CN1318430C - 一类稀土配合物及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类可用作抗肿瘤药品的新型稀土配合物，更具体地说，涉及一类稀土配合物及制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明用稀土硝酸盐、邻菲罗啉、5-氟尿嘧啶按1∶2∶3比例，以无水乙醇为溶剂，在80℃、搅拌下反应，生成通式为[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2的一类新型稀土配合物。配合物经体外抗肿瘤活性，急性毒性，小鼠肉瘤S180、小鼠肝癌HAC及荷瘤裸鼠体内抗肿瘤活性等一系列实验，初步证实配合具有制备治疗肿瘤药物的用途。

Description

一类稀土配合物及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一类稀土配合物及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
众所周知；中国是稀土矿藏的贮藏大国，也是稀土化合物的生产大国，每年有大量的初级稀土化合物出口。国内外有相当数量的科学家从事稀土化合物的应用研究，目前稀土化合物在工业、农业、畜牧业、医药业中有广泛用途。研究稀土化合物的新用途对于利用我国丰富的稀土资源、化资源优势为经济优势有相当重要的意义！从化学角度看，稀土元素包括钪、钇和镧系共16个元素，由于它们离子电荷相同、半径接近，所以性质非常相似。
随着人类生存环境的日益恶化，肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，也成为危害人类生命与健康的第二大因素。尽管目前抗肿瘤药物很多，但多存在毒副作用大、价格昂贵等缺点。稀土元素在人体内与体内各种生物大分子以配合物的形式结合，可对多种酶的活性产生影响(谭钦德.生物无机化学导论.广东高等教育出版社.1993)。日本科学家将铈、铥、镥配合物瞄准艾滋病毒和癌等目标的基因并将其剪断，研究用稀土配合物治疗艾滋病和癌症(熊钧.稀土.1993，14(4)；71)。王刚等用缬氨酸-N-荒氨酸镍与稀土配合物进行抗癌性研究(王刚等.兰州大学学报(自然科学版).1995，31(4)；194-196)。稀土配合物作为无机抗肿瘤药物的前景十分广阔。
技术内容及其它
本发明的目的在于提供一类稀土配合物及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用。
一类稀土配合物硝酸-硝酸根·二(邻菲罗啉)·三(5-氟尿嘧啶)合稀土(III)的制备方法，其特征在于用摩尔比为1∶2∶4的稀土硝酸盐、邻菲罗啉、5-氟尿嘧啶在无水乙醇中，在加热到80℃并搅拌下进行反应。
本发明的一类稀土配合物硝酸-硝酸根·二(邻菲罗啉)·三(5-氟尿嘧啶)合稀土(III)的制备方法就是；
先将稀土硝酸盐、5-氟尿嘧啶按1∶4摩尔比放入无水乙醇中，在加热到80℃并搅拌下让其溶解完全，再加入2摩尔比的邻菲罗啉(先用无水乙醇溶解或用固体均可)。很快就有沉淀生成，让反应在上述条件下进行3-5小时。停止反应后将反应器置于冰箱中放置10小时左右，取出过滤后用无水乙醇洗涤2-3次，干燥后得产品稀土配合物硝酸-硝酸根·二(邻菲罗啉)·三(5-氟尿嘧啶)合稀土(III)。化学反应方程式如下：
总共合成了七种稀土配合物，即钇(Y)、镧(La)、铈(Ce)、钐(Sm)、钆(Gd)、镝(Dy)、铒(Er)配合物。用EDTA直接滴定法测定了产品的稀土百分含量；用DDS-11A型电导率仪测定七种稀土配合物在水中的电导率；由中科院昆明植物研究所用PE-240C型元素分析仪测定七种稀土配合物的碳、氢、氮百分含量。上述实验数据与按[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2理论值对比如表1。由中科院昆明植物研究所用Bio-Rad FTS-135型富利叶红外光谱仪测定了钇、钐、镝配合物的红外光谱图；由昆明贵金属研究所用NICOLET FT-IR型富利叶红外光谱仪测定了镧、铈、钆、饵配合物的红外光谱图。
由云南师大分析测试中心用日本岛津热分析仪对七种稀土配合物进行了热分析，表2列出热分析结果。由中科院昆明植物研究所用DRX-500型核磁共振仪测定了钆配合物的核磁共振谱。
表1  七种稀土配合物的稀土、碳、氢、氮百分含量，电导率
配合物 钇配合物     镧配合物     铈配合物     钐配合物     钆配合物     镝配合物     铒配合物
稀土％理论值测定值碳％理论值测定值氢％理论值测定值氮％理论值测定值电导率(MC/cm.mmol) 8.678.4042.1640.132.452.4017.7517.66268.7     12.9112.8340.2039.522.372.2316.9217.40306.7     13.0113.2240.1540.522.372.1716.9016.85293.6     13.8413.3339.7839.222.312.4016.7617.08267.6     14.3814.7539.5239.292.302.2716.6417.12242.4     14.78141.4739.3439.112.292.2816.5616.91239.8     15.1515.2539.1737.172.282.2216.4916.00242.1
