CN1228126A - 甘油醛－3－磷酸脱氢酶及胞质雄性不育的核恢复 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胞质雄性不育的核恢复基因的标记，更具体地是将甘油醛－3－磷酸脱氢酶cDNA用作这种标记。提供了胞质雄性不育核恢复的基因，更具体是将编码甘油醛－3－磷酸脱氢酶的某种形式的基因用作此目的。最后，提供了以此基因直接通过植物的遗传转化产生恢复系的方法。
Description
发明背景(a)发明领域
本发明涉及胞质雄性不育核恢复的标记，更具体地是涉及将甘油醛-3-磷酸脱氢酶互补DNA用作这种标记的使用。本发明还涉及胞质雄性不育核恢复基因，并且更具体地为此目的而对一种形式的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因的使用。最后，本发明还涉及以这种基团对植物直接通过遗传转化而生产恢复系。(b)现有技术描述
不同作物品种杂交可能使其产量比亲本系明显地有增加。这种现象被标为杂交优势。为了实现对杂交优势的利用，有必要建立一种方法以在杂交过程中预防亲本系中的一个或二者的自花授粉。达到这种目的方法有机械、化学和遗传手段。一种成熟的遗传方法是胞质雄性不育(CMS)的性状。CMS的遗传决定因子，即父本传递的在产生可育花粉方面的无能力，位于线粒体基因组中。因为CMS植物是雄性不育的，其上所形成的全部种子都需要经过杂交。但是，由于CMS的父本传递性，其F1杂交后代一般也是雄性不育的因此也不能进行自花授粉和产生种子。为了解决这个问题，可在杂交的授粉亲本中引入被称为育性恢复因子(Rf)的特定的抑制雄性不育表型的核基因。非雄性不育胞质具不育性的基因型可被称为保持者；而携带Rf基因的则称之为恢复者；可将保持和恢复CMS的基因看作是同一座位上的不同等位基因(分别为rf和Rf)。现有方案的缺陷
为了产生不同套系的利用CMS的杂交，必须有足够量的含有Rf基因的恢复系，以及因CMS胞质而不育的“保持者”系。图1中简单示意了这些系在杂交作物生产中的应用。通过传统遗传学来发展这些系是一个缓慢的过程，它至少需要几年的努力，并且目前在某些作物中进行基于CMS的杂交产生了严重的瓶颈问题，这是作物包括加拿大的主要经济作物-Canola。例如，为了产生新的恢复系，有必要首先在一个提供Rf基因的现有保持系与接受(该基因)系之间进行杂交，然后对受体株系进行一系列的回交以在不改变该受体株系其它所需性状的情况下引入该Rf基因，这个过程一般称之为渐渗。即使经过多代之后，与Rf基因在供体DNA上连锁的一些供体DNA还将保持，这种现象被称之为连锁累赘；该供体DNA可能携带有害性状并损害受体株的质量(Jean,M.等，1993,Current Topics inMolecnlar Genetics,1:195-201)。
该过程可通过间接选择的一般方法简化：首先用与恢复基因连锁的遗传标记而非恢复基因本身来筛选后代植株。这些标记的选择是因为它们在植物发育相当早的时期即可进行筛选。这就避免了要将许多后代植株培养到成熟期的昂贵程序并可以大大加速渐渗过程。限制性片段长度多态性(RFLPs)代表了一种适于该目的的理想的DNA标记。RFLPs是用特异性探针检测到的限制性片段图谱之间的差异(在两个基因型之间)。在恢复系和保持系之间检测片段图谱差异以及与Rf基因共分离的探针在植物育种工作中可用来间接地对恢复系进行选择。我们已得到了与Rfp1连锁的一些探针，在杂交种子生产中目前正在用的是Polima的一个恢复因子或称之为polCMS和甘兰菜(Canola)(B.napus)的两种CMS中的一种。这些标记中没有任何一个与基因完全连锁。这就对其在间接选择中的应用产生了一个不确定的因素-任何一个标记在植物中的存在并不能保证该植株中也存在恢复基因。因此有必要应用许多的标记对含有该恢复基因的植株进行间接选择。
提供一个与胞质雄性不育的核恢复紧密联锁的标记是非常有必要的。
这种方法还可通过直接导入克隆的恢复系基因进一步加快进程。我们认为我们鉴定的与Rfp1完全连锁的探针检测的就是恢复系基因本身。发明简述
本发明的目的之一是提供一个与胞质雄性不育核恢复连锁的标记。
本发明的另一个目的是将甘油醛-3-磷酸脱氢酶互补DNA提供用来作为这种恢复标记。
本发明还有一个目的是用这个基因直接通过遗传转化来产生恢复系。
