CN1251995A - 提高宠物的葡萄糖代谢、饱腹感及营养物吸收的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用可改变动物内一个大淋巴样器官:胃肠道(GIT)的功能与形态,并提高葡萄糖代谢、饱腹感和营养物吸收的食物对动物进行饲养的方法。该方法包括喂给动物(如,狗或猫)含有可发酵纤维的宠物食品组合物,该可发酵纤维被粪便细菌发酵24小时时,其有机物质消失比为15－60%,纤维的量占补充的总食物纤维量的约1－11%。用这些食物饲养动物至足够的时间,以使可发酵纤维在动物的GIT中发酵。

Description

提高宠物的葡萄糖代谢、饱腹感及营养物吸收的方法
                      发明背景
本发明涉及包括利用含有可发酵纤维的宠物食品组合物来提高宠物(例如，狗和猫)的葡萄糖代谢、饱腹感及营养物吸收的方法。
最近的研究表明，食物纤维因其在狗和猫的大肠中的发酵性质而很重要。例如，Reinhart，美国专利5,616,569描述了在宠物食品组合物中添加可发酵食物纤维以保持动物的正常肠胃功能，并改善慢性腹泻。Howard等，FASEB J.(1996)10：A257，提到狗的这种可发酵纤维的消耗可以使废氮的分配由尿转至粪便，增加了动物通过粪便的氮排泄。Sunvold等，动物科学杂志，(1995)73：1099-1109，指出适当地喂给狗可发酵纤维，可通过在动物的肠道内优化短链脂肪酸(SCFA)的产生而提高胃肠道的健康状况。
某些动物(如狗及人)有时患有糖尿病或具有削弱的调节血糖水平的能力。引起糖尿病有很多原因。当诊断出糖尿病或削弱的血糖调节能力时，应密切控制动物的药物疗法和饮食。目前，利用具有高浓度的不可发酵纤维的食物治疗糖尿病。然而，这些含不可发酵纤维的食物经常会削弱动物的营养物吸收情况，导致对动物健康状况的副作用。
某些动物也具有过量热量摄入的趋向，这增加了动物发展糖尿病或其它慢性病的风险。优选能够通过食物手段控制热量的摄入，这样动物在进食后变饱，但无过量的热量摄入。
另一些动物具有消化及从食物中吸收营养物的困难。例如，具有外分泌胰腺(EPI)不足的动物(即其胰腺分泌的酶不足)，很难正常地消化他们食物中的营养物，尤其是脂肪。这就需要能够改善这些动物的营养物吸收能力。这样，仍然需要另外的食物疗法，其能改善宠物的葡萄糖代谢、饱腹感及营养物吸收情况，而无含有非可发酵纤维的食物的副作用。
                      发明概要
本发明通过提供一种以对动物的健康状况有利的方式用改变胃肠道(GIT)(一个大淋巴样器官)功能与形态的食物对动物进行饲养的方法而满足这种需求。该方法包括喂给宠物(如，狗或猫)含有可发酵纤维的宠物食品组合物(当可发酵纤维被粪便细菌发酵24小时时，其有机物质消失比(OMD)为15-60％)，纤维的量占补充的总食物纤维重量的约1-11％。用这些食物饲养动物至足够的时间，以使可发酵纤维在动物的GIT中发酵。发酵导致GLP-1(其在动物体内改善葡萄糖内稳态并促进饱腹感)的分泌的正调节。这些食物还通过增加D-葡萄糖和月桂酸(其分别是糖和脂肪吸收的指示剂)的转运从而改善动物的营养物吸收情况。
优选地，宠物食品组合物含有可发酵纤维的量为补充的总食物纤维重量的2-10％。更优选地，宠物食品组合物含有可发酵纤维的量为补充的总食物纤维重量的3-9％。最优选地，宠物食品组合物含有可发酵纤维的量为补充的总食物纤维重量的4-7％。
优选地，可发酵纤维的有机物质消失比为20-50％。更优选地，可发酵纤维的有机物质消失比为30-40％。
此外，可发酵纤维优选选自下组物质：甜菜浆，阿拉伯胶，talha胶(阿拉伯胶的一种形式)，车前草，米糠，角豆胶，桔浆，果胶，果糖寡糖或菊粉，甘露糖寡糖(mannanoligosaccharides)及其混合物。更优选地，可发酵纤维选自该组物质：甜菜浆，阿拉伯胶和果糖寡糖。最优选地，可发酵纤维是甜菜浆、talha胶和果糖寡糖的混合物。可发酵纤维混合物中甜菜浆与果糖寡糖的重量比优选的是约3∶1至6∶1，最优选的是4∶1。甜菜浆与talha胶及果糖寡糖的重量比优选的是6∶2∶1.5。
因此，本发明的特征是提供了用于改变胃肠道(GIT)的功能与形态的宠物食品组合物与方法，以在动物体内提高葡萄糖代谢和葡萄糖稳态，改善饱腹感，并促进营养物吸收。这点及本发明的其它特性和优点将由下列详细描述、附图及所附的权利要求要求得以体现。
                      附图简述
图1A-1C描述了施用口腔葡萄糖耐受性检验(OGTT)后，可发酵纤维对血浆GLP-1(A)、胰岛素(B)及葡萄糖浓度(C)的效应，用“*”表示显著差异的时间点(p＜0.05)。
图2A-2C描述了施用口腔葡萄糖耐受性检验(OGTT)后，血浆GLP-1(A)，胰岛素(B)及葡萄糖(C)在曲线下增加的面积。
图3是显示可发酵纤维对肠前胰高血糖素mRNA的效应的图表；
图4A-4B是显示可发酵纤维在犬的肠段中对绒毛高度(A)和隐窝深度(B)的效应的图表；
图5A-5B说明可发酵纤维对D-葡萄糖体外摄取进入至狗的空肠(A)和回肠(B)中的效应；
图6是可发酵纤维对肠SGLT-1转运蛋白mRNA的效应的图表；
图7A-7B说明可发酵纤维对狗的空肠(A)和回肠(B)SGLT-1转运蛋白丰度的效应；
图8A-8B说明可发酵纤维对狗的空肠(A)和回肠(B)GLUT2转运蛋白丰度的效应；
图9是葡萄糖(GLC)和脯氨酸(PRO)在近侧(P)、中间(M)及远侧(D)肠内的摄取速率的图表；
图10说明肠近侧的摄取作为葡萄糖浓度的函数；
图11说明肠近侧的摄取作为脯氨酸浓度的函数；以及
图12是说明狗的肠在肠近侧(P)、中间(M)及远侧(D)对葡萄糖(GLC)和脯氨酸(PRO)的吸收能力。
               优选实施方案的详细描述
本发明利用包含可发酵纤维的宠物食品组合物来改变动物胃肠道的功能与形态。这给动物带来了一些好处。首先，动物中的葡萄糖代谢得到改善，并且葡萄糖稳态得到提高。希望不被任何特定理论束缚，人们认为动物内葡萄糖调节的改善至少部分是由促胰岛素的肠激素(如胃肠道分泌的GLP-1)的水平增加而引起的。GLP-1是一种强效的促胰岛素且是潜在的抗糖尿病发生的试剂。人们认为GLP-1的正调节可增加动物的肠的葡萄糖转运能力，并改善葡萄糖稳态。动物GIT中GLP-1水平增加也可改善动物的饱腹感，并减少动物过分进食的趋势。这些结果在原有技术实践的观点(原来在动物食物中利用十分高的纤维浓度，但利用低可发酵纤维(如纤维素)来试图得到该结果)方面让人感到惊讶。