如表1中电导率可知七种稀土配合物的电导率在239.8-306.7之间，即在235-273之间或接近于273，均可认为七种稀土配合物属1∶2型配合物；由七种稀土配合物的稀土、碳、氢、氮百分含量理论值与测定值对比，可初步认为配合物分子式为[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2。
表2  七种稀土配合物的热分析结果
配合物 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 铒配合物
取样量(mg)一次分解温度(℃)一次失重(％) 5.7237-25235.08 5.7228-24323.66 5.3238-25237.74 4.72236-25436.94 5.39244-25933.63 6.01236-25535.86 5.52236-25026.04
一次分解热峰值(℃)二次分解温度(℃)二次失重(％)二次分解热峰值(℃)最终温度(℃)失重总量(％) 252.1252-6704 8.50594.180085.82 245.4245-51458.24492.794983.73 250.9252-56343.62462.079883.72 251.1254-55347.67543.788885.80   259.9259-57242.88527.2798.176.53   251.9255-61043.66559.7888.379.55  250.0250-62748.68586.079874.72
配合物的热分析表明；七种稀土配合物在228-244℃开始分解，798-940℃分解趋于完全，最终残渣为Ln2O3。差热曲线上245-259℃和462-594℃左右有两个较大的放热峰。可认为七种稀土配合物为配合物而非混合物。
图1为钇配合物的红外光谱图。
图2为镧配合物的红外光谱图。
图3为铈配合物的红外光谱图。
图4为钐配合物的红外光谱图。
图5为钆配合物的红外光谱图。
图6为镝配合物的红外光谱图。
图7为饵配合物的红外光谱图。
图8为钆配合物、5-氟尿嘧啶、邻菲罗啉的13C核磁共振光谱图。
附图说明1：由附图1-7可总结出表3。
表3  七种稀土配合物的红外光谱
基团 配体、中心离子 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 铒配合物
VC2＝OVC4＝O+vC-CvC＝NvC＝CvN＝ONO3配位vNO2配位vNO2配位vNO末配位σC～H(面外)vLn～O 1730(5-Fu)1675(5-Fu)1605(Phen)1545(Phen)851(Phen)739(Phen) 17121666159315081486132010331383843726419 17121685159215181483129810301384847731409 17121680159215171492129610291384845731416 17221660159115011451130510301383843726417 1711168515931490130910321384845726418 17211663159215081489131810331383843727419 1711168615931491132210351384845728416
由表中数据可知：七种稀土配合物的红外光谱是相似的。三种配体的特征吸收峰在谱图中明显可见，其中有的吸收峰的位置和强度发生了变化，同时谱图中还出现了新的吸收峰，说明稀土离子与三种配体间确实发生了相互作用。5-氟尿嘧啶的VC2＝O和VC1＝O+vC-C峰在配合物中都发生了红移，4-酮基位移较大，很可能与稀土离子配位的是4-酮基上的氧。邻菲罗啉的σC～H(面外)、vC＝N、vC＝C都发生了红移，表明其两个氮原子参与配位。在配合物谱图中还出现了表明硝酸根配位的三个吸收峰，另外在配合物谱图中在415cm1附近出现了配体没有的新吸收峰，可归属为vLn～O。
附图说明2：由附图8(c)可知，由于分子的对称性，邻菲罗啉的12个碳原子有6条谱线。在配合物中邻菲罗啉6条谱线的化学位移略有变化，可认为邻菲罗啉的两个氮原子与稀土离子配位所引起。附图8(b)中谱线可依据13C-19F之间的偶合来归属；C4＝O中的C1与F原子二键偶合，在图上以δ＝157.99为中心的二重峰，2JCF＝25.74Hz，处于最低场；C2＝O中的C2表现为单峰，δ＝150.12；C5与F原子直接相连，在图上以δ＝139.90为中心的二重峰，2JCF＝27.46Hz；C6在最高场，在图上以δ＝126.27为中心的二重峰，1JCF＝31.85Hz。而在配合物中，C1峰向高场移动，由于不存在NOF效应，报据各个碳峰强度大小的比较，可能移至δ＝123.46与邻菲罗啉的C3-C8的谱线重合，化学位移减小了34.53ppm，这是由于C4＝O同钆离子配位所致，由于氧原子配位，C1＝O具有部分单键的特征，C4上的电子密度增大，C1原子屏蔽增加，化学位移向高场移动，这与红外光谱分析是一致的。5-氟尿嘧啶其余峰的化学位移在配合物中变化不大，C2峰与邻菲罗啉的C2-C4峰重合，C6峰与邻菲罗啉的C5-C6峰重合。
