CN1252262C - 双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir及其制备方法 - Google Patents

Abstract

双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir及其制备方法，属于DNA疫苗技术领域。双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir为双股闭环DNA分子，是一种基因克隆的载体，长度为5.1Kb，用于表达制备基因工程产品和生产DNA疫苗，含有两种启动子，一种是真核细胞启动子HCMV IE启动子，另一种为大肠杆菌硝酸盐还原酶基因启动子nirB，分别在真核细胞和原核细胞中被激活表达相应的蛋白，含有多克隆酶切位点，用以插入外源基因，该载体具有SEQ ID NO 1所示的序列。本发明的疫苗载体可用于高效表达外源基因，而不需要在培养体系中加入诱导剂。

Description

双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种与胞内寄生细菌匹配的DNA疫苗双启动子表达载体pCMVnir，又称为pCN及其制备方法，属于生命科学和医学中DNA疫苗技术领域。

(二)背景技术：

DNA疫苗是一种以DNA重组技术构建的携带抗原基因的真核表达质粒，是具有广泛应用前景的第三代疫苗，大量的文献多角度多方位证实了DNA疫苗的可行性及其免疫学机制，已经有7种核酸疫苗经FDA批准进入临床实验。但作为一种新技术，DNA疫苗还面临着一些需要解决的问题，其中一个重要问题是诱导的免疫应答不如预期的强，增加DNA疫苗的免疫能力是目前急需研究的课题之一。首先是对疫苗表达载体进行改进，选用合适的强的启动子，增强抗原的表达水平；其次改进DNA疫苗的接种途径，其中以减毒胞内寄生细菌携带DNA疫苗表达质粒，通过口服和粘膜免疫接种方式，取得了较好的效果，这是因为减毒沙门氏细菌是一种良好的粘膜免疫佐剂和DNA疫苗的载体，它们可以携带质粒进入人体抗原递呈细胞，包括巨嗜细胞、树突状细胞，并在细胞生活一定的时间并持续表达抗原，诱导强而持久的免疫应答，参见Darji A.等人“减毒沙门氏细菌携带的DNA疫苗的口服免疫”《细胞》，1997；91(6)：765-775(Darji et al.Oralsomatic transgene vaccination using attenuated S.typhimurium，cell，1997；71(6)：765-775)。但现在以胞内寄生菌为免疫途径的DNA疫苗表达质粒还存在着一定的缺陷，即目前常用的DNA疫苗载体皆为真核表达质粒，不能在原核细胞中表达抗原。沙门氏细菌携带DNA疫苗在进入肠道细胞之前相当长时间不表达抗原，无疑影响了抗原的表达量及诱导免疫反应的能力。为解决这些问题，需要构建一种与胞内寄生菌匹配的新型双启动子DNA疫苗载体，使抗原基因在细菌和宿主细胞内都可表达，并不影响它们的稳定性，而常用的原核细胞启动子T7、T5、Lac、Tac等化学诱导和温度诱导启动子不合适体内使用，因为胞内寄生细菌不含大肠杆菌操纵子的调控系统，以上启动子进入后会失控的持续高表达，严重影响细菌生命，而使细菌及其携带的质粒很坏丢失，in vivo-inducible启动子可以解决以上问题，根据目前重组细菌多价菌苗的研究成果，细菌厌氧诱导启动子nirB在细菌内厌氧环境即可启动抗原基因表达，细菌厌氧环境诱导启动子nirB是从大肠杆菌中分离出来的，在细菌内指导合成硝酸盐还原酶基因NirB(nitrite reductase)，它的诱导表达方式是通过在培养基中添加氮或改变培养体系中的氧饱和度，在人工合成的NirB启动子中，由于人为缺失掉了氮元素的调控元件，所有NirB启动子不再受培养基中的氮元素浓度的影响，nirB是一种细菌内环境激活的启动子，即in vivo-inducible启动子，参见Oxer MD等，厌氧诱导启动子nirB在大肠杆菌中的高效表达外源基因，核酸研究，1991；19(11)：2889-2892(Oxer MD，et al.High level heterologous expression in E.coli using the anaerobically-activatednirB promoter.Nucleic Acid Research，1991；19(11)：2889-2892)。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种与胞内寄生细菌匹配的DNA疫苗双启动子表达载体pCMVnir及其制备方法。

本发明的双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir为双股闭环DNA分子，是一种基因克隆的载体，长度为5.1Kb，用于表达制备基因工程产品和生产DNA疫苗，含有两种启动子，一种是真核细胞启动子HCMV IE启动子，另一种为大肠杆菌硝酸盐还原酶基因启动子nirB，分别在真核细胞和原核细胞中被激活表达相应的蛋白。含有多克隆酶切位点，用以插入外源基因。

本发明的双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir的DNA序列如下：

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征：

*长度：5144碱基对

*类型：核酸，1323 A，1185 C，1165 G，1471 T.

