CN1300314C - 暂态表达重组蛋白鸡输卵管生物反应器的制造方法 - Google Patents

Abstract

暂态表达重组蛋白鸡输卵管生物反应器的制造方法，属于基因工程和生物制药领域。本发明的技术方案包括鸡卵清蛋白基因调控序列的分子克隆、鸡输卵管高效表达载体的构建及优化、基因转染剂的选择、重组载体注射方法、剂量和次数的选择。与现有的同类技术相比，该发明不仅具有非手术、经济、实用等优点，而且目的基因的表达水平高、表达维持时间长、表达产物的活性完全。表达在蛋清中的重组蛋白既可以纯化后作为防治人、畜疾病的药物，也可以不经纯化直接作为人类的保健品或动物的饲料添加剂进行开发。

Description

暂态表达重组蛋白鸡输卵管生物反应器的制造方法

技术领域

本发明属于基因工程和生物制药领域。

背景技术

目前，药用重组蛋白的表达系统主要有细菌表达、动物细胞表达和转基因动物生物反应器。细菌表达系统以大肠杆菌为典型代表，其技术难度不大，生产成本较低，现有的重组蛋白多用大肠杆菌表达，但表达的重组蛋白一般不能进行有效的折叠、加工和修饰，而且多为不溶性的包涵体，不仅活性低或无，而且对目的产物的纯化不利。动物细胞表达的最大优点是产物的活性完全，但表达水平普遍偏低，生产成本较高。转基因动物生物反应器是利用基因工程和胚胎工程技术，将编码贵重蛋白的基因转移到动物的基因组，以转基因动物的组织或器官作为生产重组蛋白的生物工厂，具有表达水平高、表达产物活性完全和无污染等突出优点，具有十分光明的产业化前景，但其技术难度很大，许多理论和技术难题均有待突破。

对于制备转基因动物生物反应器而言，鸡具有十分突出的优势，其输卵管膨大部是合成蛋白的天然工厂，蛋清中的蛋白含量高达100克/升，而且能对蛋白进行正确的加工和修饰，所以表达产物的活性完全，加之饲养成本低、世代间隔(研制周期)短、产蛋易收集和不易污染等优点，特别适合作为生产重组蛋白的生物反应器。

家禽输卵管生物反应器是利用卵清蛋白基因的表达调控序列指导外源基因在鸡输卵管细胞中表达，从蛋清中获得表达产物的一种技术，包括用转基因技术建立的转基因鸡输卵管生物反应器和产蛋鸡基因转染为基础的输卵管暂态表达生物反应器。转基因鸡输卵管生物反应器具有遗传稳定、表达水平高等突出优点，制备方法主要有反转录病毒介导法、精子转染法、原始生殖细胞转染移植法、发育鸡胚胚盘注射法和胚胎干细胞法，但其技术难度都很大，目前尚无具有产业化前景的转基因鸡生物反应器的报道。输卵管暂态表达生物反应器的缺点是外源基因不能遗传、表达水平低且时间短暂，但其技术难度不大，目前多作为研究鸡蛋清蛋白基因表达调控机制和鸡输卵管定位表达载体质量检验的实验模型。迄今为止，仅日本科学家于2002年尝试用体内基因电子穿孔法，使人的碱性磷酸酶基因在鸡的输卵管细胞及蛋清中获得表达，但该方法不仅需要特殊的仪器设备、对鸡进行麻醉和外科手术，而且蛋清中重组酶的表达水平很低(纳克/毫升)，维持时间很短(小于4天)，所以没有实用价值。

发明内容

本发明的目的在于建立简单、非手术、经济、实用的暂态表达重组蛋白鸡输卵管生物反应器的制造方法。

本发明的技术方案包括鸡卵清蛋白基因调控序列的分子克隆、鸡输卵管高效表达载体的构建及优化、基因转染剂的选择、重组载体注射方法、剂量和次数的选择：

a、分子克隆鸡卵清蛋白基因调控序列：根据已发表的鸡卵清蛋白基因序列(GenBank登录号GI：212504)设计引物，以中国狼山鸡基因组DNA为模板，用高保真多聚酶链式反应(PCR)扩增长度分别为3.0kb的5′和3′鸡卵清蛋白基因调控序列；