本发明的目的还在于将此类稀土配合物作为一类治疗肿瘤有效、低毒而价廉的新药品。
本发明用此类稀土配合物研究其体外抗肿瘤活性、急性毒性、小鼠体内抗肿瘤活性、人胃癌裸鼠移植瘤体内抗肿瘤活性。现分述如下：
一、稀土配合物和配体5-氟尿嘧啶的体外抗肿瘤活性
(一)实验材料
1.测试样品：镧、铈、钇、钐、镝、铒、钆七个稀土配合物，其分子量见表1。
表4  7种稀土配合物名称及分子量
配合物 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 铒配合物
分子量 1025.5 1075.5 1076.6 1087.0 1093.9 1099.1 1103.9
7种稀土配合物用生理盐水配成102mol/L，然后，再用生理盐水将受试药稀释成103、104、105、106、107mol/L五个浓度。45℃水浴加热，溶解充分。5-氟尿嘧啶用生理盐水配制为103mol/L后，用生理盐水稀释成101、105、106、107mol/L五个浓度，所有样品均溶解充分，未见析出。
2.细胞株
K562(人粒细胞白血病细胞株)，CA(人肝癌细胞株)，SGC-7901(人胃癌细胞株)，HCT(人结肠癌细胞株)，GLC-82(人肺癌细胞株)。
(二)实验方法
1.改良MTT法
将备用的K562细胞悬液接种于96孔板，90μl/孔。加完细胞后直接加入受试样品，每孔10μl。阴性对照为等体积的生理盐水，阳性对照为5-氟尿嘧啶。各加药组及对照组均设4个平行孔，每块板设12个调零孔(只加完全培养基)。受试样品的终浓度为101、105、106、107、108mol/L：5-氟尿嘧啶的终浓度为101、105、106、107、108mol/L。细胞在37℃，5％CO2培养箱中分别孵育48h后，分别加入MTT 5mg/ml，10μl/孔。继续培养4h后，加入三联液[10％SDS-5％异丁醇-0.012ml/LHCL(w/v/v)]，100μl/孔，37℃放置12小时后，用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各孔的OD值(周建军，1993)。
2.SRB法
将备用的CA、SGC-7901、HCT、GLC-82细胞悬液加入96孔板中，90μl/孔。细胞在培养箱中培养4h后加入不同浓度的待测样品，每孔10μl。阴性对照为等体积的生理盐水，阳性对照为5-氟尿嘧啶。加药组及对照组均设4个平行孔。每块板设12个调零孔(只加培养基)。样品及阳性对照的终浓度为104，105，106，107，108M。在37℃，5％CO2培养籍中分别孵育72h后，分别加入4℃、50％的TCA(三氯乙酸)50μl/孔，加完TCA后，将96孔培养板置于4℃孵育1小时，取出培养板，轻轻倾去板内液体。用自来水轻轻冲洗5遍(将自来水由烧杯中轻轻倒入板中，轻晃后，再将水倒去)。置于空气中风干至不见水痕。然后加入配制好的0.4％SRB(用1％乙酸稀释)，50μl/孔，于室温下静置染色30分钟后，倾去SRB溶液，用1％乙酸冲洗4遍，以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风干至无水痕后，加入10mM未缓冲Tris溶液150μl/孔(PH＝10，用三蒸水配制)，将染料溶解后，振荡器上振荡5分钟，用570nm波长读取各孔OD值。
3.数据处理
细胞存活率＝加药孔的OD值/阴性对照孔的OD值；细胞抑制率＝100％-细胞存活率。用GWBASIC软件计算各受试药的IC50及IC5095％的可信区间(徐端正.生物统计在药理学中的应用.科学出版社.1986，p81-83)。
(三)实验结果
7种稀土配合物对K562、CA、GLC-82、SGC-7901、HCT细胞增殖的影响结果见表5-9
表5  7种稀土配合物对K562细胞增殖的IC50值
配合物 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 铒配合物 5-氟尿嘧啶
IC50(M)IC50(μg/ml) 6.80×1090.008 8.63×1080.11 2.85×1063.91 4.99×10-65.25 3.64×10-64.80 5.85×1066.81 2.05×1070.26 3.92×1085.10
表6  7种稀土配合物对CA细胞增殖的IC50值
配合物 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 铒配合物 5-氟尿嘧啶
IC50(M) 1.66×10-7 4.53×10-7 1.56×10-7 8.38×10-8 3.03×107 5.92×107 3.53×108 6.76×106
