CN102223905A

CN102223905A - 生产用于组织工程的支架的方法，包括锚定单位的应用和随之产生的支架

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Publication number: CN102223905A
Application number: CN200980146882XA
Authority: CN
Inventors: D.哈尔特; R.库尔特; E.彼得斯; R.彭特曼; D.J.布罗尔; R.M.J.N.拉梅里克斯
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2008-11-24
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2011-10-19
Also published as: US20120190793A1; WO2010058361A2; EP2367576A2; WO2010058361A3; EP2367576B1

Abstract

本发明涉及生产用于组织和/或器官工程的支架材料和/或支架的方法，所述方法包括将至少一种对于标记试剂的锚定单位添加到至少一种支架材料和/或至少一种支架上。

Description

生产用于组织工程的支架的方法,包括锚定单位的应用和随之产生的支架

技术领域

本发明涉及用于组织工程和器官工程的支架材料和支架。更具体地，本发明涉及支架材料和支架的标记，其作为医学成像方法如CT、MRI、X-Ray、超声、闪烁扫描法等的造影剂（contrast agent）。

背景技术

组织工程是相对新兴的学科，其目的在于在实验室中生产组织或器官，其可随后用于修补或置换患者有缺陷的组织或器官。

在很多情况中，所述组织或器官利用支架的帮助而产生，支架是三维的基质，在体外或体内细胞利用支架作为它们生长和分化的基础。这样的支架需要模仿体内的环境，并使细胞能够影响其自身的微环境。为了这样做，其需要允许细胞附着和迁移，运输和保持细胞和生化因子，使必需的细胞营养物质和表达的产物能够扩散，并发挥某些机械的和生物的影响以更改细胞的行为。

为了提供植入组织的适当的机能，期望的是能够可视地控制支架的实际情况。这对于监控支架的连续生物降解和评估在这个降解过程中结构和机制的性能可以是特别重要的。但是，在临床相关的成像方法（如CT、MRI、X-Ray、闪烁扫描法和/或超声成像）中，在支架上生长的细胞及支架本身与周围的组织相比较提供极少或者甚至没有造影，因此可以几乎不显像。

US2006/0204445公开了一种基质，其具有相互连接的纤维和孔的三维超微结构以允许细胞附着并进一步包含图像增强剂。所述图像增强剂是基于镧系元素和/或过度元素的MRI成像标记物。此基质包含生物材料，如胶原蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白和/或多聚糖和/或合成聚合物，并例如通过电纺生产。图像增强剂是在细胞接种之前被参入支架基质内或支架基质上。当被植入的支架形成细胞的组织层并准备使用时，可使用参入剂监控人造组织的生长、发育（development）和重塑。

然而，这种方法具有一些严重的缺点，其中之一是使用的标记物的类型必须总在支架生产时确定的事实。在一些情况下，例如对于特定的成像装置或因为其对特定患者引起了免疫反应，给定的标记物仍然可表现出不适合。此外，标记物漂白可发生。

另一个缺点可能起因于一旦支架或组织或器官被植入，各自的标记物或其代谢产物持久的原位释放，即由于在生理环境下各自的结合的切割和/或标记物的代谢降解，例如通过遍在的酯酶和电解质的作用。

还另一个缺点可能起因于支架用标记试剂装备先于细胞植入的事实。因为意图在支架上沉淀下来（settle down）并建立起想要的组织或器官的悬浮细胞，对于化合物如放射性核素、重金属、带电实体、盐等（其经常被用作标记试剂，参见表1）非常地敏感，后者的存在可削弱细胞向支架的植入或刚植入支架的细胞的分裂。

发明内容

本发明的目的是提供标记用于组织工程或工程化的组织或器官的支架的方法，其克服了至少一些上述缺点。

本发明的另一个目的是提供标记用于组织工程或工程化的组织或器官的支架的方法，其在成像选择方面提供比现有技术方法更多灵活性。

本发明的另一个目的是提供标记用于组织工程或工程化的组织或器官的支架的方法，其允许患者具体的个体化方案。

本发明的另一个目的是提供标记用于组织工程的支架的方法，其降低了削弱支架植入的风险。

这些目的通过如独立权利要求所述的方法获得。从属权利要求指出优选的实施方案。在本文中值得注意的是提到以下给定的所有范围将被理解为其包含定义这些范围的值。

附图说明

本发明的目的的附加的细节、特性、特征和优点在权利要求、附图和各自附图的以下描述中公开，实施例以示例性方式显示根据本发明的优选的实施方案。需理解的是实施例不以任何方式意味着限制本发明的范围。

图1显示用于人工心脏瓣膜的支架。

图2显示了一些本发明的元件。

图2b显示了本发明的优选实施方案，其中锚定单位的附着先于单体的聚合发生。

图3显示了未共价结合单体的锚定单位与聚合的支架物质相混合的过程。

图4a显示了所谓的施陶丁格连接（Staudinger ligation）。

图4b显示了所谓的点击反应（click reaction）。

图5a显示了结合锚定单位的单链寡核苷酸。

图5b显示了2个带有粘性末端的双链寡核苷酸，其根据本发明可用作结合剂。

图6显示了根据本发明作为结合剂的其它核苷酸的不同实例。

图7-9显示了用包含共价结合的锚定单位的点击化学法标记支架的步骤。

图10-12显示了借助于Gd标记的寡核苷酸来标记支架的步骤。

图13显示了几种寡核苷酸结合剂连接到球形珠子上的实施方案。

具体实施方式

根据本发明，提供生产用于组织和/或器官工程的支架材料和/或支架的方法，所述方法包括将至少一种对于标记试剂的锚定单位添加到至少一种支架材料和/ 或至少一种支架上。

生产支架材料和/或支架的基本方法是本领域众所周知的，其中一些在下文中描述。

所述方法给予标记过程更多的灵活性，因为其允许推迟标记试剂将被用于更迟的时间点的决定并将其从支架生产过程中去耦合。

这再一次允许对标记试剂进行更好的患者特异性的选择，以便于在其中解决潜在的过敏等。

此外，这允许根据潜在的成像装置选择标记试剂。这是特别有用的，因为成像装置和标记试剂两者都是广泛的研究和发展的课题，以便获得更好的图像和改进诊断和检查的质量，同时减低成本、对患者的副作用及环境问题。根据本发明的方法因此对未来参入具有更好性能的标记试剂也是开放的。