根据本发明提供了一个特异于植物胞质雄性不育核恢复的探针，它包含甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA或基因组DNA序列、其杂交片段或者由其衍生的用来作为引物扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶的任何DNA序列，其中所说的DNA序列或其杂交片段与其特征为具核恢复基因的植物的特定DNA片段在严紧条件下杂交。
根据本发明还提供了植物中胞质雄性不育的核恢复基因，它包括编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的DNA序列及周围序列。
该周围序列可位于甘油醛-3-磷酸脱氢酶的3′和/或5′端，可以是约可50kb。
根据本发明进一步提供了一种产生恢复系的方法，其包括用本发明的胞质雄性不育核恢复基因对植物进行的遗传转化。
根据本发明，只要在该种植物中的恢复基因相应于某种特定形式的GAPC的话就可以使用任何种类的植物。这些植物包括但不限于Brassicanapus、其它芸苔属的种类、玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativum)、向日葵(Helianthus amuum)以及高梁(Sorghum bicolor)。附图简要说明
图1简要示意了杂交种子生产中对胞质雄性不育(CMS)的利用。
图2表明了用来鉴别与育性基因的Rfp1恢复因子完全连锁的标记的杂交。
图3A到3E表明的是Brassica napus cDNA克隆cRF1(SEQ ID NO:1)与来自欧白芥(sinapis dlba)(SEQ ID NO:2)与拟南芥(Arabidopsisthaliana)(SEQ ID NO:3)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPc)cDNA比较；以及
图4描述了用来自甘兰菜(Brassica napus)的cRF1探针的Rfp1基因的遗传分离群体中检测到多态性的凝胶。发明详述
我们对恢复基因为分离的植物解体的两个遗传杂交继续进行了分析(如图2示意)。在任何情况下，其杂交的本质是绝大部分不育的后代个体都显示了杂交中雄性不育亲本的RFLP特性，而绝大部分可育的后代个体都显示杂交中雄性可育亲本的RFLP特性。一个被命名为cRF1的新标记已发现它是与该基因完全连锁的。尤其是，在两个杂交的175个测试个体中，发现所有的可育后代个体都具有可育亲本的等位基因(或形式)，而发现所有的不育植株都有不育亲本的等位基因(表1)。因此cRF1是恢复基因间接选择的特别有用的工具。
表1
与现有方案的不同点
| 在两个Brassica napus回交群体中用探针cRF1(GAPc)检测到的雄性育性恢复与Rfp1特异性RFLP等位基因的共分离 |
| 杂交 可育后代植株 不育后代植株 |
| 有Rfp1特异性无RfP-1特异性有Rfp1特异性无Rfp1特异性cRF1等位基因cRF1等位基因cRF1等位基因cRF1等位基因 |
| Westar 30 0 0 34×Westar-RfKarat 56 0 0 55×Westar-Rf总计 86 0 0 89 |
由于cRF1与Rfp1完全连锁，因此将该探针用来对该恢复基因进行间接选择时的不确定性实际上已被除去了。
另外，并未分离到Polina的恢复基因或pol CMS系统，因此想直接通过遗传转化来产生恢复系是不可能的。这将使得利用间接选择来开发新恢复系(图4)的花费大大降低。
检测到这种多态性的DNA探针是B.napus的互补DNA(cDNA)，也就是与信使RNA分子(mRNA)互补的DNA。该cDNA的DNA序列是被确定了的。对核苷酸数据库的分析表明该cDNA的序列与来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的糖酵解酶即由GAPC基因编码(Shih,M.-C.等，1991,Gene,104:133-138)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(图3A和3B)的胞质型有99％的。与恢复基因的完全连锁及GAPC多态性使得我们可以相信恢复基因有可能是GAPC的特定形式。
对BC1群体我们也作了相似类型的分析，其中对另一个不同的B.napusCMS(即nap)系统来说是分离的而且发现nap恢复因子仅仅是同一遗传座位上的不同等位基因而已。因此不同形式的GAPC相应于两种不同形式的B.napus核育性恢复基因。该结果进一步说明其它恢复基因也可能有相应的同种型GAPC，并且还说明GAPC与恢复基因之间的关系可延伸到其它植物种类的其它CMS系统中。在此之前还没有提出过认为任何植物的GAPC与恢复其间之间有关系的。
