CN1252437A - 双轴旋转式细胞/组织三维培养器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织工程中的双轴旋转式细胞/组织三维培养器。主要由内筒培养液流动室、细胞培养室、外侧为气室的三筒套装一体化结构的培养器主体,培养器主体安装在作2个自由度旋转的横向转动框架上,气室和培养液流动室分别用轴通过转速调节机构与一马达带动,做同轴转动然后在做差动旋转,通过绕横轴的低速摆动,消除端部效应,营造一个更有利于细胞、细胞聚集体和组织三维生长的环境。同时更有利于培养室内氧、CO2营养物和代谢物的输运。
Description
本发明涉及于生物医学工程中使用的装置，特别是用于生物医学工程的前沿一组织工程(Tissue Engineering)领域中的双轴旋转式细胞/组织三维培养器。
‘组织工程’一词是在美国国家自然科学基金会(NSF)1987年8月召开的一次学术讨论会上提出来的。1988年由NSF的一个工作小组对它的内涵作了界定，即：“应用工程科学和生命科学的原理和方法，来解释哺乳动物组织的结构——功能关系，并且发展具有活性的工替代物，来恢复、维持或提高组织的功能”。其核心是通过哺乳动物(包括人，乃至患者自身)细胞的离体培养，生长了具有特定功能的活组织或具它生物替代物，应用于临床。组织工程涉及的科学问题很多，细胞/组织三维培养器是其关键技术之一。它和现代生物化学工程(如发酵工程、制药工业等)中所用的生物反应器以及传统的细胞培养方法有本质的差别。如一般发酵工业、制药业等所用的生物反应器借助于机械搅拌(包括实验室用的摇瓶、摇床等)或吹入气体引起强迫对流等方法避免培养物沉降，并改善营养供应，这在微生物培养(如抗生素生产)中是成功的，但对于哺乳动物细胞培养来说是不适宜的。因为：(1)哺乳动物细胞培养比微生物‘娇嫩’得多，机械搅拌造成的流动剪切和直接作用很容易损伤乃至破坏细胞，造成坏死。(2)机械搅拌造成的流动剪世使得细胞难以(甚至不能)聚集，而细胞聚集是从细胞培养成组织的第一步。
另外，传统细胞培养方法在90年代中期以前，医学界未能培养出具有与在体组功能相同或相似的生物组织来。其主要原因是：不可避免的重力作用使得细胞(或微载体)沉降于培养器底部，细胞在培养器器壁之间的接触抑制使得所培养的细胞不能真正三维生长，从而限制了细胞功能分化，长不成所需要的组织。而空间微重力环境为细胞三维生长创造了条件。美国宇航局(NASA)从80年代中期就着手发展空间生物反应器。90年代初期，NASA Johnson中心在这方面取得了重大进展，发展了旋转管式生物反应器(RWV)。并在1995年航天飞机搭载实验中成功地培养出结肠癌组织，组织切片观察表明：它具有和在体组织相似的机构。而且其尺寸比用传统方法培养的大30倍，达2厘米。1997年又进行了关节软骨组织培养实验，成功地培养出了和在体软骨组织相似的并节软骨组织，尺寸为厘米量级。这种新型的生物反应器在地面运行时，也可以借助反应器内培养液流动的流体力学效应而避免重力沉降，从而确保细胞三维生长。如参考文献：
[1]Culturing a Future，Fall 1998，Microgravity News但是这种新型的生物反应器也是有缺点的，其一是培养室内介质应力水平不可调控；其二是培养器使用时实际上悬浮物在细胞培养室内的运动是三维的，但在接近端部时它将向内筒表面收敛而造成细胞/组织三维培养极为不利；带来不利于细胞三维生长的端部效应问题，如图1所示。图中D＝6cm，d＝1.5cm，L＝6cm；N1＝5rad/s，N2＝1.25rad/s，k＝0.3；起始点：X＝1，Y＝2.0cm，Z＝0.2cm.。