如本文中所用的术语“对于标记试剂的锚定单位”涉及多种成分系统的成分，其中所述成分（即至少对于标记试剂的锚定单位和标记试剂）可被彼此共价地或非共价地附着在一起。在这个多成分系统中，锚定单位被附着或参入到支架上，而标记试剂随后共价地或非共价地附着在锚定单位上。

在本发明优选的实施方案中，被提供的是此方法进一步包括将至少一种标记试剂结合到至少一种对于标记试剂的锚定单位上的步骤。

标记试剂在大多数情况下包含允许结合所述锚定单位的实体。这个实体在下文中也被称为“互补结合单位”。互补结合单位可被结合到标记试剂上或其可形成标记试剂的部分。

因此，术语“标记试剂”应被理解为

a）结合到单独的互补结合单位上，或者

b）包含互补结合单位（作为一个整体的部分）。

在优选实施方案中，所述标记试剂可从下表中被选出，其不应理解为限制本发明关于标记试剂所提及的范围。注意用上标数标记的试剂是放射性的。

表1

在另一个优选的实施方案中，将至少一种标记试剂结合到至少一种锚定单位上的步骤借助于生物正交化学反应进行。

生物正交化学反应必须符合以下标准：

(i) 其对在支架上生长的细胞的存活必须不能具有有害作用（其必须是生物相容的），

(ii) 其需要具有选择的反应性以提供特异性结合行为，以及

(iii) 其对反应发生的组织或机体的存活和功能必须不能具有有害作用。

能够建立这样的结合的结合机制包含例如所谓“施陶丁格反应”（即叠氮化物和膦或磷酸盐的组合以生产亚氨基膦烷），“施陶丁格连接”（即通过在叠氮化物末端氮原子处亲核添加膦和脱去氮以形成亚氨基膦烷，参见Saxon等，2007），或者所谓“点击反应”（即所谓“应变促进的[3+2]叠氮-炔环加成”（“Strain Promoted [3+2] Azide-Alkyne cycloaddition”，参见Agard等，2004）。

所述结合机制和能够进行这样的机制的结合试剂例如在US20080075661A1、WO2007110811A2和WO2007039864中被公开，其内容于此通过引用被公开。特别重要的是这些结合机制允许标记试剂体内结合到锚定单位上（参见下文），并因此结合到支架上。

通过举例的方式而不是限制性的方式，在本发明的内容中有用的和被包含在其范围内的其他生物正交反应在下表中讨论，给出本文中提到的潜在的生物正交反应的概述。

表2

至少一种锚定单位和至少一种标记试剂之间的其它生物正交结合反应可用生物相容的结合试剂完成。

这些结合试剂的特别优选的组合是一对互补的寡核苷酸，其在适当的条件下通过碱基配对（核酸杂交）彼此结合。

本文中所用的术语“核酸”、“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”其中涉及RNA、DNA、LNA、PNA、吗啉（Morpholino）和其他核酸类似物的单体、寡聚体和多聚体。肽核酸（PNA）是人工合成的类似于DNA或RNA的多聚体，其共同特征为（cofeature）由重复的N-（2-氨基乙基）-氨基乙酸单元通过肽键连接组成的骨架。锁核酸（LNA）是修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分用额外的桥连接2’和4’碳来修饰。吗啉类物质（morpholinos）是合成的DNA类似物，其在结构上区别于DNA，由于吗啉类物质具有标准的核酸碱基，那些碱基结合到吗啉环而不是脱氧核糖环并通过磷酰二胺基团（phosphorodiamidate groups）而不是磷酸基团来连接。

所述寡核苷酸可以是单链或至少部分是双链。在后者的情况中，为了进行结合试剂和其互补结合试剂之间的结合，寡核苷酸可具有所谓“粘性末端”，其特征为单链突出。突出是DNA分子末端一段未配对的核苷酸。这些未配对的核苷酸可在任一链上，产生3’或者5’突出。这样的粘性末端在图5中显示。

所述互补寡核苷酸允许例如标记试剂可控地结合和切割到支架上。这些特征使所述互补寡核苷酸对体内结合特别有用，如下文讨论的。

切割可通过使用DNA限制酶获得。因为后者是在特异性识别序列（被称为限制性位点）切割双链DNA的酶，高度特异性切割可以通过各自寡核苷酸的序列特异性设计来获得。在本文中优选的是选择限制酶，其具有

a）低或至少易操纵的（manageable）、有毒的、致热的和/或免疫原的潜能，和

b）具有在各自的患者的基因组或线粒体DNA中不丰富的限制性位点。

这意味着在这种方法中应用如同限制酶将被用于治疗例如作为抗病毒治疗的相同的规则，其中切割病毒核苷酸序列而不是患者/宿主的核苷酸序列的限制酶是优选的。这样的方法例如在US5523232中公开。

下表给出一些限制酶和其限制性位点的概述，以便阐明不同的切割选择。但是仍未验证是否这些限制酶适合上述标准（即毒性/免疫原性和/或相异的（alien）限制性位点）。还需理解的是技术人员可以从教科书和科学文献中设计适合技术人员目的的限制性位点和选择适合的限制酶。

