CN1257712C - 光动力的卟啉抗微生物剂 - Google Patents

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Abstract

公开一系列新的带正电卟啉，当以比现有技术教导的那些卟啉低得多的浓度存在和短得多的照射时间时，其在使革兰氏阳性和革兰氏阴性菌对可见光光敏，导致这些细菌死亡中显示显著提高的效率。这些卟啉其特征在于在周围取代基中高达4个正电荷的存在和至少一个疏水尾部，所述疏水尾部包含6-22个碳原子在内，在所示带电位点中的一个或多个处开始。

Description

光动力的卟啉抗微生物剂
发明背景
1.技术领域
本发明涉及抗微生物剂。更具体地，本发明涉及一系列新的带正电的卟啉，其具有至少2个并可达4个的位于四吡咯大环的周围取代基中的正电荷和至少一个起源于这些带电位点中之一或两个相邻带电位点的疏水尾部，所述带电位点在杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中作为光动力(photodynamic)活性试剂。
2.背景技术
由递增量的微生物发展的对抗生素的抗性被认为是世界范围的健康问题。Tunger等，Int.J.Antimicrob.Agents，15：131-135(2000)；Jorgensen &Ferraro，Clin.Infect.Dis.30：799-808(2000)。在历史上，发现和开发新的抗生素已经是缓慢的过程，其受不确定性，失望折磨，仅相对很少的成功。即使在发现后，有希望的候选药物必须进行严格的测试以确保它们的安全性和功效。因此，高度报导的抗药微生物的出现已经在医学专家和公众中引起恐慌，留下许多疑问，是否可以足够快地开发新的抗生素以防止可能的问题。
作为这个的结果，研究人员已经开始探讨开发用于杀死微生物的非常规抗生素的方法的可能性。该开发计划的目的不仅包括控制抗生素不能治疗的感染，而且另外，通过选择不涉及目标的遗传物质的，或不是诱变的杀死机理限制另外的抗生素抗性微生物菌株的发展。这作用为至少部分抑制选择或产生可能对杀死因子的作用有抗性的菌株。
被评估的一种这样的方法是通过光动力学疗法(“PDT”)治疗微生物感染。这似乎是部分消灭细菌的有价值的备选方法，因为它似乎利用不同于大多数抗生素的典型的机理。通常，PDT是基于光敏分子的使用，所述光敏分子一旦被光活化，产生活性氧物质(“ROS”)，其对于包括细菌，支原体，和酵母的各种各样的原核和真核细胞有毒。Malik等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，5：281-293(1990)；Bertolini等，Microbios，71：33-46(1992)。
该方法的一个重要特征是许多光动力试剂的光敏活性不受细菌对抗生素的抗性损害。而它主要取决于光敏剂本身的化学结构。Malik等，J；Photochem.Photobiol.B：Biol.，14：262-266(1992)。各种类型的已知的中性和阴离子光敏剂，例如显示对革兰氏阳性菌的显著的光毒性活性，而对革兰氏阴性菌不显示明显的细胞毒素活性除非通过用EDTA或聚阳离子处理改变革兰氏阴性菌的外膜渗透性。Bertolini等，FEMS Microbiol.Lett.，71：149-156(1990)；Nitzan等，Photochem.Photobiol.，55：89-97(1992)。不局限于任何一种理论，根据当前研究，似乎革兰氏阴性菌的更复杂和更厚的细胞包膜(与革兰氏阳性菌比较)可防止这些光敏剂分子的有效结合。另外，在能够造成致命损伤之前包膜可以简单地截取和钝化由光敏剂分子产生的细胞毒素的活性氧种类。Ehrenberg等，Photochem.Photobiol.，41：429-435(1985)；和Valduga等，Photochem.Photobiol.B：Biol.，21：81-86(1993)。
相反，带正电的光敏剂，包括卟啉和酞菁染料，促进革兰氏阴性菌的有效失活而不需要修饰细胞包膜的天然结构。Merchat等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，32：158-163(1996)；和Minnock等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，32：159-164(1996)。再次，不局限于任何一种理论，似乎正电荷有利于光敏剂分子在关键细胞位点处的结合，所述关键细胞位点一旦曝露于光，导致细胞生存力的丧失。Merchat等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，35：149-157(1996)。
当前研究的各种带正电的光敏剂中的一种是基于卟啉分子。卟啉是具有环状四吡咯核的大环分子化合物。因而，通常发现卟啉是与金属离子配位的二价阴离子形式。四吡咯核的独特性质已经使卟啉成为在许多生命过程中起重要作用的许多生物系统的中心。几种对于基本生物过程极其重要的化合物，如叶绿素和血红素是来源于金属离子与卟啉核的配位。H.R.Mahler和E.H.Cordes，Biological Chemistry，第二版418，1966。
卟啉通常通过用侧链如例如甲基，乙基，乙烯基，丙酸，或芳基取代在位置1和8的一个或多个以及内消旋-(吡咯桥键)碳原子的氢原子而来源于母体四吡咯卟吩。同上。经常基于它们包含的侧链将卟啉分类。一个或两个吡咯部分的氢化产生对应的叶绿素，和各自细菌叶绿素衍生物。
如上简述，卟啉能够与各种各样的金属离子形成金属螯合物，所述金属离子包括：钴，铜，铁，镁，镍，银，和锌。同上在419。血红素是卟啉的铁螯合物，而叶绿素和细菌叶绿素是镁螯合物。例如这些的卟啉通常是从前体甘氨酸和琥珀酰CoA合成。参见L.Stryer，Biochemistry，第二版504-507(1981)。
目前的卟啉和它们使用的技术要求它们必须以至少10μM的浓度使用以便在处理细菌和其它微生物感染中，乃至用于水的光消毒中作为抗微生物剂。然后它们必须被照射大约30分钟之久。参见同上。
一种基于卟啉的阳离子光敏剂显示有效杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，包括有效地使大肠杆菌失活，是阳离子内消旋-四(N-甲基-4-吡啶基)卟吩，或“T4MPyP”。参见Merchat，等，J.Photochem.& Photobiol.B：Biol.32：153-157，(1996)；Merchat，等，J.Photochem.& Photobiol.B：Biol.，35：149-157，(1996)；Okuno，Synthesis，July 1980，537，和Valduga等，Biochem.Bioplzys.Res.Comm.，256：84-88(1999)。不局限于任何一种理论，似乎该卟啉的光毒性活性是由外膜和细胞质膜的酶和运输功能的损伤介导的。发现DNA不是T4MPyP光敏化的初始目标。
已经进一步非常确定光敏剂的亲水性或亲脂性强烈影响光敏剂与靶细胞的结合，因而影响它的细胞毒素活性。Merchat等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，35：149-157(1996)。
当前已知的卟啉光敏剂，当前它们合成的方法，和关于它们用途的已知技术对于许多期望的应用是不够的。这确实部分是由于需要高浓度的试剂和需要延长的照射时期。这些因素致使方法繁重和不方便。另外，该条件不适合于许多医学和/或工业应用。