b、构建鸡输卵管特异表达载体：对粘粒载体pHC修饰获得pHC20载体；对真核细胞表达载体pcDNA3.0修饰获得pcDNA2.2载体；将鸡卵清蛋白基因的5′和3′调控序列同时克隆入pHC20载体，获得pOV1鸡输卵管特异表达载体；将鸡卵清蛋白基因的5′和3′调控序列同时克隆入pcDNA2.2载体，获得pOV2鸡输卵管特异表达载体；将鸡卵清蛋白基因的5′调控序列单独克隆入pcDNA2.2载体，获得pOV3鸡输卵管特异表达载体；

c、将含人组织激肽释放酶cDNA(登录号为GI：22027643)的三种鸡输卵管特异表达重组载体与选定的鸡体内基因转染剂25kDa PEI混合，比例为1微克DNA：2微升PEI；分别经翅静脉注射产蛋鸡，注射总剂量为2～3毫克重组载体，分一次或两次注射。

与现有的同类技术相比，该发明不仅具有非手术、经济、实用等优点，而且目的基因的表达水平高、表达维持时间长、表达产物的活性完全。表达在蛋清中的重组蛋白既可以纯化后作为防治人、畜疾病的药物，也可以不经纯化直接作为人类的保健品或动物的饲料添加剂进行开发(视具体蛋白而定)。

本发明对pHC粘粒载体的修饰包括在其Sal I和Not I限制酶切位点之间增加Xcm I、Eco RI、Pst I、Sma I、Bam HI、Spe I、Xba I、Eag I酶切位点。

本发明对pcDNA3.0真核表达载体修饰为去掉其中的SV40病毒序列和新霉素(neo)抗性基因。

本发明中鸡体内基因转染剂25kDa聚乙烯亚胺(PEI)的浓度为10毫克/毫升。

附图说明

图1为构建的鸡输卵管特异表达载体结构示意图。

具体实施方式：

1、鸡卵清蛋白基因调控序列的分子克隆：根据已发表的鸡卵清蛋白基因序列(GenBank登录号GI：212504)设计引物，用常规的基因组DNA提取方法提取中国狼山鸡基因组DNA为模板，用大连宝生物公司的高保真多聚酶Pyrobest DNA Polymerase扩增鸡卵清蛋白基因5′和3′调控序列，将获得的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明与预计的大小相符(分别为3kb)；分别用连接酶将PCR扩增产物与商品化的PCR产物克隆载体pGEM-T连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经在含青霉素和X-gal的LB琼脂平板上培养过夜后，挑取白色菌落进行液体培养和制备质粒DNA，经DNA序列测定证明，重组质粒中的5′和3′鸡卵清蛋白基因调控序列的前500个核苷酸与公开发表的鸡卵清蛋白基因(GenBank登录号GI：212504)无差异，获得的重组质粒分别命名为pGEM5′和pGEM3′。

2、鸡输卵管特异表达载体的构建：

利用常规的基因操作技术对pHC粘粒载体和pcDNA3.0真核细胞表达载体进行改造和修饰。对pHC粘粒载体的修饰包括用Sal I和Not I限制酶消化pHC载体，去除其间的片断后与含Sal I、Xcm I、Eco RI、Pst I、Sma I、BamHI、Spe I、Xba I、Eag I、Not I酶切位点的PCR扩增片断连接，获得的载体命名为pHC20。对pcDNA3.0真核细胞表达载体的修饰包括用PvuII酶消化，去除其中的SV40病毒序列和新霉素抗性基因(neo)，重新连接后的载体命名为pcDNA2.2。

用限制酶Sal I和BamHI将鸡卵清蛋白基因的5′调控区从pGEM5′质粒中切出，与同样酶消化的pHC20载体连接，获得的重组质粒用Xho I和Not I酶消化，并与用同样酶从pGEM3′质粒中切出的3′调控序列连接，获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV1；用相同的策略将鸡卵清蛋白基因的5′和3′调控序列同时克隆入pcDNA2.2载体，获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV2；用Sal I和Xho I酶消化pcDNA2.2载体，与用同样酶从pGEM5′质粒中切出的鸡卵清蛋白基因的5′调控序列连接，获得的鸡输卵管特异表达载体命名为pOV3。三种载体的的结构见附图。