本发明的目的在于克服已有技术的缺点，为了解决已有的培养器使用时出现的不利于细胞三维生长的端部效应问题，即由有限长度端部效应引起的培养物沉降问题；和为了实现培养室内介质应力水平可以调控，从而提供一种应用同轴旋转的双圆筒之间粘性流体运动产生的流体动力克服重力沉降，使培养物(或微载体或细胞聚集体等)处于三维悬浮状态，在培养器双圆筒既可做同轴旋转又可做差动旋转的基础上，还可做横向摆动，以获得最佳三维生长条件的双轴旋转式细胞/组织三维培养器。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供的双轴旋转式细胞/组织三维培养器包括：培养液流动室、细胞培养室、气室三层同心园筒套装构成培养器主体。内筒为培养液流动室，内筒(内筒的半径为R1)壁面是一支撑用的镂空的金属架上固定液/液交换膜，中间筒(中间筒的半径为R2)是细胞培养室，其外壁是一支撑用的镂空的金属架上固定液/气交换膜，两者安有轴均可旋转，外筒(外筒的半径为R3)是气室，细胞培养室的外壁是气室的内壁，外筒壁是固定不动的；控制器匹配调控的两组由马达和变速器组成的转动机构，分别与内筒和中间筒的轴相连接。马达固定在底座的支架上，两组马达一变速器组成的转动机构，使得内筒和中间筒既可同步旋转(ω1＝ω2)，亦可差动旋转(ω1≠ω2)，(ω3＝0)。ω1(t)＝ω2(t)时，圆筒R1、R2同步旋转；ω1(t)≠ω2(t)时，培养液流动室(内圆筒R1)、细胞培养室(中间筒R2)差动旋转。内筒端轴上装有分离部件，其上有培养液进口和培养液出口，其作用是：(1)使培养液进、出口和旋转内筒轴分离开来，不随之而转动；(2)把流进新鲜培养液和流出培养液隔离开来。供液系统中的输液泵的液管与培养液存贮器相连，再通过多孔管管道先穿过出口处阻尼器后，进入细胞培养室至细胞培养室终端，细胞培养室的输出管道相连在培养液透析器，它分别与培养液回收器和代谢产物收集器相通；供气系统中的气室进气口与气源通过气管上的稳压，调压阀连接；气室的出气口通过排气管连接在余气收集器上。其特征在于：还包括横向摆动支架固定在整体支座上，另一马达安装在横向摆动支架内侧，该马达的轴穿过横向摆动支架与另一滑杆B固定在一起；通过横向转动框架内侧上的两个横向摆动转轴将培养器主体固定，横向摆动转轴上又固定一滑杆A；两根滑杆通过其上的槽滑动相配合，横向摆动调幅、限幅部件(如一螺栓)穿过一滑杆A固定在滑杆B。通过横向转动力矩马达带动滑杆做横向摆动运动，其中横向摆动调幅在8°-20°之间；培养液流动室连接有轴，轴通过转速调节机构与一马达连接；细胞培养室连接有另一轴，并通过转速调节机构与另一马达连接，气室上进气口与供气系统的气管连接；培养液进口和一出口分别与供液输运路径上的进口和出口连接；
在生长过程中(1)在细胞培养室中部，培养物悬浮的条件主要由：旋转角速度(ω1＝ω2＝ω时)、培养室内液相介质粘度、培养物和培养液密度差等决定。随着培养物尺度(用当量球径d表示)增大，为避免重力沉降所需要的角速度也增高。图2是培养物尺度与悬浮培养最低转速关系示例。
(2)实际上悬浮物的运动是三维的，如图1所示，在接近端部时它将向内筒表面收敛，这对于细胞/组织三维培养是不利的，当培养物尺度较大时尤其如此。本发明是为了克服细胞在三维培养器内生长时，在接近培养器端部时它将向内筒表面收敛，造成培养物沉在培养器底部带来不利。本发明是在生长细胞时培养物放在细胞培养室内，由供液系统和供气系统向培养液流动室供液和向气室供气，通过液/液交换膜或气/液交换膜进行交换，对细胞培养室内培养物提供氧和必要的营养，同时培养器主体中的两个圆筒在两个马达的带动下，最初做同轴转动然后在做差动旋转，使细胞在培养室内悬浮生长，培养室内的应力分布也是可调控的；由于多一个横向摆动的轴，双轴旋转，增加了一个调控因素，大大地有利于培养室内物质输运和力学环境的调控。但是横向摆动转轴的安装位置必须通过与气室/培养室/培液流动室一体化结构和旋转框架横向转动平台的质心(重心)，摆动速度才能均匀。另外，横向摆动的幅度以8°-20°为宜。