因此需要新的用于医学或其它应用的光敏抗微生物剂。提供利用非诱变的钝化或杀死生物的途径的抗微生物剂将是本领域中的一种改善。提供备选的适合用于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及其它微生物的疏水阳离子卟啉光敏剂将是本领域中的进一步改善。最后，提供这样的能够在比当前本领域已知和教导的更低浓度下和更短时期内有效作用的光敏剂将是本领域中的另一种改善。
发明概述
根据目前现有技术已经开发本发明的组合物，它们合成的方法，和它们使用有关的方法。特别地，根据本领域的问题和需要已经开发本发明的这些方面，通过当前提供的带正电卟啉，卟啉合成方法，和使用卟啉杀死包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的微生物的方法已经完全解决这些问题和需要。因此，本发明总的目的是提供带正电的光动力卟啉和它们用作光动力抗微生物剂的方法，该抗微生物剂比本领域的那些性能更好。
为了实现前述目的，按照如在这里优选实施方案中举例说明和概括描述的本发明，提供一组新的带正电的卟啉。这些新的卟啉中的许多具有高达4个正电荷。另外，这些新的卟啉还包括至少一个疏水尾部，其由至少一个长度为6-22个碳(包括在内的)的链烃组成。
在应用本发明的一个实施方案中，光动力抗微生物剂包含含有4个季铵化氮的卟啉。在本发明的该变体中，卟啉另外包含在一个季铵化氮处开始的烃尾部。在有些情况下，卟啉是吸光还原的卟啉。在有些情况下，还原的卟啉选自二氢卟酚和菌绿素。在其它情形下，卟啉或还原的卟啉是金属螯合的卟啉。在这些情形中，其金属螯合物用作光动力抗微生物剂的金属包括Mg(镁)，Sc(钪)，Zn(锌)，Al(铝)，In(铟)，Tl(铊)，Si(硅)，Ge(锗)，Sn(锡)，Pd(钯)，和Pt(铂)。
在本发明的其它实施方案中，烃尾部选自直链烷基，直链链烯基，支链烷基，支链链烯基，芳烃，混合烷基-芳烃类，和混合链烯基-芳烃类。在这些的某些中，烃尾部包含6-22个碳(包括在内的)。在其它中，烃尾部包含10-18个碳(包括在内的)。在一些特定的实施方案中，烃尾部包含苄基。在其它中，烃尾部包含6个碳的链。在还有的其它中，烃尾部包含10个碳原子的链。在其它实施方案中，烃尾部包含14个碳的链。在还有的其它中，烃尾部包含18个碳的链。
在其它实施方案中，应用的本发明是包含含有4个季铵化氮的卟啉，并且另外包含烃尾部的光动力抗微生物剂，所述烃尾部由6-22个碳(包括在内的)组成，并在所述一个季铵化氮处开始。在这些实施方案中的一些中，烃尾部包含6-18个碳。在其它的实施方案中，卟啉是吸光还原的卟啉。在这些之中，还原的卟啉可选自二氢卟酚和菌绿素。如上所述，烃尾部烃尾部选自直链烷基，直链链烯基，支链烷基，支链链烯基，芳烃，混合烷基-芳烃类，和混合链烯基-芳烃类。在还有的其它实施方案中，卟啉或还原的卟啉是金属螯合的卟啉。在这些情形中，其金属螯合物用作光动力抗微生物剂的金属包括Mg(镁)，Sc(钪)，Zn(锌)，Al(铝)，In(铟)，Tl(铊)，Si(硅)，Ge(锗)，Sn(锡)，Pd(钯)，和Pt(铂)。
在本发明的光动力抗微生物剂的特定形式中，烃尾部包含苄基。在其它中，烃尾部包含6个碳的链。在还有的其它中，烃尾部包含10个碳的链。在其它中，烃尾部包含14个碳的链。在还有的其它中，烃尾部包含18个碳的链。
在一个优选实施方案中，本发明包含一系列含有4个季铵化氮的内消旋(meso)-四-(N-甲基-吡啶基)卟啉的衍生物，其中一个N-甲基被C1-C22的烃尾部取代。在一些实施方案中，烃尾部包含6-22个碳。在其它中，烃尾部包含6-18个碳。
在这些内消旋-四-(N-甲基-吡啶基)卟啉衍生物的实施方案中的一些中，卟啉是吸光还原的卟啉。在这些中的一些中，还原的卟啉选自二氢卟酚和菌绿素。在其它中，卟啉或还原的卟啉是金属螯合的卟啉。在这些情形中，其金属螯合物用作光动力抗微生物剂的金属包括Mg(镁)，Sc(钪)，Zn(锌)，Al(铝)，In(铟)，Tl(铊)，Si(硅)，Ge(锗)，Sn(锡)，Pd(钯)，和Pt(铂)。
另外，在这些内消旋-四-(N-甲基-吡啶基)卟啉衍生物的实施方案中的一些中，烃尾部选自直链烷基，直链链烯基，支链烷基，支链链烯基，芳烃，混合烷基-芳烃类，和混合链烯基-芳烃类。在还有的其它实施方案中，卟啉或还原的卟啉是金属螯合的卟啉。在这些中的一些中，烃尾部包含苄基。在其它中，烃尾部包含6个碳的链。在其它中，烃尾部包含10个碳的链。在还有的其它中，烃尾部包含14个碳的链。在还有的其它中，烃尾部包含18个碳的链。
在本发明的其它实施方案中，本发明包含合成含有4个对称分布在4个季铵化氮上的正电荷和单一疏水烃尾部的卟啉的方法。本发明该方法的一个实施方案包含以下步骤：提供卟啉，通过将它与亚化学计量数量的(sub-stoichiometric quantity)所需疏水烃尾部的卤化物盐反应，季铵化卟啉的第一个氮原子，从非单季铵化的卟啉中分离单季铵化的卟啉，使用甲基化剂季铵化剩余的卟啉氮，从反应混合物中分离产生的含有4个对称分布的正电荷和单一疏水烃尾部的卟啉。在本发明的一些实施方案中，当适于给定应用时，缩短、简化、乃至省略从非单季铵化的卟啉中分离单季铵化的卟啉和分离产生的含有4个对称分布的正电荷和单一疏水烃尾部的卟啉的步骤之一或两者。
卤化物盐可选自直链烷基，直链链烯基，支链烷基，支链链烯基，芳烃，混合烷基-芳烃，和混合链烯基-芳烃的卤化物盐。另外，甲基化剂可以是对甲苯磺酸甲酯，甲基碘，硫酸二甲酯，氟代磺酸甲酯，和其它适当的甲基化剂。在本发明的方法中从非单季铵化的卟啉中分离单季铵化的卟啉可以利用溶解度差异来完成。另外，分离产生的含有4个对称分布的正电荷和单一疏水烃尾部的卟啉的步骤可以使用色谱法来完成。当保证卟啉的预期应用时可以简化或忽略该步骤，如在生产本发明用于工业目的的卟啉中，其中纯度的高百分率足够，不要求医药级纯度。
本发明另外包含使用光动力卟啉抗微生物剂杀死包括革兰氏阳性和/或革兰氏阴性的微生物的方法。这里所用的术语微生物包括微生物如细菌，真菌，藻类，和病毒。抗微生物剂是一类杀死微生物或抑制它们生长的化学药剂。该方法的一个实施方案包含以下步骤：提供光动力抗微生物剂，其包含含有4个对称分布的正电荷的卟啉和疏水尾部，将革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌曝露于所述光动力抗微生物剂，并照射抗微生物剂一段时间。
在该方法的一些变体中，所用卟啉是吸光还原的卟啉。在这些之中，还原的卟啉可以选自二氢卟酚和菌绿素。在其它变体中，卟啉或还原的卟啉是金属螯合的卟啉。在这些情形中，其卟啉螯合物用作光动力抗微生物剂的金属包括Mg(镁)，Sc(钪)，Zn(锌)，Al(铝)，In(铟)，Tl(铊)，Si(硅)，Ge(锗)，Sn(锡)，Pd(钯)，和Pt(铂)。
另外，在本发明的实施方案中，烃尾部可烃尾部选自直链烷基，直链链烯基，支链烷基，支链链烯基，芳烃，混合烷基-芳烃类，和混合链烯基-芳烃类。在这些中的一些中，烃尾部可包含6-22个碳(包括在内的)。在其它中，烃尾部可包含6-18个碳(包括在内的)。在还有的其它中，烃尾部可包含苄基。在其它中，烃尾部可包含6个碳的链。在还有的其它中，烃尾部可包含10个碳的链。在其它中，烃尾部可包含14个碳的链。另外，在其它实施方案中，烃尾部可包含18个碳的链。在本发明的优选实施方案中，将白光用于方法的照射步骤。
