CN1322142C - 提取dna的试剂及使用该试剂提取哺乳动物dna的方法 - Google Patents
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Abstract
提取DNA的试剂及使用该试剂提取哺乳动物DNA的方法，它涉及DNA提取试剂的组分及使用该试剂哺乳动物提取DNA的方法。本发明红细胞裂解液由下列物质按容量制成：10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/LNaCl，细胞混合液由下列物质按重量和容量制成：8.0g NH4Cl、1.0g EDTA、0.1g KH2PO4，用该试剂提取DNA的步骤为：在管中加入0.5ml血和0.5ml红细胞裂解液，上下振摇，静止10分钟至溶液呈透明的红色，将管放入离心机中14000转/min离心1分钟，弃去3/4上清，留下细胞层。本发明提取DNA的试剂具有价格低廉，易获得，没有毒、副作用的优点。提取方法具有操作简便、快捷，省去了传统提取方法繁杂的操作程序。所获得的DNA片段大的优点。
Description
技术领域：
本发明涉及一种提取DNA的试剂的组分及使用该试剂提取哺乳动物DNA的方法。
背景技术：
哺乳动物DNA的分离通常是在有EDTA及SDS一类的去污剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。低分子量杂质则用透析法加以去除。酚-氯仿抽提法是经典的核酸提取方法，这种核酸提取方法具有提取效率高、纯度好的优点，但由于其常涉及到去垢剂裂解，蛋白酶处理，有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤，不但繁琐，而且增加了标本间相互污染的机会。目前从哺乳动物细胞和组织中分离DNA有三种方法。第一种，Blin和Stafford利用蛋白酶K、SDS和酚，需要有机溶剂抽提，该方法费力。第二种方法，包括用蛋白酶K消化，用高浓度甲酰胺使DNA-蛋白质复合物解离，以及通过火棉胶袋除去残存的蛋白酶等步骤，该方法费时。第三种方法用盐酸胍裂解细胞，它所生成的DNA较小。旋转离心柱提取DNA具有操作简便、稳定、储存方便、重复可靠等特点，但是提取核酸的效率低。二氧化硅或硅藻吸附法适用于病毒及革兰氏阴性菌的基因组核酸提取，但不能直接从革兰氏阳性菌中提取核酸。微量全血核酸提取法中得使用氯仿等有害化合物，对操作者的健康有害。
发明内容：
本发明的目的是提供一种提取DNA的试剂及使用该试剂提取哺乳动物DNA的方法。提取DNA的试剂具有价格低廉，易获得，无毒副作用的特点；使用该试剂提取哺乳动物DNA的方法具有操作简便、快捷，适用范围广，提取的DNA纯度高，不含有影响PCR反应的化学物质，获得的DNA片段大的特点。本发明的提取DNA的试剂由红细胞裂解液、细胞混合液、细胞裂解液、溶液A、溶液B和溶液C成分组成，红细胞裂解液由下列物质按容量制成：10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/L NaCl、超纯水1升，红细胞裂解液的制作方法如下：将所述的Tris-HCl、MgCl2、NaCl放入容器内，加入超纯水至1升混合均匀即可；细胞混合液由下列物质按重量或容量制成：8.0gNH4Cl、1.0gEDTA、0.1gKH2PO4，超纯水＞0～＜1升，细胞混合液的制作方法如下：将所述NH4Cl、EDTA、KH2PO4放入容器内，加入超纯水至1升，然后加入10mol/LNaOH调PH值为7.0，经高压灭菌即可。细胞混合液的终浓度为l49mmol/L NH4Cl，2.6mmol/L EDTA，0.7mmol/L KH2PO4；细胞裂解液由下列物质按容量制成：50ml 2mol/L Tris，PH值为7.5，80ml 5mol/L NaCl，4ml 500mmol/L EDTA、超纯水＞0～＜1升，细胞裂解液的制作方法如下：：将所述的Tris、NaCl、EDTA放入容器内，再加入超纯水至1升，以10mol/LNaOH调pH值为8.0(用塑料吸管加入约0.75ml)高压灭菌即可；细胞裂解液的终浓度为100mmol/LTris-HCl，400mmol/L NaCl，2m mol/L EDTA。溶液A的制作方法如下：在900ml超纯水中溶解100g SDS，混合均匀，加超纯水至1升混合即可。溶液B的制做方法如下：在含有少量超纯水(减少静电)的容器中加入340.52g NaCl，再加超纯水至1升摇晃混合均匀即可。溶液C的制做方法如下：配制500ml 10∶1 TE，在容器中加入2.5ml 2mol/L TRIS-HCL，(pH值为7.5)和1ml 500mmol/L EDTA，加超纯水至500ml混合均匀，高压灭菌即可。