表达。在21周，在大脑，小脑，肺，胃组织中表达较强，肝，肾上腺，肾，肌肉次之，在肠和心脏则几乎没有表达。在25周时，大脑，小脑，肾，肾上腺，肠中表达较强，肝，肌肉中次之，在心，舌，胃则几乎没有表达。在26周时，在大脑，肺，肌肉，肾，肠中表达较强，胃，舌，心脏次之，而在肾上腺和肝中则几乎没有表达。综合各时期的表达情况可见：该基因在不同发育时期的脑组织中均有表达，且表达较强；在肝组织中表达也一直较强，但在26周无表达；在肺，肠，肌肉和舌中，随着胚胎发育时期的增长，其表达是不断增强的；在肾及胃中，表达较为特殊，呈波浪性表达。用免疫系统的6种组织的mRNA膜进行Northern杂交分析，结果表明该基因在胎儿肝及脾有强烈表达，在胸腺，骨髓中都有较强表达，而在外周血细胞和淋巴结中表达则相对较弱(图4)。

用该基因编码的蛋白质检索蛋白质数据库，发现其与人类ZNF135，狗bc3，大鼠pMLZ-4，小鼠rKr1及果蝇crol基因均有较高的同源性，其同源度分别为62％，61％，61％，60％，40％(图5)。已知人类锌指蛋白是参与正常和异常的细胞增殖与分化的(OGURI T，KATOHO，TAKAHASHI T etal，Gene，1998，222(1)：61-67.)，已有一部分人类锌指蛋白家族的基因被确定为侯选疾病基因，它们是：ZNF132，ZNF133，ZNF134，ZNF135，ZNF137，ZNF138，ZNF139，ZNF143，ZNF148，ZNF151，ZNF154和ZNF155。而其中ZNF135为甲状腺瘤疾病候选基因(Tommerup N，Vissing H，Genomics 1995 May20；27(2)：259-264.)。依据ZNF328为锌指蛋白家族成员及基因的同源同功原理，并结合其在人体中的表达情况，显示该基因亦为人类疾病候选基因。

以该基因全长cDNA检索核酸数据库nr及htgs，将该基因定位于BACCTD-2368P22上，该BAC位于染色体19q13区段，故该基因定位在染色体19q13区段。进一步检索，将该基因定位于遗传学图标记SG50955/SG45544位点上。已知在甲状腺瘤病人中，染色体19q13区段的微缺失是极为常见的(Tommerup N，Vissing H，Genomics 1995 May 20；27(2)：259-264.)，从而提示ZNF328可能也是该病的致病基因。

本发明的优点：

1、提供了一个人类新基因ZNF328基因的全长cDNA序列，并描述了其编码的蛋白产物在不同物种间同源基因结构域的同源程度，证明了该基因是锌指蛋白基因家族成员之一。

2、该基因编码的蛋白产物为锌指蛋白，是一种转录调控因子，有可能成为基因工程的产物。

3、该基因在不同时期的人组织中广泛表达，显示该基因在细胞中具有重要的功能，而其在免疫系统的强烈表达，则提示其与人类免疫反应密切相关。

4、该基因位于人类染色体的19q13区段，而19q13的微缺失是甲状腺瘤普遍的致病原因，提示该基因可能是甲状腺瘤的致病基因。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