在该方法的一些形式中，卟啉以约10μM至约0.1M的浓度存在。在其它中，卟啉以约5μM至约0.5M的浓度存在。在还有的实施方案的其它形式中，卟啉以1μM的浓度存在。在实施方案的一些形式中，照射发生期间的时期可以是约1至约10分钟。在本发明的一些实施方案中，该时期是大约5分钟。需要照射的时期的测定是基于要杀死的细菌的类型和它吸收抗微生物剂的速率，所用具体抗微生物剂的特性和浓度，所用光的波长，和所用光的强度。基于这些因素本领域的技术人员将能够测定杀死或钝化给定微生物的所需时期。
从下列描述和后附的权利要求中本发明的这些和其它目的、特征和优势将变得更充分地明显，或者可以通过以下阐明的本发明的实施来了解。
附图简述
图1是已知的光动力抗微生物剂T4MPpyP和本发明携带含有增加数量碳原子的N-烷基取代基的新的T4MPyP衍生物。
图2是显示在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中T4MPyP(1)，C18衍生物(2)，和C22衍生物(3)的正规化的吸收光谱图。
图3是显示在pH7.4的磷酸盐缓冲液(“PBS”)中大约5μM的T4MPyP(实线)，C18衍生物(点线)，和C22衍生物(短划线)的正规化的荧光发射(在600nm以上)和激发(在600nm以下)光谱图。
图4是显示在pH＝7.4的常压平衡的磷酸盐缓冲液中的卟啉衍生物的瞬时吸收光谱图，(λexc＝420nn)：(a)延迟时间为1.0(o)，8.0(△)和80(◇)μs的T4MPyP；(b)延迟时间为0.2(o)，2.0(△)和6.0(◇)μs的C18衍生物；和(c)延迟时间为0.05(o)，0.12(△)0.24(◇)和1.6(△)μs的C22衍生物。
图5是显示在用白光照射不同时期后卟啉衍射物光漂白的图。通过测量索雷谱带最大值处的吸光度的减少监视卟啉漂白：422nm T4MPyP(■)，423nm C10(●)，424nm C 14()和432nm C22()。
图6是显示T4MPyP和它的类似物与金黄色葡萄球菌细胞结合的图。在与1μM卟啉在室温下温育5分钟后不洗涤细胞，在使用PBS的1和3个洗涤步骤后测定细胞结合的卟啉的量。
图7是显示T4MPyP和它的类似物与大肠杆菌细胞结合的图。实验条件与图6中的条件相同。
图8是显示在黑暗中暴露于1(白柱)或10μM(灰柱)卟啉的金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌细胞(b)的生长抑制的图。
优选实施方案详述
通过参考图和下列详细描述将最好地理解本发明目前优选的实施方案。将容易地理解本发明的化合物的组分，如在本文图中通常所述和说明，可以排列和设计成各种各样的不同构型。另外，化合物可以以各种各样的浓度使用，如本文证明。因此，下面更详细的描述本发明的装置，系统，和方法的实施方案，如图1至8所示，不是意欲限制要求的本发明的范围，而只是表示本发明目前优选的实施方案。
通过包括从一个带电位点开始的包含6-22个碳(包括在内的)的疏水“尾部”，使含有4个对称定位的正电荷的卟啉作为抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的光动力试剂更有活性。
当“尾部”包含6-18个碳(包括在内的)时这种增加的光动力活性最显著。对于相当的疏水的直链链烯基，支链烷基或链烯基，和芳族或混合烷基芳烃或链烯基芳烃尾部，本领域的技术人员将期望类似的结果。
已经评估本发明化合物的实施方案的光物理和光敏效果。这些研究证实阳离子卟啉代表一类具有有效抗微生物活性的光敏剂。具体地，闪光光解数据指出用渐长的烃链取代T4MPyP(已知光动力敏化剂)中的一个N-甲基对量子产率和最低三重态的生存期仅有较小影响。这进一步显示对典型生物底物，如N-乙酰-L-色氨酰胺(“NATA”)的光敏氧化的效率仅有较小影响(参见疏水性实施例11，表4)。
不局限于任何已知理论，似乎在中性和均匀水介质中的高度疏水的卟啉产生大的低聚物，由于它们短的生存期其不能通过常规的时间分辨光谱技术检测。
在另一方面，卟啉分子总体中高达30％二聚物的存在，如通过关于T4MPyP的荧光衰减研究所示(疏水性实施例9，表2)，似乎对三重态的产生和NATA光氧化的效率不具有显著影响。
聚集部分的存在也可以控制卟啉的抗微生物光毒性作用的效率，如与大量的单体C10，C14和C18衍生物相比在1μM C22的存在下由照射导致的大肠杆菌生长的较小抑制所示。然而，在该情形中各种卟啉与细菌细胞的亲和力无疑起主要作用。因此T4MPyP和它的C6类似物显示与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的相对较低的结合(参见图6和7)，仅在高达10μM的浓度下光诱导显著的针对两种细胞菌株的抑菌和杀菌作用，而C10，C14，和C18类似物在低10倍的浓度下导致类似的效果。这些结果提示光敏剂分子疏水性有限的增加增强它对细菌细胞的亲和力，由此促进更有效的光失活。
在本发明中，已经通过引入控制长度的饱和烷基链调节疏水程度。不局限于任何一种理论，似乎很可能该链导致另外的效应，其包括可能它的存在干扰细菌细胞的正常功能和/或形态，如由长链卟啉衍生物显示的暗毒性所示。近来的发现进一步证明聚赖氨酸链与光敏剂分子的共价结合加强它抗各种微生物菌株的活性。使用聚赖氨酸衍生的二氢卟酚e6，Hamblin报导了类似的结果。
在本发明中，亲脂性取代基的存在将促进卟啉光敏剂在膜细胞区域中的定位。结果，在光化学过程中涉及遗传材料，由此促进诱变效应开始的可能性减少。同时，在膜中的高卟啉浓度将最优化针对抗生素抗性细菌的光失活活性，因为该现象最经常与特定膜蛋白的表达相关。在C10-C14衍生物的存在下二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株对照射显示的高光敏性完全支持该假说。
本发明的卟啉在比Merchat所用浓度低5至20倍的浓度下显示针对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的光动力效果。在相同条件下含有苄基尾部的卟啉效率大约是基本卟啉的两倍。不局限于任何一种理论，似乎烃部分可增强卟啉对细菌细胞的细胞质膜的亲和力，由此诱导更多的累积和更紧密的结合。除此以外，它可导致有限但重要的膜天然结构的解体，由此增加细胞光敏性程度。
因此，本发明的一个实施方案包含卟啉或吸光还原的卟啉(如二氢卟酚或菌绿素)和它光动力学活性的金属螯合物，其含有4个对称分布的正电荷(季铵化氮)和至少一个在一个季铵化氮处开始的疏水烃尾部，所述尾部包含6-22个碳在内。该卟啉的几个实例为：5-(4-N-癸基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)卟吩四氯化盐或其它适当的阴离子和盐形式如二盐酸盐，或它们的5，10，15，20四(3-吡啶)卟吩类似物，和5(4-N-十四烷基二甲基氨基苯基)-10，15，20-三(4-N-三甲基氨基苯基)卟吩四氯化盐或其它适当的阴离子和盐形式如二盐酸盐。
1.常规合成方法
按照下列一般合成方法制备本发明的光动力抗微生物卟啉。具体的合成实例接着这个一般描述，但不应当认为是限制本发明广泛通用的方法的范围。本申请所述卟啉是从已知的包含4个氮的卟啉制备，所述氮与对称分布在卟啉核周围的基团连接。这些氮可以转化为带正电的季铵盐。
在本发明的第一步中，通过使卟啉在适当的溶剂中与亚化学计量数量的卤代烷基，链烯基，或苄基反应将这些氮中的一个转化成季铵形式。然后通过利用溶解度差异从起始卟啉中分离单季铵化的卟啉。当保证产物卟啉的期望应用时可以简化，缩短，或忽略该步骤。
然后通过使用甲基化剂如对-甲苯磺酸甲酯，硫酸二甲酯，氟代磺酸甲酯，甲基碘，和其它常规使用的适当的甲基化剂。