*链型：双链

*拓扑结构：环行

(b)分子类型：载体DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacg cgccggtatg tacaggaaga      60

ggtttatact aaactgttac attgcaaacg tggtttcgtg tgccaagtgt gaaaaccgat      120

gtttaatcaa ggctctgacg catttctaca accacgactc caagtgtgtg ggtgaagtca      180

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attgaataat aaaacaatta taaatgtcaa atttgttttt tattaacgat acaaaccaaa      360

cgcaacaaga acatttgtag tattatctat aattgaaaac gcgtagttat aatcgctgag      420

gtaatattta aaatcatttt caaatgattc acagttaatt tgcgacaata taattttatt      480

ttcacataaa ctagacgcct tgtcgtcttc ttcttcgtat tccttctctt tttcattttt      540

ctcttcataa aaattaacat agttattatc gtatccatat atgtatctat cgtatagagt      600

aaattttttg ttgtcataaa tatatatgtc ttttttaatg gggtgtatag taccgctgcg      660

catagttttt ctgtaattta caacagtgct attttctggt agttcttcgg agtgtgttgc      720

tttaattatt aaatttatat aatcaatgaa tttgggatcg tcggttttgt acaatatgtt      780

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aacataactt tccaaaatgt tgtacgaacc gttaaacaaa aacagttcac ctcccttttc      900

tatactattg tctgcgagca gttgtttgtt gttaaaaata acagccattg taatgagacg      960

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attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta      1080

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caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg      1200

tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc      1260

cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga      1320

ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgc      1380

tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc      1440

caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact      1500

ttccaaaatg tcgtaataac cccgccccgt tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt    1560

gggaggtcta tataagcaga cgtcgtttag tgaaccgtca gatcactaga tgctttattg    1620

cggtagttta tcacagttaa attgctaacg ccagtctcga acttaacgtg cagaagttgg    1680

tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcggggct    1740

gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc    1800

gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac    1860

agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggatc    1920

ggaccgaggt aaatttgatg tacatcaaat ggtacccctt gctgaatcgt taaggtaggc    1980

ggtagggccc agatcttaat catccacagg agatatacca tggcacacca tcaccaccat    2040

cactcttctg gtaaagaaac cgctgctgcg aaatttgaac gccagcacat ggactcgcca    2100

ccgccttctg gtctggtccc ccggggcagc gcaggttctg gtacgattga tgacgacgac    2160

aagagtccgg gcttctcctc aacgatatct gagctcgtgg atccgaattc tcagatctcg    2220

gcgcgcctgc aggtcgacgg taccggttcg aagcttgcgg ccgcacagct gtatacacgt    2280

gcaagccagc cagaactcgc cccggaagac cccgaggatc tcgagcacca ccatcaccat    2340

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tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatcgatc tttttccctc tgccaaaaat    2460

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gcatgcggag gaaattctcc ttgaagtttc cctggtgttc aaagtaaagg agtttgcacc    2760

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ttgtgttttg ttttgtaata aaggttcgac gtcgttcaaa atattatgcg cttttgtatt    3180

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cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc    3780

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tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac    3900

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ggatctcaag aagatccttt gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat   4260

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg   4320

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc   4380

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc   4440

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc   4500

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ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa   4680

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat   4740

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gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca   4860

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag   4920

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agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc   5040

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata   5100

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgtccgcg cgtt                    5144

本发明的与胞内寄生细菌匹配的DNA疫苗双启动子表达载体pCMVnir是按如下方法获得的：

1.设计合成细菌厌氧诱导启动子nirB，构建携带CMVie和NirB两种不同种类启动子的新型载体pCMVnir，或pCN。

2.为研究启动子的活性，构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，转化减毒沙门氏细胞Salmonella SL3261和大肠杆菌DH5α，证实pCMVnir中Nir的激活是兼性厌氧依赖性的；将两种报告质粒分别转染Hela细胞和前列腺细胞，可见有强的荧光表达。

本发明的DNA疫苗双启动子表达载体pCMVnir的具体制备方法如下：

(1)质粒载体的构建

质粒载体pET16L1E7CTA2B，为一种人乳头瘤病毒L1E7融合基因与粘膜免疫佐剂融合表达质粒。利用下列基因和试剂按常规分子生物学制备：

含有绿色荧光蛋白EGFP-N1和红色荧光蛋白Ds-Red基因的质粒pEGFP-N1和pDsRed2-N1(可从美国Clontech公司购到)，减毒沙门氏细菌S.SL3261为一种色氨酸代谢途径基因突变的减毒株(aroA)(为常见的细菌株，可从美国ATCC公司购到)，Qiagen小量质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品，细胞转染试剂Fugene为Promega公司产品，T4 DNA连接酶、BamHI、NotI核酸内切酶为TAKARA公司试剂，其他常规分子生物学试剂均为国产或进口试剂。所用的基因质粒、减毒株均可从市场购得。

(2)设计合成细菌厌氧启动子Nir

分别设计两条单链，两链长度分别为99和98bp，预留酶切位点粘性末端，含有细菌厌氧诱导FNR顺式元件，细菌核糖体结合位点(RBS)及真核基因Kozak元件，以促进真核基因的表达，