IC50(μg/ml)   0.20   0.57     0.21     0.08     0.40     0.69     0.204  0.88
表7  7种稀土配合物对SGC-7901细胞增殖的IC50值
配合物 钇配合物  镧配合物 铈配合物  钐配合物  钆配合物  镝配合物 铒配合物 5-氟尿嘧啶
IC50(M)IC50(μg/ml) 7.83×1080.09  9.06×1080.11 5.76×1070.79  3.44×1070.36  3.34×1080.44  5.04×1080.06 1.16×1070.15 4.74×1060.62
表8  7种稀土配合物对HCT细胞增殖的IC50值
配合物 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 铒配合物 5-氟尿嘧啶
IC50(M)IC50(μg/ml) 3.70×1090.004 6.37×1090.008 4.89×1090.007 2.42×1070.25 2.25×1080.03 7.83×1080.09 1.55×1080.02 4.77×1060.006
表9  7种稀土配合物对GLC-82细胞增殖的IC50值
配合物 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 饵配合物 5-氟尿嘧啶
IC50(M)IC50(μg/ml) 3.05×1080.04 9.12×1080.11 3.26×1080.04 4.27×1080.04 1.76×1080.02 4.29×1080.05 5.70×1080.07 9.37×1070.12
由表4-8可知：七种稀土配合物在受试浓度(108～104M)对K562、CA、SGC-7901、HCT、GLC-82细胞株增殖的IC50值均＜7μg/ml，按照化合物IC50＜10μg/ml即认为对肿瘤细胞的增殖有一定的抑制作用(新药(西药)临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993：p137-139)，可认为七种稀土配合物对K562、CA、SGC-7901、HCT、GLC-82细胞株增殖有较强的抑制作用；而其中七种稀土配合物对CA、SGC-7901、HCT、GLC-82细胞株增殖的IC50值＜1μg/ml，可认为七种稀土配合物对CA、SGC-7901、HCT、GLC-82细胞株增殖有很强的抑制作用。
二、稀土配合物和配体5-氟尿嘧啶的急性毒性
(一)实验材料
1.动物
健康正常的ICR小鼠，体重18-22克，雌雄各半，由昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室动物室提供。
2.受试药品
七种稀土配合物及5-氟尿嘧啶用无菌生理盐水配制成所需浓度，按0.2ml/10g体重注射。
(二)实验方法
将体重18-22克的ICR小鼠(雌雄各半)禁食6小时后称重，根据预实验结果，随机分为4-6组，每组10只，分别按0.2ml/10g体重进行腹腔注射给药，给药后观察至第14天后处死小鼠。观察指标主要有小鼠的死亡、中枢神经、植物神经、呼吸、胃肠、心血管、生殖、皮肤、毛发等反应。
(三)实验结果
1.动物死亡情况
①死亡时间：详见表10
表10七种稀土配合物致小鼠死亡时间
样品 钇配合物 镧配合物 铈配合物 钐配合物 钆配合物 镝配合物 饵配合物   5-FU
最早死亡时间最晚死亡时间 2天5天 5分钟10分钟 10分钟13天 15分钟2小时 40分钟10天 15分钟9天 5分钟11天   5天12天
②死亡动物解剖：皮肤粘膜、心、肝、肺、脾、肠均未见肉眼可见病变，无胃肠胀气。
③中毒表现：呼吸急促，瘫软无力，活动减少、精神差、嗜睡、站立不稳，其中雄鼠睾丸肿胀。
④死亡统计结果：见表11-18
表11  钇配合物急性毒性的动物死亡情况统计
    试药浓度mg/ml 试药剂量mg/kg 受试动物数(只) 死亡动物数(只) 存活动物数(只)
    8.57.26.125.224.44 170144122.4104.488.8 1010101010 53100 5791010
表12  镧配合物急性毒性的动物死亡情况统计(经腹腔注射给药组)
    有效量mg/kg     对数剂量X     动物数n     死亡率 其它中间数据
p p2
    204142.810070     2.30962.15472.001.8451     10101010     0.90.100     0.810.0100 Xm＝2.3096i＝0.1549
∑p＝1.0   ∑p2＝0.82
注：表11中LD50的计算方法为LD50的综合计算方法。
表13  铈配合物急性毒性的动物死亡情况统计
试药浓度mg/ml 试药剂量mg/kg 受试动物数(只) 死亡动物数(只) 存活动物数(只)
86.45.12 160128102.4 101010 101010 000
    4.103.28     8265.6     1010     75     35