因此，对此基因也可能通过单步的利用遗传转化将恢复因子特异性的GAPC基因导入到保持基因型(天然状态下不含恢复因子的基因型)中而建立恢复系。这种方法可能是极其经济的，因为它可以减少在建立这些系所必需的植物育种过程中的许多步骤。如果将GAPC和恢复基因之间的关系延伸到其它作物品种中，这在许多作物中将形成一种分离恢复基因及开发恢复系的基本方法。
参考下面的实施例将可以很容易地理解本发明，这些实施例是用于描述本发明而并非限制其范围的。实施例Ⅰ
在生产新的恢复细胞系中用GAPC探针作为间接的选择标记
所研究的三种植物基因型为：
A．CMS系；
B．不含恢复基因而还含雄性可育胞质的雄性可育系；及
R．含有恢复基因同时还含雄性不育胞质的雄性可育系。
假定A系和B系之间的通过人工遗传杂交产生的杂交种表现出相当程度的杂交优势；A和R之间的杂交则没有杂交优势。由于B系不含有恢复基因，用CMS不可能在A系和B系之间的杂交产生雄性可育的杂种。但是如果可将恢复基因从R系转化到B系中，同时还不改变B系的性状，用CMS就可能使A系和B系之间的杂交得到雄性可育杂种。传统上，通过一下叫做渐渗的过程就可以完成。将R系用作雌株与B系杂交以产生A和B的雄性可育的F1杂种，该杂种含有雄性不育胞质(杂种的胞质全部来自于雌性亲本)但仍是雄性可育的，这是由于它也从R亲本系中接受了一份拷贝的恢复基因。然后在杂种(作雌株)和B系之间进行第二次杂交(称之为回交)。在田间种植大量的后代，期望有同样数目的可育株和不育株。在第二次对B系的杂交中将一株或更多株的可育株用作雌株；可育株被恢复并作为雌株与B系进行第三次杂交。将该过程重复多代，期望新的后代与B系越来越像(除了其具有恢复基因之外)。在每代中评价与B系相关的各种性状。最后，产生了具有B系的所有或绝大部分所需性状的新的恢复系。因此该系可用来大量生产A系和B系的杂种。
GAPC探针将有助于该方法，这是由于它使得在幼苗阶段的后代植株中即可评价恢复基因的存在。从小量的叶物质中提取DNA，用限制性内切酶例如HindⅢ(图4中所用)消化并以GAPC探针分析。作为恢复基因的特征的限制性片段的出现说明该幼苗具有恢复基因。以非常低的花销筛选了相当大量的植物，而这种花销在将同样的植株在田间长至成熟期时是必需的。而且，雄性不育的表型受多种不同条件的影响，通过筛选与其完全连锁的多态性来筛选该基因的存在将更方便地在渐渗过程中检测到该基因的存在。实施例Ⅱ
经转化通过恢复基因形式的GAPC的导入生产新的恢复因子细胞系
根据本方法在将研究实施例Ⅰ中的三种植物基因型。
在本实施例中，问题与实施例中的是一致的，即在不改变B系其它性状的情况下将R系的恢复基因导入到B系中。但是，在这种情况下，我们将假定该种形式的代表恢复基因的GAPC基因已被分离而且可以作为克隆的DNA区段克隆到适当的植物根瘤土壤杆菌(grobacterium tumefaciens)转化载体例如pRD400(Datla Rss,Hammer Lindl JK,Panchuk B,Pelcher LE &Keller W.(1992)Gene 211:383-384)中。与实施例Ⅰ中冗长的回交程序不同，通过农杆菌介导的转化将GAPC基因转入B系中。
为了本实施例的目的，我们也将假定A系、B系及R系是Brassicanapus系，而且克隆的恢复基因与R系的恢复基因是相同的。用Moloney等人所描述的方法(Moloney,M.,Walker,J.& Sharma,K.(1989)PlantCell.Rep.8:283-242)，用含整合了该基因的prRD 400载体的农杆菌株接种来自于菌株B动苗的子叶。通过抗生素处理除去农杆菌，并将所得植物组织置于含抗生素卡那霉素的培养基上。含该基因的pRD 400是卡那霉素抗性，于是在该抗生素上生长的细胞就有可能获得卡那霉素基因，同时还有克隆到pRD 400中的恢复基因。然后用GAPC探针测试特异于恢复因子的植物形式的限制性片段的存在来直接鉴定恢复基因在这些植物中的存在性。期望如果它们含有雄性不育胞质的话这些植株将被变成可育的，同时A系(作为雌性)和新转基因系杂交而来的F1后代也将是雄性可育的。
这种方法具有两个明显特征：它比传统的的植物育种方法更快和更便宜，它仅仅需要很少几个月而不是传统上建立该系所需的数年时间。而且，恢复基因的存在是B系和新恢复系的基因组之间存在的唯一区别。因此B系的性状完整性将更不会被受到损伤。
虽然上面的描述涉及了一种特定的植物，甘兰菜(Brassica napus)，只要该种中的恢复基因相应于一种特定形式的GAPC，那么本发明也可应用到其它物种中去。在这些情况下，用于转化的方法可能与上面所述的不同。