5’CGGACCGAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCC

CTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCCCAGATCTTAATCATCCACAGGAGATATACCATGG 3’。

各取等摩尔数的上述单链DNA混合，94℃变性30sec，然后65℃复性15min，然后缓慢冷却至室温，使两条链缓慢退火。非变性聚丙烯酰氨(PAGE)电泳，确定DNA双链形成，以备与相应核酸内切酶消化的载体连接。

(3)构建pCMVnir双启动子载体

pTriEx-4载体以相应的限制性内切酶NcoI和xhoI切割，以Qiagen凝胶试剂盒切胶回收，去掉约300bp的小片段，回收pTriEx-4片段，紫外分光光度计定量。

pET16L1E7CTA2B质粒经NcoI与xhoI双酶切，回收HPV16L1E7片段。将pTriEx-4与HPV16L1E7片段混合，经T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5α，鉴定纯化重组质粒pTriEx16L1E7。

pTriEx16L1E7经RsrII和NcoI酶切，切胶回收，并与细菌厌氧启动子NirB混合，用T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5α，鉴定纯化重组质粒pCMVnir16L1E7。并将酶切鉴定正确的pCMVnir16L1E7进行DNA序列分析。pCMVnir16L1E7经Ncol与xhol双酶切后1％琼脂糖电泳，然后用QIAquick Gel抽提试剂盒回收NirB片段；pTriEx-4经Ncol与xhol双酶切后1.5％琼脂糖电泳，去掉T7和PIO区域，用QIAquick凝胶抽提试剂盒回收pTriEx-4剩余片段，两者经T4 DNA连接酶连接，得pCMVnir转化DH5α，涂于含氨苄青霉素的LB平板上，质粒提取酶切、测序鉴定。

下面是为研究启动子的活性而构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，转化减毒沙门氏细胞Salmonella SL3261和大肠杆菌DH5α，证实pCMVnir中Nir的激活是兼性厌氧依赖性的；将两种报告质粒分别转染Hela细胞和前列腺细胞，可见有强的荧光表达。

(1)构建报告质粒pCN-EGFP和pCN-DsRedpCMVnir经BamHI与NotI双酶切后1％琼脂糖电泳，用QIAquick凝胶抽提试剂盒回收大片段；pEGFP-N1和pDsRed2-N1分别经BamHI与NotI双酶切后回收EGFP-N1与DsRed2-N1片段，然后分别与pCMVnir(pCN)连接得pCMVnir-EGFP-N1(pCN-EGFP)和pCN-DsRed，转化DH5α，涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，质粒提取酶切鉴定，在肉眼观察及荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达状况。

(2)将pCN-EGFP和pCN-DsRed分别转化减毒沙门氏菌S.SL3261和大肠杆菌DH5α，含表达质粒的阳性菌落在37℃震荡培养过夜后，以1∶100的比例接入新的培养液中生长2hr，再在菌液上面覆盖液体石蜡，静置过夜，在荧光显微镜下观察和流失细胞仪荧光蛋白的表达状况。HeLa细胞在37％、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养基为含有10％小牛血清的RDMI1640采用promega公司的Fugene转染试剂盒进行转染，具体操作按说明书，并设转染对照组和空白对照组，分别于转染后24、48hr在荧光显微镜下观察细胞表达荧光的情况。转然后24、48hr收集细胞，PBS洗涤3次，70％乙醇固定悬浮细胞，以未转染细胞作为空白对照组，用流式技术检测荧光强度。

(3)重组减毒沙门氏细菌SL3261/pCMVnir16L1E7和pCMVnir16L1E7质粒DNA在体内的变化动态及稳定性研究

pCMVnir16L1E7转化减毒沙门氏细菌，厌氧诱导表达，经口腔、鼻腔和皮肤粘膜接种BALB/c小鼠，经口腔接种前半小时，给小鼠灌胃小苏打水，接种细菌量为10⁹PFU/ml，然后分别在3、4、5和6周取小鼠脾脏、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、PP结等，匀浆，培养沙门氏细菌，然后再从培养的细菌中提取质粒。

本发明的新型DNA疫苗载体pCMVnir的实验情况如下：

[1]根据NirB启动子的研究状况，设计合成一种人工合成的NirB启动子，这种启动子含有一般启动子的基本抗体，如-35区、-10区、TATA盒上的特异转录调控元件FNR结合位点，和增强真核基因表达的Kozak序列，此启动子与大肠杆菌的野生NirB启动子相比，可更高效启动异原基因转录和翻译。图1.示相关载体的构建过程及酶切鉴定结果。pCMVnir，经DNA序列分析表明，pCMVnir中的序列与设计合成的序列相符，图2示pCMVnir质粒图谱结构及序列分析结果。其中可在MCS的末端有His肽纯化标签蛋白序列，若希望表达后纯化异原蛋白，可将外源基因与His-肽在碳端融合，若不需要，可在引物设计时将外源基因翻译终止密码子置于His-肽序列之前。

