CN1302825A - 用丝素蛋白修饰聚羟基酯生物材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用丝素蛋白修饰聚羟基酯材料的方法。以水溶性碳二亚胺(WSC)将丝素蛋白固定在聚羟基酯材料表面,实现对其表面修饰。该应用改进了聚羟基酯材料表面的亲/疏水平衡,同时引入了与细胞特异生相互作用位点,提高了聚羟基酯材料的细胞亲和性。体外细胞实验证实了丝素蛋白用于聚羟基酯材料表面修饰能促进细胞粘附、扩展、增殖和分化等功能。

Description

用丝素蛋白修饰聚羟基酯生物材料的方法
本发明涉及一种用丝素蛋白修饰聚羟基酯生物材料的方法。属于生物医学中应用的聚羟基酯材料的改性技术。
组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，研究和开发、修复和改善损伤组织和功能的生物替代物的一门科学，它是在组织水平上操作的生物工程，主要致力于组织和器官的形成和再生。生物材料在组织工程中作为三维支架，起着如下三个主要作用：一、限定和释放细胞到体内特定位置；二、维持和提供新组织形成的三维空间及组织结构形状；三、引导和发展具有适当功能的新组织[Kim B S,Mooney D J.Development of biocompatible synthticextracellular matrices for tissue engineering.Trends Biotechnol.,1998；16:224-230]。在组织工程领域，用作细胞外基质三维支架材料主要有天然聚合物(诸如胶原、硫酸软骨素)和合成高聚物两大类。前者具有特异性细胞识别位点，但却有力学性能差，加工过程中批与批间力学性能也有较大差异等缺点；而后者具有力学性能好，降解速率和力学强度可控等优点，但缺乏细胞结合位点，植入体内易导致排异反应。因此，组织工程对生物材料的要求同时包括力学强度和生理响应两个方面。近三十年来，合成聚合物生物材料的研究取得了较大发展，但大多致力于力学强度(模量、柔韧性等)的提高和降解速率的可控性方面，却忽略了生物材料的生理响应，因而能用于临床的合成材料甚少[A.Maureen Rouhi.Contempory Biomaterials,Understanding surfaces is the key to the design of clinically useful materials.Chemical EngineeringNews.1999；77(3):51-59]。聚羟基酯类合成材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等，是美国FDA批准的少数用于临床的合成生物材料，但他们仍缺乏细胞结合位点。因此，如何调控生物材料/细胞相互作用以产生期望的生理响应是生物材料研究的重要前提，也是组织工程面临的挑战之一[David Puleo,Key C Dee,Rena Bizios.Current challenges in cell-biomaterial interactions.Biomaterials,1999；20:220l]。
生物材料的表面修饰提供了一条既不影响基材力学强度而又能改善合成材料缺乏细胞结合位点的途径。本发明以不同分子量的丝素蛋白(分子量约为1×104,3×104及10×104，分另记为SF-1,SF-3和SF-10)修饰聚羟基酯材料表面，达到了改善材料表面亲/疏水平衡，提高其生物相容性的目的。丝素蛋白是源于蚕丝的一种蛋白，富含丙氨酸-甘氨酸(Ala-Gly)等氨基酸序列。Matteo等证实，丝素蛋白仅具有有限的炎症响应[Matteo S,Antonella M.,Giuliano F and Mario C.In vitro evaluation of the inflammatory potential of the silk fibroin.J.Biomed.Mater.Res.,1999；46(3):382-389]。曾有人报道以丝素蛋白、明胶和壳聚糖三元复合物涂覆纤维来作为细胞载体[Kimura et al,Nonwowen fabric coated with a mixture of silk fibroin,gelatin and insolubilized chitosan for use as a carrier for animal cells,US Patent 5,385,836]。Minoura等研究了聚乙二醇－丝素蛋白配合体与L-929细胞的相互作用[Yohko G.,Masuhiro T,Norhiko M,Yohji I.Synthesis of poly(ethylene glycol)-silk fibroi conjugates and surface interactionbetween L-929 cells andthe conjugates.Biomaterials,1997；18(3):267-271]。但都尚未涉及用丝素蛋白来修饰聚羟基酯生物材料表面。本发明在未改变聚羟基酯材料力学性能的前提下，以丝素蛋白修饰聚羟基酯材料表面，引入了细胞结合位点，改变了其与细胞接触的界面相互作用。本发明在体外细胞实验中证实，丝素蛋白用于修饰聚羟基酯材料，能提高成骨细胞的粘附、增殖和分化功能，为骨组织工程的研究提供了光明的前景。