虽然本发明与其特定的实施方案一起描述，但应理解它能够有更进一步的修改而且这种应用一般来说，意在覆盖本发明的原理的任何的变通方式、使用或调节，而且还包括本公开的那些偏离，即那些与本发明相关的在本领域的现有或常规技术范围内的并且可应用于此前建立的基本内容之上并且落入附加权利要求范围内的那些偏离。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申请人：McGill大学等(ⅱ)发明名称：甘油醛-3-磷酸脱氢酶及胞质雄性不育的核恢复(ⅲ)序列数：3(ⅳ)通讯地址：(A)通信人：SWABEY OGILVY RENAULT(B)街道：1981 McGill College Ave.-Suite 1600(C)城市：Montreal(D)州：QC(E)国家：加拿大(F)ZIP:H3A2Y3(ⅴ)计算可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM兼容(C)操作系统：DOS(D)软件：FastSEQ for Windows版本2.0(ⅵ)当前申请资料：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类：(ⅶ)在先申请资料：(A)申请号：60/020,553(B)申请日：1996年6月26日(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名：Cote,:France(B)注册号：4166(C)案卷号：1770-152“PCT”FC(ⅸ)电信信息：(A)电话：514845-7126(B)电传：514-288-8389 (C)电报：(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：1207碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ⅱ)分子类型：cNDA(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：TCTCGATCTC ATCGACACCC TCTGATATCG AAATGGCTGA CAAGAAGATT AAGATCGGAA 60TCAACGGTTT CGGAAGAATC GGTCGCTTGG TGGCTAGAGT TATCCTTCAG AGGAACGATG 120TTGAGCTCGT CGCTGTTAAC GACCCCTTCA TCACCACGGA GTACATGACG TACATGTTTA 180AGTATGACAG TGTTCACGGT CAGTGGAAGC ACAACGAGCT CAAGGTTAAG GATGAGAAGA 240CACTTCTCTT CGGTGAGAAG CCTGTCACTG TTTTCGGCAT CAGGAACCCT GAGGATATGC 300CCATGGGGTG AGGCTGGAGC TGACTTTGGG GTTGAGTCTA CTGGTGTCTT CACCGACAAG 360GACAAGGCTG CTGCTCACTT GAAGGGTGGT GCGAAGAAAG TTGTCATCTC TGCACCAAGC 420AAAGATGCTC CCATGTTCGT TGTTGGTGTC AATGAGCATG AGTACAAGTC TGATCTCAAC 480ATTGTTTCCA ACGCTAGTGC ACCACTAACT GCCTTGCTCC ACTTGCCAAG GTTATCANCG 540ACAGGTTTGG AATTGTCGAG GGACTCATGA CCACCGTCCA CTCTATCACT GCAACTCAGA 600AGACAGTTGA TGGTCCATCA ATGAAGGACT GGAGAGGTGG AAGAGCCGCT TCCTTCAACA 660TCATTCCCAG CAGCACCGGA GCTGCCAAGG CTGTCGGAAA GGTTCTTCCA CAGCTCAACG 720GAAAGCTGAC CGGTATGTCC TTCCGTGTTC CCACCGTTGA TGTTTCAGTT GTTGACTCAC 780GGTTAGACTC GAGAAAGCTG CAACCTACGA TGAAATCAAG AAGGCTATCA AGGAGGAATC 840TGAGGGCAAG CTAAAGGGAA TCCTTGGTTA