本发明使用以上所述试剂提取哺乳动物外周血细胞DNA的方法，其步骤如下：(1)在标本管中加入0.5ml血和0.5ml红细胞裂解液，上下振摇，静止10分钟至溶液呈透明的红色，或者0.5ml血置于-80℃冰箱中5分钟，(2)将标本管放入离心机中14000转/min离心1分钟，弃去3/4上清，留下细胞层，(3)加入900μl细胞混和液，关盖，颠倒混匀7-10分钟，(4)14000转/min离心1分钟，去上清，(5)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(6)加入20μl的溶液A和10μl的20mg/ml蛋白酶K，上下轻混15-20次，使混合充分，(7)56℃水浴2小时至溶液均匀化，稍离心，(8)加入105μl溶液B，摇晃15秒，静置5-7分钟，(9)标本管14000转/min离心1分钟，分界不清，再离心1-3分钟，(10)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清，在装有DNA上清的管中加入800μl浓度为100％乙醇，轻混至有线状DNA沉淀出现，(11)14000转/min离心1分钟，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(12)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，轻晃管五下，洗沉淀，(13)14000转/min离心1分钟，去掉所有乙醇，(14)使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，(15)加入50-60μl的溶液C，轻击打管底混匀沉淀，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解，即获得含有外周血细胞DNA的溶液。本发明使用以上所述试剂提取口腔上皮细胞DNA的方法，其步骤如下：(1)在每个管中放入上皮细胞刷2个，加入900μl细胞混合液，(2)关盖，颠倒混匀7-10分钟，(3)14000转/min离心1分钟，去上清，(4)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(5)每管加入20μl的溶液A和10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，(6)上下轻混15-20次，使混合充分，(7)56℃水浴2小时～18小时至溶液均匀化，(8)14000转/min离心1分钟，用镊子夹住上皮细胞刷，挤出水分，弃去上皮细胞刷，(9)每管加入105μl溶液B，(10)盖上盖子，剧烈摇晃15秒，(11)静置5-7分钟，(12)标本管14000转/min离心1分钟，如果分界不清，再离心1-3分钟，(13)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)将含上清的管加入800μl浓度为100％乙醇，(15)盖上盖子，轻混至有线状DNA沉淀出现，(16)14000转/min离心1分钟，(17)打开盖，勿扰沉淀，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(18)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，洗沉淀，(19)关盖，轻晃管五下，沉淀可能浮起，(20)14000转/min离心1分钟，(21)弃450μl乙醇，使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，(22)加入50-60μl的溶液C，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解即获得含有口腔上皮细胞DNA的溶液。本发明使用以上所述试剂提取哺乳动物羊水培养细胞DNA的方法，其步骤如下：(1)取培养后的羊水弃大部分上清，(2)用细胞挂器挂下细胞，用塑料吸管吸入1.5ml置于离心管中，(3)离心机中14000转/min离心2分钟，弃上清，留100-200μl，(4)用PBS缓冲液洗细胞沉淀两次，每次加入1ml PBS缓冲液，涡旋混匀，14000转/min离心1分钟，弃上清，(5)加入900μl细胞混合液，(6)关盖，颠倒混匀7-10分钟，14000转/min离心1分钟，去上清，(7)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl的溶液A和10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，关盖，上下轻混15-20次，使混合充分，(9)56℃水浴2小时～18小时至溶液均匀化，稍离心，(10)每管加入105μl溶液B，(11)盖上盖子，剧烈摇晃15秒，(12)静置5-7分钟，(13)离心管14000转/min离心1分钟，如果分界不清，再离心1-3分钟，(14)从离心管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清加入第二管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(15)弃去含蛋白沉淀的管，(16)将含上清的管加入800μl浓度为100％乙醇，(17)盖上盖子，轻混至有线状DNA沉淀出现，(18)14000转/min离心1分钟，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，洗沉淀，(20)关盖，轻晃管五下，(21)14000转/min离心1分钟，(22)弃450μl乙醇，使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，加入50-60μl的溶液C，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解即获得含有羊水培养细胞DNA的溶液。