[2]报告质粒pCN-EGFP和pCN-DsRed，转化减毒沙门氏细菌SL3261和大肠杆菌DH5a，经厌氧培养，静止于4℃放置24～48hr后，细菌可发出肉眼可见的绿色和红色荧光，荧光随菌体沉淀于细菌培养管的管底，如图3，上层液体则较澄清，没有明显可见的荧光，表明这两种荧光蛋白表达不是分泌性的，而是沉淀于管底。涂菌于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，可见菌落可分别呈现绿色和粉红色荧光，这种色素局限于菌落而非扩散于培养基中。纯化两种表达质粒，经Fugene脂质体转染Hela细胞和前列腺细胞，转染后48～72小时，荧光显微镜下观察表达情况，镜下可见有强的荧光产生，表明CMVie启动子可以在真核细胞中有效翻译和转录异原蛋白。流失细胞仪检测荧光报告基因表达的强度，经FACS表明，NirB可启动EGFP和DsRed在大肠杆菌和减毒沙门氏细菌中高效表达，见图4。

[3]两种报告质粒pCN-EGFP和pCN-DsRed转化大肠杆菌DH5α和减毒沙门氏细菌SL3261，经过厌氧诱导表达后，在用碱法和Qiagen质粒提取试剂盒，可以从细菌中提取出转化的质粒，质粒的量与对照质粒相似，其中宿主细菌的生长情况与其他对照菌相比没有明显受到抑制的现象。

[4]pCMVnir16L1E7转化减毒沙门氏细菌，厌氧诱导表达，经口腔、鼻腔和皮肤粘膜接种BALB/c小鼠，分别在3、4、5和6周取小鼠脾脏、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、PP结等，匀浆，培养沙门氏细菌，然后再从培养的细菌中提取质粒，发现重组沙门氏细菌在小鼠体内可以进行有限的复制，如在第三周培养的细菌较少，而在2、3周细菌得到复制达到最高，然后细菌量逐渐下降，见图5，因为营养原因，减毒沙门氏细菌不能无限的复制。从培养的细菌中可以提取出转化的质粒DNA，表明质粒DNA在小鼠和细菌体内是稳定的，与用报告质粒的研究结果一致。

[5]图6示，本发明所构建载体与目前国内外同类研究的对比，表明以pCMVnir为载体构建的DNA疫苗，与减毒胞内寄生细菌联合应用可大量增加细胞抗原的表达量，对解决目前DNA疫苗所面临的免疫原性弱的缺点有重要作用。

上述实验证明pCMVnir是一个理想的DNA疫苗载体，这种载体与减毒胞内寄生菌匹配应用，将提高DNA疫苗诱导的免疫反，并可用于体外表达其他的基因工程产品。

本发明与现有技术相比优良效果如下：

1.pCMVnir载体及减毒沙门氏细菌进入肠道后，可在肠道等相对厌氧的环境中启动nirB启动子表达所携带的抗原，当胞内寄生菌携带质粒进入真核细胞后，在真核细胞内可行成两个外原抗原表达灶，一个是nirB启动子以沙门氏菌为场所，另一个是质粒从细菌漏出到细胞浆后CMV启动子以细胞浆为场所表达抗原，无疑在细胞内会形成更多的抗原蛋白用于递呈到细胞表面，而其他DNA疫苗载体由于只含有CMV启动子，只能在胞浆表达抗原。再则在寄生于真核细胞内的沙门氏细菌中的抗原表达载体进入细胞核，即在真核细胞内形成一个质粒复制的厂房。

2.在构建多价细菌菌苗时，曾尝试以常规启动子为研究对象，但由于沙门氏菌中不具有大肠杆菌中的操纵子调控机制，外源基因无限制的高效表达即抑制了细菌的繁殖又导致质粒DNA的过早丢失，当口服后两周之内从各种组织器官中只能测出极少的一部沙门氏菌，更为严重的是这些沙门氏细菌中几乎不含有抗原表达质粒，即一般携带常规原核表达启动子的质粒是不合适于以胞内寄生菌为载体的疫苗研究的，而nirB的活性是由细菌内环境有机调控的。结果表明本发明构建pCMVnir的nirB启动子既可以高效表达外源基因，况且不会影响重组细菌和质粒在体内的稳定性，是一种理想的与胞内寄生细菌匹配的DNA新型表达载体，由于本载体所用的启动子为一种细菌内环境诱导的强启动子，因此可用于高效表达外源基因，而不需要在培养体系中加入诱导剂。

本研究将CMV与nir启动子联合应用，构建了一种新型双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir(pCN)，并研究了两种启动子的活性和重组减毒胞内寄生细菌及所携带的质粒的稳定性。本发明构建的新型双启动子DNA疫苗载体携带真核细胞CMVie和原核细胞NirB厌氧诱导启动子，NirB启动子在菌体内被激活高效表达异原蛋白，这种高效表达并不对细胞的生长和宿主菌中质粒的稳定性有明显的影响，由于细菌中微环境随着细菌生长和增殖对其的不同而变化并有机调节了NirB启动子的活性。

