CN1307131A

CN1307131A - 用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法及其用途

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Publication number: CN1307131A
Application number: CN 00112055
Authority: CN
Inventors: 沈树宝; 胡永红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-01-26
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2001-08-08
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: CN1163598C

Abstract

本发明用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法及其用途涉及的是一种生物催化剂包括酶及微生物细胞的固定化新方法及其用途。其方法为:将动物肠衣进行碱、酸及有机溶剂清洗,对于固定化生物催化剂尺寸较小的生物催化剂进行絮凝,将生物催化剂装入上述清洗处理过的动物肠衣膜,封口制成动物肠衣膜固定化组件。本发明方法可用于游离酶、细胞的固定化,多酶体系、辅酶体系、酶催化激活因子协同固定化以及动、物细胞的培养。

Description

用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法及其用途

本发明用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法及其用途涉及的是一种生物催化剂包括酶及微生物细胞的固定化新方法及其用途，属生物工程领域。

酶与细胞固定化就是将具有化学催化活性的蛋白质固定及定位于一定的空间范围内，实现催化反应。由于它有反应后易于将底物与产物分开，稳定性提高，可反复使用及连续化操作和反应所需空间小等显著优点，从而与游离酶及细胞相比可大大降低生产成本，提高单位生物反应器体积的生产能力。六十年代以后，国内外都投入了大量人力、物力、财力，对此进行研究，成为当今生物工程的关键技术之一。目前发展的固定化方法主要包括：吸附法、包埋法、交联法、化学共价法、徽囊化法、絮凝法等。各种方法各有优缺点，从中还不能找出一种较为普适的固定化方法，已有的固定化方法不是产生固定化后生物催化活性损失大，再生困难等缺点，就是产生生物催化剂易泄漏、脱落或制备困难，固定化费用高的缺点。

近年来，国内外越来越对用膜将酶或细胞限制在一定范围内形成膜截留固定化法给予极大重视。由于其较好地综合了上述各种固定化方法的优点，改进了上述各种方法的许多不足，而且操作比较简单，可以建立数学模型进行计算及选择不同截留分子量膜，以适应不同底物与产物的要求，当酶或细胞失活以后，更新容易。但近年来发展的膜截留固定化方法也还存在以下几个主要问题：

A．pH适用范围较窄，一般有机高分子膜适用pH为3～12，较多应用的中空纤维膜适用pH为4～8，因此，这类膜不能耐受强酸、强碱，从而限制了其使用范围及给膜的清洗带来困难。

B．一般有机膜亦不能耐受很高的温度，使用温度正常不超过50℃。

C．一些有机膜在生物催化剂存在的情况下会发生生物降解，有机膜溶胀性差，在细胞增殖过程中易发生破裂。

D．对无机陶瓷膜而言，以氧化铝为基质，pH应用范围也较窄，而总的说来，无机膜价格较贵，且其生物相容性很差，难以适合生物物质正常生长及代谢的需求。

本发明的目的是针对上述生物催化剂固定化方法存在不足之处，提供一种用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法及其用途。采用动物(猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等)肠衣膜，对生物催化剂(包括酶及细胞)来进行固定化，由于用动物(猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等)肠衣膜，因而它具有非常好的生物相容性，也具有比有机高分子膜更耐酸、碱，耐有机溶剂，耐温等更优的性能，比有机高分子膜更难生物降解。而且动物(猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等)肠衣膜原料来源广，价格低廉，可广泛应用于各种分子大小生物催化剂的固定化。

用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法及其用途是采取以下方案实现的：动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法是采用动物肠衣膜作为膜截留固定化的载体。动物肠衣膜包括猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等动物肠衣膜。其工艺方法为：