本发明的效果和优点
本发明提供的双轴旋转式细胞/组织三维培养器的细胞培养室、气室和培养液流动室的配置既可同步调速，亦可差动调节，培养室内的应力分布是可调控的；由于双轴旋转，通过绕横轴的低速摆动，消除端部效应，能显著改善端部效应引起的培养物向内管壁面聚集的倾向，增加了一个调控因素，有利于培养室内物质输运和力学环境的调控，营造一个更有利于细胞、细胞聚集体和组织三维生长的环境。同时，更有利于培养室内氧、CO2营养物和代谢物的输运，且为培养室内力学环境的调控增添了一条途径。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细地说明：
附图1是培养器有限长度引起的端部效应图
附图2是本发明的培养器培养物尺寸(d)和悬浮培养所需最低转速
附图3是本发明的双轴式旋转式细胞/组织三维培养器结构示意图
附图4是本发明的双轴式旋转式细胞/组织三维培养器供液输运路径示意图
附图5是本发明的双轴式旋转式细胞/组织三维培养器供气输运路径示意图
实施例1
按图3-5制作一台本发明的双轴式旋转式细胞/组织三维培养器，在图中1该三维培养器包括一培养液流动室(3)/细胞培养室(1)/气室(7)三个同心圆圆筒，套装成的一体化培养器主体结构，培养器主体结构用聚碳酸脂材料制作圆筒，三个同心圆圆筒之间的用市售的液/液交换膜或气/液交换膜隔开；马达(11)固定在横向转动框架(38)一端，马达(11)的轴通过齿轮(10)与齿轮(14)咬合，培养液流动室(3)的轴穿出横向转动框架(38)外，该轴在框架(38)内末段有一齿轮(5)，该轴露出横向转动框架(38)外段上套一聚碳酸脂材料制作的分离通道(6)，它与培养液流动室(3)连通，分离通道(6)上有一进液口、(14)和一出液口(15)，分离通道(6)内安有一密封圈，隔离新鲜培养液与流出的培养液；培养器主体两端固定在不锈钢的横向转动框架(38)上，横向转动框架(38)固定在横向摆动支架(34)上，横向摆动支架(34)安在整体支座(35)；在横向转动框架(38)两侧各通过一横向摆动转轴(30)将培养器主体三者固定在一起，即横向摆动转轴的安装位置必须通过与气室/培养室/培液流动室一体化结构和旋转框架横向转动平台(7)的质心(重心)；横向摆动转轴(30)上又固定一滑杆B(37)，横向摆动支架(34)内侧固定一马达(33)并与横向摆轴(30)相连，马达(33)的轴穿过横向摆动支架(34)与滑杆(36)固定在一起；滑杆B(36)与滑杆B(37)上有槽，两者滑动相配合，一螺栓(31)穿过滑杆并与滑杆B(36)上固定，但是螺栓(31)可以在滑杆B(37)的槽内滑动。
(6)用聚碳酸脂做的分离通道；
(38)为不锈钢材料的横向转动框架；
(8)、(9)为细胞培养室内、外筒壁连接的转速调节机构；
(10)、(11)为驱动马达、分别与转速调节机构(8)、(9)相连；
(12)、(13)和(14)、(15)分别为气室(7)上的气体进、出口和培养液流动室(3)上的培养液进、出口，分别与供气部分和培养液供液输运路径相连接；
(30)是横向摆动转轴，横向摆动转轴的安装位置必须通过与气室/培养室/培液流动室一体化结构和旋转框架横向转动平台(7)的质心(重心)；，
(31)是用一螺栓做横向摆动调幅、限幅部件，
(32)是横向摆轴；
(33)是横向转动力矩马达，安装在支架架(34)内侧，图中看不出；
(34)是横向摆动支架，横向转动框架(38)通过横向摆动转轴(30)固定其上；
(35)是整体支座，上述(30)-(35)均用不锈钢制作；
