CN1332719C - 用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置 - Google Patents

用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置 Download PDF

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一种用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，它包括有带容器的机体、不锈钢网状隔板、不锈钢滤网、固定夹、灌流瓶和蠕动泵，设置在机体上的蠕动泵输入端与无菌输入导管连通，蠕动泵输出端通过无菌输出导管、针柄与灌流针连通，其特征在于：设置于机体上的充氧器输入端通过输氧管与位于机体上氧气口连通，充氧器输出端通过导氧管经灌流瓶侧孔与灌流瓶内连通。本发明可以对离体肝脏进行两步肝灌流，最大限度地快速、连续进行前灌流液和消化液的有效灌注，最大程度地质控消化肝组织过程，节约成本，恒定温度，减少污染，从而保质保量的获得实验与临床所用的肝细胞，尤其是肝细胞移植、生物人工肝等所需的大量肝细胞。

Description

用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置
(一)、所属技术领域
本发明涉及一种医学实验设备及医疗仪器的辅助设备，特别是一种以获取肝脏细胞为目的体外肝灌流装置。
(二)、技术背景
现有成熟的肝细胞分离所采用的方法是酶消化法，该方法是将胶原酶等注入肝脏血管，作用于肝组织，使肝细胞间复杂的纤维连接溶解，从而获得完整的个体肝细胞。由于没有统一的标准、方法及仪器，致使各实验室及实验人员难以掌握该技术，分离效果不一，细胞获得率和活力不高。在酶消化方法上，无论原位还是体外灌流，一般采用人工注射器注入式，每次吸取20ml灌流液进行反复灌注。该方法不仅操作繁琐，而且需要他人配合，一般需要2～3人花1小时以上的时间才能完成，既耗时又费力，并容易造成细菌等污染，在对大动物肝脏进行灌流时更不方便。即使使用灌注泵，也很难将肝脏大小血管内的血细胞冲洗干净，使消化液均匀地灌满整个肝脏。同时，人工注射法灌流压力控制不均匀，压力过低时灌流不充分，过大时对细胞造成损伤。由于胶原酶对温度要求很高，37℃为其最佳作用温度，上述方法很难控制灌流液温度，因此，往往由于温度控制不好，而影响了最终的细胞消化效果，不能达到所需细胞数量和质量要求，而且造成昂贵胶原酶的浪费，增加分离培养肝细胞的成本。
(三)、发明内容
本发明的目的就是提供一种结构简单和操作方便的用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，它可以对离体肝脏进行两步肝灌流，最大限度地快速、连续进行前灌流液和消化液的有效灌注，最大程度地质控消化肝组织过程，节约成本，恒定温度，减少污染，从而保质保量的获得实验与临床所用的肝细胞，尤其是肝细胞移植、生物人工肝等所需的大量肝细胞。
本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它是在机体上设置有容器，容器内设置有不锈钢网状隔板，位于不锈钢网状隔板下方的容器底部设置有加热器，带有侧孔的灌流瓶通过固定夹定位于不锈钢网状隔板上表面处，灌流瓶顶部通过支架固定有不锈钢滤网，设置于机体上的蠕动泵输入端与无菌输入导管连通，蠕动泵输出端通过无菌输出导管、针柄与灌流针连通，其特征在于：设置于机体上的充氧器输入端通过输氧管与位于机体上氧气口连通，充氧器输出端通过导氧管经灌流瓶侧孔与灌流瓶内连通。
本发明的工作原理是这样的：
向机体上的容器内加入蒸馏水，并通过加热器把水加热至37℃，以保证在37℃的恒定温度下进行全部操作。