表14  钐配合物急性毒性的动物死亡情况统计
试药浓度(mg/ml) 试药剂量(mg/kg) 受试动物数(只) 死亡动物数(只) 存活动物数(只)
107.86.084.74 200156121.694.8 10101010 6200 481010
表15  钆配合物急性毒性的动物死亡情况统计
试药浓度(mg/ml) 试药剂量(mg/kg) 受试动物数(只) 死亡动物数(只) 存活动物数(只)
11.4385.63.92 228.616011278.4 10101010 7310 37910
表16  镝配合物急性毒性的动物死亡情况统计
试药浓度(mg/ml) 试药剂量(mg/kg) 受试动物数(只) 死亡动物数(只) 存活动物数(只)
1410.57.885.91 280210157.611 8.2 10101010 101060 00410
表17  铒配合物急性毒性的动物死亡情况统计
试药浓度(mg/ml) 试药剂量(mg/kg) 受试动物数(只) 死亡动物数(只) 存活动物数(只)
11.4385.63.92 228.61601127 8.4 10101010 8560 25410
表18  5-FU急性毒性的动物死亡情况统计
   剂量g/kg 对数剂量(X) 动物数(只) 动物死亡数(只) 死亡率(％) 儿率单位(Y)
    0.5200.3640.255 2.722.562.41 101010 10106 10010060 7.7657.0755.173
    0.1780.1250.087     2.252.101.94     101010     530     50300     5.0004.5342.811
2.存活动物情况：存活动物五官未观察到异常分泌物，动物粪便未见异常。
3.LD50、LD10的计算用改进的BIiss法(机率单位加权回归法)程序进行计算。
(四)结论：
经计算7种稀土配合物的LD50和LD10及其95％可信范围，见表19。
表19  七种稀土配合物的LD50和LD10及其95％可信范围
    LD10     LD50
    LD10(mg/kg)     95％可信范围     LD50(mg/kg)   95％可信范围
  钇配合物     111.70     89.04-140.12     185.74   149.16-231.30
  镧配合物     129.68     105.78-158.98     170.30   149.57-193.90
  铈配合物     33.49     18.17-61.72     59.95   46.94-76.55
  钐配合物     123.47     92.05-165.60     203.23   167.87-246.03
  钆配合物     96.91     64.95-144.60     201.31   155.80-260.10
  镝配合物     100.31     80.06-125.68     146.39   127.97-167.46
  铒配合物     50.09     25.66-97.78     143.38   108.07-190.23
   5-氟尿嘧啶     93.59     65.59-133.23     183.08   149.52-224.16
从以上结果可以看出七种稀土配合物与5-氟尿嘧啶相比，LD50大于5-氟尿嘧啶的有三个(钇、钐、钆)；LD10大于5-氟尿嘧啶的有五个(镧、钇、钐、镝、钆)，表明稀土配合物药物的毒性明显降低，安全范围有所扩大。
三、稀土配合物和配体5-氟尿嘧啶的体内抗肿瘤活性
(一)实验材料
1.实验动物
ICR小鼠动物，18～22克，清洁级，由云南省天然药物药理重点实验室动室提供，合格证号：云动管字第0001486号。
2.肿瘤细胞株
小鼠肉瘤细胞株(S180)和小鼠肝癌(HAC)，从上海药物研究所引种后本室传代保存。
3.主要试剂与设备
5-氟尿嘧啶：由上海华联制药公司生产。
0.9％生理盐水注射液(0.9％NS)，云南昆明南疆制药厂生产，批号20011101
(二)实验方法
1.样品的配制
称取适量的5-氟尿嘧啶，用无菌的0.9％生理盐水，90℃助溶，配制为需要的浓度；称取适量的七种稀土配合物，用无菌的0.9％生理盐水，90℃助溶，配制为需要的浓度(1/4的LD10)，样品溶解良好，未见析出。
2.七种稀土配合物体内抗肿瘤活性及对荷肉瘤(S180)、肝癌(HAC)小鼠的毒性
用接种肉瘤细胞株(S180)和肝癌(HAC)后6～7天，肿瘤生长良好的小鼠，取其瘤细胞用无菌的0.9％生理盐水调成8×106个细胞/ml浓度的瘤细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下(0.2ml/每只)经腹腔注射(i.p)按0.1ml/10g体重给药，连续给药七天，停药后24小时处死动物，称体重、瘤重、肝重、脾重、肾重及胸腺重(新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993)。