此外，食物中存在可发酵纤维增加了D-葡萄糖和月桂酸在小肠的空肠(中间部分)内的转运。D-葡萄糖和月桂酸分别是动物体内糖和脂肪的吸收指示剂。这样，健康的动物将受益于本发明的改善营养物吸收的方法。然而，患有一定疾病(如外分泌胰腺功能不全(EPI))的动物将受益更多。EPI是由于胰腺所分泌酶的分泌不足而引起的，这些酶是动物正常营养物消化所需要的。患有EPI的动物很难消化食物中的营养物，尤其是脂肪。给患有EPI的动物喂以本发明的宠物食品组合物将通过改善其食物营养物的吸收能力而获益。
本发明利用包含可发酵纤维(其具有一定的有机物质消失百分比)的宠物食品组合物。用于本发明的可发酵纤维当在体外被粪便细菌发酵24小时时，其有机物质消失比(OMD)为大约15-60％。也就是说，粪便细菌发酵和转化了原来存在的所有有机物的约15-60％。纤维的有机物消失比优选的是20-50％，最优选地是30-40％。
这样，体外OMD百分比的计算如下：
{1-[(OM剩余-OM空白对照)/OM初值]}×100，其中OM剩余是在发酵24小时后回收的有机物，OM空白对照是在相应的空白对照管(即含有基质和稀释的粪便但无底物的试管)中回收的有机物，OM初值是在发酵前放置到试管中的有机物质。该方法的其它细节见Sunvold等，动物科学杂志1995，73：1099-1109期。
宠物食品组合物可以是可给动物提供适当营养物的任何合适宠物食品制剂。例如，一种用于本发明的典型犬类食物可以含有约30％的粗蛋白，约20％脂肪及约10％的总食物纤维。但是，不要求这些或其它营养物的特定比值或百分比。
在本发明中有用的可发酵纤维产生短链脂肪酸(SCFA)，其产率范围为每1000卡路里(kcal)代谢能量(ME)产生约28至约85mmol的SCFA，更优选的是每1000ME千卡产生约42至约71mmol的SCFA。这相当于含有可产生约100至约350mmol SCFA/kg食物的总可发酵纤维的组合物。
每1000千卡代谢能量的SCFA毫摩尔数可通过先计算给定食物组合物中每千克组合物的代谢能量(ME)的总卡路里而得到。每1000千卡ME的克数可由第一个计算得到。然后，可以计算组合物中可发酵纤维组分的克数及毫摩尔数。
本发明的可发酵纤维可以是任何纤维来源，只要其能被动物体内存在的肠道细菌发酵以产生有效数量的SCFA。对于本发明，SCFA的″有效量″是在24个小时内每克底物的总SCFA超过0.5mmol。优选的纤维包括甜菜浆，阿拉伯胶(包括talha胶)，车前草，米糠，角豆胶，桔浆，果胶，果糖寡糖或菊粉，甘露糖寡糖及其混合物)。更优选地，可发酵纤维选自下组物质：甜菜浆，阿拉伯胶和果糖寡糖。最优选地，可发酵纤维是甜菜浆、talha胶和果糖寡糖的混合物。可发酵纤维中甜菜浆与果糖寡糖的重量比优选的是约3∶1至6∶1，最优选的是4∶1。甜菜浆与talha胶及果糖寡糖的重量比优选的是6∶2∶1.5。
用于宠物食品组合物的可发酵纤维的量占补充的总食物纤维重量的1-11％，优选的是重量的2-10％，最优选的是重量的3-7％。
″补充的总食物纤维″的定义首先要求解释″总食物纤维″。″总食物纤维″是指植物食品的残渣，它们对动物消化酶的水解具有抵抗力。总食物纤维的主要组分是纤维素，半纤维素，果胶，木质素以及树胶(不同于″粗纤维″，其仅仅含有某些形式的纤维素和木质素)。″补充的总食物纤维″是添加到上述食品产品中的食物纤维，不包括该食品产物其它组分中天然存在的任何食物纤维。同时，认为″纤维来源″也是这样(当它主要由纤维组成时)。
为了更容易了解本发明，可参考下列实施例，这些实施例旨在说明本发明，但不限制其范围。实施例1
参见表1，食物被制成含相等氮和相等能量，并提供约19.5MJ/kg食物，其中能量的35％来自糖，30％来自脂肪且35％来自蛋白质。低可发酵纤维(LFF)食物包含木纤维素作为纤维来源，高可发酵纤维(HFF)食物包含多种可发酵植物纤维(甜菜浆，MichganSugar，Saginaw，M1；阿拉伯胶，TIC Gums，Belcamp，MD；果糖寡糖(FOS)，Golden技术公司，Golden，CO)的混合物。甜菜浆比阿拉伯胶比FOS的比值为约6∶2∶1.5。甜菜浆对FOS的比值为约4∶1。
利用成年杂种狗(n＝16)。当刚到达时，让动物适应7天并喂以完全营养的食物(Can-Pro，Beaumont，AB)。每日称量所有狗的体重，并且利用式：能量吸收(MJ)＝0.553×kg(体重)0.67分别喂养每只狗以满足能量需求。每日在0900-1000小时间提供食物一次，水随意提供。利用交叉实验设计，其中随机安排狗接收HFF或LFF食物14天，接着交换食物继续喂养14天。由于在同一时间内未能提供16只狗，所以狗在整个实验中均是成对的。
口腔葡萄糖耐受性检验。在第13和27天1600小时撤走食物。在第14和28天的0845-0900小时，将狗宽松地套上薄套环，利用70％(w/w)葡萄糖进行口腔葡萄糖耐受性检验(OGTT)，其中每千克体重为2g葡萄糖。在0，15，30，45，60，90和120分钟时通过将Insyte-W 20GA 2″导管(Becton-Dickinson Vascular Access，Sandy，UT)放置在隐静脉中取外周血液样。
外周血液样品。将用于一般化学筛选和完全血液计数的血液样品(2ml)放置到3ml肝素化的Vacutainer试管中(商标，Becton-Dickinson，Sunnyvale，CA)，并且存放在冰中直至分析。利用Coulter STKS仪器(Courter Electronics公司，Hialeah，FL)进行血液学分析，并进行手工差异计数。将进行胰岛素和GLP-1分析的血液样品收集在10ml EDTA肝素化的并含抑蛋白酶肽的Vacutainer试管中(500KIU/ml血液，Sigma Chemicals，St.Louis MO)，并且存储在-70℃(GLP-1)或-35℃(胰岛素)。将进行血清葡萄糖检测的血液样品放置在250μl微离心管中，并在室温下于2900×g离心10分钟。用吸管取出血清，并且存储在-35℃下。
肠样品。在第28天，在OGTT之后用茄醇(MTC药物，剑桥，ON)静脉内注射法通过隐导管用1ml/2.27kg体重的量对狗进行麻醉。取出肠样品进行Northern印迹分析，并且立即放置在液氮中。将进行营养物摄取分析的空肠和回肠样品放置在冰盐水中，并在取样30分钟之内进行分析。刮削空肠和回肠片段以便获得粘膜样品进行Western印迹分析。将组织学样品直接放置到福尔马林中，并且制备切片。
葡萄糖。利用西格玛诊断葡萄糖(Trinder)试剂进行血清葡萄糖检测，以在505nm下进行葡萄糖的酶促检测(Cat#315-100，SigmaChemical，St.Louis MO).