表3

借助于寡核苷酸结合的标记试剂的成像后释放的另一种方法是应用局部的温度上升。这通常通过加热杂交的核苷酸到85℃以上的温度（即解链温度）来完成。

确定所述解链温度的一种方法是所谓Wallace方法，其适合于长度上少于18mer的寡核苷酸。其通过计算每个核苷酸碱基的频率来完成。这种方法背后的原因是因为胞嘧啶-鸟嘌呤对形成三个氢键而腺嘌呤和胸腺嘧啶形成两个氢键，前者对双螺旋的稳定性贡献更多。

Wallace方法基于以下等式：

T _m = 2(A + T) + 3(G + C)

如上所述，局部聚焦的加热的应用可例如用高强度聚焦超声（HIFU）的应用来完成。后者是使用高强度聚焦超声以快速地加热（并有时破坏）组织的高度精准的医学方法。治疗用超声是最低限度的侵入式或非侵入式方法以在组织中累积声能。根据本领域的传统应用包括组织切除（例如用于肿瘤治疗）或高热治疗（低水平加热结合放疗和化疗）。超声波可例如用透镜或用球形的曲面传感器（transducer）几何学聚焦，或通过调节传感器的阵列中相关要素的相位（“相位阵列”）电子聚焦。通过动态调节相位阵列的要素的电子信号，波束可被操纵到不同的位置，源于组织结构的偏差可被修正。HIFU在一些情况在超声波检查法或计算机化MRI的控制下进行。

以局部聚焦的方式应用加热的其它方法包括通过局部施加交变电场(AC field)将磁珠带入振动的使用或使用红外光。后者对在定位在患者身体的外周的支架或移植物（例如鼻软骨植入）中的应用特别有益。

另外，寡核苷酸提供了特定的锚定单位被两个或更多标记试剂标记的选择。这允许用两个或更多不同的标记试剂同时标记支架（例如允许连续（sequential）或同时用两种或多种不同的成像方法成像）。

本领域普通技术人员可以例如一起选择具有40个残基（40mer）的寡核苷酸和每一个用10个残基（10mer）连接到标记试剂上的互补寡核苷酸。在另一种实施方案中，寡核苷酸可包含相互分离两个序列的间隔。实施例显示在图6中。

如本文中所用的术语“间隔”（“spacer”）涉及化学连接体、多聚体、肽和其类似物，其在空间上分离结合试剂（如寡核苷酸）的不同部分。优选地，选择间隔以使其允许两个或多个互补结合试剂的结合，以这种方式两个或多个互补结合试剂不会相互干扰。

另一个选择是几个寡核苷酸连接到参入支架材料中的球状珠子上，如图13显示。在这个实施方案中，寡核苷酸结合试剂以三维的方式安排，其促进各自的标记试剂的结合。

其它优选的结合试剂在下表中显示，其不应理解为限制本发明的范围。结合试剂1可例如充当根据本发明的互补结合单位，其结合标记试剂或形成标记试剂的部分，结合试剂2可被结合到或充当锚定单位，或反之亦然。

在优选的实施方案中，锚定单位可基本上由结合试剂1或2组成。在这种情况中，其直接结合到支架上，具有对互补结合单位（其结合标记试剂或形成标记试剂的部分）自由结合的部分。

很多所示的生物相容性结合试剂也提供可控的结合和切割，如上针对寡核苷酸讨论的，并因此用于体内应用（参见下文）。

表4

如本文中所用的术语“两性离子”是指具有由正电荷基团和负电荷基团组成的至少一对的分子。对本发明至关重要的是在这种情况下，互补的两性离子存在，以使两种两性离子都可充当互补结合试剂。

如本文中所用的术语“双功能基团”是指具有由亲水和疏水部分或子域组成的至少一对的基团。对本发明至关重要的是在这种情况下，互补的两性离子存在，以使两种双功能基团都可充当互补结合试剂。

如本文中所用的术语“分子标签”（有时也称为“亲和标签”）是指例如被用于蛋白纯化的分子。这些标签的实例在表5中以非限制性方式显示。

表5

上文讨论的生物正交结合机制另一个显著的优势是其减低了削弱细胞植入支架或刚植入支架的细胞的分裂的风险。这基本上由于上文讨论的生物正交结合机制或结合试剂（如叠氮化物基团或寡核苷酸）比上文讨论的标记试剂中的大部分更小可能对细胞具有有害效果的事实。

通过举例的方式而非限制的方式，其它优选的将标记试剂结合到锚定单位的反应类型在下表中显示，其不应理解为限制本发明的范围。

表6

这些只是示例性反应。本领域普通技术人员为了此目的将能够使用科学文献和教科书中描述的任何种类（有机）反应或甚至使用新的化学反应。

在本发明还另一个优选的实施方案中，聚合的支架材料和/或支架通过至少一种选自以下的方法生产：

a)电纺（electrospinning），

b) 快速原型（rapid prototyping），

c)编织（knitting）和/或

d)相分离（phase separation）。

电纺是从材料如聚合物、合成物和其它材料中产生超细纤维的方法。也可合成实心和空心内部的（“纳米管”）纳米纤维。细纤维通过源自聚合物溶液的或施加高电压熔化的粘弹性喷射的单轴延伸产生。纤维沉积在平面上并导致随后可被成形的复杂网络。用于制造支架的电纺方法是本领域中已知的，如Van Lieshout等（2006）所描述的。

如本文中所用的术语“快速原型”是指使用实体自由形状制造（即没有模具）构建物理对象的方法。快速原型从计算机辅助设计（CAD）或动画建模软件中获得虚拟的设计，将其转化为薄的、虚拟的、横截面并随后在物理空间内创建每一个截面，一个接着一个直到模型完成。表7提供一些可用在本发明的内容中的快速原型方法的非限制性概述。