图1.ZNF328的cDNA序列

图2.ZNF328的编码蛋白

图3.在人体胚胎不同发育阶段的Northem杂交

图3a 18周胚胎

图中：1肝  2肠  3肾上腺  4心脏  5肺6舌  7大脑

8小脑     9肾  10肌肉   11胃  12脾

图3b 19周胚胎

图中：1肌肉  2大脑  3肠  4小脑  5肾  6肝  7心脏  8肺

图3c 21周胚胎

图中：1肝  2肠  3肾上腺  4心脏  5肺  6大脑

7小脑  8肾  9肌肉  10胃

图3d 25周胚胎

图中：1肝  2肠  3肾上腺  4心脏  5肺   6舌

7大脑   8小脑   9肾   10肌肉  11胃

图3e 26周胚胎

图中：1胃  2肌肉  3肾  4大脑  5舌  6肺  7心脏

8肾上腺  9肠  10肝

图4.在人体免疫系统组织的Northern杂交

1脾  2淋巴结  3胸腺  4外周血  5骨髓  6胎儿肝

图5.ZNF328编码的蛋白在不同物种间的同源性比较

实施例1 ZNF328全长cDNA的克隆和测序

1、ZNF328开放阅读框的克隆

以胎盘组织的cDNA为模板，利用部分cDNA序列设计引物，PCR扩增得到该基因开放阅读框序列，经T载体克隆并测序。

引物序列：

W1S：5-CAT ATG AGA ATG CAT ACT GGA GA-3

W1AS：5-TTC AAT TCA GTT TCT CTT CAC TGT-3

2、利用TakaRa公司的5’端RACE试剂盒做ZNF328基因的5’端RACE，以开放阅读框序列设计RACE引物：

5’端磷酸化RT primer：5-XCTC CGA TGA GCA ACA AGG-3

primer A1：5-CAG ATG GCT CAC CTT G-3

primer S1：5-GTT TAG TGA GGG CTG A-3

primer A2：5-CCT TGT TGC TCA TCG G-3

primer S2：5-TGC TTT GCC ACA TTC C-3

上述引物均由上海生工公司合成。

利用TakaRa公司的5’端RACE试剂盒做5’端RACE的具体操作按该公司protocol进行。本实验中取大脑组织mRNA 5ug为模板。

将RACE产物克隆入Topo ta cloning载体(由Invitroten公司提供)并测序获得ZNF3285’端序列。

3、ZNF328全长cDNA的克隆

以胎盘组织的cDNA为模板，利用5’端RACE获得的5’端序列设计5’引物，利用数据库检索得到的3’端同源EST序列设计3’端引物，PCR扩增得到ZNF328全长cDNA，T载体克隆并测序(图1)。该基因cDNA全长2467bp，其中5’端非翻译区为430bp，编码区为789bp，编码262个氨基酸组成的蛋白质，3’端非翻译区为1248bp(图2)，其近5’端有一个起始密码子ATG，近3’端有一个终止密码子TGA以及末端的加尾信号ATAAA。

引物序列：

5’端引物(W2S)：5-TAC TCA ACA TAC AAG CAC TTA CAC-3

3’端引物(W2AS)：5-GAC AGA GAA ACC AGG TAA CT-3

实施例2 Northern杂交

1：组织总RNA的提取(按王雁云等，一种快速的总RNA提取方法，生命科学研究，5(1)：88-90(2001)进行)。

2：总RNA的电泳及转膜，均按《现代分子生物学实验技术》介绍的方法进行(卢圣栋主编，第二版)。

3：Northern杂交

将固定有人各种组织的总RNA的尼龙膜，放在杂交袋中，加入变性10ml68℃预热的快速杂交液(Clontech公司)，68℃预杂交的30分钟，加入变性的同位素标记的ZNF328的开放阅读框789bp的片段，42℃杂交过夜。2XSSC，0.05％SDS洗膜，42℃洗两次，15分钟/次。0.1XSSC，0.1％SDS 42℃洗两次，15分钟/次。

4.-80℃曝光12小时，洗出X光片即得图3.4。

Claims (1)