胰岛素。利用Coat-A-CountI125诊断性放射免疫测定法(Cat#TKIN1，诊断产品公司，洛杉矶CA)进行血清胰岛素浓度检验。
提取血浆GLP-1(7-36)NH2。按照Reimer和McBurney，Endocrinol.137：3948-3956(1996)所描述的方法，从2.5ml血浆中提取GLP-1免疫活性肽。利用SEP-COLUMN，其含有200mgC18(Cat#RIK-SEPCOL Peninsula-Laboratories，Belmont，CA)，并以缓冲液A(0.1％三氟乙酸(Cat#RIK-BA-1))和缓冲液B(60％乙腈(Cat#RIK-BB 1)作为洗脱剂。利用Speed-Vac(商标，SevantInc.，Midland，MI)冻干样品过夜，并且存储在-70℃下。
肠的GLP-1(7-36)NH2的提取。从肠片段中提取GLP-1(7-36)NH2的方法见Xioyan，PhD论文，英国哥伦比亚，Vancouver大学(1996)，稍作改动后进行提取。将每个节段(空肠，回肠和结肠)的400-500mg添加至含有0.5ml 2M乙酸的12×75mm Simport聚丙烯试管(Fischer Scientific，Edmonton，AB)内，并煮沸1小时。在4500×g离心试管10分钟，收集上清液，并移至新试管中，用1N NaOH中和。出于RIA目的，用RIA缓冲液(100mM Tris，50mM NaCl，200mMNa2-EDTA，0.2g/L叠氮化钠，pH8.5)按1∶10稀释上清液样品，直至样品终体积为100μL。
GLP-1(7-36)NH2的放射免疫分析。利用Xiaoyan(1996)所描述的竞争性结合放射免疫分析法稍作改动后测量GLP-1(7-36)NH2的浓度。在250μL RIA分析缓冲液(100mM Tris，50mM NaCl，20mM Na2-EDTA，0.2g/L叠氮化钠，pH8.5)中重建冻干的血浆样品。聚丙烯试管(12mm×75mm)用于对照、标准品和样品，整个方法均在冰上进行。GLP-1(7-36NH2)标准品(Peninsula Laboratories，Belmont，CA)由连续的稀释液组成，范围从4000pg/ml至15pg/ml。4℃下振荡试管，并温育24小时。温育后，添加50Bq125I-GLP-1(736)NH2示踪物至试管中，4℃下涡旋混合试管并温育48小时。在除TC试管外的所有试管(100μL)中加入葡聚糖-炭悬浮物(分析缓冲液中含有4g/L葡聚糖T70，80g/L炭)。通过涡旋混合试管，并置于冰上15分钟，2200×g离心30分钟，将600μl上清液转换到新试管中，并利用CobraTM Auto-Gamma计数器(Packard仪器公司，Downers Grove，IL)对其进行计数。
GLP-1(7-36)NH2的碘化作用。利用Xiaoyan(1996)所描述的氯胺-T方法使GLP-1(7-36NH2)发生碘化作用。先让10ml含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈流过，接着让10ml含有0.1％TFA的双蒸水流过，从而准备好柱体。用注射器推入l0ml空气穿过柱体以干燥柱体。碘化作用的实施首先是将30-40μg的GLP-1溶解在30-40μL的双蒸水中，接着将10μL转移到一个新的eppendorf试管内。往该管中先加入10μL 0.5MPO4(pH7.0)，接着加入0.5mCi 125I。加入氯胺-T(10μl)，并且轻敲试管整30秒。加入偏亚硫酸氢钠(5mg/ml)，接着加入1ml 0.1％TFA，然后将其转换到已预先制好的柱内。利用10cc的注射器对柱施加轻压。含有0.1％TFA的乙腈用作洗脱剂来获取5个组分。乙腈(5ml，10％+0.1％TFA)和乙腈(5ml，20％+0.1％TFA)是按这一顺序所利用的头两份洗脱剂，将组分收集在14mL的圆底试管中。然后，30％乙腈(1ml+0.1％TFA，4次)，38％乙腈(lml+0.1％TFA，1次)和40％乙腈(1ml+0.1％TFA，5次)按照该顺序作为下面的洗脱剂，其组分收集在小的聚丙烯管中。将每个洗脱组分充分混匀，并利用CobraTM Auto-Gamma计数器对每个组分的10μL进行计数。标记物通常洗脱在40％乙腈的组分1，2和/或3中。集中含有标记GLP-1(7-36)NH2的组分并存储在-35℃下。125I GLP-1(7-36)NH2大约有2周的存储期。
总RNA的分离。按照制造厂商提供的方案，利用TrizolTM(GibcoBRL，Burlincton，ON)分离每个肠节段的总RNA。将400-500mg的组织在预冷的无菌研钵中用杵研碎。称量研碎的组织(200mg两份)，并双份转移到两个聚丙烯试管(12mm×75mm)中，添加2ml TrizolTM溶液，并用Polytron匀浆器在第十档匀浆样品30秒。将匀浆过的样品转移至14ml无菌聚丙烯FalconTM试管中，并在室温下温育5分钟。在每个样品中加入400μl三氯甲烷，用手用力振荡试管15秒，并在室温下再温育2-5分钟。接着，4℃下于12,000×g离心样品15分钟。将水相转移到一根新eppendorf试管内，并添加1ml异丙醇至试管内。然后涡旋试管，并在-20℃下沉淀RNA过夜。4℃下于10,000-12,000×g离心样品10分钟，除去上清液，并以75％乙醇(至少1ml)洗涤沉淀两次。通过涡旋混合样品，并在4℃下于7,500×g离心10分钟以沉淀。让RNA沉淀在空气中暂时干燥(不超过10分钟)。通过轻涡旋，使RNA沉淀溶解在无RNA酶的水中(每100mg组织50-100μl)，并在55-60℃下温育5-10分钟，70℃下保存。在260，280和230nm处用紫外分光光度法检测RNA的量和纯度。
Northern印迹分析。按照Zhao等，Intern.J.Bioch.25：1897-1903(1993)所描述的Northern印迹分析测定信使RNA。将15μg总RNA的等分试样分别溶解在10μl凝胶上样缓冲液中(50％去离子甲酰胺(vol/vol)，2M甲醛，1.3％甘油(vol/vol)，0.02M吗啉代丙磺酸(MOPS)，5mM乙酸钠，1mM EDTA及0.1％溴酚蓝(wt/vol))。将溶解的RNA等分试样煮沸2分钟以使RNA变性，然后上样在含有(0.66M)甲醛的1％琼脂糖(wt/vol)凝胶上，在循环电泳缓冲液(其含有0.02MMOPS，5mM乙酸钠和1mM EDTA)的情况下通过电泳(100V 5小时)而将RNA按大小分离出来。电泳后，将凝胶浸在10×标准柠檬酸盐溶液(SSC)(1.5M NaCl，0.15M柠檬酸三钠，pH7.0)中(换液两次)，并印迹到ζ-探针GT Genomi测试印迹膜(BioRad，Mississauga，ON)上。真空80℃下烘烤2小时使RNA固定在膜上。在与[32P]CTP标记的核酸探针杂交前，将每张膜于50℃下在20ml预杂交缓冲液中预杂交2小时，其中所说的预杂交缓冲液组成为去离子化甲酰胺(60％vol/vol)，2×SSPE(5％vol/vol)，10％blotto(5％vol/vol)，20％SDS(5％vol/vol)及10mg/ml剪切的鲑鱼DNA(通过热水浴中煮10分钟使其变性，5％vol/vol)。50℃下在相同体积的新鲜杂交溶液[去离子化甲酰胺(55％vol/vol)，20×SSPE(5％vol/vol)，10％blotto(5％vol/vol)，20％SDS(5％vol/vol)及10mg/ml剪切的鲑鱼DNA(与等量去离子化甲酰胺相混合，2.5％vol/vol)]中杂交12-16小时。在添加预热的杂交溶液之前，先添加16.7KBq(1×106cpm)的标记核酸探针，并在70℃水浴中预热5分钟。室温下用2×SSC洗涤膜5分钟，然后用2×SSC/0.1％SDS洗涤10分钟(GLUT2)或15分钟(前胰高血糖素，SGLT-1)。如下将膜转移到0.2×SSC/1％SDS的水浴中：前胰高血糖素(70℃10分钟)，SGLT-1(70℃20分钟)，GLUT2(60℃2-3分钟)。最后，在室温下用0.2×SSC洗涤膜2-3分钟。将膜热密封在塑料袋中，并在-70℃下利用增感屏(Dupont Canada，Mississauga，ON)使其对柯达XRA5胶片(Eastman柯达，Rochester，NY)曝光。为了进行统计分析，利用激光光密度分析法(型号GS-670图象光密度仪，BioRad实验室(加拿大)有限公司，Mississauga，ON)定量测定信号。通过膜照片的底片来量化28S和18S核糖体带。这些带用来确认RNA的完整性，并用来弥补较小的上样偏差值。
核酸探针。由Xba I线性化的质粒DNA[pGEM4Z-HTL-3]和T7聚合酶制备3.8kb放射性标记的GLUT2反义核酸探针。由Rsa I线性化的质粒DNA[pGEM4Z-HTL-3]和Sp6聚合酶制备350kb前胰高血糖素有义核酸探针。最后，由小羊肠SGLT-1克隆的1.4Kb片段(aa 207-664)(Wood等，Bioch.Sec.Trans.22：266s 1994)制备2.1kb SGLT-1反义核酸探针。