(三)结果处理
肿瘤抑制率(％)＝(阴性对照平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对照平均瘤重×100％
数据处理：用华西医科大学扬树勤教授主编的《中国医学百科全书.医学统计学》(第二版)统计软件包中方差分析比较各组结果。
(四)结果
1.七种稀上配合物对小鼠肉瘤(S180)、小鼠肝癌(HAC)生长的影响
根据七种稀土配合物和5-氟尿嘧啶的急性毒性实验结果，采用七种稀土配合物及5-氟尿嘧啶剂量为1/4 LD10给药浓度，对七种稀土配合物及5-氟尿嘧啶进行了小鼠肉瘤(S180)、肝癌(HAC)腹腔注射的抗肿瘤实验，实验结果见表20、21。
表20七种稀土配合物对小鼠肉瘤细胞株(S180)生长的影响
样品   剂量g.kg1/d 动物数   实验前后体重     瘤重(克)
开始 最后   体重差(X±s) 抑制率(％)     (X±s) 抑制率(％)
  0.9％NS5-氟尿嘧啶钇配合物镧配合物铈配合物钐配合物钆配合物镝配合物   ---0.02340.280.3260.01580.0310.0250.025 2010101010101010 16101089101010   4.22±2.430.5±1.68*2.46±3.06*3.83±1.95*1.10±3.49*0.55±2.70*0.15±2.36*0.53±2.39* ---48.816.518.715.99.2819.6517.95     1.43±0.780.56±0.27#0.66±0.32#1.49±0.40#0.59±0.20#0.35±0.22#0.45±0.23##0.35±0.21### ---69.179.4269.7761.6378.7968.7545.9
饵配合物   0.024     10     10     1.16±2.37*     16.07     0.53±0.36#     67.88
注：与阴性对照组比*p＜0.01
与阳性对照组比#p＜0.05##p＜0.01###p＜0.05
表21  七种稀土配合物对小鼠肝癌(HAC)生长的影响
样品  剂量g.kg1/d 动物数     实验前后体重     瘤重(克)
开始   最后     体重差(X±s) 抑制率(％)     (X±s) 抑制率(％)
0.9％NS5-氟尿嘧啶钇配合物镧配合物铈配合物钐配合物钆配合物镝配合物铒配合物  ---0.02340.280.3260.01580.0310.0250.0250.024 201010101010101010   19101091010101010     4.16±2.430.5±1.68*1.59±3.06*2.21±1.95*2.52±3.49*1.93±2.70*2.21±2.36*3.32±2.39*3.09±2.37* ---48.817.119.514.69.7523.1721.9513.0     1.81±0.40#0.56±0.27#0.66±0.32#1.07±0.24#0.59±0.20#0.56±0.24#0.64±0.13##0.98±0.47###0.91±0.32# ---69.163.640.967.468.864.445.949.2
注：与阴性对照组比*p＜0.01
与阳性对照组比#p＜0.05##p＜0.01###p＜0.05
由表20、21可见，与阴性对照组0.9％NS相比，七种稀土配合物对小鼠肉瘤(S180)生长的抑制率为45.9～79.4％(p＜0.01)：对小鼠肝癌(HAC)生长的抑制率为40.9～68.8％(p＜0.01)。其中铈、钇、钐、钆四种配合物的抑制率均大于60％，与阳性对照组的抑制率相近；镧、镝、铒三个配合物的抑制率在40～50％之间。铈、钇、钐、铒、钆五个配合物对小鼠肝癌生长的抑制率与阳性对照组5-氟尿嘧啶在统计学上无显著性差异。
2.七种稀土配合物对荷瘤小鼠多个脏器的影响
在浓度为1/4LD10时，七种稀土配合物及5-氟尿嘧啶对荷肝癌小鼠肝脏、脾脏、肾脏及胸腺重量的影响详见表22、23。
表22  七种稀土配合物对荷瘤小鼠肝脏和脾脏重量的影响
样品 剂量g.kg1/d 动物数   肝重(克)     脾重(克)
开始 最后   X±SD 抑制率(％)     X±SD 抑制率(％)
0.9％NS5-氟尿嘧啶钇配合物 ---0.02340.28 201010 191010   1.77±0.321.43±0.18*1.66±0.23 ---19.26.78     0.41±0.130.21±0.08*0.34±0.13 ---48.817.1
镧配合物铈配合物钐配合物钆配合物镝配合物饵配合物  0.3260.01580.0310.0250.0250.024     101010101010   91010101010     1.55±0.231.63±0.261.65±0.301.55±0.191.60±0.231.47±0.31**     12.47.916.7812.49.6016.9     0.33±0.130.35±0.0980.37±0.120.32±0.0810.32±0.0820.36±0.13     19.514.69.7523.1721.9513.0