首先，在无菌条件下，以手术方法获取动物肝脏或正常人供肝组织，稍加外表修整和冲洗后，放在无菌不锈钢筛网上，灌流瓶的容积是500～1000ml。将无菌输入导管先与装有充氧前灌流液的容器相连通，充氧前灌流液是含EDTA、无Ca2+及Mg2+离子的Hanks液，将灌流针与放于无菌不锈钢筛网上的动物肝脏或正常人供肝组织中的门静脉或肝动脉相连通。开启蠕动泵，以80～100ml/分钟的速度将500～800ml、37℃的充氧前灌流液灌入肝脏，灌入肝脏的充氧前灌流液自肝门血管溢出，滴入灌流瓶内，时间约10～15分钟。此为第一步灌流，主要采用恒温、匀速灌流方法，通过37℃的前灌流液冲洗肝内血液，使残留红细胞尽可能冲干净，为酶消化做准备。
其次，移弃灌流瓶内的充氧前灌流液及其它残留红细胞等杂质，用无菌缓冲液洗净后，向灌流瓶内加入浓度为0.05％的胶原酶液100～250ml。将无菌输入导管经灌流瓶侧孔与灌流瓶内的胶原酶液相连通，灌流针仍与肝脏门静脉或肝动脉相连通，开启蠕动泵，以50～70ml/分钟的灌速匀速循环灌注肝脏，10分钟后结束灌流。此为第二步肝灌流，主要通过向肝内循环灌注胶原酶，消化分解肝细胞之间的纤维连接，分离肝细胞。
经过灌流的动物肝脏或正常人供肝组织置于灌流瓶内，用剪刀划破肝包膜，剔除胆囊和大块纤维结缔组织，振荡灌流瓶，继续消化肝组织10～15分钟，用培养液终止消化。收集肝细胞悬液，用200目钢网进行过滤，然后转移至离心管低速离心即可得到所需肝细胞。
本发明可以对对灌流液进行充氧处理，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内空泡，提高肝细胞的活力。
综上所述，本发明为一肝灌流消化分离肝细胞的装置，以体外两步胶原酶灌流法为基本原理，通过该装置可获得高质量的肝细胞，用于实验研究或应用研究，尤其可用于需要大量肝细胞的应用与临床研究用途。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
1.结构简单，使用方便，运行可靠，单人只需在半小时内就可以完成操作，节约人力、物力和时间。
2.灌流液置于37℃恒温水浴之内，满足了肝细胞分离及胶原酶所需的恒定温定，保证了消化和分离肝细胞的活性。
3.采用蠕动泵匀速灌注，使灌注压保持在一定的范围之内，避免了人射器灌注所致的压力不定。
4.使用特制硅胶软管灌注针，37℃时可随意弯曲，能顺利插入肝内血管及分枝，且不易损伤组织，并能酌情改变方向，向肝内不同血管分枝方向灌注，达到最佳灌注效果。
5.对灌流液进行充氧处理，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内空泡，提高肝细胞的活力。
6.容器内充入水形成的水浴池不仅保证了灌流液温度，同时可作为灌流后继续消化细胞之用。整个装置在无菌操作台上，单人操作，连续进行，避免了细菌、真菌的污染，简化了传统方法较为复杂的操作过程。
(四)、附图说明
本发明的附图说明如下：
图1为本发明的结构示意图；
图中：1.机体；2.不锈钢网状隔板；3.固定夹；4.加热器；5.氧气口；6.温控钮；7.温度监视器；8.调速钮；9.电源开关；10.蠕动泵；11.无菌输入导管；12.无菌输出导管；13.针柄；14.灌流针；15.不锈钢滤网；16.导氧管；17.灌流瓶；18.充氧器；19.侧孔；20.输氧管。
(五)、具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
如图1所示，本发明是在机体1上设置有容器，容器内设置有不锈钢网状隔板2，位于不锈钢网状隔板2下方的容器底部设置有加热器4，带有侧孔19的灌流瓶17通过固定夹3定位于不锈钢网状隔板2上表面处，灌流瓶17顶部通过支架固定有不锈钢滤网15，设置于机体1上的蠕动泵10输入端与无菌输入导管11连通，蠕动泵10输出端通过无菌输出导管12、针柄13与灌流针14连通，其特征在于：设置于机体1上的充氧器18输入端通过输氧管20与位于机体上氧气口5连通，充氧器18输出端通过导氧管16经灌流瓶17侧孔与灌流瓶17内连通。