BBM和BLM的分离、制备和富集。利用上述方法(Maenz和Cheeseman，生物化学生物物理学学报860(2)：277-285(1986))在冰上进行所有操作。添加约5gm粘膜碎片至15ml膜悬浮溶液中(MSS缓冲液，125mM/1蔗糖，1mM/1 Tris-HCL，0.05mM/L PMSF，pH7.4)，用Polytron匀浆器在第八档匀浆30秒。然后对匀浆物的等份样品进行富集分析。将样品分放在两根30ml eppendorf试管内，并往每支试管内添加20ml MSS缓冲液。将每支试管在第8档匀浆30秒(两次以上)。然后于2400×g离心样品15分钟，收集上清液，并于43,700×g离心20分钟。余下的沉淀由两种组分组成。外部的白绒毛状层包括基底外侧膜(BLM)，内部深褐色沉淀包括刷状缘膜(BBM)。将BLM轻轻地再次悬浮在少量MSS缓冲液中，并转移到14ml eppendorf试管内。将BBM再次悬浮在MSS缓冲液中，并将来自相同动物的样品集中到1支试管中，并补充MSS缓冲液至20ml。然后于43,700×g离心BBM 20分钟。再次将绒毛状白沉淀轻轻悬浮在MSS缓冲液中，并转移到14mleppendorf试管内，将黑色沉淀悬浮在正好30ml的MSS缓冲液中。在第8档匀浆分离的BLM 15秒。将每种样品上样到25ml 20％Percoll上，并于46,000×g离心30分钟。收集Percoll中所形成的绒毛状带，并转移到25mm×89mm聚碳酸酯超速离心试管中(Beekman仪器公司，Palo Alto，CA)，然后用MSS缓冲液调整体积(大约38ml)，于115,000×g离心30分钟。取出膜层，用20ml MSS缓冲液稀释，并用Polytron在第8档匀浆15秒。加入CaCl2(1M，100μl)，在冰上轻轻振荡10分钟。于7700×g离心样品10分钟，将沉淀重悬浮在20mlMSS缓冲液中，并在第8档匀浆15秒。于46,000×g再离心样品20分钟，沉淀重悬浮在1ml MSS缓冲液中。然后取等份样品进行标记富集检验。用Polytron在第8档匀浆BBM样品15秒，接着于1,900×g离心10分钟。将上清液转移到新试管中，并于14,600×g再离心15分钟。再次将上清液转移到含有300μl 1M CaCl的新试管中，并在冰上缓慢振荡20分钟。于3,000×g离心样品30分钟，收集上清液，于46,000×g再次离心30分钟。将沉淀重悬浮在1ml双蒸水中，取出等份样品进行富集检验。将Esmann，酶学方法156：72-79(1988)所描述的富集分析用于BLM酶Na+K+-ATP酶。总ATP酶活性的分析是通过在ATP和Mg2+的存在下温育粘膜匀浆物和膜制备物，并利用标准钼反应测量游离无机磷酸而进行的。乌本箭毒苷非敏感性的ATP酶活性在乌本箭毒苷存在下如同上述进行分析。Na+K+-ATP酶活性对乌本箭毒苷敏感，因此总ATP酶活性和乌本箭毒苷非敏感性ATP酶活性之间的差值区别是Na+K+-ATP酶活性。按照百分比倍富集法表述结果。利用来自Sigma的碱性磷酸酶试剂盒(Cat#245-10，Sigm Diagnostics，St.Louis，MO)对BBM酶碱性磷酸酶进行富集分析。该方法是基于碱性磷酸酶使对硝基苯基磷酸水解为对硝基苯酚和无机磷酸。所形成的对硝基苯酚呈黄色，并在405nm处显示最大吸收值。
Western印迹分析。通过Tappenden，PhD论文，Alberta大学，Edmonton，加拿大(1997)所描述的Western印迹分析方案对BBM和BLM葡萄糖转运蛋白进行量化。按1∶4的比例将BLM(60μg分离蛋白质)样品稀释在1×样品缓冲液[0.5M Tris-HCI pH6.8(13.2％vol/vol)，甘油(10.5％vol/vol)，0.05％(w/vol)溴酚蓝和10％SDS(0.21％w/vol)]中。按3∶1的比例将BBM(60μg分离蛋白质)样品稀释在4×样品缓冲液(0.24M Tris-HCL，40％甘油，8％vol/vol的10％w/vol SDS，0.5mL溴酚蓝)中。煮沸BBM样品10分钟，但是BLM样品无此操作。将浓缩胶(4.1M丙烯酰胺/21mM N′N-双甲叉丙烯(10.7％vol/vol)，0.5MTris-HCL，pH6.8(0.24％vol/vol)，10％(w/vol)SDS(0.97％vol/vol)，10％APS w/v(4.86％vol/vol)和0.4％TEMED(vol/vol))放置在分离胶[4.1M丙烯酰胺/21mM N′N-双甲叉丙烯(32.1％vol/vol)，1.5MTris-HCL，pH8.8(32.1％vol/vol)，10％(w/vol)SDS(1.3％vol/vol)，10％(w/vol)APS(0.66％vol/vol)和0.16％(vol/vol)TEMED]的顶部。在100-200V下于电泳缓冲液[0.3％Tris(w/vol)，1.44％甘氨酸(w/vol)和0.1％SDS〗中电泳1-2小时，直到染料前沿到达凝胶末端时才结束。然后利用转移装置(BioRad，Mississauga，ON)和转移缓冲液]Tris碱(0.189％w/vol)，甘氨酸(0.9％w/vol)，甲醇(20％vol/vol)，SDS(0.02％w/vol)〗，在200V下将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(MSI实验室，休斯敦，TX)上1.5-2小时。转移后，将膜立即放置在TBST(1M Tris pH7.5(2％vol/vol)，NaCI(0.88％w/vol)，0.05％Tween-20(0.05％vol/vol))内。轻微振荡下，使膜在TBSTM(混有5％(w/vol)奶粉的TBST)中封闭至少1小时，然后使其与SGLT-1(Cat#AB1352，Chernicon国际公司，Temecula，CA)的初级抗体的1∶1000稀释液一起或者与GLUT2(Cat# AB1342)的初级抗体的1∶500稀释液一起于4℃下温育过夜。用TBST轻微振荡洗涤膜3×10分钟，然后与次级抗体(抗兔IgG HRP缀合物，SignalTransduction，PDI生物科学公司，Aurora，ON)的1∶4000稀释液轻微振荡下温育至少2小时。在印迹对KODAK XRA5胶片曝光之前，用Supersignal CL-HRPTM(Cat#34080，Pierce，Rockford，IL)工作溶液完全覆盖印迹，并温育5分钟。以丽春红S(0.1％w/vol丽春红S(BDH)，5％乙酸)对印迹进行染色，以确认上样一致性和蛋白质转移程度。对带的相对强度进行统计分析。为了进行统计分析，信号通过激光光密度分析法进行量化。
转运动力学分析。按照Thomson和Rajotte，Am.J..Clin.Nutr.38：394-403(1983)所描述的方法进行转运的动力学分析。从每个动物体内取出12cm的肠节段，沿着肠系膜的边缘打开，并用冰冷的生理盐水细心地洗去可见的粘液和碎片。将肠切成块状(1cm2)，并将组织展平在37℃的含有充氧Kreb碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)的温育槽中。将组织块在该缓冲液中预温育15分钟，以平衡于该温度下。在预温育后，将温育槽转移到37℃的含有于充氧Kreb碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)中的[3H]胰岛素和各种[14C]-探针分子的烧杯中。D-葡萄糖和D-果糖的溶质浓度是4、8、16、32和64mM，L-葡萄糖是16m，月桂酸是0.1mM。利用环状磁棒(其用频闪灯光调整至搅拌速率为600rpm，并对肠未搅拌水层具低的有效抗性)混合预先温育的溶液与温育溶液。取出槽，迅速将组织放入冷的盐水中浸洗约5秒，并用环状钢打孔机从温育槽中切割下暴露的粘膜组织，从而终止实验。在烘箱中55℃过夜干燥组织以便确定组织的干重，然后用0.75N NaOH使其皂化。将闪烁液(Beekman Ready Solv HP，多伦多，ON)添加至样品中，利用外部标准化技术来校正两种同位素的可变猝灭以检测放射性(Beekman Beta LS-5801，Beekman仪器公司，MountainVies，CA)。营养物的摄取以nmol/100mg干燥组织/分钟来表述。
绒毛高度和隐窝深度测量方法。将肠片段切割成若干部分。在光学显微镜下，利用Northern Exposure Image Analysis软件(EmpixImaging公司，Mississauga，ON)测量肠绒毛高度和隐窝深度。对每只动物和每节段总共记录10次，其平均值用于统计分析。
统计分析。利用Statistical Analysis System(SAS)统计包(6.10版本，SAS研究所，Cary，Nc)完成所有统计分析。至于前胰高血糖素和SGLT-1 mRNA的丰度、以及SGLT-1和GLUT2转运蛋白的丰度，数据由普通线型模拟方法(proc GLM)来分析，显著性差异由单向ANOVA来确定。该模型包括食物、凝胶、时期、成对的和喂食时期。发现时期和喂食时期均无显著差异，其后将它们排除出去。利用proc GLM和单向ANOVA(其包括食物和成对)分析绒毛高度、隐窝深度及肠GLP-1浓度。再次发现时期和喂食时期均无显著差异，从模型中将它们排除掉。在proc GLM内利用成对T-检验分析GLP-1、胰岛素及葡萄糖的血浆AUC。利用重复测量法ANOVA来分析动物重量之间的差异。检验了进食时间的影响，但不显著(P＞0.05)。在proc GLM内利用成对T-检验分析了D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-果糖及脂肪酸12的肠转运速率。数据以平均值±SEM表示。当P＜0.05时，确定为有显著性差异。
食物对体重的效应。分别计算所需的能量，相应地调整食物结构，这样狗体重没有因为实验食物(实验前、HFF和LFF时分别为23.4±1.8kg，22.9±1.8kg，23.5±1.8kg)或时期(实验前[第7天]、时期1[第21天]及时期3[第35天]分别为23.4±1.8kg，23.4±1.8kg，23.4±1.8kg)而不同。