1．将动物肠衣进行碱、酸及有机溶剂清洗，首先将动物肠衣用碱性溶液浸泡5～48小时(h)，浸泡用碱性溶液可采用氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水等中的一种或混合物。溶液浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)，用水漂洗后，再用酸溶液浸泡5～48小时(h)，用水漂洗到中性，浸泡用酸溶液可采用盐酸、硫酸、甲酸、柠檬酸等中的一种或混合物，溶液浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)。用有机溶剂进一步清洗动物肠衣，用有机溶剂浸泡5～48小时(h)，用水漂洗干净制成动物肠衣膜备用。有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇、四氢呋喃等，溶液浓度为0.05％～1.0％(水溶剂)。

2．根据所固定化生物催化剂的颗粒大小决定是否需要预先对生物催化剂进行絮凝，以增加生物催化剂颗粒的大小。对于固定化生物催化剂颗粒较小的生物催化剂进行絮凝，以增加生物催化剂颗粒的尺寸。对于固定化生物催化剂尺寸较小的生物催化剂需进行絮凝，在生物催化剂中加入絮凝剂搅拌均匀，絮凝剂可采用壳聚糖、海藻胶、卡拉胶、明胶、几丁质等，浓度为1.0ppm～5ppm。

3．将上述经碱、酸及有机溶剂清洗处理过的动物肠衣膜装入生物催化剂，封口，即制成生物催化剂固定化膜组件。

本发明动物肠衣膜固定化生物催化剂方法是一种采用动物(猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等)肠衣膜截留生物催化剂固定化新方法，可以用于游离酶、完整微生物细胞固定化，多酶体系、辅酶体系及酶催化激活因子协同固定化。同时由于该方法不易受剪切力影响，能耐受高机械强度搅拌，具有很好的生物相容性，因此该固定化方法亦可用于动、植物细胞的培养。

应用时，将装有生物催化剂的动物肠衣膜固定化组件置入已装有反应底物溶液的生物反应器中进行反应，反应完毕可将整个动物肠衣膜取出来放入另一个装有相同反应底物体系的生物反应器中进行反应，如此重复进行多次，也可用连续方式进行操作，不断地向反应器中加入底物并连续排出产物。该固定化方法可以大大提高酶活回收率，酶活回收率近100％，明显延长了生物催化剂的半衰期，有的能达到20个月。

本发明采用动物(猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等)肠衣膜固定化新方法及与絮凝法相结合的新工艺，来对生物催化剂(包括酶及细胞)来进行固定化。由于采用改性动物肠衣膜，因而它具有非常好的生物相容性，也具有比有机高分子膜更耐酸、碱、耐有机溶剂，耐温度等更优的性能，比有机高分子膜更难生物降解。另外，动物肠衣原料来源广、价格非常低廉，结合絮凝法可广泛应用于各种分子大小生物催化剂的固定化，这种固定化新方法及新工艺具有广普性，固定化后生物催化剂活性回收率高，膜内外扩散限制小，生物催化剂活性保留时间长。由于动物肠衣有很好的韧性、机械强度和溶胀性，因此，经这种方法固定化的生物催化剂可适用于较强的机械搅拌和剪切力的工况，且固定化成本很低。

以下结合实施例进一步描述：

实施例1．本发明方法可采用动物肠衣膜固定化方法生产L-苹果酸。

将一定长度和尺寸的动物肠衣，包括猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等动物肠衣用浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)氢氧化钠溶液，或氢氧化钙溶液与氢氧化钾溶液的混合液中浸泡5～48小时(h)，清洗漂洗后再用浓度为0.05～2摩尔/升mol/L盐酸溶液浸泡5～4小时(h)，再漂洗到中性，最后采用浓度0.05～10％的乙醇溶液浸泡清洗干净制成动物肠衣膜备用。将培养好的产氨短杆菌MA-2.1kg装入上述碱、酸及有机溶剂处理好的动物肠衣膜中，封口形成固定化膜组件，在1摩尔/升(mol/L)富马酸钠底物中进行反应，反应温度为37℃,pH为7.0，时间为3.5小时(h)，平均转化率达81.5％(即平衡转化率)然后进行分离、纯化，制备L-苹果酸成品。采用本发明，固定化单位菌体延胡萦酸酶活回收率达100％，不存在内外扩散问题，操作半衰期可达18个月。