通过使用分离技术如色谱法将它从反应混合物中去除以纯化终产物。使用离子交换介质可以改变抗衡离子(阴离子)。当保证产物卟啉的期望应用时可以简化，缩短，或忽略这最后的分离步骤。
2.合成实施例
实施例1
制备5-(4-N-癸基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)-21H，23H-卟吩四氯化物二盐酸盐：
在20ml的冰醋酸中回流1g(1.61毫摩尔)5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩加上285mg(1.29毫摩尔)1-溴代癸烷22小时。在用90/10甲醇/6NHCl V/V洗脱的C-18 silica反相板上的薄层色谱法显示大约35-40％的单-N-癸基衍生物和稍微更多的起始卟啉和痕量的二-N-癸基衍生物(取代基增加Rf减小)。将混合物倒入200ml甲醇中并在冷冻机中冷却几小时，然后在冷藏箱中几小时以沉淀起始卟啉。通过离心收集沉淀，通过旋转式真空干燥包含产物的滗析溶剂。在150ml的甲醇中将产生的固体回流4小时，在冷冻机中冷却过夜，然后通过离心去除产生的固体。滗析溶液的薄层色谱法(与上述相同的系统)显示主要单基取代的产物，和一些双取代的卟啉，和痕量的起始卟啉。通过旋转蒸发去除溶剂，然后用于下一步骤而不进一步纯化。
将固体溶解在50ml包含1g对甲苯磺酸甲酯的N，N-二甲基甲酰胺中，回流2小时。通过旋转蒸发去除溶剂，将固体溶解在50ml去离子水中并过滤以去除不溶物。将溶液加样到用40μm丁基(C-4)反相填料(J.T.Baker)填充的8cm×2cm色谱柱上。用3NHCl简单地洗涤柱，然后用50％甲醇，50％1N HCl洗脱。收集主带并通过旋转蒸发干燥以产生400mg有光泽的暗绿色粉末，通过用50％甲醇，50％1N HCl V/V Rf 0.2洗脱的在Whatman KC2 silica反相板上的薄层色谱法评估其大于95％。
实施例2
制备5-(4-N-十四烷基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)-21H，23H-卟吩四氯化物二盐酸盐：
在20ml的冰醋酸中回流1g(1.61毫摩尔)5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩加上357mg(1.29毫摩尔)1-溴代十四烷连同500mg无水乙酸钠16小时。在用异丙醇/水/丙酮/乙酸/浓氢氧化铵，V/V/V/V/V洗脱的silica板上的薄层色谱法显示大约30％单基取代的卟啉和痕量的双取代的和剩余的起始卟啉。通过旋转蒸发去除溶剂，通过用200ml甲醇回流4小时提取固体。趁热过滤以去除大部分起始卟啉，然后在冷冻机中冷却几小时后再次过滤以去除大部分剩余的起始卟啉。在旋转蒸发器上将溶液体积减少至大约20ml，然后在冷冻机中冷却几小时。在小的瓷漏斗上将包含大部分单基取代的卟啉和一些起始卟啉的固体滤去，如通过上述薄层色谱系统确定。
将固体在25ml包含0.5g对甲苯磺酸甲酯的N，N-二甲基甲酰胺中回流2小时。通过旋转蒸发去除溶剂，将固体溶解在50ml去离子水中并过滤以去除不溶物，加样到用40μm丁基(C-4)反相填料(J.T.Baker)填充的8cm×2cm色谱柱上。用3N HCl简单地洗涤柱，然后用50％甲醇，50％ 1N HCl，V/V洗脱。收集主带的中心并通过旋转蒸发干燥以产生110mg有光泽的暗绿色粉末，通过用70％甲醇，30％1N HCl V/VRf＝0.22洗脱的在Whatman KC2 silica反相板上的薄层色谱法评估其大于95％。从洗脱液的其它级分回收另外80mg产物，纯度大约为90％。
实施例3
制备5-(4-N-己基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)-21H，23H-卟吩四氯化物二盐酸盐：
在20ml的冰醋酸中回流1g(1.61毫摩尔)5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩加上273mg(1.29毫摩尔)1-碘己烷和500mg无水乙酸钠18小时。在用异丙醇/水/丙酮/乙酸/浓氢氧化铵，V/V/V/V/V洗脱的silica板上的薄层色谱法显示仅15-20％单基取代产物。将144mg更多的1-碘己烷加入混合物，继续回流另外10.5小时。使用上述系统的薄层色谱法显示20-25％单基取代产物。将另外144mg 1-碘己烷加入混合物并继续回流另外12小时，导致通过上述薄层色谱系统估计的30％单基取代产物。通过旋转蒸发去除溶剂，用100ml回流的甲醇2小时提取固体。在冷冻机中冷却混合物24小时，然后过滤以去除大部分起始卟啉。在旋转蒸发器上将体积减少至大约30ml，在冷冻机中冷却过夜。过滤产生大约100mg固体，其包含大约85-90％单基取代的卟啉，这是通过以上所述的薄层系统评估的。
将固体与400mg对甲苯磺酸甲酯一起在20ml的N，N-二甲基甲酰胺中回流2小时，然后通过旋转蒸发去除溶剂。将固体溶解在30ml热水中，过滤，并加样到用40μm丁基(C-4)反相填料(J.T.Baker)填充的8cm×2cm色谱柱上。用3N HCl简单地洗涤柱，然后用70％1N HCl，30％甲醇，V/V洗脱。收集三个级分并通过用50％甲醇，50％1N HCl，V/V洗脱在Whatman KC2 silica反相板上的薄层色谱法评估。第一级分包含被大约20％四N-甲基化的起始卟啉污染的所需产物。第二级分包含具有估计95％或更好的纯度的所需产物，第三级分主要是二-N-己基，二-N-甲基取代卟啉。在旋转蒸发器上从第二级分去除溶剂，将固体溶解在几毫升的水中，用几滴3N HCl滴定直至溶液变暗绿色，其后将它在冷冻干燥机上冷冻和干燥。有光泽的暗绿色粉末的产率为45mg。在上述反相薄层系统中Rf＝0.36。
实施例4
制备5-(4-N-十八烷基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)-21H，23H-卟吩四氯化物二盐酸盐。
在20ml的冰醋酸中回流1g(1.61毫摩尔)5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩加上490mg(1.29毫摩尔)1-碘代十八烷16小时。在用90/10甲醇/6N HCl V/V洗脱的C-18 silica反相板上的薄层色谱法显示大约等量的单-N-十八烷基衍生物和原材料以及痕量的一-N-十八烷衍生物(取代增加Rf减小)。通过旋转蒸发去除溶剂，加入200ml甲醇和1ml冰醋酸并将溶液回流6小时，然后使在室温下静置过夜。过滤溶液，在旋转蒸发器上将主要包含单基取代的卟啉和少量双取代以及起始卟啉的滤液蒸发干。在100ml甲醇中将固体回流3小时，使在室温下静置过夜，然后放置在冷藏箱中片刻，过滤，将滤液加入先前的滤液中并如上蒸发干。
将干燥的组合滤液溶解在75ml包含1.5g对甲苯磺酸甲酯的N，N-二甲基甲酰胺中并回流2小时。在旋转蒸发器上去除溶剂并将固体溶解在75ml热的去离子水中并过滤去除不溶物。将溶液加样到用40μm丁基(C-4)反相填料(J.T.Baker)填充的2cm×10cm色谱柱上。首先用3N HCl洗涤柱，然后50/50V/V甲醇/1N HCl以去除一些杂质。用70％甲醇，30％3N HCl V/V洗脱产物(通过用70/30甲醇/3N HCl V/V Rf 0.25洗脱在Whatman KC2 silica反相板上的薄层色谱法评估大于95％)，并在旋转蒸发器上干燥以产生400mg有光泽的暗绿色粉末。