编织是本领域众所周知的方法。在支架生产中，其允许机械上可靠的开放结构的生产。编织的优势是可产生的复杂的几何学结构，例如用于主动脉弓置换的有分支的假体。已被用于编织的材料中有涤纶还有碳纤维以及如聚己酸内酯的聚合物。制造支架的编织方法也被Van Lieshout等(2006)描述。

相分离包括不同的方法，其为浸入沉淀，固-液相分离、液-液相分离、聚合诱导的相分离和特别的热致相分离（“TIPS”）。热致相分离是需要使用容易升华的低熔点溶剂的方法。这可例如用二烷作为聚乳酸的溶剂来完成。相分离随后通过加入小量的水引起，其导致聚合物富集相和聚合物缺乏相的形成。混合物随后被冷却到溶剂熔点以下并真空干燥以升华溶剂为了获得多孔的支架。

用于生产落在本发明的范围之下的支架的其它方法包括选自以下的至少一种：

· 用注入气体、CaCO₃ 或 NH₄HCO₃的气体发泡

· 微球体烧结（sintering of microspheres）

· 超临界流体技术

· 粒子沥滤（particulate leaching）

· 乳化作用

· 冻干

· 溶剂浇铸（solvent casting）

· 挤压

· 无纺布的生产

· 织造（weaving）

· 纤维结合

· 膜叠片（membrane lamination）

· 烃模板（hydrocarbon templating）

· 实体自由形状制造技术

· 模具浇铸和/或

· 微机器人/微机械加工。

在另一个优选的实施方案中，支架材料是可生物降解的材料。这样的生物降解材料可选自：胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、胶原蛋白VI、胶原蛋白VII、胶原蛋白VIII、胶原蛋白IX、胶原蛋白X、弹性蛋白、聚（丙交酯-乙交酯共聚物）（PLGA）、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、组织培养塑料(TCP)、聚(富马酸二羟丙酯) (PPF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PEGT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、肽水凝胶（Peptide Hydrogels）（例如PuraMatrix^TM）、多糖材料特别是壳聚糖或黏多糖（glycosaminoglycan，GAGs）、透明质酸特别是与交联剂（例如戊二醛、多聚甲醛或水溶性碳二亚胺）的组合、或其混合物、共聚物或修饰等（参见实施例1）。

本领域普通技术人员很好地理解各自的聚合反应和各自使用的单体。

在本发明的另一个优选实施方案中，提供的是在聚合前将锚定单位加入反应混合物中。

在这个实施方案中，锚定单位在聚合前加入例如单体混合物中。在PLGA的情况中，PLGA是乙醇酸和乳酸的环状二聚体（1,4-二烷-2,5-二酮）的共聚体，通过随机开环共聚合作用的方法合成，锚定单位因此被加入所述环状二聚体中。这种方法提供锚定单位在随后支架中的平均分配，并因此提供了支架的均一标记，但是只在锚定单位的存在不影响聚合过程的条件下才能获得。

在可选的实施方案中，提供的是锚定单位附着在支架从中形成的聚合物上。

在这个实施方案中，锚定单位在支架形成前例如通过电纺和/或快速原型加入例如聚合物。这再一次产生在随后支架中锚定单位的平均分配。

在还另一种可选的实施方案中，提供的是锚定单位在支架形成后附着。

在这个实施方案中，锚定单位主要附着在支架的表面。这对体内标记的应用有作用（参见下文），因为这里标记试剂的结合只可以发生在支架的表面。

锚定单位附着在支架上在优选的实施方案中是共价结合步骤。

在还另一个优选的实施方案中，锚定单位附着在支架上是非共价结合步骤，如例如在图3中显示的。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的方法特征在于在体内标记试剂结合到锚定单位上。

如本文中所用的术语“体内”（“in vivo”）应指一旦支架被植入患者而发生的结合过程。其可与术语“原位（“in situ”）互换使用。

这是特别有利的方法，因为其允许将患者的身体暴露于标记试剂（其在一些情况下是潜在的过敏性的、甚至毒性的试剂）尽可能短的时间段，例如只在成像过程之前直接地暴露。

为了在植入的支架降解过程中监控支架的连续生物降解和评估结构和机制的性能，本领域普通技术人员可以因此在植入前提供给所述支架至少一种根据本发明的锚定单位。

特别优选的是在体内方法中，标记试剂在成像实验后再一次释放。以上所示的一些结合试剂允许这样的释放。

当出现对支架检查的需要时，本领域普通技术人员可以随后给患者施用标记试剂，其一旦进入血流，结合锚定单位，因此允许完整支架适当的成像。在医学检查后，结合可被切割，标记试剂释放并将例如随尿排出。

在只有在较长时间段后需要进行支架检查检测的情况下，这种方法特别有用，因为一些生物降解过程耗时几个月或甚至几年。在许多情况中，标记试剂如基于钆（Gd）的试剂具有较差的生物相容性，不期望的是在体内长时间地具有这些试剂，因为Gd可以从复合物中释放，并且如果在身体里长时间驻留会导致健康问题。但是，根据现有技术的方法提供在植入前将标记试剂加入支架或支架材料。

另外与之相反，体内应用允许甚至在长时间后加入。这意味着标记试剂可以在例如支架植入身体后一年加入。这可以是优势的，因为如果引入先于植入，在这个延长的时间中成像标记物可以降解或释放，因此随时间降解标记功能。

对于体内应用，上文提到的可控的结合和切割具有几个优势，因为其允许标记试剂时间上可控的结合和去除。

另外这种方法促进了放射性核素作为标记试剂的应用（参见表1），其对一些成像形式（imaging modalities）是必须的，如PET、SPECT、闪烁扫描法或其它核医学X射线断层成像技术（参见表1）。