注：与阴性对照组比*p＜0.01 **p＜0.05
表23  七种稀土配合物对荷瘤小鼠胸腺和肾脏重量的影响
样品 剂量g.kg1/d   动物数   胸腺(克)     肾重(克)
  开始 最后   X±SD   抑制率(％)     X±SD 抑制率(％)
0.9％NS5-氟尿嘧啶钇配合物镧配合物铈配合物钐配合物钆配合物镝配合物饵配合物 ---0.02340.280.3260.01580.0310.0250.0250.024   201010101010101010 19101091010101010   0.06±0.020.027±0.009*0.048±0.0180.033±0.011**0.036±0.02**0.046±0.0170.047±0.0120.049±0.0260.032±0.014   ---55.020.045.040.023.318.321.746.7     0.29±0.0480.28±0.0340.30±0.0380.271±0.0450.27±0.0200.31±0.0520.31±0.0340.31±0.0470.27±0.056 ---3.4506.556.900006.89
注；与阴性对照组比*p＜0.01** p＜0.05
由表22、23可见，与阴性对照组(0.9％NS)相比，七种稀土配合物可使小鼠肝脏重量减轻6.8～16.9％，但在统计学上无显著差异(p＞0.05)；而配体5-氟尿嘧啶可使小鼠肝脏重量减轻19.2％，有显著差异(p＜0.01)。
七种稀土配合物可使小鼠脾脏重量减轻9.8～23.2％，但在统计学上无显著差异(p＞0.05)，而5-氟尿嘧啶可使小鼠脾脏重量减轻48.8％，有显著差异(p＜0.01)。
七种稀土配合物使小鼠胸腺重量减轻18.3～46.7％，但铈、钇、钐、镝、钆等五个配合物在统计学上无显著差异(p＞0.05)，而5-氟尿嘧啶使小鼠胸腺重量减轻为55.0％，有显著差异(p＜0.01)。
七种稀土配合物使小鼠肾脏重量减轻0.0～6.9％，在统计学上无显著差异(p＞0.05)，5-氟尿嘧啶使小鼠肾脏重量减轻3.5％，在统计学上无显著差异(p＞0.05)。
(五)结论
七种稀土配合物在剂量为1/4LD10时，对荷肝癌(HAC)小鼠经腹腔注射给药。七种稀土配合物及5-氟尿嘧啶对肿瘤生长的抑制率在40.9～69.1％，与阴性对照组(0，9％N.S)相比有显著性差异(p＜0.01)：与5-氟尿嘧啶相比，铈、钌、钐、镝、钆等五个稀土配合物对肿瘤生长的抑制率无显著性差异(p＞0.05)。上述结果表明，在1/4LD10剂量时，七种稀土配合物对小鼠肝癌(HAC)生长具有显著的抑制作用，且铈、钇、钐、镝、钆五种稀土配合物对小鼠肝癌(HAC)生长的抑制作用与5-氟尿嘧啶相近(p＞0.05)。
研究还表明，七种稀上配合物对小鼠肝癌(HAC)的体内生长均具有明显抑制作用，并且对各脏器重量减轻的影响均比5-氟尿嘧啶小，表明它们的毒性比5-氟尿嘧啶小。其中钐、钆的抗癌活性与5-氟尿嘧啶相当，而毒性小于5-氟尿嘧啶。此外钇、铈的活性也与5-氟尿嘧啶相当，而毒性较小。
*得到七种稀土配合物对小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC的ED50值，结合七种稀土配合物的急性毒性LD50值，计算出七种稀土配合物对小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC的治疗指数TI值(TI＝LD50/ED50)，见表24：
表24  七种稀土配合物对小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC的治疗指数Tl值
样品   S180 HAC
  LD10(mg/Kg) ED50(mg/Kg)     TI LD50(mg/Kg) ED50(mg/Kg)     TI
  钇配合物镧配合物铈配合物钐配合物钆配合物镝配合物饵配合物   185.74170.7592.31203.23204.57146.39171.49 27.8518.6624.4027.8125.4519.4825.87     6.679.153.787.318.047.516.63 185.74170.7592.31203.23204.57146.39171.49 24.0729.2623.9626.7232.4040.5128.93     7.725.843.857.606.313.615.93
由表中TI值可知钆、钇、钐、镧配合物对小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC有较强的抑制作用和较安全，综合其它因素从中选出钇、钐配合物作为下一步研究样品。
四、稀土配合物在荷瘤裸鼠体内的抗瘤效应
(一)材料与方法
1样品：钇、钐配合物
2动物：BalB/C，nu/nu裸鼠，购自中科院上海药物所，鼠7-8周，体重18～20g，雌性，共30只。