用于克隆鸡卵清蛋白基因调控序列的PCR引物

5′调控区正向引物：

5-TTGTCGACGCAGACTGACATGCATTTCATAGG-3

5′调控区反向引物：

5-ATGGATCCCTCGAGGGTGAACTCTGAGTTGTCTAGAGC-3

3′调控区正向引物：

5-ATCTCGAGAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAG-3

3′调控区反向引物：

5-ATGCGGCCGCATTGGACACACTGCTCCAGATGAG-3

3、鸡输卵管表达载体的表达特性鉴定：用Xho I酶切开三种鸡输卵管特异表达载体，末端补平后分别与从商品化质粒pSV-β-galactosidase中切出的lacZ报告基因连接，获得的重组载体分别命名为pOV1lacZ、pOV2lacZ、pOV3lacZ，用其转化的大肠杆菌进行LB液体培养，用标准的碱性裂解法和PEG沉淀法制备重组质粒，纯化的三种重组质粒与鸡体内基因转染剂25kDaPEI混合后，分别经翅静脉注射产蛋鸡，每鸡收集到一枚蛋后将其扑杀，取其心、肝、脾、肾和输卵管组织，按商品试剂盒说明进行β-半乳糖苷酶的活性检测，结果显示在鸡输卵管细胞和蛋清中能检测到β-半乳糖苷酶活性，而在心、肝、脾、肾等组织中不能检测到β-半乳糖苷酶活性，证明三种载体不仅能指导报告基因在输卵管细胞中表达，表达具有良好的组织特异性，而且能将表达产物分泌到蛋清中，符合鸡输卵管特异表达载体的设计要求，其中以pOV3的表达水平较高。

4、基因转染剂的选择：将含lacZ报告基因的三种重组载体分别与商品化的脂质体(Lipofectamine^TM reagent)、100kDa和25kDa的PEI混合，然后分别注射产蛋鸡和进行重组酶的活性检测，结果发现PEI包被载体的表达水平与脂质体无明显差异，而100kDa PEI的毒性较强，最终选择25kDa PEI为转染剂，使用浓度为10毫克/毫升。

5、基因注射剂量及次数的选择：用Xho I限制酶将克隆在pGEM-T质粒中的人组织激肽释放酶cDNA切出，分别与同样酶切开的三种鸡输卵管特异表达重组载体连接，用标准的碱性裂解法和PEG沉淀法从获得的重组菌培养中制备重组质粒，与选定的鸡体内基因转染剂PEI混合，比例为1微克DNA∶2微升PEI，分别经翅静脉注射产蛋鸡，注射总量共2-3毫克重组载体，分一次或两次(次日)注射，然后收集鸡蛋，按标准的方法进行组织激肽释放酶的活性测定，结果显示三种载体均能指导目的基因在鸡输卵管细胞中的表达，表达产物能分泌到蛋清中，其中以pOV3的表达水平最高，高峰期的酶活性高达58U/毫升，表达时间维持10天左右。

6、鸡品种对表达水平的影响：选择新扬州蛋鸡和青壳蛋鸡为实验对象，用上述建立的方法进行基因注射和酶的活性测定，结果显示两个品种鸡的外源基因表达水平无明显差异。

7、重复注射对表达水平的影响：在初次基因注射和重组酶表达下降至基因注射前水平时，用同样的方法和剂量对试验鸡进行再次基因注射，蛋清中的酶活性测定结果显示，再次注射后重组酶的表达水平较初次注射略高，说明试验鸡可以反复注射和利用。