但是，在另一个优选的实施方案中，标记试剂在体外结合锚定单位。如本文中所用的术语“体外”应指先于支架植入发生的结合过程。体外结合的优势是化学耦联反应的苛刻条件可被应用，致使更可靠的结合。另外，更大数量的结合反应在体外方法中是可用的。

本发明其他优选的实施方案包括对生产组织和/或器官有用的支架，其特征在于所述支架具有至少一种对于标记试剂的锚定单位。

在优选的实施方案中，所述支架用根据本发明的方法获得。

在另一个优选的实施方案中，所述支架被用于生产至少一种选自以下的组织和/或器官：

a)人工心脏瓣膜，

b)血管移植物，

c)皮肤，

d)神经组织，

e)器官，

f)膀胱，

g)血管，

h)软骨组织，和/或

i)骨组织。

另外，提供这样的支架用于制造组织和/或器官的用途，以及包含这样的支架的组织和/或器官。所述组织和/或器官优选地选自以下的至少一种：

a)人工心脏瓣膜，

b)血管移植物，

c)皮肤，

d)神经组织，

e)器官，

f)膀胱，

g)血管，

h)软骨组织，和/或

i)骨组织。

在另一个实施方案中，本发明包含标记根据本发明用于组织和/或器官工程的支架材料和/或支架的方法，所述方法包括将至少一种标记试剂结合到锚定单位上的步骤。

在优选的实施方案中，至少一种标记试剂借助于生物正交化学反应结合到锚定单位。

进一步优选的是至少一种标记试剂在体内结合到锚定单位上。在另一个优选的实施方案中，所述方法包括在体内从锚定单位释放至少一种标记试剂的步骤。

下表给出根据本发明的一些支架材料、锚定单位、互补结合单位和标记试剂的非限制性的概述。应当注意的是在大多数情况下，锚定单位和互补结合单位可互换使用。另外，应当注意的是在第1、2-3和4列中提到的材料可互换使用，例如第3行的支架材料可与第8行的标记试剂一起使用，并通过锚定单位和第1行的其互补结合单位来彼此连接，等等。

表8

。

定义

如本文中所用的术语“组织工程”是指针对发展重建、维持或改进组织功能或整个器官的生物替代品运用工程和生命科学原理的跨学科领域。其包含细胞、工程和材料方法及适当的生物化学和生理化学的要素组合的使用，以改进或替代生物功能，特别是组织和/或器官。

这包括了修复和置换部分或全部组织和/或器官（即骨、软骨、血管、膀胱等），有时导致人造器官和/或组织，如人工胰腺或生物人工肝脏。组织工程在大部分情况下需要支架和以植入前者的活细胞。

如本文中所用的术语“支架”是指细胞在其上生长的三维基质。这些基质在先体外后体内（ex vivo）和体内对于重现体内环境及允许细胞影响其自身的微环境都经常是关键性的。支架通常用于下列目的中的至少一种：

· 允许细胞附着和迁移

· 运输和保持细胞和生化因子

· 能够扩散必要的细胞营养物和表达的产物

· 发挥某些机械的和生物影响以修饰细胞阶段的行为。

为达到组织重建的目的，支架必须满足一些特殊要求。高度多孔性和适当的孔大小对于促进细胞接种以及细胞和营养遍及整个结构的扩散是必要的。在支架假定随时间被周围组织吸收而无需外科手术移除的情况下，生物可降解性经常是基本的要素。降解发生的速率必须尽可能与组织形成的速率一致。这意味着当细胞在其周围构建其自身的天然基质结构时，支架在机体内提供结构完整性，并且最终将分解留下所谓的新组织，即新形成的将接管机械负荷的组织。

用于组织工程的细胞包括成纤维细胞和/或角质细胞（用于皮肤置换或修复）、软骨细胞（用于软骨置换或修复）、干细胞（将被置换或修复的大量多样性的潜在组织）、多能细胞（将被置换或修复的大量多样性的潜在组织）、心脏干细胞（用于心脏组织的修复或置换）、内皮干细胞（用于血管组织的修复和置换）、瓣膜干细胞（valve stem cell）（用于心脏瓣膜的修复或置换）等等。

在优选的实施方案中，所用细胞包含延长的端粒以增加其分裂潜能和/或寿命，在未修饰的细胞中其被所谓海弗利克极限限制。

特别优选的，所用细胞是自体细胞，即细胞与随之产生的组织或器官的受体遗传上相容。这主要是细胞源自与细胞被应用的相同对象（即供体和受体是同一人）的情况，或供体与受体是近亲的情况。

术语“互补核酸”和“互补寡核苷酸”是指具有包含任何胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）、或次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异鸟嘌呤和异胞嘧啶碱基的碱基序列的碱基核酸、多核苷酸和/或寡核苷酸，其能够根据Watson-Crick碱基配对机制与另一种核酸、多核苷酸和/或寡核苷酸杂交。

术语“抗体”和“单克隆抗体”是指对特定抗原展示结合亲和力的免疫球蛋白分子，其由被免疫的哺乳动物或由重组的微生物产生。

凝集素是糖结合蛋白，其对它们的糖部分是高度特异性的。它们通常在包括细胞和蛋白的生物识别现象中发挥作用。例如，一些细菌在感染中用凝集素将其自身附着到宿主生物的细胞上。

锚蛋白重复源自天然的锚蛋白重复蛋白质，其在自然界中用作具有不同功能（如细胞信号转导、激酶抑制或受体结合，只列举了几种）的多功能结合蛋白。这些锚蛋白重复例如在EP1332209中描述的。