目前国外的常规DNA疫苗载体携带的耐药基因多为氨苄青霉素和卡那霉素耐药基因。本发明的DNA疫苗载体携带氨苄青霉素耐药基因，在应用时可能会使机体内的细菌捕获耐药基因，可以在本发明的基础上用卡那霉素耐药基因替代氨苄青霉素耐药基因。

(四)附图说明

图1是新型双启动子DNA疫苗pCMVnir质粒图谱，质粒大小为5.1Kbp，携带氨苄青霉素抗性基因(bla)，大肠杆菌高拷贝质粒复制子(ori)，真核细胞启动子为HCMV前早期启动子，修饰了的大肠杆菌厌氧诱导启动子nirB，多克隆酶切位点含有多个单一的位点，供外援基因插入表达，MCS含有His-肽纯化标记，可融合表达外源蛋白，作为纯化标签，及原核细胞和真核细胞转录终止序列，poly(A)加尾信号。B为nirB启动子的DNA序列测序结果，表明nirB含有厌氧诱导调控元件FNR，启动子核心TATA盒，核糖体结合序列RBS和真核细胞KOZAK序列和第一个ATG密码子。

图2是pCMVnir载体的构建过程的酶切鉴定结果：1，pCMVnir16L1E7的NcoI+Xhol酶切片段，含有约1500bp的L1E7 DNA片段2，pTriEx16L1E7为CpoI单酶切：3.4为pTriEx16L1E7的NcoI+Xhol双酶切条带，含有1500bp的L1E7片段；5.6，pCMVnir的NcoI+RsrII酶切片段，含有分子量较小的Nir启动子序列；7，为pET16L1E7CTA2B的NcoI+Xhol酶切片段，含1500bp的L1E7片段；8，Marker：λ-EcoT14I.

图3是将报告基因Ds-Red插入pCMVnir构建的报告质粒pCN-DsRed转化减毒沙门氏细菌SL3261和大肠杆菌DH5a，厌氧诱导表达后出现肉眼可见的荧光蛋白表达，表明启动子nirB可在相对厌氧的环境中高效表达外源蛋白，这种蛋白是非分泌性的的，局限于细菌的沉淀内，而培养基较澄清。A，B为SL3261和DH5a的空白对照。C，F为pCN-Red转化的SL3261，D，E为pCN-Red转化的大肠杆菌DH5a，C，D，E，F都出现了肉眼可见的红色荧光蛋白，而对照组没有可见的荧光蛋白。

图4是pCMVnir16L1E7转化减毒沙门氏细菌，厌氧诱导表达，经口腔(IG)、鼻腔(IN)和皮肤粘膜(TEI)接种BALB/c小鼠，为从Peyer’s Patch(肠系膜集合淋巴滤泡)中的分离培养情况，发现重组沙门氏细菌在小鼠体内可以进行有限的复制，在第三周培养的细菌菌落较少，而在4、5周细菌得到复制达到最高，然后细菌量逐渐下降，所以细菌在体内被最终清除，不会对人体造成潜在的危害。

图5是报告质粒pCN-EGFP转化减毒沙门氏细菌与大肠杆菌DH5a，经厌氧诱导表达以后形成的红色荧光沉淀，收集细菌用流式细胞仪检测应绿色荧光蛋白EGFP的表达量，同时做三组试验，并设置相应对照，取均值，用Graphpad公司软件分析，pCN-EGFP转化的细菌表达的荧光量明显高于对照组。

图6是本研究构建的双启动子DNA疫苗载体和目前常用的单启动子DNA疫苗的对照，上图为减毒沙门氏细菌为载体的双启动子DNA疫苗所携带的抗原表达情况，抗原自细菌进入人体内肠道等处即开始表达抗原蛋白，被肠道细胞摄取递呈，诱导免疫反应，并被肠道的上皮内的APC细胞递呈，当细菌进入APC后，可在细胞内形成两个抗原表达场所，一部分继续在胞内细菌内由nirB启动子表达，另一部分当质粒漏入APC后CMV启动抗原蛋白表达。而其他另外途经，抗原蛋白只能当质粒进入APC并由细菌内漏出后才能表达抗原蛋白。充分发挥了减毒胞内寄生细菌的抗原表达场所，粘膜免疫佐剂和携带DNA疫苗的作用。

(五)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：需要常规的分子生物学实验设备和技术，主要包括超净工作台、无菌设备、低温离心机、细菌培养设备、核酸分离纯化、电泳、紫外线分光光度计等。

(1)质粒载体的构建

含有绿色荧光蛋白EGFP-N1和红色荧光蛋白Ds-Red基因的质粒pEGFP-N1和pDsRed2-N1(从美国Clontech公司购到)，减毒沙门氏细菌S.SL3261为一种色氨酸代谢途径基因突变的减毒株(aroA)(从美国ATCC公司购到)，Qiagen小量质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品，细胞转染试剂Fugene为Promega公司产品，T4 DNA连接酶、BamHI、NotI核酸内切酶为TAKARA公司试剂，其他常规分子生物学试剂均为国产或进口试剂。所用的基因质粒、减毒株均可从市场购得。