实施例5
制备5-(4-N-二十二烷基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)-21H，23H-卟吩四氯化物二盐酸盐。
在20ml的冰醋酸中回流1g(1.61毫摩尔)5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩加上502mg(1.29毫摩尔)1-溴代二十二烷以及500mg无水乙酸钠16小时。然后加入200mg更多的1-溴代二十二烷，将溶液回流另外8小时。然后在旋转蒸发器上使溶液干燥。通过分级结晶或通过silica柱层析都不能从起始卟啉中分离单基取代的衍生物。因此，在50ml N，N-二甲基甲酰胺中将粗反应混合物与1.0g对甲苯磺酸甲酯回流以完成季铵化过程。将溶液缓慢倒入125ml快速搅拌的水中，过滤，并加样到用40μm丁基(C-4)反相填料(J.T.Baker)填充的8cm×2cm色谱柱上。用1NHCl简单地洗涤柱，然后用40％甲醇，60％1N HCl，V/V，然后60％甲醇，40％1N HCl，V/V洗脱以去除四N-甲基化卟啉。用80％甲醇，20％ 1N HCl，V/V将产物从柱上洗脱，并通过旋转蒸发去除溶剂。将产物溶解在少许水中，加入几滴1N HCl直至它变暗绿色，冷冻并在冷冻干燥机上干燥，产生180mg有光泽的暗绿色粉末。用70％甲醇，30％3N HCl，V/V，洗脱在Whatman KC2 silica反相板上的薄层色谱法显示大约95％的纯度，Rf＝0.18。
实施例6
制备5-(4-N-苄基吡啶基)-10，15，20-三(4-N-甲基吡啶基)-21H，23H-卟吩四氯化物二盐酸盐。
在20ml的冰醋酸中回流1g(1.61毫摩尔)5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩加上193mg(1.13毫摩尔)1-苄基溴连同500mg无水乙酸钠2小时。在用异丙醇/水/丙酮/乙酸/浓氢氧化铵，V/V/V/V/V洗脱的silica板上的薄层色谱法显示大约50％单-N-苄基衍生物和大量的起始卟啉和二-N-苄基衍生物。趁热将溶液倒入150ml乙醇中，并在冷冻机中冷却过夜。将溶液过滤以去除大部分起始卟啉，然后在旋转蒸发器上干燥。
将包含单-N-苄基卟啉衍生物的固体与500mg对甲苯磺酸甲酯一起在25ml N，N-甲基甲酰胺中回流2小时，然后通过旋转蒸发去除溶剂。将固体溶解在50ml热水中，过滤，加样到用40μm丁基(C-4)反相填料(J.T.Baker)填充的8cm×2cm色谱柱上。用3N HCl简单地洗涤柱，然后用1N HCl中的20-50％甲醇，V/V洗脱。洗脱的主带包含所需产物，通过旋转蒸发去除溶剂以产生255mg有光泽的暗绿色粉末。通过用70％甲醇，30％1N HCl，V/V洗脱的在Whatman KC2 silica反相板上的薄层色谱法评估的纯度大于95％，Rf＝0.33。
实施例7
制备一系列新的带正电的卟啉并针对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和抗生素抗性的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)检验。确定通过包括从带电位点之一开始的包含6-22个碳(包括在内的)的疏水“尾部”，使含有4个对称定位的正电荷的卟啉作为抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的光动力试剂更有活性。另外，当“尾部”包含多于6个和少于18个碳时，该增加的光动力活性最显著。仅制备和检验直链烷基尾部和苄基尾部，但对于可比较的疏水的，直链链烯基，支链烷基或链烯基，和芳族或混合烷基-芳族或链烯基-芳族尾部，本领域的技术人员将期望类似的结果。上述卟啉在卟啉敏化剂低5-20倍的浓度下显示针对这些细菌的可与在上述Merchat参考中使用的基本卟啉(T4MPyP)相比的光动力效果。在相同条件下含有苄基尾部的卟啉的效率大约是基本卟啉的两倍。参见表1。
在加1.5％NaCl的脑心浸液(Difco)中在20℃下好氧培养细菌。在脑心浸液肉汤中在37℃下好氧培养大肠杆菌。通过离心收获对数生长期的细胞并用10mM磷酸盐缓冲盐溶液pH7.4洗涤3次，所述磷酸盐缓冲盐溶液还含有2.7mM KCl和0.14M NaCl。在该缓冲液中稀释细胞至大约107个细胞/ml的终浓度。
实施例8
相对T4MPyP检验本发明卟啉的各种实例杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的能力。参见表7。将每种化合物与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌温育5分钟，接着用白光照射样品不同长度的时间。
表7：与T4MPYP和不同单-衍生物温育5分钟并用白光照射的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制(％)。
  光敏剂  浓度(μM)   照射时间(分钟)          生长抑制(％)
  大肠杆菌   金黄色葡萄球菌
T4MPYP 10 515 28.782.8 96.4100
单-C6 0.510 530510 4.815.598.7100 ----
  单-C10  0.51   510510   46.39296.1100   73.987.9--
  单-C14  0.5   510   81.8100   72.788.9
  单-C18  0.10.51   510510510   --2656.657.995.7   12.720.241.458.1--
  单-C22  1   51030   2.7-18.5   69.790.2-
  单-苄基  10   510   54.1100   --
首先将T4MPyP以10μM的浓度暴露于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌5分钟。照射第一个样品5分钟。这导致对大肠杆菌28.7％的生长抑制，和对金黄色葡萄球菌96.4％的生长抑制。照射第二个样品15分钟，其导致大肠杆菌82.8％的生长抑制，对金黄色葡萄球菌100％的生长抑制。
接着将单基取代的卟啉暴露于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。该卟啉被己烷尾部取代。将第一个样品以0.5μM的浓度暴露于细菌5分钟。在5分钟时，大肠杆菌只被抑制4.8％。在30分钟时，大肠杆菌被15.5％抑制。将第二个样品暴露于10μM单基取代的卟啉，在5分钟时，大肠杆菌被98.7％抑制。在10分钟时，大肠杆菌被100％抑制。
接下来再用第二种单基取代的卟啉处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌5分钟，其具有10个碳原子的尾部。用0.5μM卟啉处理第一个样品并照射5分钟。在5分钟时，大肠杆菌生长被46.3％抑制，而金黄色葡萄球菌被73.9％抑制。在10分钟时，大肠杆菌被92％抑制，而金黄色葡萄球菌被87.9％抑制。
用浓度为1μM的10个碳原子取代的卟啉处理第二个样品。在用白光照射5分钟后，大肠杆菌被96.1％抑制，在10分钟时，大肠杆菌被100％抑制。