链霉抗生物素蛋白是从细菌阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）中纯化的53Kd蛋白质，其展示了对维生素生物素的强亲和力；生物素-链霉抗生物素蛋白复合物的解离常数（Kd）接近约10-15 mol/L。抗生物素蛋白也是对生物素具有强亲和力的类似蛋白。

如本文中所用的术语“标记试剂”是指试剂，即分子，其可借助于成像设备（如X射线、计算机断层（CT，特别是光谱CT）、磁共振成像仪（MRI）、声谱仪、正电子发射X线断层摄影术（PET）和/或闪烁扫描法，参见表1）的方法可见。当用所述标记试剂标记的实体被移植进入人体时，可视化特别有用。在这种情况下，本领域普通技术人员将谈及原位可视化或体内可视化。经常地，所述标记试剂也称为“造影剂”。

附图讨论

下列附图示意性地阐明本发明的基本方面。

图1以示例性方式显示用于人工心脏瓣膜的支架1。支架通过聚合物、不同的未修饰或修饰的聚合物的混合物、或聚合物和其它材料/实体的混合的电纺制成。这导致材料包含长纤维2，根据本发明的锚定单位3,4附着到其上。

图2a显示本发明的一些要素，即单体5、聚合物6、共价结合单体5的锚定单位7、标记试剂8及未共价结合单体的另一个锚定单位9。

标记试剂8可结合实体或形成实体的部分，该实体允许结合锚定单位7或9。这个实体也称为“互补结合单位”。

锚定单位9在电纺过程中结合可被非共价地参入支架中的颗粒。

图2b显示本发明优选的实施方案，其中锚定单位的附着发生在单体聚合之前。因此产生的聚合物可随后经历电纺。然后，标记试剂可结合锚定单位，特别是在体内。

将被用于MRI的标记试剂可以是含¹⁹F的材料、移动支架中质子的质子信号的化学位移试剂或镧系元素离子，例如含有钆Gd的复合物。可被用于MRI的其它试剂当然也是可能的。另外，用于其它成像形式（CT、X射线）的标记试剂也可被使用。钆复合物也可被用于光谱CT，其比传统CT更加敏感（参见表1）。

图3显示了未共价结合单体的锚定单位和聚合的支架物质混合随后经历共电纺（co-electrospinning ）的过程，以这样的方式锚定试剂参入在如此产生的纤维中。随后标记试剂可结合锚定单位，特别是在体内。

图4a显示标记试剂与锚定单位的生物正交结合的实例，所谓施陶丁格连接。单体包含作为根据本发明的锚定单位的化学修饰，即叠氮化物（N₃-基团）10，其可点击到（click to）携带标记试剂的膦基团11上。

可选地，以相反的方式，单体也可被连接到膦基团上（11），膦基团在这种情况下作为根据本发明的锚定单位，随后标记试剂通过其叠氮化物基团（10）附着在锚定单位上。

锚定单位和标记试剂的互补结合单位也可以是寡核苷酸的互补链，其可在体内形成稳定的非共价键，并能够将标记物特异性地靶向需要的位点。

图4b显示作为标记试剂与锚定单位的生物正交结合的另一个实例，所谓点击反应，其中修饰的单体点击到应力压迫（strain-stressed）的炔上。

图5a显示结合到锚定单位上的单链寡核苷酸和结合到标记试剂上的互补单链寡核苷酸。两者可相互杂交，特别是在体内情况下，因此将标记试剂恰好及时地结合到支架上（参见上文）。在特定的环境下，杂交可随后被再次切割，例如通过应用局部聚焦的加热或限制酶。

图5b显示2种带有粘性末端的双链寡核苷酸，其可用作根据本发明的结合试剂。突出彼此互补，因此允许通过杂交结合。所示寡核苷酸中的一个可连接锚定单位，或甚至形成其部分。所述互补寡核苷酸允许例如标记试剂与支架的可控结合和切割。这些特征使所述互补寡核苷酸对于体内结合特别有用，如下文讨论的。

再次，切割可通过运用加热或限制酶来发生。在后一种情况中，优选的是限制酶的切割位点对应于粘性末端的序列。

图6显示了其它核苷酸作为根据本发明的结合试剂的不同实例。在图6a中，具有40个残基（40-mer）的寡核苷酸和2种各个连接到标记试剂的各具有10个残基（10-mer）的互补寡核苷酸共同显示。

在图6b中，寡核苷酸具有2个部分，互补于2种各携带标记试剂的寡核苷酸，2个部分通过n个残基长度的寡聚体彼此分开。

在图6c中，寡核苷酸具有3个部分，互补于3种各携带标记试剂的寡核苷酸，因此允许使用3种不同的标记试剂。

在图6d中，寡核苷酸显示其包含使2个序列彼此分开的间隔，因此允许2个各携带标记试剂的互补寡核苷酸的空间上分离的杂交。

图7-9显示了用包含共价结合的锚定单位的点击化学法标记支架的步骤。这些图与实施例1相关进行讨论。

图10-12显示了借助于Gd标记的寡核苷酸来标记支架的步骤。这些图与实施例3相关进行讨论。。

图13显示几种寡核苷酸结合试剂连接到参入支架中的球形珠上。在此实施方案中，寡核苷酸结合试剂以三维方式排列（例如以四分支（tetraedric）形状，而在图13中这以二维方式伸出）。在此实施例中球形珠是金颗粒，如在实施例3中描述的。三维排列具有几种优势。首先结合寡核苷酸结合试剂的不同标记试剂之间的任何空间相互作用减少到最小。另外，排列提供选择以使用不同寡核苷酸结合试剂（即其通过它们的序列彼此区别，如图13显示的），以允许使用不同的标记试剂，其反过来可用于不同成像装置。