(2)合成细菌厌氧启动子Nir

分别设计两条单链，两链长度分别为99和98bp，预留酶切位点粘性末端，含有细菌厌氧诱导FNR顺式元件，细菌核糖体结合位点(RBS)及真核基因Kozak元件，以促进真核基因的表达，

5’CGGACCGAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCC

CTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCCCAGATCTTAATCATCCACAGGAGATATACCATGG 3’。

各取等摩尔数的上述单链DNA混合，94℃变性30sec，然后65℃复性15min，然后缓慢冷却至室温，使两条链缓慢退火。非变性聚丙烯酰氨(PAGE)电泳，确定DNA双链形成，以备与相应核酸内切酶消化的载体连接。

(3)构建pCMVnir双启动子载体

pTriEx-4(20μg)载体以相应的限制性内切酶NcoI(5unit)和xho I(5unit)切割，以Qiagen凝胶试剂盒切胶回收，去掉约300bp的小片段，回收pTriEx-4片段，紫外分光光度计定量。

pET16L1E7CTA2B质粒(20μg)经NcoI(5unit)与xhoI(5unit)双酶切，回收HPV16L1E7片段。将pTriEx-4与HPV16L1E7片段混合(摩尔比为1∶3，DNA分子质量总量为0.1-1μg)，经T4DNA连接酶连接(10μL体系，lunit连接酶)于14度连接过夜，取5μL转化感受态DH5α，涂于含有氨苄青霉素的LB培养板上，鉴定纯化重组质粒pTriEx16L1E7。

TriEx16L1E7质粒(20μg)经RsrII(5unit)和NcoI(5unit)酶切，切胶回收，并与细菌厌氧启动子NirB混合(摩尔比为1∶10，总量为0.1-1μg)，用T4DNA连接酶连接(10μL体系，1unit连接酶)于14度连接过夜，取5μL转化感受态DH5α，鉴定纯化重组质粒pCMVnir16L1E7。并将酶切鉴定正确的pCMVnir16L1E7进行DNA序列分析。

pCMVni16L1E7质粒(20μg)经Ncol(5unit)与xhol(5unit)双酶切后1％琼脂糖电泳，然后用QIAquick Gel抽提试剂盒回收Nir B片段；pTriEx-4经Ncol与xhol双酶切后1.5％琼脂糖电泳，去掉T7和P10区域，用QIAquick凝胶抽提试剂盒回收pTriEx-4剩余片段，回收的Nir B片段和pTriEx-4两片段，经T4 DNA连接酶连接(摩尔比为1∶3，DNA分子质量总量为0.1-1μg)，取5μL连接产物pCMVnir转化DH5α，涂于含氨苄青霉素的LB平板上，质粒提取酶切、测序鉴定。

在采用以上途经构建pCMVnir的同时，还采用另一种直接方法构建，即将等量的nirB启动子的两条链，在95度变性5分钟，然后置于工作台上自然冷却到室温，经PAGE胶电泳确定双链退火情况，并将pTriEx-4质粒(20μg)经RsrII(5unit)和NcoI(5unit)酶切电泳，切胶回收，并与细菌厌氧启动子NirB混合(摩尔比为1∶10，总量为0.1-1μg)，用T4DNA连接酶连接(10μL体系，lunit连接酶)于14度连接过夜，取5μL转化感受态DH5α，鉴定纯化重组质粒pCMVnir。采用两种方法获得的pCMVnir具有完全相同的结构特征。

为研究启动子的活性而构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，转化减毒沙门氏细胞Salmonella SL3261和大肠杆菌DH5α，证实pCMVnir中Nir的激活是兼性厌氧依赖性的；将两种报告质粒分别转染Hela细胞和前列腺细胞，可见有强的荧光表达。(1)构建报告质粒pCN-EGFP和pCN-DsRedpCMVnir质粒〔20μg〕经BamHI(5unit)与NotI(5unit)双酶切后1％琼脂糖电泳，用QIAquick凝胶抽提试剂盒回收大片段；pEGFP-N1〔20μg〕和pDsRed2-N1〔20μg〕分别经BamHI(5unit)与NotI(5unit)双酶切后回收EGFP-N1与DsRed2-N1片段，然后分别与pCMVnir(pCN)连接(摩尔比为1∶10，总量为0.1-1μg)，用T4DNA连接酶连接(10μL体系，1unit连接酶)于14度连接过夜，取5μL转化DH5α，得pCMVnir-EGFP-N1(pCN-EGFP)和pCN-DsRed，，涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，质粒提取酶切鉴定，在肉眼观察及荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达状况。