1、一个锌指蛋白家族的人类新基因ZNF328，其特征在于该人类新基因ZNF328的cDNA核苷酸序列与氨基酸序列如下：＞znf328cDNA1                                                                T2      ACT CAA CAT ACA AGC ACT TAC ACT GCA GAG AAA CCC TAT GAC TAC       4647     AAT GAA TGT GGG ACG TCT TTC ATC TGG AGC TCT TAC CTT ATT CAA       9192     CAT AAG AAA ACT CAT ACT GGA GAA AAA CCC TAT GAA TGT GAT AAA       136137    TGT GGA AAA GTT TTT AGG AAT CGC TCA GCC CTT ACG AAA CAT GAA       181182    CGG ACT CAC ACT GGA ATA AAA CCC TAT GAA TGT AAT AAA TGT GGA       226227    AAA GCC TTC AGC TGG AAT TCT CAT CTT ATT GTA CAT AAG AGA ATT       271272    CAT ACA GGA GAA AAA CCT TAT GTT TGT AAT GAG TGT GGG AAA TCT       316317    TTC AAC TGG AAC TCT CAT CTT ATT GGA CAT CAG AGG ACT CAT ACA       361362    GGA GAG AAA CCT TTT GAA TGT ACT GAA TGT GGG AAA TCA TTC AGC       406407    TGG AGC TCC CAT CTT ATT GCC CAT ATG AGA ATG CAT ACT GGA GAG       451452    AAA CCC TTT AAA TGT GAT GAA TGT GAA AAA GCT TTT AGG GAC TAC       496497    TCA GCC CTT AGT AAA CAT GAA AGA ACT CAT TCT GGA GCA AAA CCA       541542    TAT AAA TGT ACT GAA TGT GGA AAA TCC TTC AGC TGG AGC TCC CAT       586587    CTT ATT GCC CAT CAG AGA ACT CAC ACG GGA GAG AAA CCA TAT AAC       631632    TGT CAG GAA TGT GGC AAA GCA TTC AGA GAA CGC TCA GCC CTC ACT       676677    AAA CAT GAG ATA ATT CAT TCT GGA ATT AAG CCC TAT GAA TGT AAT       721722    AAA TGT GGA AAA TCC TGT AGC CAG ATG GCT CAC CTT GTT AGA CAT       766

                                                                   续后767    CAA AGG ACT CAT ACT GGA GAA AAA CCC TAT GAA TGC AAT AAA TGT    811812    GGA AAA TCC TTC AGT CAG AGC TGT CAC CTT GTT GCT CAT CGG AGA    856857    ATT CAC ACT GGT GAG AAA CCC TAT AAA TGT AAT CAG TGT GAA AGA    901902    TCC TTT AAC TGT AGT TCT CAC CTC ATT GCA CAC CGG AGA ACT CAT    946947    ACT GGA GAG AAA CCA TAC AGG TGT AAT GAA TGT GGG AAA GCA TTT    991992    AAT GAG AGT TCA TCC CTT ATT GTA CAC CTA AGA AAC CAT ACT GGA    10361037   GAA AAG CCC TAC AAA TGT AAT CAT TGT GAA AAA GCA TTT TGT AAG    10811082   AAT TCT TCC CTT ATT ATT CAT CAG AGA ATG CAT AGT GGA GAG AAA    11261127   CGC TTT ATA TGC AGT GAA TGT GGA AAA GCC TTT AGT GGT CAC TCA    11711172   GCC CTA CTT CAA CAC CAG AGA AAT CAC AGT GAA GAG AAA CTG AAT    12161217   TGA ATT TAT GCG AGT TTT TCG TTT CTT GTA CAT TTG ACA ACA CAT    12611262   TGA GGA AAA CCC TAT AAA CAT AAT CAA GAG GGG ACA TTT TTC ATT    13061307   AAG AGT TCA GTA AGA CTT CTC CCA CAT TAT TTA CTA GAA AAT ATC    13511352   ATC TTA GAA GAA ACC CCA TGA AGG AAA AGA ATA GGG AAA AGC TTT    13961397   CAG CAG TTA TTT AGC CCT TAC TCA AAA TCA GAT AAT TAA CAA TGA    14411442   AGG AAA CTC TAA ACT CCC CTT ATG GTC TAC CAG TAA TTC ATA CTT    14861487   GAG GAC CAT GAC TGC GGG GAA TGA GGC ATC TTT TAG CAA GAG CTC    15311532   TCA CCA ATT GTA GAT TGG TGT GAA TTG CTA AGG GAA AAA CCT TAT    15761577   GCA GAG AAA AGT TTT TGA CTG GAA ATA CAC TGT TTT GCA TCA AGC    16211622   TGG AGT ACT GGA TGG AAA ACT CTA CAA TAA CAT TTT GTG CAT AAT    16661667   TGT AGA AAT ACA GAT TTT GTT GTT ATA AGG GGA GGG TCT GGG TGC    17111712   CCA GGA GTA GAA TAT GAA GTG CTA AAT CTG AAT GTA AGA AAA ATA    17561757   ATA GTA TTG AAT GGG GTA TTT ACT GTT GAT TAA CCT CCT TAG AGA    1801