OGTT对血浆GLP-1、胰岛素和葡萄糖的效应。当狗进食HFF食物时，相对于LFF食物时，其在30和90分钟时血浆GLP-1浓度增加(参见图1A)。当狗进食HFF食物时，相对于LFF食物，其在90分钟时胰岛素浓度增加(参见图1B)。在OGTT期间，食物纤维类型没有影响任何时间点的血液葡萄糖浓度(参见图1C)。当狗进食HFF食物时，相对于LFF食物，对于GLP-1(参见图2A，988±92对648±92pmol/L*h，P≤0.05)和胰岛素(参见图2B，15781±1371对11209±1371pmol/L*hr，P＜0.05)来说，曲线下的增长面积明显更高一些。当狗进食HFF食物时，相对于LFF食物，曲线下的增长面积对于葡萄糖来说明显低一些((219±22mmol/L*hr对291±22mmol/L*hr，P≤0.05，参见图2C)。这说明了可发酵纤维食物增加了检验的动物中GLP-1的量，并且改善了葡萄糖内稳态。
食物对肠前胰高血糖素和GLP-1浓度的效应。HFF食物相对于LFF食物的消化，在回肠中(1.13±0.04对0.83±0.04光密度单位)和结肠中(1.45±0.05对0.78±0.05光密度单位)引起了更高的前胰高血糖素mRNA丰度(参见图3)。在十二指肠中没有检测到前胰高血糖素mRNA的表达。当狗进食HFF食物时，相对于进食LFF食物，其粘膜碎片中的GLP-1浓度显著高一些(41±4pmol GLP-1/mg蛋白质对25±4pmol GLP-1/mg蛋白质)。这再次说明了检验动物中可发酵纤维食物可增加GLP-1的浓度。
组织学。食物对肠绒毛高度和隐窝深度的效应见图4。进食HFF食物的狗与进食LFF食物的狗相比，前者的十二指肠绒毛高度更高一些(1505±83对1294±83μm，P＝0.1)，但十二指肠隐窝深度无差异(289±28对262±28μm)。进食HFF食物的狗，相对于进食LFF食物的狗，前者的空肠绒毛高度明显高一些(分别是1517±43对1343±43μm)，但隐窝深度无显著差异(277±19对234±19μm)。进食HFF的狗对进食LFF食物的狗，两者的回肠绒毛高度和隐窝深度无显著差异(分别为1035±45对993±45μm和251±46对357±46μm)。进食HFF食物的狗，相对于进食LFF食物的狗，两者的结肠隐窝深度无显著差异(724±33对727±33μm)。
营养物摄取。食物纤维可发酵性对营养物摄取的效应见表2。HFF的消耗导致空肠对D-葡萄糖的最大葡萄糖摄取能力(Vmax)明显更高(参见图5)。在空肠中还注意到食物对脂肪酸-12摄取的重要影响，这种摄取是未搅拌水层抗性的一个度量。Michaelis亲和常数(Km)不受到食物的影响。D-葡萄糖的细胞旁摄取或者由16mM时L-葡萄糖的摄取外推至原点并标准化为1mM时确定的D-葡萄糖kd估计值，不受食物的明显影响。D-果糖的Kd不受食物的影响。
葡萄糖输送蛋白。食物对任何检测肠段中的SGLT-1 mRNA无影响(参见图6)。相对于LFF食物，HFF食物的消耗与空肠内SGLT-1转运蛋白的蛋白质丰度更高相关(22.2±3.7对6.6±3.7光密度单位)。当消耗HFF食物时，回肠中SGLT-1转运蛋白的蛋白质丰度更高(13.4±0.7对10.4±0.7光密度单位，P＝0.09，参见图7)。空肠和回肠GLUT2转运蛋白的蛋白质丰度由于食物而引起显著性差异(参见图8)，这显示相对LFF食物，随着HFF食物的消耗而丰度增加(分别为1.9±0.2对0.9±0.1光密度单位和4.2±0.2对1.5±0.2光密度单位)。
                                  表1
                             实验食物的组成
                           低可发酵纤维      高可发酵纤维成分                           (LFF)            (HFF)
                               (g/kg进食食物)家禽副产品粉                    460             460家禽脂肪                        164             164鱼粉                            122             121预先胶化的玉米淀粉              80              110鲱鱼油                          3               3干燥的整蛋                      40              40小鸡消化物                      25              25维生素混合物                    3.2             3.2矿物混合物                      2.4             2.4纤维素                          70              ---甜菜浆                          ---             60阿拉伯胶                        ---             20果糖寡糖                        ---             15氯化钾                          2.2             2.1氯化钙                          1.9             1.1胆碱氯化物                      1.1             ---氯化物钠                        0.3             0.3
                         表2
       进食14天高可发酵纤维(HFF)的狗对进食14天
       低可发酵纤维(LFF)食物的狗的肠转运速率
                 空肠                  回肠
            HFF        LFF        HFF         LFFD-葡萄糖1Vmax         182±15a  133±13b  132±11     146±15(nmol/mg组织/分钟)Km(mM)       10.0±1.9  8.0±2.0    5.5±1.2   12.7±2.2L-葡萄糖(nmol/mg组织/分钟)16mM         21.7±1.2  21.5±3.3   33.7±5.3  27.8±3.51mM          1.4±0.1   1.4±0.2    2.1±0.3   1.4±0.2D-果糖(nmol/mg组织/分钟)Kd2         1.96       1.61        2.43       2.28脂肪酸12摄取3(nmol/mg组织/分钟)
           2.4±0.2a 1.7±0.2b 3.6±0.5    4.2±0.21各值是平均值±SEM，每种食物n＝8。上角标的不同字母表明在同一肠位点内两种食物之间的显著性差异(P＜0.05)。2KD是描述被动摄取L-葡萄糖的线条的斜率，这也反映了D-葡萄糖被动摄取的组分。Kd等于将16mM L-葡萄糖标准化为1mM时的摄取。3脂肪酸12(月桂酸)的摄取是未搅拌水层耐受性的度量。实施例2
喂给两组五只成年小猎犬(两种性别均包括)两种食物，这两种食物仅有纤维来源方面的不同(参见表3)。将纤维素(其通过犬类胃肠道(GIT)只被轻度降解)以3.6％的水平添加至对照食物(A)内。第二种食物(B)中包含甜菜浆(4.2％)和果糖寡糖(FOS)(1％)，它们可被狗GIT细菌发酵。化学分析显示这两种食物均含有25.9％蛋白质，11.8％脂肪，6.2％水分，5.7％灰分，1.23％钙，以及0.79％磷。食物B采用甜菜浆和FOS的混合物，因为狗的肠道细菌对它们的纤维发酵速率有区别。FOS的细菌代谢产物(如SCFA)与甜菜浆(其发酵缓慢)的细菌代谢产物相比应能在GIT的更近端获得。此外，可发酵纤维的两个来源设计为能产生不同浓度和比率的SCFA。从Fiber and SalesDevelepment公司(St.Loui s，MO)获得纤维素(Solka Floc)，从Michigan Sugar(Saginaw，MI)获得甜菜浆，从GoldenTechnologies(Golden，CO)获得FOS。
                        表3
       成分             食物组分比例，重量百分比
      玉米粉                     到100
小鸡和小鸡副产品粉               23.4
   啤酒制造稻米                  15.9
     小鸡脂肪                     4.2
     纤维来源                      a
       鱼粉                       3.3
维生素和矿物混合物                3.2
    小鸡消化物                    2.0
   干燥的蛋产品                   1.4
       鱼油                      0.75
   干燥的啤酒酵母                0.47
       亚麻                      0.28
   DL-甲硫氨酸                   0.19