(2)将pCN-EGFP〔0.01μg〕和pCN-DsRed〔0.01μg〕分别转化减毒沙门氏菌S.SL3261和大肠杆菌DH5α，含表达质粒的阳性菌落在37℃震荡培养过夜后，以1∶100的比例接入新的培养液中生长2hr，再在菌液上面覆盖液体石蜡，静置过夜，在荧光显微镜下观察和流失细胞仪荧光蛋白的表达状况。HeLa细胞在37％、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养基为含有10％小牛血清的RDMI1640采用promega公司的Fugene转染试剂盒进行转染，具体操作按说明书，并设转染对照组和空白对照组，分别于转染后24、48hr在荧光显微镜下观察细胞表达荧光的情况。转然后24、48hr收集细胞，PBS洗涤3次，70％乙醇固定悬浮细胞，以未转染细胞作为空白对照组，用流式技术检测荧光强度。

(3)重组减毒沙门氏细菌SL3261/pCMVnir16L1E7和pCMVnir16L1E7质粒DNA在体内的变化动态及稳定性研究

a.每组5-6只年龄为6周的雌性BALB/C小鼠，鼻饲小鼠，小鼠先通过吸入本巴比妥钠麻醉，然后用微量移液器每个鼻孔滴入30μL细菌悬液，细菌浓度为10⁹/ml。

b.通过口腔接种方法为：在细菌接种以前30分钟，先给小鼠灌胃5％碳酸氢钠60μL，以中和小鼠胃酸，然后再用22-gauge feeding tubes饲养管，给小鼠接种细菌0.25mL。

c.经皮肤粘膜接种(transcutaneous inoculation，TCI)方法为：有研究表明皮肤粘膜的细胞可以摄取涂在皮肤上的抗原，并产生可靠的免疫反应，本研究为探索通过皮肤粘膜接种减毒沙门氏细菌疫苗做了尝试：小鼠在细菌接种前，先通过巴比妥那麻醉，然后用医用脱毛剂在小鼠腹部1cm²的面积脱去毛发，并用肥皂水清晰脱毛区域，晾干，然后将500μL的细菌悬液涂于脱毛处，静置直到小鼠苏醒为止，由于小鼠的麻醉、脱毛和洗涤，小鼠比较虚弱，为了防治小鼠的死亡，注意小鼠的保温。

d.分别在小鼠接种细菌以后的3、4、5、6周，研究重组细菌在小鼠体内的变化，小鼠经脱颈处死，解剖台上分别取小鼠的颌下淋巴结、脾脏、肠系膜淋巴结、Peyer’s patch、腹股沟淋巴结，用研磨器将以上组织器官研磨，PP结和肠系膜淋巴结为每一只小鼠分别取2个淋巴结；脾脏为每只小鼠取一个完整的脾脏；肝脏为每一只小鼠取1/3部分，颌下淋巴结为每只小鼠取3个，在2ml PBS匀浆，分别取200μL涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜，计数菌落的数目。调取单菌落接种于同样的液体培养基中，振荡培养过夜，用Qiagen小量质粒提取试剂盒提取质粒，电泳以观察质粒的稳定性。

序列表

<110>山东大学

<120>双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir及其制备方法

<140>

<141>

<160>1

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>5144

<212>DNA

<400>1

tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacg cgccggtatg tacaggaaga    60

ggtttatact aaactgttac attgcaaacg tggtttcgtg tgccaagtgt gaaaaccgat    120

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aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata    5100

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgtccgcg cgtt                     5144

Claims (4)

1.双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir，其特征在于为双股闭环DNA分子，是一种基因克隆的载体，长度为5.1Kb，用于表达制备基因工程产品和生产DNA疫苗，含有两种启动子，一种是真核细胞启动子HCMV IE启动子，另一种为大肠杆菌硝酸盐还原酶基因启动子nirB，分别在真核细胞和原核细胞中被激活表达相应的蛋白，含有多克隆酶切位点，用以插入外源基因，该载体具有SEQ ID NO 1所示的序列

(a)序列特征：

长度：5144碱基对

类型：核酸，1323A，1185C，1165G，1471T.

链型：双链

拓扑结构：环形

(b)分子类型：载体DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacg cgccggtatg tacaggaaga     60

ggtttatact aaactgttac attgcaaacg tggtttcgtg tgccaagtgt gaaaaccgat    120

gtttaatcaa ggctctgacg catttctaca accacgactc caagtgtgtg ggtgaagtca    180

tgcatctttt aatcaaatcc caagatgtgt ataaaccacc aaactgccaa aaaatgaaaa    240

ctgtcgacaa gctctgtccg tttgctggca actgcaaggg tctcaatcct atttgtaatt    300

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caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact   1500

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ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgtccgcg cgtt                     5144。

2.权利要求1所述的双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir，其特征在于，是按如下方法获得的：

(1)设计合成细菌厌氧诱导启动子nirB，构建携带CMVie和NirB两种不同种类启动子的载体pCMVnir；

(2)构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒，转化减毒沙门氏细胞SalmonellaSL3261和大肠杆菌DH5α，证实pCMVnir中Nir的激活是兼性厌氧依赖性的；将两种报告质粒分别转染Hela细胞和前列腺细胞，可见有强的荧光表达。