本发明卟啉的光物理和光生物学性质的结合研究证明有益于理解这些阳离子卟啉诱导抗微生物活性的机理。不局限于任何一种理论，光物理数据似乎显示在缓冲水中，放射失活起适中的作用。然而，系间窜越至三重态簇(manifold)似乎是这些卟啉的S1态最重要的松弛途径，除了长链化合物C22以外，在C22中由于它在水中的大量聚集松弛主要通过内转化至基态发生。
不局限于任何一种理论，由此似乎三重态主要负责卟啉的光敏性能。T1的性能，特别是T1的生存期，主要受聚集物形成的影响。这又与光敏活性的降低相关。
因此通过结合精心设计的周围取代基平衡四吡咯大环进行聚集的倾向似乎是重要的。在申请人进行的研究中获得的数据提示通过增加一个适当大小(C10-C14)的烃链到卟啉可以在本发明的优选实施例中实现该目的。这个增加产生增强卟啉对细菌细胞的亲和力的另外的优势。
需要引入提高光敏作用效率的结构元素在革兰氏阴性菌的情形中特别重要。已经反复报导这些细菌与革兰氏阳性菌相比对光敏失活显著地较不敏感。Malik等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，5：281-293(1990)。包含在本申请中的发现进一步支持该结论。参见疏水性实施例13，表5。
特别是对于体内光线疗法的应用，对于当前方法似乎优选设计光敏剂分子以产生暗-和光毒性。这些当前方法中的许多是基于平行引入两组化学药品。第一组化学药品的成员作用为使细菌壁更可渗透的。该化学药品经常包括多粘菌素九肽或EDTA。Malik等，J.Photochern.Photobiol.B：Biol.，14：262-266(1992)，Bertoloni等，FEMS Microbiol.Lett.，71：149-156(1990)。第二组化学药品包括光敏剂，在使细菌更可渗透以后其能够更好地发挥作用。
3.评估增加疏水性对与细菌的亲和力的影响和测量光物理性质的材料和方法
卟啉和其它化学药品：内消旋-四(N-甲基-4-吡啶基)卟吩四甲苯磺酸盐(T4MPyP)购自Frontier Scientific(Logan，UT，USA)，并在不另外纯化下使用。在Frontier Scientific(Logan，UT，USA)实验室中合成各种内消旋-取代的卟吩，其中T4MPyP的一个N-甲基被每个含有递增数量的碳原子的烷基链取代。各种卟啉衍生物的化学结构在图1中显示。所有其它的化学药品是分析级试剂并在不另外纯化下使用。
光谱和光物理研究：用Lambda 5 Perkin-Elmer分光光度计记录卟啉(磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)中大约5μM)的基态吸收光谱。用Perkin-Elmer(型号LS)或Spex(Fluorolog F112)分光荧光计记录校正仪器响应的荧光光谱。通过测量发射光谱(600-800nm范围，在560nm激发)的面积和使用甲苯中的四-正丙基porphycene作为参比(ΦF＝0.38)，测定卟啉衍生物在PBS中和在包含2％十二烷基硫酸盐的(洗涤剂，以下“SDS”)水中的荧光量子产率(ΦF)。Braslavsky等，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，40：191-198(1997)。在所有情形中，将样品和参比溶液的吸光度保持在激发波长处的0.1之下以最小化内部的滤波效应。
基于相转变法通过Spex Fluorolog-τ2分光光度计测量卟啉样品的荧光衰变时间。全面分析频率响应曲线(相转变和解调比率对频率)。
通过使用先前在Gorner等中描述的装置进行激光闪光光解实验，激发波长为355和420nm。Gorner等Photoinduced electron transfer betweenstyrylanthracenes and electron donors and acceptors in acetonitrile，J.Chem.Noc.Faraday Erans.，第88卷，第29-34页(1992)。
耐光性研究：在使用白光(400-800nm)照明1μM溶液后在PBS中测定卟啉的耐光性，所述白光分离自装备有UV和红外滤色片(Teclas，Lugano，瑞士)的石英卤素灯。灯以150mW/cm2的流量率运转。在照射期间，将溶液磁搅拌并保持在37℃。在不同照射时间分光光度计监视卟啉样品的浓度，并将耐光性表达为参照照射前所测吸光度的剩余吸光度的百分比。
体外光氧化研究：通过测量它们促进作为典型生物底物的N-乙酰-L-色氨酰胺(NATA，Aldrich Chem.Co.)的光氧化效率检测各种卟啉的光敏活性。为了这个目的，在5μM卟啉的存在下照射在PBS中或在包含2％SDS的水中的10μM NATA。用通过干涉滤光片(Balzers，Liechtenstein)分离的515±10nm的光进行照射，同时在1cm光路的石英比色杯中磁搅拌溶液(2ml)并保持在25℃。在光敏修饰NATA以后接着测量在不同照射时间经290nm的光激发后它的荧光发射光谱(300-450nm)强度的减小。将InF°/F(其中F°和F分别表示在时间0和t的荧光强度)对照射时间绘图可以得到光化学过程的一级速率常数。
通过使用甲苯中的Aberchrome 999P作为光能测定仪测量入射光的强度。Heller，EPA Newslett.，29：49-60(1987)。该参数被用于计算被不同卟啉敏化的NATA光氧化的量子产率。
卟啉与细菌细胞的结合：在脑心浸液肉汤(BHI，Difco，Detroit，Michigan)中在37℃下好氧培养大肠杆菌，菌株04(野生型)，和甲氧西林(methycillin)抗性的金黄色葡萄球菌，菌株MRSA 110。通过肉汤培养物的离心(2,000g 15分钟)收获稳定生长期的细胞，用pH＝7.4、包含2.7mM KCl和0.14M NaCl的10mM PBS洗涤2次，以108-109个细胞/ml的密度(吸光度在650nm下约为0.7)悬浮在PBS中。将5ml细胞悬浮液的等分试样与1μM卟啉在室温下黑暗中温育5分钟。在温育后将悬浮液离心，立即收集细胞沉淀或用PBS洗涤，再次离心1次或3次。
在2％SDS水溶液中重悬浮和过夜温育后测定沉淀中细胞结合的卟啉的量。通过测量在420nm激发后发射的红色荧光(600-750nm)强度和内插数据于用已知卟啉浓度获得的校正曲线上测定在细胞裂解物中的卟啉浓度。通过Lowry的方法(Lowry等，J.Biol.Chem.，193：265-275(1951))测定细胞样品的蛋白质含量，并用于将与细胞结合的卟啉的量表示为纳摩尔卟啉/mg蛋白质。
卟啉对细菌细胞的暗和光毒性：通过测量在黑暗中或曝光用卟啉处理之后的生长抑制(抑菌效果)的程度和存活率(杀细胞/杀菌效果)的降低评估T4MPyP和它的类似物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞的毒性效应。
在所有情形中，将5ml细胞悬浮液(108-109个细胞/ml)与选择的浓度为0.5-10μM的光敏剂在室温下在黑暗中温育5分钟。在暗温育后，用白光(150mW/cm2)照射一部分细胞样品。在照射期间，(可达30分钟)将细胞保持在37℃并磁力搅拌。用BHI稀释处理的和未处理的对照细胞，并保持在37℃，同时在预定时期监视悬浮液在650nm处的吸光度以测定生长曲线。通过下列方程计算在处理的细胞中的生长抑制的百分比：
             [1-(Ax-A0)/(Ac-A0)]×100
其中Ax和Ac分别是处理的和对照细胞悬浮液在3小时温育后的吸光度，而A0表示初始吸光度，Ac是在5小时温育后对照细胞悬浮液的吸光度。通过将处理和未处理细胞的连续稀释的等分试样铺平板至脑心琼脂和计算在37℃下温育18-24小时后的克隆数量测定细胞存活率。