本发明的目的在于提供一种用丝素蛋白修饰聚羟基酯生物材料的方法。依该方法修饰后聚羟基酯生物材料，与聚羟基酯材料比较，不但改善了材料的亲/疏水平衡性，而且提高了材料的表面的细胞亲和性，从而能促进骨细胞的生长。
为达到上述目上的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。以聚乳酸溶液为原料制备聚乳酸薄膜，薄膜经水解处理及膜表面的羧基活化处理后，将膜浸入丝素蛋白溶液中，最后经过水洗、干燥密封、灭菌制得丝素蛋白修饰的聚羟基酯生物材料，其特征在于，聚乳酸溶液为2-10％mol/L，水解处理是采用0.5-2.0mol/L的NaOH，在30-55℃下水解0.5-2小时，活化剂采用0.05-2％(w/v)的水溶性碳二亚胺水溶液，丝素蛋白水溶液为4-8wt％，在4-20℃浸泡时间为24-96小时。
本发明修饰的聚羟基酯生物材料，不但保持了原聚羟基酯材料的良好力学强度。而且有效地改善了聚羟基酯材料表面的亲水/疏水平衡，明显提高了材料的表面与生物(细胞)的亲和性，特别有利于成骨细胞的生长。
下面以实施例对本发明加以进一步说明。
实施例一：
配制5％的聚乳酸溶液以蒸发法制备聚乳酸薄膜，以1.0mol/L的NaOH在50℃下水解1小时，用稀酸冲洗调pH值为中性后，再以去离子水冲洗5次备用。将水解后的聚乳酸薄膜浸入0.1％(w/v)的水溶性碳二亚胺溶液中，并调pH值至4.65，在4℃下活化聚乳酸薄膜表面的羧基24小时。以去离子水冲洗10次后，将表面羧基已被活化的聚乳酸薄膜浸入6(wt)％丝素蛋白水溶液，在4℃下浸泡48小时进行固定化反应。固定反应结束后，以蒸馏水冲洗5次，在37℃下真空干燥。干燥后的聚乳酸薄膜取出后用聚乙烯薄膜密封，再以Co60射线照射，累计1.5Mrad剂量的辐射以达到灭菌的目的，备用。
实施例二：
配制8％的聚乳酸溶液以蒸发法制备聚乳酸薄膜，以1.0mol/L的NaOH在45℃下水解1.5小时，用稀酸冲洗调pH值为中性后，再以去离子水冲洗5次备用。将水解后的聚乳酸薄膜浸入0.5％(w/v)的水溶性碳二亚胺溶液中，并调pH值至5，在4℃下活化聚乳酸薄膜表面的羧基48小时。以去离子水冲洗10次后，将表面羧基已被活化的聚乳酸薄膜浸入6(wt)％丝素蛋白水溶液，在4℃下浸泡48小时进行固定化反应。固定反应结束后，以蒸馏水冲洗5次，在37℃下真空干燥。干燥后的聚乳酸薄膜取出后用聚乙烯薄膜密封，再以Co60射线照射，累计1.5Mrad剂量的辐射以达到灭菌的目的，备用。
实施例三：
配制10％的聚乳酸溶液以蒸发法制备聚乳酸薄膜，以1.0mol/L的NaOH在40℃下水解2小时，用稀酸冲洗调pH值为中性后，再以去离子水冲洗5次备用。将水解后的聚乳酸薄膜浸入0.1％(w/v)的水溶性碳二亚胺溶液中，并调pH值至5.5，在20℃下活化聚乳酸薄膜表面的羧基36小时。以去离子水冲洗10次后，将表面羧基已被活化的聚乳酸薄膜浸入4(wt)％丝素蛋白水溶液，在4℃下浸泡72小时进行固定化反应。固定反应结束后，以蒸馏水冲洗5次，在37℃下真空干燥。干燥后的聚乳酸薄膜取出后用聚乙烯薄膜密封，再以Co60射线照射，累计1.0Mrad剂量的辐射以达到灭菌的目的，备用。
下面以图表通过对比手段看本发明的积极效果。图表1所示是细胞粘附情况，反映了细胞和生物材料表面接触的短期细胞行为，以丝素蛋白修饰后的聚乳酸更有利于细胞粘附，和未修饰的聚乳酸(参照组：Control)相比有显著差异性(P＜0.05)(星号所示)，图表2表示细胞接种在材料表面的增殖行为，结果显示SF-3修饰的聚乳酸对细胞生长有促进作用(星号所示)，图表3反映了细胞活力情况，同样是SF-3修饰的聚乳酸能大大提高细胞活力(P＜0.01)，图表4表示细胞分化功能，同未修饰的聚乳酸相比，SF-1和SF-3修饰后的聚乳酸都能提高细胞的分化功能。

Claims (1)

1．一种用丝素蛋白修饰聚羟基酯生物材料的方法，它是以聚乳酸溶液为原料制备聚乳酸薄膜，薄膜经水解处理及膜表面的羧基活化处理后，将膜浸入丝素蛋白溶液中，最后经过水洗、干燥密封、灭菌制得丝素蛋白修饰的聚羟基酯生物材料，其特征在于：聚乳酸溶液为2-10％mol/L，水解处理是采用0.5-2.0mol/L的NaOH，在30-55℃下水解0.5-2小时，活化剂采用0.05-2％(w/v)的水溶性碳二亚胺水溶液，丝素蛋白水溶液为4-8wt％，在4-20℃浸泡时间为24-96小时。
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