3瘤种：人胃癌BGC-823细胞株为从中国科学院上海药物所引种后，在我室长期传代保存。
4样品溶液的配制：称取一定量样品，加入生理盐水，干80℃水浴加热助溶1-1.5小时，此为高剂量。再取高剂量溶液的1/2，加入相同体积的生理盐水，即为低剂量。
5给药方案及给药次数
1)钇、钐配合物的动物给药剂量：依据其LD10值，以1/2 LD10为高剂量，1/4 LD10为低剂量，具体数据为：钇配合物，高剂量浓度为56mg/Kg，低剂量浓度为28mg/Kg；钐配合物，高剂量浓度为62mg/Kg，低剂量浓度为31mg/Kg。
2)阳性对照药：5-氟尿嘧啶，上海旭东海普药业有限公司(0.25g/10ml)，批号：010403。
3)阴性对照药：生理盐水，昆明南疆制药厂，批号：200209091。
5-氟尿嘧啶、生理盐水及样品均经腹腔注射(i.p)，按0.1ml/10g体重给药，每周3次。
6实验方法：
a细胞悬液接种法：将体外培养的BGC-823细胞悬液接种于2只裸鼠右背部皮下，每只0.2mL。观察裸鼠接种肿瘤细胞后，肿瘤形成情况。待肿瘤长出后，传代。
b初代移植；当接种的人胃癌组织长出2周时，在严格无菌条件下，取得瘤块，置于RPMI1640培养基中，用剪子剪成1mm×1mm×1mm大小的肿瘤组织块。用组织匀浆器将肿瘤组织磨碎，过200目尼龙网，制成细胞悬液。用1ml注射器将细胞悬液接种于2只裸鼠右背部皮下，每只0.2mL传代移植；
c传代移植：当接种的初代移植人胃癌组织长出2周时，按初代移植的方法再传两代。
d分组：将第三代的人胃癌组织按初代移植的方法接种于30只裸鼠背部皮下，10～16天有肿瘤生长出来。待其肿瘤长至30～100mm3时，按瘤大小将其分为6组：阳性对照组(氟尿嘧啶组)、阴性对照组(生理盐水组)、钇高剂量组、钇低剂量组、钐高剂量组、钐低剂量组。每周2，4，7给药，连续给药4周。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重。
7结果处理：
计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率后用(医百医统·统计软件包)(PEMS)中的方差分析进行统计学处理。
肿瘤抑制率(％)＝(空白对照平均瘤重-治疗组平均瘤重)/空白对照平均瘤重×100％
(二)结果
钇配合物对人胃癌(GBC-823)生长的抑制作用见表25；钐配合物对人胃癌(GBC-823)生长的抑制作用见表26。
表25  钇配合物对人胃癌(BGC-823)生长的抑制作用
分组     动物数     平均体重(克)     瘤重(克)X±SD 抑制率(％)
开始 结束     开始     最后
    N.S阴性对照组氟尿嘧啶阳性对照组钇高剂量组钇低剂量组 5555 5555     18.718.918.718.2     18.018.518.420.5     1.09±0.180.11±0.04*0.09±0.04*0.13±0.08* ～69.7271.5666.06
注；*，与N.S阴性对照组相比较，p＜0.01
表  26钐配合物对人胃癌(BGC-823)生长的抑制作用
分组   动物数 平均体重(克)     瘤重(克)X±SD     抑制率(％)
  开始   结束 开始 最后
  N.S阴性对照组氟尿嘧啶阳性对照组钐高剂量组钐低剂量组   5555   5555 18.718.918.318.8 18.018.518.918.4     1.09±0.180.11±0.04*0.07±0.03*0.29±0.15*     ～69.7280.7464.22
注；*，与N.S阴性对照组相比较，p＜0.01
(三)结论：
由上述结果可以看出，钇、钐配合物对荷人胃癌(BGC-823)裸鼠移植瘤的生长有较强的抑制作用。
本发明的有益效果在于利用我国丰富的稀土资源，合成了一类新型的，具有抗肿瘤活性的稀土配合物[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2。
本发明的另一个有益效果在于上述研究表明：此类稀土配合物在上述实验条件下，与配体5-氟尿嘧啶相比抗肿瘤活性更高而且更为安全。

Claims (3)

1一类稀土配合物，其特征在于配合物是硝酸-硝酸根·二(邻菲罗啉)·三(5-氟尿嘧啶)合稀土(III)，其分子通式为[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2。
2.一类稀土配合物硝酸-硝酸根·二(邻菲罗啉)·三(5-氟尿嘧啶)合稀土(III)的制备方法，其特征在于用摩尔比为1∶2∶3的稀土硝酸盐、邻菲罗啉、5-氟尿嘧啶在无水乙醇中，在加热到80℃并搅拌下进行反应。
3.一类稀土配合物硝酸-硝酸根·二(邻菲罗啉)·三(5-氟尿嘧啶)合稀土(III)，在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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