另一个优势是在球形珠参入到支架材料中的情况下，这样的排列改善了结合性能。以这样的方式，至少一种结合试剂从支架材料上显现(peeks put of)的可能性上升，并因此可用于结合标记试剂。在这种情况下，不同寡核苷酸可优选地具有相同的序列。

实施例

实施例1：用包含共价结合的锚定单位的点击化学法标记支架。

ε-己内酯和α-溴-ε-己内酯（或纯α-溴-ε-己内酯）的共聚物被生产作为形成支架的聚合物。这个过程在实施例1.1. – 1.3.中被描述。然后共聚物的溴基团被叠氮化物（N₃）基团取代，后者是本发明的锚定单位。这个过程在实施例1.4.中被描述。共聚物可经历支架形成过程，例如通过在取代过程之前或之后的电纺。标记试剂借助于施陶丁格反应被结合到锚定单位上。

1.1. α-溴环己酮的合成

α-溴环己酮根据以下程序被合成：将49 g （0.306 mol）溴在5小时的时间段中滴加至30 g （0.306 mol）环己酮和200 mL蒸馏水的搅拌的混合物中，其间温度通过外部制冷被保持在25到30℃。

当添加完成时，继续搅拌直到反应混合物无色（约1小时）。重的有机层从水层分离并用无水MgSO₄干燥。纯α-溴环己酮（37 g，69%产量）随后通过蒸馏获得。反应方案参见图7a。

1.2. α-溴己内酯的合成（αBrCL）

将31g 3-氯过氧苯甲酸（mCPBA，0.135 mol）加入21.8g（0.123 mol）α-溴环己酮的200mL二氯甲烷溶液。室温搅拌8小时后，反应瓶放置在冰箱中以沉淀反应中产生的3-氯苯甲酸。溶液随后过滤并用饱和的Na₂S₂O₃溶液洗涤三遍，用NaHCO₃溶液洗涤三遍，最后用蒸馏水洗涤直到中性pH。有机相用无水MgSO₄干燥过夜。MgSO₄被过滤掉之后，溶剂用旋转蒸发去除。粗产物溶解在乙烷和乙酸乙酯的混合物中（10/3体积比）并通过用相同的溶剂准备的硅胶柱，收集第二个级分。溶剂用旋转蒸发去除，白色固体室温下真空干燥过夜。产量：12.5g（53%）。熔点：34.5 8C。反应方案参见图7a。

1.3. ε-己内酯（εCL）和αBrCL通过开环聚合（ROP）共聚合

随机的开环聚合在25℃在甲苯中进行。将15 mL甲苯、0.628 g（3.25 mol）αBrCL的甲苯溶液、5.507 g （48.31 mmol）εCL以及0.307 g异丙氧化铝（Al(O-i-Pr)₃，1.5 mmol）的甲苯溶液用注射器通过橡皮隔片逐次地加入50 mL聚合瓶（通过五个真空氩循环脱气）。聚合3小时之后，加入过量的1 N HCl，通过在冷甲醇中沉淀被恢复。反应方案参见图7b。

1.4. 溴基团的取代

因此产生的共聚物在室温下被浸入饱和叠氮化钠的2,5-二甲基呋喃（DMF）溶液中24小时。基底（substrates）随后用DMF漂洗，在乙醇中超声3分钟，在水中超声分钟，并在空气流中干燥。这个过程导致溴基团被叠氮化物（N₃）基团取代，后者是本发明的锚定单位。反应方案参见图8。

1.5.借助于点击化学法标记试剂的结合

香豆素染料被作为示例性标记试剂。共聚物的叠氮化物基团和香豆素343衍生物（10-氧代-2,3, 5,6-四氢-1H,4H,10H-11-氧杂-3a氮杂-苯并[de]蒽-9-羧酸丙-2-炔酯）的丙炔基团之间的点击反应通过将叠氮化物功能化的基底浸入香豆素343衍生物（5 mg，0.015 mmol）溶解于10ml乙醇的溶液中在室温进行。

CuSO₄ × 5 H₂O （0.19 mg，7.73 × 10?4 mmol，5 mol%）和抗坏血酸钠（0.31 mg，1.55 × 10?3 mmol，10 mol%）各个溶解于1ml水中，作为催化剂加入。随后，基底在乙醇中超声3min并在空气流中干燥。

所述反应具有特别的优势，其可在体内进行。

另外，反应可用所有可被提供末端炔基团（?C≡CH或 ?≡）的标记试剂进行。

实施例2：用¹⁸F标记寡核苷酸结合试剂

如图5显示的寡核苷酸在其5’端用¹⁸F根据Kuhnast 2003的方法标记。¹⁸F优选用于正电子发射X线断层摄影术（PET）和闪烁扫描法（参见表1）。互补的寡核苷酸通过根据本领域的方法被锚定到支架材料上，因此作为根据本发明的锚定单位。将寡核苷酸结合到硅酸盐表面或聚合物表面的方法例如从涉及生物芯片生产的文献中已知。

实施例3：借助于Gd标记的寡核苷酸标记支架

3.1. DNA-颗粒-成分的合成

Au（金）颗粒可如文献（Grabar等(1995)）中描述的制备。这些微粒容易用寡核苷酸修饰，所述寡核苷酸用烷烃硫醇在其一端例如5’端被官能化。这里，1.5 ml （17 nM）的胶体金（13nm ?）溶液用460 μl（3.75 μM）以下种类的SH-5’-寡核苷酸-3’处理24小时（此处序列随机选择，即任何其它序列也可以）：