CACAGAGGAT GATGTTGTCT CAACCGACTT 900CGTTGGTGAC AACAGGTCGA GCATTTTTGA CGCAAAGGCT GGAATCGCGT TGAGTGACAA 960CTTTGTGAAG CTGGTGTCGT GGTACGACAA CGAATGGGGT TACAGTACCC GTGTGGTCGA 1020CTTGATCATT CACATGTCCA AGGCCTAAGT CGATGAAGAT CTCGAGTGAT GTAATGGTGT 1080TTTTAAATTG TTGTTTTTAT CGAATAAATT TTCTTGGGTT TTGAAACCTT TATGGTTTTG 1140GCGAATTCTC TACTTTCACG TGACGTGATA AGAAGTTTGT AGACCGGTTG TTTTTTATTT 1200TTACTGA 1207(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：1091碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑学：线性SEQ ID NO:2的序列描述TTTCGAAATG GCTGACAAGA AGATTAAGAT CGGAATCAAC GGTTTCGGAA GAATCGGTCG 60TTTGGTGGCT AGAGTTATCC TTCAGAGGAA CGATGTTGAG CTCGTCGCTG TTAACGATCC 120CTTCATCACC ACCGAGTACA TGACGTACAT GTTTAAGTAT GACAGTGTTC ATGGTCAGTG 180GAAGCACAAT GAGCTCAAGG TGAAGGATGA GAAAACACTT CTCTTCGGAG AGAAGCCTGT 240CACTGTTTTC GGCATCAGGA ACCCTGAGGA TATCCCATGG GGTGAGGCCG GAGCTGACTT 300TGTTGTTGAG TCTACTGGTG TCTTCACTGA CAAGGACAAG GCTGCTGCTC ACTTGAAGGG 360TGGTGCCAAG AAAGTTGTCA TCTCTGCACC AAGCAAAGAT GCTCCTATGT TCGTTGTTGG 420TGTCAATGAG CATGAGTACA AGTCTGATCT CAACATTGTT TCCAACGCTA GTTGCACCAC 480TAACTGCCTT GCTCCACTTG CCAAGGTTAT CAACGACAGG TTTGGAATTG TCGAGGGACT 540CATGACTACT GTCCACTCTA TCACTGCTAC TCAGAAGACA GTTGATGGTC CATCAATGAA 600GGACTGGAGA GGTGGAAGAG CCGCTTCCTT CAACATCATT CCCAGCAGCA CCGGAGCTGC 660CAAGGCTGTC GGAAAGGTGC TTCCACAGCT CAATGGAAAA TTGACCGGAA TGTCCTTCCG 720TGTTCCCACC GTTGATGTTT CAGTTGTCGA CCTCACGGTT AGACTCGAGA AAGCTGCAAC 780CTACGATGAA ATCAAGAAGG CTATCAAGGA GGAGTCTCAG GGCAAGCTAA AGGGAATCCT 840TGGTTACACA GAGGATGATG TTGTCTCAAC TGACTTCGTT GGTGACAACA GGTCGAGCAT 900CTTTGACGCC AAGGCTGGAA TCGCATTGAG TGACAACTTC GTGAAGCTGG TGTCGTGGTA 960TGACAACGAA TGGGGTTACA GTACCCGTGT GGTCGACTTG ATCATTCATA TGTCCAAGGC 1020CTAAAACGCT GAAGATCTAC AATGATGTAA TGGTGTCTTA ATTTGTGGTT TTCGAATAAG 1080ATTTCTTTGG G 1091SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征：(A)长度：1295碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑学：线性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述CTCATCTTCA