                                                                  续后1802     AAA  TTA   ATG  AAT  GAG   ATG   ACT   AAC  GGT   AGA  AAA  GTT   ATT   GCC   TAG       18461847     GAG  TGT   GAG  ACT  GAT   GTT   GCT   GGA  CAG   AAA  GTG  ATC   CTT   AGC   CCA       18911892     GTG  TGT   CAG  CGT  CCA   TTG   TTA   CTC  ATC   ACT  GCA  TTG   TTG   GGC   AAT       19361937     TAG  TTT   GTA  ATT  TGT   TTT   AGG   CAA  TCA   CTA  TAA  ATT   ATA   ATT   ATG       19811982     GAC  ACT   GCA  TCA  GTA   TAC   ATA   ACA  TGA   AGG  AAT  AAA   AAG   GAT   ACA       20262027     GAA  TTG   TAT  ATA  CAT   ACT   TAC   TGT  AAC   ACA  TCT  AAA   AAA   ATG   TAT       20712072     ATG  GGT   AAG  GAC  CTG   AAA   GAT   CCA  TGG   AAA  AGT  TAA   CCC   AGT   TGA       21162117     GAT  TTT   TAA  AAA  GTT   TTA   CAA   ATA  CAT   ATA  ACA  CTT   ATG   TGC   TGG       21612162     GCT  TTC   TTT  TAA  ATG   CTT   TCC   AAG  TGT   TAA  CTT  GTT   TAG   TCC   CCT       22062207     TTA  CTC   TGA  GAT  AGG   TAC   TGT   TAC  CCC   AGT  TTT  ACA   AAT   GGC   TAA       22512252     GCT  GAA   GCA  GAG  ATG   TTG   AAG   GAT  CCT   ACC  TAA  GGG   GCA   CAA   CTA       22962297     GTA  AGG   GAG  TAG  AGC   TGA   GAT   TGG  CTC   CAG  AGT  TCT   TGT   TTT   CAG       23412342     CCA  CCA   TTT  TAT  GCT   GCC   TCT   CCA  GTG   ATT  TTT  TTT   CCC   ATT   TTC       23862387     TTC  AGT   GTT  TCT  ATA   GCA   GAG   ATT  TGA   TAA  TAA  AAA   GAA   AAT   CCT       24312432     AAA  CAA   TGA  GAA  ATA   AAG   TTA   CCT  GGT   TTC  TCT  GTC     2467ZNF328编码的蛋白质：1   MRMHTGEKPF   KCDECEKAFR   DYSALSKHER   THSGAKPYKC   TECGKSFSWS51   SHLIAHQRTH   TGEKPYNCQE   CGKAFRERSA   LTKHEIIHSG   IKPYECNKCG101   KSCSQMAHLV   RHQRTHTGEK   PYECNKCGKS   FSQSCHLVAH   RRIHTGEKPY151   KCNQCERSFN   CSSHLIAHRR   THTGEKPYRC   NECGKAFNES   SSLIVHLRNH201   TGEKPYKCNH   CEKAFCKNSS   LIIHQRMHSG   EKRFICSECG   KAFSGHSALL251   QHQRNHSEEK   LN

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