a：食物A含有3.6％纤维素，食物B含有4.2％甜菜浆和1.0％FOS。
将狗分成两组分别在单独的开阔狗舍中饲养。在进行外科操作之前，进食至少六周。外科手术后，立即取出小肠，并切断相联的肠系膜，以将肠展平在水平表面上，并在静置状态下测量长度。取出三个长25-30cm的肠段并立即放置在冷(2-4℃)的Ringers(其已充入O2及CO2的混合物(95％和5％))中。第一个节段起源于距幽门30cm远处，视作近侧肠。第二段取自小肠的中部，作为中间的肠。第三节段，从距回肠结肠连接点30cm处开始到近侧，作为远侧肠的代表。
从三段小肠中的每一段取l0cm长用来确定每cm的湿重、周长及基于干燥物质的粘膜百分比。区域湿重和名义表面积(不计算由绒毛和微绒毛所扩增的面积)的估算通过用每cm的区域重量值和周长乘以区域长度而得到的。区域粘膜的量通过用粘膜百分比乘以区域湿重来估计。整个肠的值通过加和这三个区而得到。
利用外翻套管方法(Karasov等，J.Comp.Physiol.B 152：105-116(1983))的改进方法来测量营养物摄取的速率。因为成年小猎犬具有大直径的小肠(＞1cm)，故它不适于利用完整套管来测量营养物吸收。而将组织约0.5cm2的块用丝带系在5mm棒的旁边邻近末端处，并使得粘膜暴露出来。初步证实研究显示，摄取速率与利用肠的完整套管所测量的值相当(安装技术之间的差异＜10％)。在安装在棒上之前、期间及之后，将组织保持在冷的充气Ringers中。
在肠取出后45分钟于37℃下开始进行摄取的测量。按照Puchal和Buddington(Am.J.Physiol.，262：G895-902(1992))的方案，温育溶液由含有葡萄糖或脯氨酸的Ringers组成。组织积累营养物的量化通过添加标记的L-脯氨酸(3H)或D-葡萄糖(14C)来完成。选择脯氨酸作为代表性氨基酸是因为它有″私自的″载体(亚氨基酸转运蛋白)，而其它氨基酸载体可以转运几种不同类的氨基酸(亲和力有所不同)。往脯氨酸溶液中添加聚乙二醇(14C)以便校正与粘附流体相关的但实际上并未吸收的脯氨酸。对于葡萄糖溶液，加入被动吸收的异构体L-葡萄糖(3H)，以同时校正粘附流体内存在的、不依赖于载体而被动吸收的D-葡萄糖。在组织暴露于营养物溶液中后，将它们从棒上取下(将暴露于葡萄糖的组织首先在冷的Ringers中冲洗20秒)，并且放置在确定了空重的瓶中。记录湿重之后，溶解组织，加入闪烁剂，通过液体闪烁计数法测量结合的放射性。计算葡萄糖和脯氨酸的摄取速率，并表示为组织重量的函数。
摄取的区域分布通过在包含50mmol/L葡萄糖或脯氨酸溶液的溶液中温育每个节段的组织来确定。初步研究显示该浓度足够高，能够饱和载体并且使吸收速率最大。通过将所有摄取区域速率的值乘以区域的湿重来估算全长小肠吸收葡萄糖和脯氨酸的最大能力。
确定肠近侧对葡萄糖和肠中部对脯氨酸摄取的动力学。将组织置于含有0.04，0.2，1，5，25，以及50mmol/L未标记的葡萄糖和脯氨酸的Ringers中来完成上述目的。所得的摄取值由非线性回归分析来检测，以计算最大摄取速率(Vmax)和表观亲和常数(Km)。为了分析脯氨酸数据，引入了被动渗透系数，以便表示被动吸收而不依赖于载体的脯氨酸。
表和图中所示值是平均值和标准误差值。ANOVA被用来检查食物和区域对葡萄糖和脯氨酸吸收的容量和速率的效应。若发现了显著的区域影响，即利用Duncan检验来确定具体差异。利用StatisticalAnalysis  System(SAS，6.11版本，Cary，NC)对数据进行分析，以P＜0.05作为可接受的显著性临界水平。
在进食两种食物的狗之间，体重没有不同。然而，喂以含甜菜浆和FOS的混合物作为可发酵纤维来源的食物(食物B)的狗，与那些喂以含非可发酵纤维的食物(食物A)的狗相比，前者的肠长22％(P＝0.09；见表4)。从远侧到近侧周长下降(p＜0.05)。虽然在任何区域内的两种处理之间数值没有显著差异，但当综合三个区域时，进食食物B(其含有可发酵纤维)的狗，其可供吸收使用的所有肠表面积多28％。
在两组动物中，每cm的湿重从近侧到远侧下降，而且所有区域间均有显著性差异(P＜0.05)。进食可发酵纤维的狗，其肠每cm的平均湿重更高(1.17对1.04；P＜0.05)，这主要是因为近侧肠的量更高(p＜0.05)。中间和远侧区域的每cm湿重在两个处理之间没有明显差异。因此进食可发酵纤维的狗的总肠湿重更高是由于其肠更长及近侧肠的每cm重量更高的综合结果。每cm的干重也从近侧到远侧下降(P＜0.05)，但是任何区域在不同处理之间均没有差异，这表明进食可发酵纤维的狗其每cm近侧肠更重部分是因为其具有更高的含水量。即使这样，进食可发酵纤维的狗具有更高的总肠干重。
粘膜的百分比在不同区域之间(P＞0.50)或在任何区域的不同处理之间(P＞0.70)没有差异。进食可发酵纤维和没有进食可发酵纤维的狗，它们在三个区域的平均值分别是39％±0.02和39％±0.03。喂以可发酵纤维食物的狗由于其有更高的全肠重量，因此总肠粘膜量更大。
                     表4
  参数             食物A            食物B
体重(kg)        10.18±1.05      10.18±0.47肠长度(cm)        306±26*          372±23肠表面积(cm2)    1240±95*         1582±96肠的湿重(g)       318±23*          430±17
肠干重(g)       60.9±3.1*         77.9±5.7
 ％粘膜           39±3              39±2*星号表明基于食物的效应显著。
葡萄糖的摄取值代表了载体介导的转运。在50mmol/L的饱和浓度时，摄取速率在近侧肠最高(图9，区域效应P＜0.05)，但是在进食含有可发酵纤维的食物的狗内没有显著变高(处理效应p＞0.20)。中间和远侧肠的值之间、它们在两种处理之间均没有显著差异。
近侧肠的以葡萄糖浓度函数而描述的摄取动力学分析(图10)说明了两种处理的狗的可饱和摄取。虽然50mmol/L时的摄取值在两种处理之间没有显著差异，但动力学分析显示，进食可发酵纤维食物的狗具有更高的最大摄取速率(1.21±0.11nmol/mg-min对0.60±0.13，P＜0.05)。在两种不同处理之间，表观亲和常数无差异(6.2±2.1对3.9±3.3)，这表明仅仅存在一种转运蛋白类型。
脯氨酸摄取的速率值阐述载体介导的摄取和被动的不依赖于载体的吸收的总量。50mmol/L时的值在两种处理之间或区域之间没有差异(图9)。
进食纤维素食物(食物A)的狗，其脯氨酸摄取随着脯氨酸浓度中单一性地增加(图11)，没有显示载体所介导过程典型性的饱和动力学的任何证据，并且非常符合线性关系。作为另一个指示剂，相对于50mmol/L，计算0.04mmol/L时示踪物脯氨酸的积累比率。如果载体存在的数量有限，标记的和未标记脯氨酸将竞争载体位点。因为示踪物的积累和营养物浓度之间的相互关系，这将导致比率超过1.0。进食纤维素食物的狗的比率平均值为0.96±0.11，这表明无竞争。这些研究结果并结合动力学分析的那些结果表明，被动流入占了总脯氨酸吸收的几乎100％，并且只有极少量的输送蛋白存在或起作用。
相反，当狗进食可发酵纤维食物(食物B)时，脯氨酸的摄取速率和浓度之间的关系偏离线性关系，并且非常符合包括了可饱和过程与被动流入的一个平衡。这点得到了示踪物积累比的证实，其平均为1.21±0.15。该值与1.0无显著差异，并且明显低于葡萄糖的比率(进食有和无可发酵纤维的食物的狗，分别是9.13±1.36和4.58±0.80，两处理间及与1.0相比p＜0.05)。然而，这有可能表明当狗进食可发酵纤维食物时在中间肠位置存在更多脯氨酸载体。即使这样，在50mmol/L脯氨酸时，被动流入仍然占总流入的90％以上。
其它脊椎动物的完整组织对脯氨酸摄取的亲和常数的范围为约1至5mmol/L。如果狗的亚氨基转运蛋白与其它已知哺乳动物相似，那么所有载体应在25mmol/L浓度时被饱和。因此，在25和50mmol/L之间脯氨酸吸收的任何增加都应该反映了被动的、不依赖于载体的流入。比较25和50mmol/L时的线条斜率，在进食食物A(0.074±0.022nmol/mg-min-mmol/l)和食物B(0.054±0.011，P＞0.20)的狗之间没有发现差异。
当摄取速率对区域湿重积分时，进食可发酵纤维食物的狗具有对葡萄糖更高的总肠吸收能力(271±42μmol/min对139±37；P＜0.05)。这主要是由肠近侧的值更高造成的；中间和远侧肠的值在两处理之间确实有差异(图12)。未检测到两种处理对任何区域的脯氨酸摄取能力(图12)或对小肠总长度(食物A＝1246±155，食物B＝1031±124；P＞0.40)有任何效果。
实验显示食物中存在的纤维类型能改变狗的肠结构与功能。这些结果显示，当狗进食具有易被GIT细菌发酵的纤维的食物时，可导致肠具有更多表面积和粘膜，并且更长和更重。根据进食两种食物的狗之间在近侧肠重量和粘膜量方面的差异，说明这种反应在近侧肠更为明显。在肠的近侧或肠的任何其它区域均无粘膜百分比的差异(p＞0.9)，这表明其在所有组织层均得以增加。然而，由于近侧区域更大量，因此进食可发酵纤维食物的狗在近侧区域及小肠的全长内具有更多粘膜。这表明进食可发酵纤维食物的狗具有更多的肠用于水解和吸收吞食的食物。该结果也表明，在犬类食物中添加可发酵纤维，对健康的狗来说，除了能增加有益的GIT细菌之外，还有助于其健康。
为了说明本发明阐述了一些代表性的实施方案和细节，对于本领域技术人员来说，显然在本文所揭示的方法与装置方面可作各种变化，而仍不超出附属权利要求书所定义的本发明范围。