本发明使用以上所述的试剂提取哺乳动物绒毛DNA的方法，其步骤如下：(1)取绒毛5mg在15ml离心管中2000转/min离心5分钟，弃上清，留1ml，(2)将细胞沉淀吸入1.5ml离心管中，离心机中14000转/min离心2分钟，(3)弃上清，留100-200μl，(4)加入900μl细胞混合液，(5)关盖，颠倒混匀7-10分钟，(6)14000转/min离心1分钟，(7)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl的溶液A和10μ120mg/ml蛋白酶K，上下轻混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2～18小时至溶液均匀化，稍离心，(10)每管加入105μl溶液B，盖上盖子，剧烈摇晃15秒，(11)静置5-7分钟，(12)标本管14000转/min离心1分钟，分界不清，再离心1-3分钟，(13)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清加入另一管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)弃去含蛋白沉淀的管，(15)向含上清的管加入800μl浓度为100％乙醇，(16)盖上盖子，轻混至有线状DNA沉淀出现，(17)14000转/min离心1分钟，(18)去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，关盖，轻晃管五下洗沉淀，(20)14000转/min离心1分钟，弃450μl乙醇，(21)吸弃剩余乙醇，使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，(22)根据DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，轻击打管底混匀沉淀，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解即获得含有绒毛DNA的溶液。本发明提取DNA的试剂具有价格低廉，易获得，没有毒、副作用，解决了传统的提取试剂对操作者有害的难题。适用于提取多种组织、细胞的DNA，适用范围广的优点；本发明提取DNA的方法具有提取操作简便、快捷，省去了传统提取方法繁杂的操作程序。所获得的DNA片段大，可应用于构建基因组DNA文库及PCR反应等各种分子生物学试验。DNA纯度高，不含有影响PCR反应的化学物质的优点。从各种标本中提取的DNA预期浓度范围见下表：
| 标本种类 | 浓度范围 | 平均浓度 |
| 全血 | 12-48μg/ml | 33μg/ml |
| 口腔上皮细胞 | 4-12μg/ml | 7μg/ml |
| 羊水培养细胞 | 46-99μg/ml | 76μg/ml |
| 绒毛 | 50-105μg/ml | 85μg/ml |
具体实施方式：
具体实施方式一：本实施方式的提取DNA的试剂由红细胞裂解液、细胞混合液、细胞裂解液、溶液A、溶液B和溶液C成分组成，红细胞裂解液由下列物质按容量制成：10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/L NaCl和超纯水1升，红细胞裂解液的制作方法如下：将所述的Tris-HCl、MgCl2、NaCl放入容器内，加入超纯水至1升混合均匀即可；细胞混合液由下列物质按重量或容量制成：8.0g NH4Cl、1.0g EDTA、0.1g KH2PO4和超纯水＞0～＜1升，细胞混合液的制作方法如下：将所述NH4Cl、EDTA、KH2PO4放入容器内，加入超纯水至1升，然后加入10mol/LnaOH，调PH值为7.0，经高压灭菌即可。细胞混合液的终浓度为149mmol/L NH4Cl，2.6mmol/L EDTA，0.7mmol/L KH2PO4；细胞裂解液由下列物质按容量制成：50ml 2mol/L Tris，PH值为7.5，80ml 5mol/L NaCl，4ml 500mmol/L EDTA和超纯水＞0～＜1升，细胞裂解液的制作方法如下：：将所述的Tris、NaCl、EDTA放入容器内，再加入超纯水至1升，以10mol/L NaOH调pH值为8.0(用塑料吸管加入约0.75ml)高压灭菌即可；细胞裂解液的终浓度为100mmol/LTris-HCl，400mmol/LNaCl，2m mol/L EDTA。溶液A的制作方法如下：在900ml超纯水中溶解100gSDS，混合均匀，加超纯水至1升混合即可。溶液B的制做方法如下：在含有少量超纯水(减少静电)的容器中加入340.52g NaCl，再加超纯水至1升摇晃混合均匀即可。溶液C的制做方法如下：配制500ml 10∶1 TE，在容器中加入2.5ml 2mol/L TRIS-HCL，(pH值为7.5)和1ml 500mmol/L EDTA，加超纯水至500ml混合均匀，高压灭菌即可。