4.疏水性实施例
实施例9：吸收和发射性能
T4MPyP(参见图2)的基态吸收光谱在422nm显示强烈的索雷谱带，摩尔吸光系数为194,000M-1cm-1，是内消旋-不含取代基的-基本卟啉的特征，和在520，552，585和640nm处的Q-带。通常，在一个吡咯氮处的烷基尾部大小的增加不影响卟啉基态光谱。仅对C22衍生物观察到显著的变化(参见图2)。特别地，在索雷谱带的区域中检测到大约4400cm-1的展宽，其说明该卟啉样品的广泛聚集。
T4MPyP在缓冲液，pH＝7.4中的荧光光谱显示在715nm的最大值和在675nm的肩(参见图3)。通常，经增加烷基尾部的大小后观察到蓝肩(shoulder)的增强。对于C18和C22衍生物，荧光光谱显示2个最大值(在660和720nm)。对于不同卟啉衍生物在几个发射波长记录的激发光谱总是与相应的吸收光谱重叠。只在C18和C22衍生物的情形中，在激发光谱中观察到索雷谱带明显变窄，其提示荧光发射主要是由于单体组分导致。这与文献数据一致。表1显示对于各种卟啉在PBS和2％SDS水溶液介质中获得的荧光量子产率。该产率主要低于0.03。这似乎说明从第一激发单态的辐射衰变在竞争性驰豫过程中是次要的。对于大部分卟啉，发现量子产率在胶束水溶液中稍高。
表1.T4MPyP和它的类似物在PBS中和在2％SDS水溶液中的荧光量子产率(ΦF)。
  卟啉   ΦF(PBS)   ΦF(SDS)
  T4MPyPC6C10C14C18C22   0.0170.0180.0150.0190.0220.001   0.0310.0290.0260.0220.0240.029
特别是，可以发现C22衍生物在PBS中的ΦF值比在相同介质中的其它卟啉所记录的小得多，而在SDS中它变得与其它ΦF值可比较。该性能可能反映C22衍生物在中性水溶液中的低溶解度，其导致形成聚集体，该聚集体然后通过加入SDS表面活性剂被破坏。
通过记录总发射光的相转变法测量荧光衰变时间。频率相应曲线的整体分析结果在表2中总结：
表2.卟啉(大约5μM)在pH＝7.4的常压平衡的缓冲液中的荧光衰变时间。通过相转变法获得数据(λexc＝420nm，λem＞600nm)。
  卟啉   τ1(ns)   A1(％)   τ2(ns)   A2(％)
  T4MPyPC6C10C14C18C22   1.00.91.11.01.40.5   29662327   4.75.15.26.59.05.9   719494989773
对于所有的卟啉衍生物，频率响应曲线与二级指数函数令人满意地相符。分析T4MPyP曲线对于快组分得出1.0ns的衰变时间(τ1)和29％的相对重量，而对于慢组分获得4.7ns的衰变时间(τ2)。本结果与文献数据的比较提示长寿命和短寿命的物质分别为卟啉衍生物的单体和二聚体。分析对于C6-，C10-，C14-和C18-衍生物获得的迹线得出在实验误差内的类似于对于T4MPyP获得的衰变时间；然而，烷基衍生物的快组分的相对贡献比对于典型化合物获得的小一个数量级(2-6％)。对于C22衍生物，快组分显示0.5ns的衰变时间和大约30％的相对重量。参数的不同拟合和在C22的吸收和发射光谱中观察到的变化可能显示新的失活途径或相互作用过程的出现。
实施例10：三重态性能
经在355nm和420nm下激光闪光光解激发后记录卟啉在缓冲液中的瞬时光谱。T4MPyP的时间分辨光谱(参见图4a)显示在480nm的最大值和在425nm的负的最小值(对应于基态吸收)，其是由于三重态-三重态吸收导致。按照一级动力学发生信号(漂白)的衰减(生长)并导致基态完全恢复，生存期为91μs。考虑到已知的在425nm的基态吸光系数，将全耗尽方法(total depletion method)用于获得卟啉在920nm的三重态-三重态吸光系数(εT)，其中基态对吸收无重要贡献。这也允许在使用光学匹配的二苯甲酮的乙腈溶液校正实验装置以后测定三重态的量子产率(T)(参见表3)。
表3.卟啉在磷酸盐缓冲液中的三重态性能
  卟啉   λmin(nm)   λmin(nm)  τN2(μs)   τ空气(μs)   φ×ε920(M-1cm-1)   φT a
  T4MPyPC6C10C14C18C22   425425420425420420   480480490480470340，510  9171677074n.d.b   14162020210.1   681462171021497622700＜122   0.730.480.490.480.17＜0.08
a通过全耗尽方法(从基态的ε)评估ε920来测定三重态量子产率。
b未检测，因为起N2泡的溶液产生许多泡沫，底物集中在比色杯的壁上。
对T4MPyP获得0.73的φT值，其稍低于文献值。这个不一致可能是由于存在部分聚集的卟啉物质，如荧光衰变数据所示(参见表2)。使用C6至C18的卟啉衍生物的激光闪光光解实验产生瞬时物质，由于光谱和衰退性质与对T4MPyP记录的那些的相似性其被指定为最低的三重态。这例举为图4b中的C18衍生物。在另一方面，在C22衍生物的情形中瞬时光谱显示在340和510nm的不同的吸收最大值(图4c)和更短的0.1μs的衰变时间(参见表3)。如表所示，三重态量子产率受N-烷基链的长度的影响，对于C18显示显著的减少，对于C22更多。
在C22的情形中，三重态生存期的缩短可能反映广泛聚合的C22物质的形成，如由在蓝色波长范围内吸收光谱的展宽，和慢和快衰变组分对于该卟啉样品总的荧光发射明显低的贡献所提示。N-取代基对三重态的生存期施加小得多的影响(参见表3)，即使该生存期被氧的存在所抑制，其是光动力光敏剂的特征。聚集主要负责C22的差的光物理性能的假说受到在SDS胶束的存在下它对NATA的光敏活性(其在磷酸盐缓冲液中可以忽略)变得与其它卟啉的特征非常类似的观察的进一步支持(参见疏水性实施例3，表4)。该表面活性剂已知诱导聚集的卟啉物质的单体化。
实施例11：N-乙酰-L-色氨酰胺和卟啉光漂白的光敏化研究
针对作为典型底物的NATA检验各种卟啉的固有光敏效率。已知色氨酰胺通过I类(涉及自由基)和II类(涉及1O2)途径进行它吲哚部分的光敏修饰(Foote，Oxygen and Oxy-Radicals in Chemistry and Biology，425440(1981))，因此它可以用于检验与实际反应机理无关的光敏剂的活性。
如表4所示，T4MPyP和它含有长烷基链的类似物诱导容易检测的NATA的光氧化降解，量子产率值在10-3范围内，如先前对于其它光敏剂所发现的。Foote，Oxygen and Oxy-Radicals in Chemistry and Biology，425-440(1981)。
表4用在磷酸盐缓冲液中和在2％SDS水溶液中的不同卟啉衍生物敏化的10μM NATA的光氧化量子产率。
  卟啉    ΦPBS×103   ΦSDS×103
  T4MPyPC6C10C14C18C22   0.77±0.210.59±0.050.59±0.050.66±0.100.14±0.01n.d.a   0.64±0.080.68±0.140.64±0.260.71±0.030.80±0.040.83±0.08
a未能检测
对于在2％SDS水溶液中的各种卟啉衍生物仅测量到量子产率的较小变化，其中所有样品是纯单体形式。明显地证明聚集体的形成导致对卟啉光敏效率的显著影响，如在PBS中关于NATA光氧化的量子产率值所示(参见表4)。该值紧密类似于在2％SDS中关于T4MPyP和C14衍生物发现的那些，T4MPyP和C14衍生物主要以单体状态存在于两种介质中，而对于在中性均匀水溶液中高度聚集的C22观察到下降到低于我们的检测范围。