Claims (16)

1.一种改变动物胃肠道(GIT)的功能与组成以改善葡萄糖代谢的方法，该方法包括以下步骤：
喂给动物主要由含有可发酵纤维的组合物组成的食物，其中所述可发酵纤维当被粪便细菌发酵24小时时，其有机物质消失比为15-60％，所述纤维的存在量占补充的总食物纤维重量的约1-11％，以及
用该食物饲养动物至足够的时间，以使该可发酵纤维在该动物的GIT中发酵。
2.权利要求1的方法，其中所述组合物含有所述可发酵纤维的量占补充的总食物纤维重量的2-10％。
3.权利要求1的方法，其中所述组合物含有所述可发酵纤维的量占补充的总食物纤维重量的3-9％。
4.权利要求1的方法，其中所述组合物含有所述可发酵纤维的量占补充的总食物纤维重量的4-7％。
5.权利要求1的方法，其中所述可发酵纤维的有机物质消失比为20-50％。
6.权利要求1的方法，其中所述可发酵纤维的有机物质消失比为30-40％。
7.权利要求1的方法，其中所述可发酵纤维选自：甜菜浆，阿拉伯胶，talha胶，车前草，米糠，角豆胶，桔浆，果胶，果糖寡糖，甘露糖寡糖及其混合物。
8.权利要求1的方法，其中所述可发酵纤维选自：甜菜浆，阿拉伯胶和果糖寡糖。
9.权利要求1的方法，其中所述可发酵纤维包含甜菜浆、talha胶和果糖寡糖的混合物。
10.权利要求9的方法，其中在所述混合物中甜菜浆与果糖寡糖的比例在约3∶1至6∶1之间。
11.权利要求9的方法，其中所述混合物中甜菜浆与果糖寡糖的比例约为4∶1。
12.权利要求9的方法，其中所述甜菜浆与talha胶及果糖寡糖的比例约为6∶2∶1.5。
13.权利要求1的方法，其中所述动物是狗。
14.一种促进动物胃肠道(GIT)分泌胰高血糖素样肽1(GLP-1)以改善所述动物内葡萄糖代谢和饱腹感的方法，该方法包括以下步骤：
喂给动物主要由含有可发酵纤维的组合物组成的食物，其中所述可发酵纤维当被粪便细菌发酵24小时时，其有机物质消失比为15-60％，该纤维的存在量占补充的总食物纤维重量的约1-11％，以及
用该食物饲养动物至足够的时间，以使该可发酵纤维在动物的GIT中发酵从而促进动物胃肠道中GLP-1的分泌。
15.一种改善动物胃肠道(GIT)的营养物吸收的方法，该方法包括以下步骤：
喂给动物主要由含有可发酵纤维的组合物组成的食物，其中所述可发酵纤维当被粪便细菌发酵24小时时，其有机物质消失比为15-60％，该纤维的存在量占补充的总食物纤维重量的约1-11％，以及
用该食物饲养动物至足够的时间，以使该可发酵纤维在动物的GIT中发酵，从而增加动物胃肠道内D-葡萄糖和月桂酸的转运。
16.一种治疗患外分泌胰腺功能不全(EPI)的动物的方法，该方法包括以下步骤：
喂给动物主要由含有可发酵纤维的组合物组成的食物，其中所述可发酵纤维当被粪便细菌发酵24小时时，其有机物质消失比为15-60％，该纤维的存在量占补充的总食物纤维重量的约1-11％，以及
用该食物饲养动物至足够的时间，以使该可发酵纤维在动物的GIT中发酵，从而增加动物胃肠道内的营养吸收及D-葡萄糖和月桂酸的转运。
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044932A1 (en) 1997-04-07 1998-10-15 The Iams Company Process for improving glucose metabolism, satiety, and nutrient absorption in companion animals
US5932258A (en) * 1998-04-06 1999-08-03 The Iams Company Composition and process for improving glucose metabolism in companion animals
CA2342861C (en) * 1998-09-02 2009-06-09 Heska Corporation Method and composition to protect an obligate carnivore from a disease of abnormal carbohydrate metabolism
US20040022828A1 (en) * 1999-02-23 2004-02-05 Sunvold Gregory D Use of carbohydrate source to limit weight gain in cats
US6630159B2 (en) 1999-02-23 2003-10-07 The Procter & Gamble Company Limiting weight gain of cats by feeding carbohydrate source that excludes rice
JP4098522B2 (ja) * 1999-09-06 2008-06-11 エッフェム フーズ ピーティーワイ リミテッド ペットフード製品およびそれを製造する方法
AU778193B2 (en) * 1999-09-06 2004-11-18 Effem Foods Pty Ltd Food product and process for manufacturing same
US7892586B2 (en) 2001-02-22 2011-02-22 Suzanne Jaffe Stillman Water containing soluble fiber
US8178150B2 (en) 2000-02-22 2012-05-15 Suzanne Jaffe Stillman Water containing soluble fiber
US8642051B2 (en) 2000-03-21 2014-02-04 Suzanne Jaffe Stillman Method of hydration; infusion packet system(s), support member(s), delivery system(s), and method(s); with business model(s) and Method(s)
WO2002071865A1 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Land O'lakes Farmland Feed Llc Method of feeding a ruminant
JP5214831B2 (ja) * 2001-05-30 2013-06-19 ユニチカ株式会社 肥満防止用ペットフード及びその製造方法並びにペットの肥満防止方法
JP2003104900A (ja) * 2001-09-28 2003-04-09 Univ Nihon ビートパルプ摂取抑制剤
KR20040053291A (ko) * 2001-11-09 2004-06-23 바이오메디신즈 인코포레이티드 오메가 인터페론을 이용한 질환 치료 방법
US20040018959A1 (en) * 2002-05-02 2004-01-29 Randall S. Hickle System and methods of lipid removal from the body
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
AU2002368480A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-14 Mars Uk Limited Food for gastrointestinal health
US8034372B2 (en) * 2003-03-05 2011-10-11 Nestec, Ltd. Dietary supplement for athletic pets
CN1852659B (zh) * 2003-10-16 2011-02-09 泰克康姆集团公司 具有降低的血糖应答的可消化性降低的碳水化合物食物
US20050118234A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-02 The Iams Company Methods and kits related to administration of a fructooligosaccharide
US20050119222A1 (en) 2003-12-01 2005-06-02 The Iams Company Compositions comprising fermentable fiber which are adapted for use by a companion animal and kits and methods of their use
US7393903B2 (en) * 2004-08-04 2008-07-01 Guerry Grune Devices and methods for the rapid, reliable detection and determination of acrylamide concentration in food substances and prevention of acrylamide formation in the same
ATE531311T1 (de) * 2005-12-09 2011-11-15 Dna Genotek Inc Behältersystem zur lagerung und leichten ausgabe einer substanz
