CN1274835C - 结核分枝杆菌esat－6蛋白在毕赤氏酵母中的融合表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体为一种结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤氏酵母中的融合表达方法。它将esat-6基因和人α-2a干扰素基因串联起来，两者间的linker为人肠激酶识别序列，将重组融合基因的DNA片段插入表达载体p PIC9K，电击导入毕赤氏酵母菌株SMD1168中，实现ESAT-6融合蛋白的高效分泌表达。经疏水层析和离子交换获得纯的ESAT-6蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，是一种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)ESAT-6蛋白的融合表达方法。具体是通过构建毕赤氏酵母重组工程菌株，经摇瓶发酵高效分泌表达ESAT-6融合蛋白，经分离纯化获得ESTA-6融合蛋白。
背景技术
ESAT-6蛋白是在结核分枝杆菌短期培养滤液中分离到的一种分泌性蛋白，由95个氨基酸残基组成，分子量为9.9KD。ESTA-6蛋白仅存在于结核杆菌群及少数几种致病性分枝杆菌中，卡介苗(BCG vaccine)所有菌株缺乏该蛋白；90％以上的非致病性分枝杆菌菌株缺失esat-6基因。牛型结核分枝杆菌的四种分泌性蛋白MPB59、MPB64、MPB70、和ESTA-6中，仅ESAT-6蛋白能够区分出BCG所免疫的动物和牛型结核分枝杆菌所感染的动物；对ESAT-6蛋白的特异性IFN-r应答仅在结核分枝杆菌所引起的肺疾患者中存在，鸟型分枝杆菌群(MAC)引起的肺疾患者及健康对照者中均未观察到该反应。因此ESAT-6蛋白可作为诊断动物和人的致病性结核分枝杆菌感染的特异性诊断试剂。
抗结核分枝杆菌的免疫回忆反应是由免疫效应细胞所介导，在远交系豚鼠模型和牛TB动物模型中，ESAT-6蛋白是这种效应性T细胞的主要靶抗原之一，可在再次结核感染的早期，诱导其迅速增殖和释放高水平IFN-r，从而有效地激活巨噬细胞。而将ESAT-6蛋白辅以佐剂—磷酰基脂质A(MPL)制成亚单位疫苗，可诱导产生强烈的特异性T细胞反应和与BCG相当的保护效应。因此ESAT-6蛋白可作为亚单位疫苗的组分以达到对结核病长期、有效的预防。
用基因工程方法，构建重组ESAT-6蛋白工程菌株，是大规模生产ESAT-6蛋白的最佳途径。目前国内有人尝试利用大肠杆菌表达系统来表达ESAT-6蛋白，虽可获得高水平的表达，但所表达的重组ESAT-6蛋白主要以包涵体(inclusion body)形式存在，而且至今未见该蛋白具有生物活性的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效表达结核分枝杆菌ESAT-6融合蛋白的方法。具体是采用DNA重组技术构建毕赤氏酵母重组工程菌株，经摇瓶发酵和SDS-PAGE鉴定，证明重组菌能高效分泌表达ESAT-6融合蛋白；该融合蛋白经生物活性分析和western blot鉴定，表明它具有较高的干扰素活性，并能和结核病人的血清发生特异性结合。
本发明提出的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的融合表达方法，将结核分枝杆菌的esat-6基因和人α-2a干扰素基因串联起来，两者间的linker为人肠激酶识别序列，将重组融合基因的DNA片段插入表达载体p PIC9K，电击导入毕赤氏酵母(Pichia pastoris)菌株SMD1168中，实现ESAT-6融合蛋白的高效分泌表达。经疏水层析和离子交换获得纯的ESAT-6融合蛋白。
本发明的具体操作步骤如下：
1.构建重组表达质粒
分别以αF9质粒(含人α-2a干扰素基因，该基因序列已公开发表)和E1f质粒(含结核分枝杆菌esat-6基因，该基因序列已公开发表)为模板，通过PCR扩增得到人α-2a干扰素基因和结核分枝杆菌esat-6基因。α-2a干扰素基因的5’端和3’端分别含有XhoI和NotI酶切位点。esat-6基因的5’端含有NotI酶切位点和人肠激酶Linker，3’端含有EcoRI酶切位点。将α-2a干扰素基因片段用XhoI和NotI双酶切，esat-6基因片段用NotI和EcoRI双酶切，质粒pPIC9(INVITROGEN公司产品)用XhoI和EcoRI双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，获得重组质粒pPIC9-α2a-esat6。将该重组质粒用BamHI和SalI双酶切，所得到的小片段插入表达质粒pPIC9K(INVITROGEN公司产品)，获得重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6。
2.筛选重组工程菌株
将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6经SalI单酶切后，电转化毕赤氏酵母SMD1168(INVITROGEN公司产品)，转化液涂布RDB平板，培养后获得转化子。转化子经G418抗性筛选，(在含4mg/mlG418的YPD平板上)获得高抗性菌株。高抗性菌株经摇瓶发酵和SDS-PAGE检测，证明能高效分泌表达分子量大小约为30KD的ESAT-6融合蛋白。