具体实施方式二：本实施方式使用实施方式一所述的提取DNA的试剂，提取哺乳动物外周血细胞DNA的方法其步骤如下：(1)在管中加入0.5ml血和0.5ml红细胞裂解液，上下振摇，静止10分钟至溶液呈透明的红色，或者0.5ml血置于-80℃冰箱中5分钟，(2)将管放入离心机中14000转/min离心1分钟，弃去3/4上清，留下细胞层，(3)加入900μl细胞混合液，关盖，颠倒混匀7-10分钟，(4)14000转/min离心1分钟，去上清，(5)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(6)加入20μl溶液A和10μl20mg/ml蛋白酶K，上下轻混15-20次，使混合充分，(7)56℃水浴2小时至溶液均匀化，稍离心，(8)加入105μl溶液B，摇晃15秒，静置5-7分钟，(9)标本管14000转/min离心1分钟，分界不清，再离心1-3分钟，(10)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清，在装有含DNA上清的管中加入800μl浓度为100％乙醇，轻混至有线状DNA沉淀出现，(11)14000转/min离心1分钟，去掉约1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(12)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，轻晃管五下，洗沉淀，(13)14000转/min离心1分钟，去掉所有乙醇，(14)使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，(15)加入适量的溶液C(约50-60μl)，轻击打管底混匀沉淀，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解，即获得含有外周血细胞DNA的溶液。
具体实施方式三：本实施方式使用实施方式一所述的提取哺乳动物DNA的试剂提取口腔上皮细胞DNA的方法，其步骤如下：(1)在每个标本管中放相应的上皮细胞刷2个，加入900μl细胞混合液，(2)关盖，颠倒混匀7-10分钟，(3)14000转/min离心1分钟，去上清，(4)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(5)每标本管加入20μl溶液A和10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，(6)上下轻混15-20次，使混合充分，(7)56℃水浴2小时～18小时至溶液均匀化，(8)14000转/min离心1分钟，用镊子夹住上皮细胞刷，挤出水分，弃去上皮细胞刷，(9)每标本管加入105μl溶液B，(10)盖上盖子，剧烈摇晃15秒，(11)静置5-7分钟，(12)标本管14000转/min离心1分钟，分界不清，再离心1-3分钟，(13)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清(约400μl)，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)将含上清的管加入800μl浓度为100％乙醇，(15)盖上盖子，轻混至有线状DNA沉淀出现，(16)14000转/min离心1分钟，(17)打开盖，勿扰沉淀，去掉约1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(18)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，洗沉淀，(19)关盖，轻晃管五下，(20)14000转/min离心1分钟，(21)弃约450μl乙醇，使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，(22)加入合适量的溶液C(约50-60μl)，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解即获得含有口腔上皮细胞DNA的溶液。