JP2009523462A (ja) * 2006-01-23 2009-06-25 ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド 動物の食物摂取を減少し、そして体重を制御するための方法
FR2903860B1 (fr) * 2006-07-21 2010-12-31 Royal Canin Sa Aliment sec pour reduire l'appetit des chiens
US20080038432A1 (en) * 2006-08-14 2008-02-14 Hoffman Andrew J Food Additive Comprising at Least One Fiber Source and at Least One Monosaccharide or Sugar Alcohol
US9420807B2 (en) 2007-04-02 2016-08-23 Purina Animal Nutrition Llc Method of feeding young monogastric mammals and composition fed to young monogastric mammals
WO2009033483A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Københavns Universitet Compositions and methods for increasing the suppression of hunger and reducing the digestibility of non-fat energy satiety
US20090123580A1 (en) * 2007-10-17 2009-05-14 Nutracea Methods for treating obesity, insulin resistance and inducing satiety
BR112012001333A2 (pt) * 2009-07-21 2015-09-01 Hills Pet Nutrition Inc Sistema de nutrição, sistema de perda de peso para um animal de companhia em necessidade de perder peso, e, método para administrar a absorção nutricional de um animal de companhia.
CA2839693A1 (en) 2011-06-19 2012-12-27 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
US9392814B2 (en) 2014-06-06 2016-07-19 Nicholas J. Singer Delivery system for drinks
CN106998756A (zh) * 2014-11-03 2017-08-01 特种宠物食品公司 适口的干燥猫食品及其制备方法
US11547125B2 (en) 2015-02-13 2023-01-10 Mars, Incorporated Pet food feeding system
USD773313S1 (en) 2015-06-23 2016-12-06 Nicholas J. Singer Package

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5616569A (en) 1994-03-28 1997-04-01 The Iams Company Pet food product containing fermentable fibers and process for treating gastrointestinal disorders
US5776524A (en) * 1996-10-30 1998-07-07 The Iams Company Process for treating small intestine bacterial overgrowth in animals
JP2001514523A (ja) * 1997-03-13 2001-09-11 アボット・ラボラトリーズ 加水分解タンパク質および繊維ブレンドを含む栄養組成物
US5965175A (en) * 1997-03-27 1999-10-12 The Iams Company Composition and method for repartitioning nitrogen and increasing colonic blood flow in dogs to promote intestinal health
US5958898A (en) * 1997-04-07 1999-09-28 The Iams Company Process for altering the function and composition of gut associated lymphoid tissue in an animal
WO1998044932A1 (en) * 1997-04-07 1998-10-15 The Iams Company Process for improving glucose metabolism, satiety, and nutrient absorption in companion animals

Also Published As

Publication number Publication date
DE69830569D1 (de) 2005-07-21
USRE38112E1 (en) 2003-05-06
ATE297741T1 (de) 2005-07-15
NZ337829A (en) 2001-03-30
CA2286299A1 (en) 1998-10-15
AU734098B2 (en) 2001-06-07
US20020197275A1 (en) 2002-12-26
AU6796998A (en) 1998-10-30
US6818225B2 (en) 2004-11-16
WO1998044932A1 (en) 1998-10-15
EP0967985A1 (en) 2000-01-05
CN1203863C (zh) 2005-06-01
US6475512B1 (en) 2002-11-05
CA2286299C (en) 2005-06-21
JP2007105051A (ja) 2007-04-26
DE69830569T2 (de) 2006-05-11
BR9807935A (pt) 2000-02-22
EP0967985B1 (en) 2005-06-15
TR199902485T2 (xx) 2000-05-22
JP2000513583A (ja) 2000-10-17
US6180131B1 (en) 2001-01-30

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Kung Jr et al. Rumen fermentation and nutrient digestion in cattle fed diets varying in forage and energy source
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Rijal Proximate analysis of animal feed from organic waste and effect on changes in body weight Gallus domesticus
Garg et al. Effect of feeding rumen protected protein on milk production in lactating buffaloes
Lunsin et al. Oil palm meal and urea pellet can partially replace soybean meal in the rations of lactating dairy cows
Munn et al. Hindgut plasticity in wallabies fed hay either unchopped or ground and pelleted: fiber is not the only factor
Kara et al. Comparison of forages’ digestion levels for different in vitro digestion techniques in horses
Whitney et al. Substituting hammermilled Juniperus spp. for chopped alfalfa hay in steer feedlot diets: growth performance and blood serum chemistry
Chen et al. Effects of different unconventional feed combinations on growth, digestion and rumen fermentation of dairy cows

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