CN1233657C - 抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能快速准确地检测出中毒者尿液中抗凝血类杀鼠药成份的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，它以4-羟基香豆素为半抗原，利用酯化反应进行化学修饰得到香豆素-琥珀酸酯，通过混合酸酐法的氯甲酸异丁酯法进行偶联，通过葡聚糖G50凝胶柱纯化，冻干，合成出的抗凝血类杀鼠药免疫原特异性强的抗凝血类杀鼠药免疫原的结合物，该免疫原可以用于免疫动物，进一步制备出用于检测用的抗凝血类杀鼠药的单克隆抗体。本发明广泛适用于临床，生物化学，环境分析等各个领域中。
Description
一、技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫分析方法，具体地说是一种抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法。
二、背景技术
近年来，使用杀鼠药投毒或意外中毒的事件时有发生，严重影响了社会的安定和人民生活的稳定。快速准确地检测中毒者尿液，以确定毒物名称，为及时给医院抢救提供方向和给事件性质定性提供依据，是当前相关部门研究的方向。目前抗凝血类杀鼠药的中毒现象时有发生，因此准确、快速地检验抗凝血类杀鼠药(10min之内给出结果)具有重要的实际意义。
常规的免疫分析方法主要利用在抗体上标记放射性同位素、酶、荧光物质等，在待测抗原与标记抗体特异性反应后，洗板分离，通过测定标记的放射性同位素或荧光物质的信号，或测定标记酶作用于底物所产生的电活性物质、发光物质等的信号进行测定。近几十年来，免疫分析技术结合了抗原、抗体分子间的特异性识别反应和电化学、光谱学、声学等技术的灵敏、方便等特性，以其对分析物的高选择性和高灵敏性，成为临床，生物化学，环境分析等各个领域重要分析手段之一。在所有这些方法中，无论标记的是何种物质，都需要得到特异性强、灵敏度高的单克隆抗体，而单克隆抗体的获得需要有特异性强的免疫原。小分子化合物本身不具备免疫原性，因此免疫原的合成至关重要。免疫原的合成通常是将小分子化合物与牛血清白蛋白BSA联结，联结的位置直接影响单克隆抗体的特异性。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种能快速准确地检测出中毒者尿液中抗凝血类杀鼠药成份的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，它给医院及时抢救提供依据，同时给中毒事件性质定性提供方向。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征在于它包括以下步骤：
A)羟基香豆素类化合物作为半抗原，利用酯化反应进行化学修饰得到香豆素-琥珀酸酯；
羟基香豆素在吡啶介质中与琥珀酸酐酯化反应式为：
B)将步骤A)得到的香豆素-琥珀酸酯通过混合酸酐法的氯甲酸异丁酯法进行偶联；
羟基香豆素与牛血清白蛋白(BSA)偶联过程为：
C)将步骤B)得到的反应产物通过葡聚糖G50凝胶柱纯化，冻干，制备出抗凝血类杀鼠药免疫原的结合物。
抗凝血类杀鼠药在体内的代谢物主要为羟基香豆素类化合物，如7-羟基香豆素、4-羟基香豆素。考虑到代表性，选择抗凝血类杀鼠药的半抗原为4-羟基香豆素，在步骤A)中所述羟基香豆素类化合物为4-羟基香豆素。
将步骤A)中的4-羟基香豆素1～2g于反应瓶中，加入琥珀酸酐，在100～120℃吡啶介质中回流3～5小时，再用旋转蒸发器甩干吡啶溶液，氯仿提取，氯仿层用重蒸馏水洗2～4次，得到产物为酱油色油状体香豆素-琥珀酸酯。
步骤B)中所用原料包括牛血清白蛋白Bovine Serum Albumin(BSA)、三丁胺Tri-n-butylamine、氯甲酸乙酯Ethyl Chloroformate、二氧六环和氢氧化钠溶液。其中，所述牛血清白蛋白(BSA)为BR级，白蛋白含量95％，分子量67366.4；三丁胺为分子量185.34，CP纯，含量不少于99％；氯甲酸乙酯为分子量108.53，CP纯，含量不少于96.5％；二氧六环为AR级，重蒸馏；氢氧化钠溶液为1M。具体操作步骤为：
(1)、首先将牛血清白蛋白溶解在重蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调至pH8.5后反应：