具体实施方式四：本实施方式使用实施方式一所述的提取DNA的试剂提取哺乳动物羊水培养细胞DNA的方法，其步骤如下：(1)取培养后的羊水弃大部分上清，(2)用细胞挂器挂下细胞，用塑料吸管吸入1.5ml置于离心管中，(3)离心机中14000转/min离心2分钟，弃上清，留约100-200μl，(4)用PBS缓冲液洗细胞沉淀两次，每次加入1ml PBS缓冲液，涡旋混匀，14000转/min离心1分钟，弃上清，(5)加入900μl细胞混合液，(6)关盖，颠倒混匀7-10分钟，14000转/min离心1分钟，去上清，(7)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl溶液A和10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，关盖，上下轻混15-20次，使混合充分，(9)56℃水浴2小时～18小时至溶液均匀化，稍离心，(10)每管加入105μl溶液B，(11)盖上盖子，剧烈摇晃15秒，(12)静置5-7分钟，(13)标本管14000转/min离心1分钟，分界不清，再离心1-3分钟，(14)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清(约400μl)加入第二管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(15)弃去含蛋白沉淀的管，(16)将含上清的管加入800μl浓度为100％乙醇，(17)盖上盖子，轻混至有线状DNA沉淀出现，(18)14000转/min离心1分钟，去掉约1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，洗沉淀，(20)关盖，轻晃管五下，(21)14000转/min离心1分钟，(22)弃450μl乙醇，使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，加入合适量的溶液C(50-60μl)，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解即获得含有羊水培养细胞DNA的溶液。
具体实施方式五：本实施方式使用实施方式一所述的提取DNA的试剂提取哺乳动物绒毛DNA的方法，其步骤如下：(1)取绒毛约5mg在15ml离心管中2000转/min离心5分钟，弃上清，留约1ml，(2)将细胞沉淀吸入1.5ml离心管中，离心机中14000转/min离心2分钟，(3)弃上清，留约100-200μl，(4)加入900μl细胞混和液，(5)关盖，颠倒混匀7-10分钟，(6)14000转/min离心1分钟，(7)加入300μl细胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl溶液A和10μl20mg/ml蛋白酶K，上下轻混15-20次，使混合充分，(9)56℃水浴2小时～18小时至溶液均匀化，稍离心，(10)每管加入105μl溶液B，盖上盖子，剧烈摇晃15秒，(11)静置5-7分钟，(12)标本管14000转/min离心1分钟，如果分界不清，再离心1-3分钟，(13)从标本管中穿过泡沫层，吸出含DNA的上清(400μl)加入另一管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)弃去含蛋白沉淀的管，(15)向含上清的管加入800μl浓度为100％乙醇，(16)盖上盖子，轻混至有线状DNA沉淀出现，(17)14000转/min离心1分钟，(18)去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl浓度为70％乙醇，关盖，轻晃管五下洗沉淀，(20)14000转/min离心1分钟，弃450μl乙醇，(21)吸弃剩余乙醇，使DNA沉淀气干，至沉淀边缘清晰，(22)加入合适量的溶液C(50-60μl)，轻击打管底混匀沉淀，56℃水浴2小时或室温使沉淀溶解即获得含有绒毛DNA的溶液。
Claims (3)
1、一种提取DNA的试剂，其特征在于它由红细胞裂解液、细胞混合液、细胞裂解液、溶液A、溶液B和溶液C成分组成，红细胞裂解液由下列物质按容量制成：10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/L NaCl和超纯水1升；细胞混合液由下列物质按重量或容量制成：8.0g NH4Cl、1.0g EDTA、0.1g KH2PO4和超纯水＞0～＜1升，细胞裂解液由下列物质按容量制成：每升超纯水中含50ml 2mol/L Tris，PH值为7.5，80ml 5mol/L NaCl，4ml 500mmol/LEDTA和超纯水＞0～＜1升；溶液A的制作方法如下：在900ml超纯水中溶解100g SDS，混合均匀，加超纯水至1升混合即可；溶液B的制做方法如下：在含有少量超纯水的容器中加入340.52g NaCl，再加超纯水至1升摇晃混合均匀即可；溶液C的制做方法如下：配制500ml 10∶1 TE，在容器中加入2.5ml 2mol/L TRIS-HCL和1ml 500mmol/L EDTA，加超纯水至500ml混合均匀，高压灭菌即可。
2、根据权利要求1所述的提取DNA的试剂，其特征在于细胞混合液的终浓度为149mmol/L NH4Cl，2.6mmol/L EDTA，0.7mmol/L KH2PO4。
3、根据权利要求1所述的提取DNA的试剂，其特征在于细胞裂解液的终浓度为100mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA。
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2004
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