3.摇瓶发酵
将上述所得的高抗性菌株用BMGY培养基，进行摇瓶发酵。具体可在优化BMGY培养基中，在30℃下振荡培养24h左右，菌液离心6000r/min 6min，收集菌体，用优化BMMY培养基(摇瓶)悬浮，同样条件下振荡培养96h，每24h补加一次甲醇。上清液经检测，ESAT-6融合蛋白表达水平约为60mg/L。
4.分离纯化
发酵上清液经phenyl-Sepharose疏水层析和DEAE-Sephadex离子交换，获得纯的ESAT-6融合蛋白。
ESAT-6融合蛋白的生物活性分析和特异性检测方法如下：
分别取第2、3、4天发酵液上清和初步纯化后的样品测定干扰素生物活性，证明ESAT-6融合蛋白有较高的干扰素活性。另外分别以结核病人血清和鼠抗人α干扰素单克隆抗体作为一抗，对工程菌株表达的产物进行western blot鉴定，证明其为ESAT-6融合蛋白。
本发明中，在重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6上，α-2a干扰素基因位于重组DNA的5’端，esat-6基因位于3’端，两者之间的Linker为人肠激酶识别序列。该肠激酶Linker的DNA序列可设计如下：
5’...
GCGGCCGCT
GATGACGATGACAAA...3’
NotI 人肠激酶Linker
因此表达得到的融合蛋白的N端为重组α-2a干扰素，C端为ESAT-6蛋白，两者之间为肠激酶识别肽。
已知人α-2a干扰素具有抗病毒和增强机体免疫力的功效，esat-6基因与人α-2a干扰素基因的串联，有利于esat-6基因在毕赤氏酵母中的表达。在本发明中，酵母所表达的融合蛋白的N端为重组α-2a干扰素，C端为重组ESTA-6蛋白，如果直接将融合蛋白导入体内，利用人体自身的肠激酶可分离α-2a干扰素和ESTA-6蛋白，也可以在体外通过酶解就实现分离。研究发现ESAT-6融合蛋白不仅具有较高的干扰素活性，而且可以和结核病人的血清发生特异性结合，因此在结核病的快速诊断和疫苗的研制上具有应用前景。
附图说明
图1本发明的重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6的构建图。
图2本发明的SDS-PAGE电泳图谱：1、蛋白分子质量标准；2～4、重组工程菌株SMD1168/pPIC9K-α2a-esat6的发酵液上清；5、毕赤氏酵母SMD1168的发酵液上清。
图3本发明的ESAT-6蛋白的western blot检测。
图4本发明的α-2a干扰素的western blot检测。
具体实施方式
实施例1、重组表达质粒的构建和鉴定
质粒pPIC9用XhoI和EcoRI双酶切，含有α-2a干扰素基因的PCR产物用XhoI和NotI双酶切，含有esat-6基因的PCR产物用NotI和EcoRI双酶切。然后用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，提取重组质粒pPIC9-α2a-esat6酶切鉴定。然后再将该重组质粒用BamHI和SalI双酶切并回收小片段，质粒pPIC9K也用BamHI和SalI双酶切并回收大片段，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Top10，提取重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6，酶切鉴定和DNA序列测定，证明重组表达质粒的构建完全正确。
实施例2、重组表达质粒电转化毕赤氏酵母SMD1168
接种毕赤氏酵母SMD1168(pep4，his4)于YPD培养基中，30℃振荡培养至OD600为1.3～1.5，4℃5000r/min离心5min，收集菌体，用预冷无菌水和1mol/L山梨醇各洗涤一次，最后用1mol/L山梨醇200μl悬浮，即得到SMD1168感受态细胞。取80μl SMD1168感受态细胞与5μg以SalI单酶切的重组表达质粒混合，在1300v，25μF，200Ω条件下电击转化，用1mol/L山梨醇1ml悬浮后，涂布于RDB平板，30℃培养3～4d，结果得到1000余个转化子。
实施例3、G418高抗性酵母转化子的筛选
将在RDB平板上长的1000余个酵母转化子菌落点种到含G418浓度为1.5、3.0、4.0mg/ml的YPD平板上，30℃培养，逐级筛选G418抗性菌株。结果在含4mg/ml G418平板上获得28个菌株。
实施例4、高表达重组工程菌的筛选
将G418高抗性转化子接种于含3ml BMGY的试管，30℃振荡24h，取1.5ml菌液转入50ml优化BMGY培养基中，在30℃条件下，振荡培养24h左右，菌液离心6000r/min6min，收集菌体。用15ml优化BMMY培养基悬浮，同样条件振荡培养96h，每24小时补加一次甲醇。取发酵第4天的发酵液上清，用15％SDS-PAGE检测。结果获得6株高表达菌株，选其中32号菌株作为实验菌株，其ESAT-6融合蛋白表达水平约为60mg/L发酵液。