(2)、然后将香豆素-4-琥珀酸酯溶于重蒸馏的二氧六环溶剂中，加入氯甲酸乙酯和三丁胺，再冰浴反应；
(3)最后把(2)得到的溶液缓缓倒入(1)的溶液中并小心搅拌，加入氢氧化钠溶液调至pH8.5，加重蒸馏水，将总体剂在5℃冰箱中反应。
在以上操作步骤中，(1)中牛血清白蛋白为0.512g、重蒸馏水为100ml、氢氧化钠溶液为1M、反应时间为30min；(2)中香豆素-4-琥珀酸酯为0.3g、重蒸馏的二氧六环溶剂为25ml、氯甲酸乙酯为97μl、三丁胺为178μl、冰浴反应时间为30min；(3)中氢氧化钠溶液为1M，总体剂为200ml，冰箱中反应时间为8小时。
对以上通过本发明制得的香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物进行免疫原鉴定：
1、紫外分析法
纯化后的香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物用紫外光谱仪进行测量，同时用紫外光谱仪分别测量香豆素-4-琥珀酸酯和BSA，以验证结合物是否为香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物，验证结果证明的确是香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物。
2、红外分析法
冻干纯化后的香豆素-4-琥珀酸酯-BSA结合物，溴化钾压片，进行红外分析，同时分析BSA及香豆素琥珀酸脂，用以判断是否为香豆素琥珀酸酯的结合物，判断结果证明的确是香豆素琥珀酸酯的结合物。
3、飞行质谱方法
采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析半抗原结合到BSA分子上的数目，半抗原结合到BSA分子上的数目常常影响抗体产生。过去有的作者认为接到BSA分子上的半抗原要尽可能多。实验结果表明过多的半抗原并不能得到预期的结果。半抗原过多或过少均可能降低诱发产生抗体的能力。
本发明的优点是：1、抗原和BSA联结的位置直接影响单克隆抗体的特异性，本发明选择在识别不重要的羟基位置进行联结，合成出的抗凝血类杀鼠药免疫原特异性强，可为进一步免疫动物，为制备出特异性强的单克隆抗体打下了良好的基础；2、本发明中合成方法简单、易操作，不需要特殊的仪器设备。
四、具体实施方式
一种本发明所述的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，抗凝血类杀鼠药在体内的代谢物主要为羟基香豆素类化合物，如7-羟基香豆素、4-羟基香豆素。考虑到代表性，选择抗凝血类杀鼠药的半抗原为4-羟基香豆素。它包括以下步骤：
A)香豆素-4-琥珀酸酯(Coumarin-4-hemisuccinate)的合成
取4-羟基香豆素1.6g于三口反应瓶中，加3.0g琥珀酸酐，在110℃吡啶介质中回流4小时，用旋转蒸发器甩干吡啶溶液，氯仿提取，氯仿层用重蒸馏水洗3次，产物为酱油色油状体。
香豆素-4-琥珀酸酯合成路线如下：
4-羟基香豆素 丁二酸酐 香豆素-7-琥珀酸酯
(4-Hydroxycoumarin) Coumarin-4-hemisuccinate
(4-O-carboxymethylcoumarin)
B)香豆素-4-琥珀酸酯-BAS结合物的偶联
原料为：
牛血清白蛋白Bovine Serum Albumin(BSA)，BR级，含量95％(白蛋白)，分子量67366.4。三丁胺Tri-n-butylamine，分子量185.34，CP纯，含量不少于99％。氯甲酸乙酯Ethyl-Chloroformate，分子量108.53，CP纯，含量不少于96.5。二氧六环AR级，重蒸馏。1M氢氧化钠溶液。
偶联过程为：
(1)BSA 0.512g溶解在100ml重蒸馏水中，用1M氢氧化钠溶液调pH8.5，反应30min。
(2)香豆素-4-琥珀酸酯0.3g溶于25ml重蒸馏的二氧六环溶剂，加97μl氯甲酸乙酯，178μl三丁胺，在冰浴反应30min。
(3)把(2)的溶液缓缓倒入(1)的溶液中并小心搅拌，加入1M氢氧化钠溶液调pH8.5，加重蒸馏水，使总体剂为200ml，在5℃冰箱反应8小时。
香豆素-4-琥珀酸酯-BSA偶联(混合酸酐法)如下：
香豆素琥珀酸酯 香豆素琥珀酸酯-BSA结合物
C)去水冻干纯化
反应后的溶液放在冻干机中冻干。冻干的结合物用2ml磷酸盐缓冲溶液溶解，过葡聚糖G50柱，接收第二峰的液体，接收液在冻干机器中冻干为成品抗凝血鼠药结合物。