8、重组酶的鉴定：将重组载体注射前、后收集的鸡蛋清进行聚丙烯酰胺电泳，用人组织激肽释放酶特异单克隆抗体进行免疫转印，与重组载体注射前的鸡蛋清相比，在重组载体注射后的鸡蛋清中出现分子量分别为36-37kDa和43kDa的两条带，前者与天然人组织激肽释放酶的分子量相符，后者可能是保留7个氨基酸的原酶；将含重组酶的蛋清用不同pH的缓冲液稀释，然后进行酶的活性测定，结果显示蛋清中的重组酶在pH小于4.0和大于10.0时无活性，在pH5.0-10.0之间都有活性，以pH7.0时的活性最高；将含重组酶的蛋清分别在37℃、55℃、75℃和100℃孵育30分钟，然后进行酶的活性测定，结果在37℃下孵育过程中，酶活性先呈上升趋势，30分钟时由原来的48U/毫升上升至340U/毫升，这是在37℃温度下人组织激肽释放酶自身激活的结果，30分钟后呈逐渐下降趋势，但孵育60分钟后的酶活性仍高于37℃孵育前的酶活性，重组酶在其它温度条件下的热稳定性与已报道的天然人组织激肽释放酶相似，100℃孵育30分钟活性完全消失；用含不同单位重组酶的蛋清灌服自发性高血压大鼠，然后用常规的方法定时测量大鼠的尾动脉舒张压，结果在灌服2、4、6个单位重组酶后的7小时，高血压大鼠的血压均有明显下降，灌服4和6单位重组酶的2天时，试验大鼠的血压与同龄正常大鼠接近，然后逐渐恢复到灌服前水平。

综上所述，本发明构建的鸡输卵管表达载体不仅能有效指导lacZ报告基因和人组织激肽释放酶基因在鸡输卵管细胞中表达，而且表达具有较强的组织特异性，其中pOV3的表达水平最高。重组载体注射鸡的产蛋等生理指标无明显影响，两次基因注射后重组蛋白的表达维持时间为10天左右，不同品种鸡的外源基因表达水平无明显差异，重复注射对外源基因表达水平无明显影响，说明所建立的鸡输卵管暂态表达重组蛋白技术具有通用性和实用性。表达在蛋清中的重组酶具有与天然酶相同的分子量、热稳定性、活性pH范围和降血压作用，说明重组酶的理化及生物学特性与天然酶相同。重组载体用自行设计的方法(不包括在本发明内)从高密度发酵的重组菌培养物中纯化所得，成本低廉，表达在鸡蛋清中的人组织激肽释放酶活性最高达58单位/毫升，37℃激活后可达340单位/毫升，用同样方法表达的人溶菌酶接近1毫克/毫升，证明建立的鸡输卵管暂态表达重组蛋白生物反应器具有较高的表达水平和良好的产业化开发价值。

Claims (2)

1、暂态表达重组蛋白鸡输卵管生物反应器的制造方法，包括以下步骤：

a、分子克隆鸡卵清蛋白基因调控序列：根据已发表的GenBank登录号GI：212504鸡卵清蛋白基因序列设计引物，以中国狼山鸡基因组DNA为模板，用高保真多聚酶链式反应PCR克隆长度分别为3.0kb的5′和3′鸡卵清蛋白基因调控序列；

b、构建鸡输卵管特异表达载体：对pHC粘粒载体修饰获得pHC20载体；对pcDNA3.0真核表达载体修饰获得pcDNA2.2载体；将鸡卵清蛋白基因的5′和3′调控序列同时克隆入pHC20载体，获得pOV1鸡输卵管特异表达载体；将鸡卵清蛋白基因的5′和3′调控序列同时克隆入pcDNA2.2载体，获得pOV2鸡输卵管特异表达载体；将鸡卵清蛋白基因的5′调控序列克隆入pcDNA2.2载体，获得pOV3鸡输卵管特异表达载体；所述对pHC粘粒载体的修饰包括在其SalI和NotI限制酶切位点之间增加XcmI、EcoRI、PstI、SmaI、BamHI、SpeI、XbaI、EagI酶切位点；对pcDNA3.0真核表达载体修饰为去掉其中的SV40病毒序列和新霉素neo抗性基因，

c、将含人组织激肽释放酶基因GenBank登录号为GI：22027643的三种鸡输卵管特异表达重组载体与选定的鸡体内基因转染剂25kDa聚乙烯亚胺PEI混合，比例为1微克DNA∶2微升PEI，分别经翅静脉注射产蛋鸡，注射剂总量为2～3毫克重组载体，分一次或两次注射。

2、根据权利要求1所述暂态表达重组蛋白鸡输卵管生物反应器的制造方法，其特征在于：鸡体内基因转染剂25kDa聚乙烯亚胺PEI的浓度为10毫克/毫升。

Images