ACCTCTCTCT AACTCTCGTT TTCGATTCTA CAATGGCTGA CAAGAAGATT 60AGGATCGGAA TCAACGGATT CGGAAGAATT GGTCGTTTGG TTGCTAGAGT TGTTCTCCAG 120AGGGACGATG TTGAGCTCGT CGCTGTCAAC GACCCCTTCA TCACTACTGA GTACATGACC 180TACATGTTCA AGTACGACAG TGTTCACGGT CAATGGAAAC ACAATGAACT CAAGATCAAG 240GATGAGAAGA CCCTTCTCTT CGGTGAGAAG CCAGTCACTG TTTTCGGCAT CAGGAACCCT 300GAGGATATCC CATGGGCCGA GGCTGGAGCT GACTACGTTG TTGAGTCTAC TGGTGTCTTC 360ACTGACAAAG ACAAGGCTGC AGCTCACTTG AAGGGTGGTG CCAAGAAGGT TGTTATCTCT 420GAACCCAGCA AAGACGCTCC AATGTTTGTT GTTGGTGTCA ACGAGCACGA ATACAAGTCC 480GACCTTGACA TTGTCTCCAA CGCTAGCTGC ACCACTAACT GCCTTGCTCC CCTTGCCAAG 540GTTATCAATG ACAGATTTGG AATTGTTGAG GGTCTTATGA CTACAGTCCA CTCAATCACT 600GCTACTCAGA AGACTGTTGA TGGGCCTTCA ATGAAGGACT GGAGAGGTGG AAGAGCTGCT 660TCATTCAACA TTATTCCCAG CAGCACTGGA GCTGCCAAGG CTGTCGGAAA GGTGCTTCCA 720GCTCTTAACG GAAAGTTGAC TGGAATGTCT TTCCGTGTCC CAACCGTTGA TGTCTCAGTT 780GTTGACCTTA CTGTCAGACT CGAGAAAGCT GCTACCTACG AAGAAATCAA AAAGGCTATC 840AAGGAGGAAT CCGAAGGCAA ACTCAAGGGA ATCCTTGGAT ACACCGAGGA TGATGTTGTC 900TCAACTGACT TCGTTGGCGA CAACAGGTCG AGCATTTTTG ACGCCAAGGC TGGAATTGCA 960TTGAGCGACA AGTTTGTGAA ATTGGTGTCA TGGTACGACA ACGAATGGGG TTACAGTTCC 1020CGTGTGGTCG ACTTGATCGT CCACATGTCA AAGGCCTAAG CTAAGAAGCA GATCTCGAAT 1080GATAGGGAGT GGAAAGTCAT CTGTTCATCC CCTTTTATGG TCTGAATTTG TCGTTTTCGA 1140ATAAAATTTC TTTGAACTTG GAACTTTTTT TTTTTTTGGT TTTCTTAATT CTCATTCATG 1200TGAGGTGATG GGAGTTTGTA GACCGATGTT TTACTGGAAG CCCTTTGTTT TTGGCTTTTG 1260ATATATTGAG TTAACGTTAT GGTTTTAAAA AAAAA 1295
Claims (5)
1．特异于植物胞质雄性不育的核恢复的探针，其包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA或基因组DNA序列或其杂交片段或者从其衍生的用作甘油醛-3-磷酸脱氢酶扩增的引物的任何DNA序列，其中所说的DNA序列或其杂交片段与作为具有核恢复因子基因的植株特征的特异DNA在严紧条件下杂交。
2．植物中胞质雄性不育性核恢复的基因，它包括编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的DNA序列及周围序列。
3．权利要求2的基因，其中所说的周围序列位于甘油醛-3-磷酸脱氢酶序列的3′和/或5′。
4．权利要求3的基因，其中的周围序列约为50kb。
5．产生恢复系的方法，其包括用权利要求2的胞质雄性不育核恢复基因对植物进行遗传转化。
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