3.一种权利要求1所述的双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir制备方法，包括如下步骤：

(1)质粒载体的构建

质粒载体pET16L1E7CTA2B，为一种人乳头瘤病毒L1E7融合基因与粘膜免疫佐剂融合表达质粒，利用下列基因和试剂按常规分子生物学制备：

含有绿色荧光蛋白EGFP-N1和红色荧光蛋白Ds-Red基因的质粒pEGFP-N1和pDsRed2-N1，减毒沙门氏细菌S.SL3261为一种色氨酸代谢途径基因突变的减毒株(aroA)，Qiagen小量质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品，细胞转染试剂Fugene为Promega公司产品，T4DNA连接酶、BamHI、NotI核酸内切酶为TAKARA公司试剂，其他常规分子生物学试剂均为市售试剂，所用的基因质粒、减毒株均为市售产品；

(2)设计合成细菌厌氧启动子Nir

分别设计两条单链，两链长度分别为99和98bp，预留酶切位点粘性末端，含有细菌厌氧诱导FNR顺式元件，细菌核糖体结合位点(RBS)及真核基因Kozak元件，以促进真核基因的表达，

5’CGGACCGAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCC

CTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCCCAGATCTTAATCATCCACAGGAGATATACCATGG 3’；

各取等摩尔数的上述单链DNA混合，94℃变性30sec，然后65℃复性15min，然后缓慢冷却至室温，使两条链缓慢退火，非变性聚丙烯酰氨电泳，确定DNA双链形成，以备与相应核酸内切酶消化的载体连接；

(3)构建pCMVnir双启动子载体

pTriEx-4载体以相应的限制性内切酶NcoI和xhoI切割，以Qiagen凝胶试剂盒切胶回收，去掉约300bp的小片段，回收pTriEx-4片段，紫外分光光度计定量；

pET16L1E7CTA2B质粒经NcoI与xhoI双酶切，回收HPV16L1E7片段，将pTriEx-4与HPV16L1E7片段混合，经T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5α，鉴定纯化重组质粒pTriEx16L1E7；

pTriEx16L1E7经RsrII和NcoI酶切，切胶回收，并与细菌厌氧启动子NirB混合，用T₄DNA连接酶连接，转化感受态DH5α，鉴定纯化重组质粒pCMVnir16L1E₇，并将酶切鉴定正确的pCMVnir16L1E7进行DNA序列分析，pCMVnir16L1E7经NcoI与xhoI双酶切后1％琼脂糖电泳，然后用QIAquick Gel抽提试剂盒回收Nir B片段；pTriEx-4经NcoI与xhoI双酶切后1.5％琼脂糖电泳，去掉T7和P10区域，用QIAquick凝胶抽提试剂盒回收pTriEx-4剩余片段，两者经T4 DNA连接酶连接，得pCMVnir转化DH5α，涂于含氨苄青霉素的LB平板上，质粒提取酶切、测序鉴定。

4.一种权利要求2所述的双启动子DNA疫苗表达载体pCMVnir的制备方法，其特征在于，

(1)构建报告质粒pCN-EGFP和pCN-DsRed

pCMVnir经BamHI与NotI双酶切后1％琼脂糖电泳，用QIAquick凝胶抽提试剂盒回收大片段；pEGFP-N1和pDsRed2-N1分别经BamHI与NotI双酶切后回收EGFP-N1与DsRed2-N1片段，然后分别与pCMVnir连接得pCMVnir-EGFP-N1和pCN-DsRed，转化DH5α，涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，质粒提取酶切鉴定，在肉眼观察及荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达状况；

(2)将pCN-EGFP和pCN-DsRed分别转化减毒沙门氏菌S.SL3261和大肠杆菌DH5α，含表达质粒的阳性菌落在37℃震荡培养过夜后，以1∶100的比例接入新的培养液中生长2hr，再在菌液上面覆盖液体石蜡，静置过夜，在荧光显微镜下观察和流失细胞仪荧光蛋白的表达状况；HeLa细胞在37％、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养基为含有10％小牛血清的RDMI1640采用promega公司的Fugene转染试剂盒进行转染，并设转染对照组和空白对照组，分别于转染后24、48hr在荧光显微镜下观察细胞表达荧光的情况；转染后24、48hr收集细胞，PBS洗涤3次，70％乙醇固定悬浮细胞，以未转染细胞作为空白对照组，用流式技术检测荧光强度；

(3)重组减毒沙门氏细菌SL3261/pCMVnir16L1E7和pCMVnir16L1E7质粒DNA在体内的变化动态及稳定性

pCMVnir16L1E7转化减毒沙门氏细菌，厌氧诱导表达，经口腔、鼻腔和皮肤粘膜接种BALB/c小鼠，经口腔接种前半小时，给小鼠灌胃小苏打水，接种细菌量为10⁹PFU/ml，然后分别在3、4、5和6周取小鼠脾脏、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、PP结等，匀浆，培养沙门氏细菌，然后再从培养的细菌中提取质粒。

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