实施例2．采用本发明方法生产L-天冬氨酸。

将一定长度和尺寸的动物肠衣包括猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等动物肠衣，用浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)氢氧化钾溶液浸泡5～48小时(h)，清水漂洗后，再用浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)的硫酸溶液或硫酸与盐酸的混合液浸泡5～48小时(h)再漂洗到中性，最后采用0.05～10％的丙酮溶液浸泡、清洗干净制成动物肠衣膜备用。将培养好的富含天冬氨酸酶的大肠杆菌(E.coli No.1)0.5kg加入1毫摩尔/升(mmol/L)Mg²⁺并采用絮凝剂海藻胶进行絮凝，装入上述动物肠衣膜中封口制成固定化膜组件，通入1摩尔/升(mol/L)富马酸铵，停留时间为3.5h，平均转化率达99.9％，然后进行分离提取，平均1kg富马酸能转化生成1.08kg医药级的L-天冬氨酸，总收率达94％以上，半衰期长达20个月，而且无需在底物溶液中连续不断添加微量Mg²⁺，显著降低了操作成本。

实施例3．采用本发明方法由葡萄糖异构化酶生产D-果糖。

将一定长度和尺寸的动物肠衣包括猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等动物肠衣，用浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)氨水溶液浸泡5～48小时(h)，清水漂洗后，用浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)的柠檬酸溶液浸泡5～48小时(h)，再清洗到中性，最后采用0.05～10％的四氢呋喃溶液浸泡，清洗干净制成动物肠衣膜备用。将丹麦NOVO公司购买的葡萄糖异构化酶(Glucose Isomerases.EC.5.3.1.5)200g经壳聚糖絮凝后装入动物肠衣膜中，封口制成动物肠衣固定化膜组件，在葡萄糖浓度为20％,pH为7.0,65℃下反应2h，其转化率达42％，反应基本达到平衡转化率，采用本发明固定化方法，游离葡萄糖异构化酶回收率高达100％，且产物与游离酶易于分离，固定化葡萄糖异构化酶半衰期达100天。

Claims

1．一种用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法，其特征是采用动物肠衣膜作为膜截留固定化的载体，其工艺方法为：(1)．将动物肠衣进行碱、酸及有机溶剂清洗，首先将动物肠衣用碱性溶液浸泡5～48小时，溶液浓度为0.05～2摩尔/升，用水漂洗至中性后，再用酸溶液浸泡5～48小时，用水漂洗到中性，溶液浓度为0.05～2摩尔/升；用有机溶剂进一步清洗动物肠衣，用有机溶剂浸泡5～48小时(h)，用水漂洗干净制成动物肠衣膜备用；(2)．对于尺寸较小的生物催化剂可预先进行絮凝，在生物催化剂中加入絮凝剂搅拌均匀；(3)．将上述经碱、酸、有机溶剂清洗处理过的动物肠衣膜装入生物催化剂，封口即制成动物肠衣膜固定化组件。

2．根据权利要求1所述的用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法，其特征是动物肠衣膜包括猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅等肠衣膜。

3．根据权利要求1所述的用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法，其特征是浸泡用碱性溶液可采用氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾及氨水中的一种或混合物，溶液浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)。

4．根据权利要求1所述的用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法，其特征是浸泡用酸溶液可采用盐酸、硫酸、甲酸、柠檬酸中的一种或混合物，溶液浓度为0.05～2摩尔/升(mol/L)。

5．根据权利要求1所述的用动物肠衣膜固定化生物催化剂的方法，其特征是清洗用有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇、四氢呋喃。

6．根据权利要求1所述的用动物肠衣膜固定化生物催化剂方法的用途，其特征是动物肠衣膜截留生物催化剂固定化方法可用于游离酶、完整微生物细胞固定化，多酶体系、辅酶体系、酶催化激活因子协同固定化以及动植、物细胞的培养。