对以上采用本发明制得的香豆素-4-琥珀酸酯-BSA结合物免疫原的鉴定：
1、飞行质谱方法
香豆素琥珀酸酯-BSA结合物纯化后的香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物，以芥子酸为介质，进行飞行质谱测量。因为结合物的分子量与BSA的分子量不同，在飞行质谱中的飞行速度有所不同，根据结合物与BSA的质核比(m/z)，可计算出免疫原中载体蛋白与药物的结合摩尔比。
采用JMS-LDI1700时间飞行质谱(TOF)，N2激光器，波长337nm，脉冲3ns，检测器电压-4.75kv，基质：103倍数芥子酸含有10％的三氟乙酸水溶液。香豆素-4-琥珀酸酯的分子量为262，实际测得BSA的分子量为67366.4，BSA-香豆素-7-琥珀酸酯分子量为70839.5。
2、紫外分析
透析纯化后的香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物(未冻干)用紫外光谱仪进行测量，同时分别进行测量香豆素-4-琥珀酸酯和BSA的紫外光谱，如果在BSA上没有结合香豆素-4-琥珀酸酯，就不存在香豆素-4-琥珀酸酯的吸收峰。以此验证结合物是否为香豆素-4-琥珀酸酯-BSA结合物，验证结果证明的确是香豆素-4-琥珀酸酯半抗原-BSA结合物。
3、红外分析
纯化后的香豆素-4-琥珀酸酯-BSA结合物冻干，溴化钾压片，进行红外分析，同时分析BSA及香豆素-4-琥珀酸酯，用以判断是否为香豆素-4-琥珀酸酯的结合物，判断结果证明的确是香豆素琥珀酸酯的结合物。
Claims (6)
1、一种抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征在于它包括以下步骤：
A)用羟基香豆素类化合物4-羟基香豆素作为半抗原，利用酯化反应进行化学修饰得到香豆素-琥珀酸酯；
B)将步骤A)得到的香豆素-琥珀酸酯通过混合酸酐法的氯甲酸异丁酯法进行偶联；
C)将步骤B)得到的反应产物通过葡聚糖G50凝胶柱纯化，冻干，制备出抗凝血类杀鼠药免疫原的结合物。
2、根据权利要求1所述的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征是：将步骤A)中的4-羟基香豆素1～2g置于反应瓶中，加入琥珀酸酐，在100～120℃吡啶介质中回流3～5小时，再用旋转蒸发器甩干吡啶溶液，氯仿提取，氯仿层用重蒸馏水洗2～4次，得到产物为酱油色油状体香豆素-琥珀酸酯。
3、根据权利要求1所述的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征是：步骤B)中所用原料包括牛血清白蛋白、三丁胺、氯甲酸乙酯、二氧六环和氢氧化钠溶液。
4、根据权利要求3所述的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征是：所述牛血清白蛋白为BR级，白蛋白含量95％，分子量67366.4；三丁胺为分子量185.34，CP纯，含量不少于99％；氯甲酸乙酯为分子量108.53，CP纯，含量不少于96.5％；二氧六环为AR级，重蒸馏；氢氧化钠溶液为1M。
5、根据权利要求4所述的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征是：
(1)首先将牛血清白蛋白溶解在重蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调至pH8.5后反应；
(2)然后将香豆素-4-琥珀酸酯溶于重蒸馏的二氧六环溶剂中，加入氯甲酸乙酯和三丁胺，再冰浴反应；
(3)最后把(2)得到的溶液缓缓倒入(1)的溶液中并小心搅拌，加入氢氧化钠溶液调至pH8.5，加重蒸馏水，将总体剂在5℃冰箱中反应。
6、根据权利要求5所述的抗凝血类杀鼠药免疫原的合成方法，其特征是：(1)中牛血清白蛋白为0.512g、重蒸馏水为100ml、氢氧化钠溶液为1M、反应时间为30min；(2)中香豆素-4-琥珀酸酯为0.3g、重蒸馏的二氧六环溶剂为25ml、氯甲酸乙酯为97μl、三丁胺为178μl、冰浴反应时间为30min；(3)中氢氧化钠溶液为1M，总体剂为200ml，冰箱中反应时间为8小时。
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