本实验新型的工作原理是这样的：
向机体1上的容器内加入蒸馏水，并通过加热器4把水加热至37℃，以保证在37℃的恒定温度下进行全部操作。
首先，在无菌条件下，以手术方法获取动物肝脏或正常人供肝组织，稍加外表修整和冲洗后，放在无菌不锈钢筛网15上，灌流瓶17的容积是500～1000ml。将无菌输入导管11先与装有充氧前灌流液的容器相连通，充氧前灌流液是含EDTA、无Ca2+及Mg2+离子的Hanks液，将灌流针14与放于无菌不锈钢筛网15上的动物肝脏或正常人供肝组织中的门静脉或肝动脉相连通。开启蠕动泵10，以80～100ml/分钟的速度将500～800ml、37℃的充氧前灌流液灌入肝脏，灌入肝脏的充氧前灌流液自肝门血管溢出，滴入灌流瓶17内，时间约10～15分钟。此为第一步灌流，主要采用恒温、匀速灌流方法，通过37℃的前灌流液冲洗肝内血液，使残留红细胞尽可能冲干净，为酶消化做准备。
其次，移弃灌流瓶17内的充氧前灌流液及其它残留红细胞等杂质，用无菌缓冲液洗净后，向灌流瓶17内加入浓度为0.05％的胶原酶液100～250ml。将无菌输入导管11经灌流瓶17侧孔与灌流瓶17内的胶原酶液相连通，灌流针14仍与肝脏门静脉或肝动脉相连通，开启蠕动泵10，以50～70ml/分钟的灌速匀速循环灌注肝脏，10分钟后结束灌流。此为第二步肝灌流，主要通过向肝内循环灌注胶原酶，消化分解肝细胞之间的纤维连接，分离肝细胞。
经过灌流的动物肝脏或正常人供肝组织置于灌流瓶17内，用剪刀划破肝包膜，剔除胆囊和大块纤维结缔组织，振荡灌流瓶17，继续消化肝组织10～15分钟，用培养液终止消化。收集肝细胞悬液，用200目钢网进行过滤，然后转移至离心管低速离心即可得到所需肝细胞。
本发明可以对对灌流液进行充氧处理，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内空泡，提高肝细胞的活力。
综上所述，本发明为一肝灌流消化分离肝细胞的装置，以体外两步胶原酶灌流法为基本原理，通过该装置可获得高质量的肝细胞，用于实验研究或应用研究，尤其可用于需要大量肝细胞的应用与临床研究用途。
如图1所示，蠕动泵10的调速钮8和电源开关9均可以设置于机体10上。如图1所示，机体1上可以设置有监测容器内温度的温度监视器7。如图1所示，加热器4的温控钮6可以设置于机体1上。

Claims (4)

1.一种用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，它是在机体(1)上设置有容器，容器内设置有不锈钢网状隔板(2)，位于不锈钢网状隔板(2)下方的容器底部设置有加热器(4)，带有侧孔(19)的灌流瓶(17)通过固定夹(3)定位于不锈钢网状隔板(2)上表面处，灌流瓶(17)顶部通过支架固定有不锈钢滤网(15)，设置于机体(1)上的蠕动泵(10)输入端与无菌输入导管(11)连通，蠕动泵(10)输出端通过无菌输出导管(12)、针柄(13)与灌流针(14)连通，其特征在于：设置于机体(1)上的充氧器(18)输入端通过输氧管(20)与位于机体上氧气口(5)连通，充氧器(18)输出端通过导氧管(16)经灌流瓶(17)侧孔与灌流瓶(17)内连通。
2.如权利要求1所述的用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，其特征在于：蠕动泵(10)的调速钮(8)和电源开关(9)均设置于机体(10)上。
3.如权利要求1所述的用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，其特征在于：机体(1)上设置有监测容器内温度的温度监视器(7)。
4.如权利要求1所述的用于消化分离肝细胞的简易体外肝灌流装置，其特征在于：加热器(4)的温控钮(6)设置于机体(1)上。
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