如图5所示，当用白光照射在PBS中的1M溶液时所有卟啉进行逐渐的光漂白。在所有情形中，光诱导的卟啉浓度的减小与二级指数曲线相符：最初的快速降解期其特征最经常是1-3分钟的t1/2；然而，C22衍生物的样品似乎明显地更不感光(t1/2＝6.5分钟)。
实施例12：卟啉与细菌的结合
在图6和7中分别显示T4MPyP和它的类似物与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的结合。明显地，将N-烷基取代基的长度从1个增加至10个碳原子提高革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的卟啉累积效率。进一步延长烷基链至C14和C22对细胞结合的卟啉的量无重要影响。特别是，与未洗涤细菌细胞结合的C10-C22卟啉的量与T4MPyP相比大约高10倍。在所有情形中，在金黄色葡萄球菌细胞的情形中卟啉结合更高。卟啉对大肠杆菌细胞的较低亲和力对于C6和C10衍生物特别明显，C6和C10衍生物与金黄色葡萄球菌的结合几乎比革兰氏阴性菌的情形中发现的大2倍。
通过反复洗涤可以逐渐去除一小部分细胞结合的卟啉，提示一些卟啉分子与细胞微弱地结合。然而，当光敏剂的疏水性增加时，在1次或3次洗涤后仍与细胞结合的等分试样显著增加：因此，在与T4MPyP温育5分钟后进行3次洗涤的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞分别只保留11％和16％初始结合的卟啉。当细菌细胞与携带含有10-22个碳原子的取代基的卟啉衍生物温育时这些百分比对于大肠杆菌增大至大约60％，对于金黄色葡萄球菌77％。这暗示与细菌紧密结合的卟啉的量比在T4MPyP的情形中观察到的大50-60倍。
实施例13：卟啉对细菌细胞的暗和光毒性
在黑暗中温育5分钟后评估各种卟啉衍生物对细菌细胞的细胞毒素作用。图8a表示的关于金黄色葡萄球菌的数据和图8b表示的关于大肠杆菌的数据指出对两种细菌菌株的暗细胞毒性的程度强烈依赖于光敏剂的化学结构。因此，10μM浓度的T4MPyP或C6衍生物导致几乎不能检测的细菌细胞生长抑制，而通过与10μM C14-或C18-衍生物温育诱导完全抑制。观察到的效果似乎主要是抑菌而不是杀菌的性质，至少对于大肠杆菌，因为在与10μM C14或C18细胞温育后仅观察到细胞存活率适中的(小于2个对数)减少。在所有情形中，与大肠杆菌相比“暗”细胞毒素效应对于金黄色葡萄球菌明显更显著(参见图8)。
在其在黑暗中基本上无效果的浓度下所有检验的卟啉对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的损伤也是有效的光敏剂。如从表5可以看出，在10μM T4MPyP和C6的存在下经照射后观察到对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两者明显的细胞生长抑制。
表5.在与浓度为0.5-10μM的各种卟啉温育5分钟后用白光(150mW/cm2)照射5分钟的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长抑制。
  卟啉   浓度(μM)        生长抑制(％)
  大肠杆菌   金黄色葡萄球菌
  T4MPyP   10   29   96
  C6   0.510   599   47-
  C10   0.51   4696   74-
  C14   0.51   82100   73-
  C18   0.51   2658   4259
  C22   0.51   -3   2770
经增加N-烷基链的长度至C10和C14后卟啉的抗微生物光活性增加，其导致在低至1μM的浓度下完全抑制大肠杆菌。进一步增加取代基的大小至C18和C22伴随光敏效率的下降，其在大肠杆菌的情形中特别明显。还测定似乎通常比金黄色葡萄球菌更耐光的该细菌菌株由卟啉光敏化导致的生存力的任何损失。如表6所示，生存率数据与生长抑制数据紧密平行。
表6.在与1或10μM卟啉在黑暗中温育5分钟后用白光(150mW/cm2)照射15分钟的大肠杆菌细胞的生存率的减小。
  卟啉              生存率的减小(1og)
  1μM   10μM
  T4MPyPC6C10C14C18C22   +0.28+0.05-4.32±0.34-4.35±0.45-2.78±0.62+0.22±0.07   -1.82±0.82-4.23±0.54----1.94±0.28
实际上对于C10-和C14-衍生物观察到最大的光效率，在1μM卟啉的存在下经照射15分钟后其导致大肠杆菌的存活率下降4个对数。仅对于10μM浓度的C6获得类似结果，而T4MPyP和C22衍生物两者显示较低的效率。
因此，本发明包括一组新的带正电的含有高达4个正电荷的卟啉，其包括疏水烃链。烃尾部可以包括至少一个长度为6-22个碳原子的烃链。尾部可包括直链烷基，直链链烯基，支链烷基，支链链烯基，芳烃，混合烷基-芳烃类，和混合链烯基-芳烃类。

Claims (17)

1.一种光动力抗微生物剂，其包含：具有下式结构的卟啉
其中，R1＝R2＝R3＝-CH3，R4为具有6-22个碳原子的直链烷基或苄基的烃尾部。
2.权利要求1的光动力抗微生物剂，其中所述烃尾部为具有6-18个碳原子的直链烷基。
3.权利要求1的光动力抗微生物剂，其中所述烃尾部为苄基。
4.权利要求2的光动力抗微生物剂，其中所述烃尾部为具有6个碳原子的直链烷基。
5.权利要求2的光动力抗微生物剂，其中所述烃尾部为具有10个碳原子的直链烷基。
6.权利要求2的光动力抗微生物剂，其中所述烃尾部为具有14个碳原子的直链烷基。
7.权利要求2的光动力抗微生物剂，其中所述烃尾部为具有18个碳原子的直链烷基。
8.一种合成按照权利要求1中所定义的卟啉的方法，其包含以下步骤：
通过将它与亚化学计量数量的所需疏水烃尾部的卤化物盐反应，季铵化5，10，15，20四(4-吡啶基)-21H，23H-卟吩的第一个氮原子以形成单季铵化的卟啉；和
使用甲基化剂季铵化单季铵化的卟啉剩余的卟啉氮以形成权利要求1中所定义的卟啉。
9.权利要求8的方法，其另外包含从任何剩余卟啉或卤化物盐分离单季铵化的卟啉的步骤。
10.权利要求8的方法，其中所述从任何剩余卟啉或卤化物盐分离单季铵化的卟啉的步骤是利用溶解度差异完成的。
11.权利要求8的方法，其另外包含从任何剩余卟啉、其它副产物、和卤化物盐分离按照权利要求1中所定义的卟啉的步骤。
12.权利要求11的方法，其中所述从任何剩余卟啉、其它副产物、和卤化物盐分离按照权利要求1中所定义的卟啉的步骤是使用色谱法完成的。
13.权利要求8的方法，其中所述甲基化剂选自对甲苯磺酸甲酯，甲基碘，硫酸二甲酯，和氟代磺酸甲酯。
14.一种杀死革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的方法，其包含以下步骤：
将革兰氏阳性或革兰氏阴性菌曝露于按照权利要求1-7中任何一项的包含卟啉的光动力抗微生物剂；和
照射细菌和抗微生物剂。
15.权利要求14的方法，其中所述卟啉是以10μM至0.1μM的浓度存在。
16.权利要求14的方法，其中所述卟啉是以5μM至0.5μM的浓度存在。
17.权利要求14的方法，其中所述卟啉是以1μM的浓度存在。
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