3'-GCTATCTGGCTATCTGTATCTGTTTTTTT-5'-SH

以提供DNA-金-成分。以这样的方式，获得包含寡核苷酸作为结合试剂的锚定单位。参见图10 对于所述过程的说明。

3.2. DNA-Gd-标记成分的合成

1 μmol以下种类的胺修饰的寡核苷酸（序列部分互补于上述序列）：

H₂N-5’-GATTCGATAGACCGATAGACATAGAC-3

溶解在1000 μl PBS中。向此溶液中加入溶解在1000 μl PBS中的6 μmol DOTA-NHS-酯（DOTA-NHS-酯 = 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单（N-羟基-琥珀酰亚胺酯））。后者携带胺反应性琥珀酰亚胺基酯部分。

混合物随后在室温搅拌以进行取代反应。

产物用纯水透析（6-8 kDa的截止）。随后加入1 μmol GdCl₃

6 H₂O（20 mg/ml储液）。pH保持稳定在5.0到5.5之间（通过加入1N HCl或1N NaOH）过夜。随后加入1 μmol EDTA以螯合过剩的Gd³⁺。搅拌30分钟之后，乳浊液可用Sephadex G-25柱纯化以从DNA-DOTA-钆复合物中去除EDTA-Gd³⁺和其它未反应的低分子量化合物。DOTA-NHS-酯是商业上可获得的，例如从Macrocyclics, Dallas,Texas或CheMatech, Dijon, France获得。

以这样的方式，获得包含寡核苷酸作为互补结合试剂的基于Gd的标记试剂。参见图11对于所述过程的说明。

3.3. 在用于组织工程的支架中的使用

对于电纺，将聚己内酯（PCL, 80 000 kD分子量）用于溶液（在5:1到7:1混合比的氯仿：甲醇混合物中8-20 % w/w PCL）中。将步骤1中的DNA单链包被的胶体金以0.01%的量混合到此溶液中。随后进行电纺以建立随后可被成型的纤维网络（此方法在文献例如在Van Lieshout等（2006）和很多其它文献中被很好地描述）。

随后，即成型之后，将用钆复合物修饰的DNA单链借助于金颗粒加入到构建入支架的互补的DNA链中。所述结合可在体外或体内发生，如上所述。参见图12对于所述结合过程的说明。

参考文献

Agard, N.J., Prescher, J.A., and Bertozzi, C.R., A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc., 126, 46, 15046 - 15047, 2004

Grabar, K.C., R.G. Rreeman, M.B. Hommer, and M.J. Natan. 1995. Extended Oligothienylenevinylenes End-Capped with 1,4-Dithiafulvenyl -Donor Groups: Toward a Supramolecular Control of Effective Conjugation Length. Analyt. Chem. 67:735-743.

Saxon, E.; Bertozzi, C.R. Science 2000, 287, 2007

van Lieshout, M.I., C.M. Vaz, M.C. Rutten, G.W. Peters, and F.P. Baaijens, Electrospinning versus knitting: two scaffolds for tissue engineering of the aortic valve. J Biomater Sci Polym Ed. 17:77-89, 2006

Kuhnast, F. Hinnen, R. Boisgard, B. Tavitian, F. Dollé, Fluorine-18 labelling of oligonucleotides: Prosthetic labelling at the 5’-end using the N-(4-[¹⁸F] fluorobenzyl)-2-bromoacetamide reagent, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 46 (12), 1093-1103, 2003。

Claims

1.一种生产用于组织和/或器官工程的支架材料和/或支架的方法，所述方法包括将至少一种对于标记试剂的锚定单位添加到至少一种支架材料和/或到至少一种支架上。

2.根据权利要求1的方法，其进一步包括将至少一种标记试剂结合到至少一种对于标记试剂的锚定单位上的步骤，其中所述将至少一种标记试剂结合到至少一种锚定单位上的步骤借助于生物正交化学反应进行。

3.根据权利要求1的方法，其中聚合的支架材料和/或支架通过至少一种选自以下的方法生产：

a)电纺，

b)快速原型，

c)编织和/或

d)相分离。

4.根据权利要求1的方法，其中所述支架材料是可生物降解的材料，并且在聚合前将锚定单位加入反应混合物中，其中所述锚定单位附着在支架从中形成的聚合物上。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于所述锚定单位在支架形成之后附着，其中所述锚定单位的附着是共价结合步骤。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于所述锚定单位的附着是非共价结合步骤。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于所述标记试剂在体内结合到锚定单位上。

8.一种支架材料，其对用于组织和/或器官工程的支架的制备是有用的，其特征在于所述支架材料具有至少一种对于标记试剂的锚定单位。

9.一种对组织和/或器官的制备有用的支架，其特征在于所述支架具有至少一种对于标记试剂的锚定单位。

10.根据权利要求1-9任一项的方法获得的支架材料和/或支架。

11.根据权利要求8或9的支架，其被用于生产至少一种选自以下的组织和/或器官：

a)人工心脏瓣膜，

b)血管移植物，

c)皮肤，

d)神经组织，

e)器官，

f)膀胱，

g)血管，

h)软骨组织，和/或

i)骨组织。

12.根据权利要求8或9的支架用于制备组织和/或器官的用途。

13.一种包含根据权利要求8或9的支架的组织和/或器官。

14.根据权利要求13的组织和/或器官，其特征在于所述组织和/或器官选自以下的至少一种：

a)人工心脏瓣膜，

b)血管移植物，

c)皮肤，

d)神经组织，

e)器官，

f)膀胱，

g)血管，

h)软骨组织，和/或

i)骨组织。

15.一种根据权利要求8-10标记用于组织和/或器官工程的支架材料和/或支架的方法，所述方法包括将至少一种标记试剂结合到所述锚定单位上的步骤，其中至少一种标记试剂借助于生物正交化学反应结合到所述锚定单位上，其中至少一种标记试剂在体内被结合到所述锚定单位上，以及所述方法包括在体内从所述锚定单位释放至少一种标记试剂的步骤。