实施例5、表达产物的western blot鉴定
关于ESAT-6蛋白的特异性检测：将电泳后的SDS-PAGE凝胶剥离，电转移到NC薄膜上，200mA恒流转移2h；将NC膜放入5％脱脂牛奶封闭液中，37℃振荡1h，用TBS室温振荡洗3次；将结核病人血清2ml作为一抗，室温孵育1h，用TBS振荡洗3次；用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体(用5％的牛奶稀释10000倍)作为二抗，孵育1h，用TBS振荡洗3次；；加入0.1mol/LTris·HCl(PH7.5)5ml，100μl DAB储存液(40mg/ml)，25μl NiCl2储存液(40mg/ml)和3％H2O215μl，闭光显色5min后，用水洗终止反应。
关于α-2a干扰素的特异性检测：方法基本同上。以鼠抗人α干扰素单克隆抗体(用5％脱脂牛奶稀释500倍)作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体(用5％脱脂牛奶稀释10000倍)作为二抗，于暗室中加入DAB缓冲液10ml后，再加入Peroxide Buffer700μl和Ehancer Solution 700μl，萤光显色。
实施例6、表达产物的干扰素生物活性的测定
分别取第2、3、4天发酵液上清和经初步纯化后的样品由上海万兴生物制药有限公司测定干扰素的生物活性，以未插入外源基因的酵母SMD1168发酵液上清作为对照。
测得干扰素活性如下表：
| 样品 | 第2天样品 | 第3天样品 | 第4天样品 | 初步纯化样品 | 对照 |
| 活性(U/ml) | 3.15×105 | 1.24×106 | 2.10×106 | 2.97×106 | 0 |
由上表可知：从发酵第2天到第4天，α-2a干扰素的活性逐渐升高，其中第3天和第4天的活性差别不大，对照没有活性。
实施例7、表达产物的分离纯化
在发酵上清液中加入硫酸铵至终浓度为1M，置4℃2h，离心后取上清，加入已平衡好的Phenyl-Sepharase柱，流速为0.5ml/min。用5倍体积1M硫酸铵洗涤，再分别用重蒸水洗脱和30％异丙醇洗脱，收集流出样品，作电泳检测。将蛋白样品装入透析袋，置于0.1M磷酸钠缓冲液中透析。透析后的蛋白样品离心后，加入已平衡好的DEAE-Sephadex柱中，流速为0.5ml/min。先用10倍体积0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.6)洗涤，再用5倍体积含NaCl的0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.6)洗脱，收集洗脱样品作电泳检测。
Claims (2)
1、一种结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的融合表达方法，其特征是将结核分枝杆菌的esat-6基因和人α-2a干扰素基因串联起来，两者之间的Linker为人肠激酶识别序列，重组DNA插入分泌型表达载体p PIC9K，线性化后电击导入毕赤氏酵母菌株SMD1168中，实现ESAT-6融合蛋白的高效分泌表达，经疏水层析和离子交换获得纯的ESAT-6融合蛋白；所述肠激酶识别序列为：
5’......
GCGGCCGC T
GATGACGATGACAAA......3’
NotI 肠激酶Linker 。
2、根据权利要求1所述的融合表达方法，其特征在于具体操作步骤如下：
(1)构建重组表达质粒
分别以含人α-2a干扰素基因的αF9质粒和含结核分枝杆菌esat-6基因的E1f质粒为模板，通过PCR扩增得到人α-2a干扰素基因和结核分枝杆菌esat-6基因；α-2a干扰素基因的5’端和3’端分别含有XhoI和NotI酶切位点，esat-6基因的5’端含有NotI酶切位点和人肠激酶Linker，3’端含有EcoRI酶切位点；将α-2a干扰素基因片段用XhoI和NotI双酶切，esat-6基因片段NotI和EcoRI双酶切，质粒pPIC9用XhoI和EcoRI双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，获得重组质粒pPIC9-α2a-esat6；将该重组质粒用BamHI和SalI双酶切，所得到的小片段插入表达质粒pPIC9K，获得重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6；
(2)筛选重组工程菌株
将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6经SalI单酶切后，电转化毕赤氏酵母SMD1168，转化液涂布RDB平板，培养后获得转化子；转化子经G418抗性筛选，获得高抗性菌株；
(3)摇瓶发酵
将上述所得的高抗性菌株接入优化BMGY培养基，进行摇瓶发酵；
(4)分离纯化
发酵上清液经phenyl-Sepharose疏水层析和DEAE-Sephadex离子交换，获得纯的ESAT-6融合蛋白。
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