(36)滑杆A；
(37)滑杆B；使用不锈钢制作的两条带滑槽的配合件，两者之间靠滑动槽滑动调整两条部件的交叉角度，即横向摆动的幅度，调整好交叉角度后用螺栓(31)锁住滑杆A，但螺栓(31)可以带动滑杆A(36)在滑杆B(36)槽内滑动。在滑杆B(36)的一端安有一摆动用横向摆轴(32)，在滑杆A(37)的一端通过一摆动用横向摆轴(30)将其固定在横向摆动支架(34)上。
本实施例的培养液输运系统，如图4所示，在图中：
(18)为新鲜培养液存贮器；
(19)为流量、压力可调的输液泵；；
(20)为输入培养液用多孔管道，经出口段阻尼器进入培养室至培养室终端。
(21)出口阻尼器，是市售的带有可调节螺钉的软管夹子；用以调节输入培养室的培养液流量，达到调节培养室内压力(Pb(ζ))；
(22)是培养液透析器；
(23)是培养液回收器；
(24)是代谢产物收集器；其中输液泵(19)的液管与培养液存贮器(18)相连，再通过多孔管道的一端先穿过出口阻尼器(21)后，进入细胞培养室至培养室终端，细胞培养室的输出管道相连培养液透析器(22)，它分别与培养液回收器(23)和代谢产物收集器(24)相通；其中气室进气口与气源(25)通过气管上的稳压，调压阀(26)连接；气室出气口通过排气管(28)连接余气收集器(29)上。
本实施例的供气——排气系统，如图4所示，在图中：
(25)为气源，普通的储气瓶；
(26)为稳压，调压阀，通过对稳压，调压阀的调控作用达到调节培养室内应力的目的；
(27)为进气管(与图-6之(9)相连)；
(28)为排气管(与图-6之(10)相连)；
(29)为余气收集器；其中气室进气口与气源(25)通过气管上的稳压，调压阀(26)
连接；气室出气口通过排气管(28)连接余气收集器(29)上。
Claims (2)
1、一种双轴旋转式细胞/组织三维培养器包括：培养液流动室、细胞培养室、气室三层同心园筒套装构成培养器主体，内筒为培养液流动室，内筒壁面是用一支撑架上固定液/液交换膜，中间筒是细胞培养室，其外壁是用一支撑架上固定液/气交换膜，两者同一端安有轴，外筒是气室，细胞培养室的外壁是气室的内壁，外筒壁是固定不动的；控制器匹配调控的两组由马达和变速器组成的转动机构，分别与内筒和中间筒的轴相连接。马达固定在底座的支架上，两组马达一变速器组成的转动机构，内筒端轴上装有隔离机构，其上有培养液进口和培养液出口，供液系统中的输液泵的液管与培养液存贮器相连，再通过多孔管管道先穿过出口处阻尼器后，进入细胞培养室至细胞培养室终端，细胞培养室的输出管道相连在培养液透析器，它分别与培养液回收器和代谢产物收集器相通；供气系统中的气室进气口与气源通过气管上的稳压，调压阀连接；气室的出气口通过排气管连接在余气收集器上，其特征在于：还包括横向摆动支架固定在整体支座上，另一马达安装在横向摆动支架内侧，该马达的轴穿过横向摆动支架与另一滑杆B固定在一起；通过横向转动框架内侧上的两个横向摆动转轴将培养器主体同定，横向摆动转轴上又固定一滑杆A；两根滑杆通过其上的槽滑动相配合，横向摆动调幅、限幅部件(如一螺栓)穿过一滑杆A固定在滑杆B。通过横向转动力矩马达带动滑杆做横向摆动运动，其中横向摆动调幅在8°-20°之间；培养液流动室连接有轴，轴通过转速调节机构与一马达连接；细胞培养室连接有另一轴，并通过转速调节机构与另一马达连接，气室上进气口与供气系统的气管连接；培养液进口和一出口分别与供液输运路径上的进口和出口连接；
2、按权利要求1所述的双轴旋转式细胞/组织三维培养器，其特征在于：
所说的横向摆动调幅、限幅部件包括螺栓，横向摆动调幅为8°-20°。
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